Sidonnaisuudet kahden viimeisen vuoden ajalta Multiplex-PCR ym. uudet monianalyyttimenetelmät - Laboratorion näkökulma Dos., osastonylilääkäri Maija Lappalainen HUSLAB, Virologian ja immunologian osasto Shp-SIRO-FiRe-päivät 30.9.-1.10.2013 LT, Dosentti, Kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, hallinnon pätevyys, lääkärikouluttajan erityispätevyys Päätoimi HUSLAB, Osastonylilääkäri, vastuuyksikön päällikkö, Virologian ja immunologian osasto Sivutoimet konsultoiva erikoislääkäri, Yhtyneet Medix Laboratoriot Kierrosasiantuntija, Labquality Koulutustoiminta Luentopalkkiot: Astellas Pharma, Pfizer, Labquality, Roche Osallistunut lääkealan yrityksen koulutusten suunnitteluun: Orion Diagnostica Osallistunut yrityksen maksamaan koulutukseen: Roche Diagnostics Luottamustoimet terveydenhuollon alalla STM, tartuntatautien neuvottelukunnan/pandemiajaoksen pysyvä asiantuntija Kuntaliitto, laboratorionimikkeistötyöryhmän jäsen THL, mikrobinimikkeistötyöryhmän jäsen Labquality, hallituksen jäsen Muut sidonnaisuudet Osakkeen omistaja Medviro Oy Vaatimuksia diagnostiselle mikrobiologian laboratoriolle Luotettavat tulokset Vieri- ja kotitestaukset lisääntyvät Diagnostiikan nopeus lyhyemmät hoitoajat, avohoidossa käynnit lisääntyvät Infektion aiheuttaja selvillä 2 tunnin kuluttua sairaalaan tulosta Näytteenoton (ja logistiikan) kehittäminen Analytiikka keskittyy isoihin keskuslaboratorioihin, integraatio Toimiva tietojärjestelmä Jatkuva valmius seurata kehitystä ja pystyttää/evaluoida/ottaa käyttöön moderneja diagnostisia menetelmiä Yhteistyötä alan tutkimuslaboratorioiden kanssa Diagnostiset sirut, Syväsekvensointimenetelmät (highthroughput) Clinical Microbiology and Infection Volume 19, Issue 9, pages 781-783, 19 AUG 2013 DOI: 10.1111/1469-0691.12243 Mikä on ns. multiplex-pcr tutkimus? Esitelty v. 1988 (Chamberlain ym.), käyttökohteena sikiödiagnostiikassa useiden mutaatioiden yhtäaikainen tutkiminen pienestä näytemäärästä. Samasta näytteestä voidaan monistaa useita tutkittavia geenisekvenssejä yhtäaikaisesti samassa reaktioputkessa käyttämällä useita eri alukkeita Monta PCR-testiä samassa putkessa 2, 3, jopa kymmeniä Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22:611-633...mikä on ns. multiplex-pcr tutkimus? Monistustuotteet voidaan osoittaa/tunnistaa useilla eri tekniikoilla Geelielektroforeesi, Sekvensointi Reaaliaikainen tuotteiden osoittaminen Ns. microarray -menetelmät esim. Luminex-teknologia ns. suspensioarray; oligonukleotideillä, peptideillä tai polysakkarideilla päällystettyjä mikropartikkeleita->kalastavat kohdemolekyylejä Hyödynnetään liuoskinetiikan lyhyttä reaktioaikaa ja hyvää toistettavuutta Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22:611-633
Käyttöalueita virusdiagnostiikassa Verenluovuttajien ja verituotteiden seulonta (Fournier-Wirth C ym. Transfusion 2010). HIV-, HCV-, HBV Lyhentää infektioiden ns. ikkunavaihetta Respiratoriset infektiot Diagnostiikka Monitorointi (Madan RP, Herold BC. Current Opinion in Organ Transplantation 2010, 15:293 300) Keskushermostoinfektiot Gastroenteriitit (Higgins RR ym. J Clin Microbiol 2011;49:3154-3162). Ns. superserologia (ns. serosiru) Matkailijoiden kuumetaudit Verenvuotokuumeet Rokkotaudit Multiplex-PCR:n vaatimukset ja haasteet Hyödyt: Vähentää reagenssien ja näytteen kulutusta Sopivien alukkeiden suunnittelu on vaativaa Reaktio-olosuhteet ja potilasnäytteiden käsittely tulee optimoida Kullekin näytelaadulle erikseen Sopivat testikontrollit pitää määritellä (Loens K ym. J Clin Microbiol 2012) Multiplex-reaktion riippumattomuus esim. erilaisista templaattimääristä pitää testata huolellisesti Mitä enemmän alukkeita samassa reaktiossa, sitä todennäköisemmin epäspesifistä monistumista.-> monistusreaktion teho -> Herkkyys kärsii (Azzari C, PlosOne 2010) Jokaisen alukeparin toimivuus, spesifisyys ja sensitiivisyys tulee testata erikseen ja yhdessä Useampi taudinaiheuttaja näytteessä?: Sopiva ja luotettava erotus-/tunnistusmenetelmä (esim. Luminex) Illustration of the FilmArray RP pouch and the steps involved in processing a specimen for testing using the FilmArray system. Multiplex-PCR:n vaatimukset ja haasteet Semi- ja täysautomaattiset(kin) mikrobiologiset PCR-testit laitteineen vaativat: Osaavaa henkilökuntaa Tinkimättömiä ja hyviksi todettuja työtapoja Asianmukaiset työtilat ja olosuhteet Pierce V M et al. J. Clin. Microbiol. 2012;50:364-371 Lisäksi, arvioitavia seikkoja (Babady E ym. J Clin Microbiol 2012): Hands-on aika? Hinta per näyte? TAT, montako näytettä per ajo Miten tulkitaan? PCR-testeillä löydetään oireisten potilaiden näytteistä enemmän viruksia kuin muilla testeillä Sekainfektiot ovat tavallisia, kliininen merkitys? 5-8%:ssa lasten ja aikuisten hengitystienäytteistä löytyy kaksi tai kolme virusta (Mahony ym, 2007; Mahony 2008;, Pabbaraju ym 2008) Peräkkäin sairastetut infektiot Samanaikaisesti sairastetut infektiot Kvantitaatiosta apua? (Jansen RR ym., J Clin Microbiol 2011) Haasteita kliinisesti merkittävien raja-arvojen määrittämiselle: näytteenoton ajoitus, näytteen laatu ja standardointi Kontrollien löydökset: oireeton ikkunavaiheen infektio, postinfektioosi eritys, subkliininen infektio. Viruseristyksen kesto? Miten kauan on tartuttava? CNS-infektioiden etiologian selvittäminen on haasteellista Ennen geenimonistustestien aikaa: etiologinen aiheuttaja selville meningiiteissä n. 50%:ssa Geenimonistustestien myötä etiologia selville meningiiteissä 66-85%; enkefaliiteissa 36-75% 1-3, 5 HSV etiologinen tekijä 5-35%:ssa enkefaliiteista 2,4 1 Koskiniemi M, ym., J Neurovirol 2001 2 Kupila L, ym., Neurology 2006 3 Huttunen P, ym. Acta Paediatrica 2009 4 Elbers J, ym., Pediatrics 2007 5 Leveque N, ym., J Clin Microbiol 2011
Multiplex-herpesvirus testi (ProveIt, Mobidiag Ltd, Helsinki) Likvor-näytteet testattiin sekä referenssi-pcr-menetelmällä että Prove-it Herpes -testillä helmi-kesäkuun 2009 aikana Kliininen evaluaatio, monikeskustutkimus (Suomi: HUSLAB, Virologian osasto, Turun yliopisto Virusopin laitos, ISLAB, Kuopio) Näytemäärä (CSF) yhteensä 495 Prospektiiviset näytteet 340 Retrospektiiviset näytteet 155 Laadunarviointikierrosnäytteitä (QCMD, TY) 51 Prospektiiviset näytteet testattiin on-line rinnan referenssi-pcr:n kanssa mahdollisuuksien mukaan DNA-ekstraktio ja Prove-it tehtiin samana päivänä Jos referenssi-pcr-testiä ei ollut saatavana, tulosta verrattiin sekvensointitulokseen (HHV-7-tapaukset) Mannonen ym. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;73:74-79 Tulokset Tuotteen herkkyys ja spesifisyys 93 % ja 99 % Jokela P ym. J Virol Meth 2012;182:82-86
Tuuminen T ym., J Med Virol 2013 Ivaska L ym. J Clin Virol 2013 maripoc-evaluaatio/huslab (R. Loginov) Näytteet: Lastenklinikan imulimanäytteet epidemiakaudella marraskuu 2011- huhtikuu 2012 Yhteensä 265 näytettä Näistä ajettu rinnan RVirAg (FA) ja maripoc Eriävät näytteet: mikroskopoitu uudelleen ja ajettu RVP Tulokset Tulokset 74/ 265 näytteessä löydös FA:ssa, löydöksiä 75 (yksi kaksoisinfektio) Näistä 75 löydöksestä maripoc löysi 49 (65%) Maripoc spesifisyys 99.2% ( 2 virheellisesti positiivista RSV:tä) Löydös FA:ssa Maripoc Parainfluenssa 1 1 0 Parainfluenssa 2 3 0 Parainfluenssa 3 5 5 (100%) Adenovirus 3 3 (100%) Influenssa A 10 9 (90%) Influenssa B 1 0 RSV 52 32 (62%) Kaikki Lkm Yhtenevät Yhtenevät % Eriävät RSV:t 34 26 76,5 8 41 23 56,0 18 75 49 65,3 26 18 15 83,3 3 34 18 52,9 16 Harmaa= ei-immuunipuutteiset potilaat Vihreä= immuunipuutteiset potilaat
Yhteenveto Diagnostisia testejä päivitettävä jatkuvasti, menetelmät myös monianalyyttitestit - kehittyvät Multiplex-paneelit tulleet diagnostiikkaan Koinfektiot ovat yleisiä Tulokseen vaikuttavat: Preanalyyttiset tekijät: näytteen laatu, kuljetus ja näytteenkäsittely Potilasaineisto! Löydösten merkitys? Lisätutkimuksia kaivataan. Oikeat näytteet oikeasta paikasta oikeaan aikaan oikein otettuna