Luubiopsian histomorfometrinen tutkimus metabolisten luusairauksien diagnostiikassa

Katsaus Inari Tamminen, Hannu Kantola ja Heikki Kröger Luubiopsian histomorfometrinen tutkimus metabolisten luusairauksien diagnostiikassa Luubiopsioiden kvantitatiivista histomorfometriaa käytetään luun uudismuodostuksen eli remodellaation ja luun aineenvaihdunnan tutkimiseen kudos- ja solutasolla. Histomorfometriaa hyödynnetään metabolisten luusairauksien, kuten osteomalasian, renaalisen osteodystrofian ja vaikean osteoporoosin diagnostiikassa, ja sen avulla voidaan arvioida lääkehoidon tehokkuutta. Pelkällä luuntiheysmittauksella ei pystytä erottamaan osteoporoosia muista luun metabolisista sairauksista, joten epäselvissä tapauksissa diagnoosi edellyttää juuri luubiopsiaa. Analyysia varten tarvitaan kovakudosleike, joka valmistetaan potilaan suoliluun siivestä otetusta luubiopsianäytteestä. Ennen biopsiaa potilaalle tehdään fluorokromileimaus tetrasykliinillä kahdessa jaksossa, jolloin voidaan tarkastella luun aineenvaihdunnan dynaamisia ominaisuuksia, esimerkiksi mineraalistumisen nopeutta. V aikka dekalsifioitujen luunäytteiden histologinen tutkiminen oli pitkään ollut mahdollista, mineraalistuneen ja vastasyntetisoituneen luun (osteoidi) erottaminen sekä luusolujen säilyttäminen leikkeissä mahdollistui vasta 1950-luvulla Nordinin ja Bordierin kehittämän kovakudostekniikan avulla. Tetrasykliinillä tehty merkkiaineleimaus mahdollisti muun muassa luun muodostumis- ja mineraalistumisnopeuden tarkastelun (Frost 1973). Luunäytteessä todetut löydökset voidaan kvantifioida histomorfometrian avulla. Nykyään menetelmässä käytettävä termistö ja yksiköt on standardisoitu (Merz ja Schenk 1970, Frost 1973, Hodgkinson ja Knowles 1976, Jowsey 1977, Parfitt ym. 1987). Saatu näyte käsitellään ilman mineraalien poistoa, ja siitä valmistetaan kovakudosleikkeet histologista analyysiä varten. Histomorfometrinen tutkimus tehdään tavallisimmin käyttäen Duodecim 2007;123:2561 9 puoliautomaattista analyysiohjelmaa, jolla saatavat numeeriset tulokset kuvaavat luukudoksen aineenvaihduntaa (Recker 1999 ja 2006, Alhava ja Kröger 2002). Luun uudelleen muotoutuminen Luukudos koostuu rakenteellisesti trabekulaarisesta hohkaluusta ja kortikaalisesta tiivisluusta, jotka rakentuvat orgaanisesta matriksista eli osteoidista, mineraalista ja soluista. Kerroksittaiset kollageenisäikeet muodostavat lamellaarisen rakenteen. Kun luuta muodostuu hyvin nopeasti, kollageenisäikeiden orientaatio on satunnainen (punosluu, woven bone). Luun mineraaliosuus on pääosin kalsiumhydroksiapatiittia (Baron 1993, Recker 1999, Alhava ja Kröger 2002). Luun uudelleen muotoutumista (remodeling) tapahtuu jatkuvasti hohkaluussa trabekkelien ja kortikaalisessa luussa nk. Haversin systee- 2561

Kuva 1. Eroosiopintaa hohkaluun alueella. Luupalkki näkyy vihreänä ja luuta hajottavat monitumaiset solut, osteoklastit, rosoisen resorptiokuopan pinnalla punaisina (nuolet). Masson Goldnerin värjäys, x 400. Kuva 2. Luun uudelleen muotoutumisen (remodeling) synteesivaihe. Juuri muodostunut luu eli osteoidi näkyy luupalkin pinnalla punaisena juosteena. Osteoidin pinnalla on luuta syntetisoivia tummanpunaisia ja pallomaisia osteoblasteja (nuolet). Masson Goldnerin värjäys, x200. min pinnoilla. Ensimmäisenä aktivoituvat osteoklastien kantasolut, jotka erikoistuvat osteoklasteiksi eli luuta hajottaviksi monitumaisiksi jättisoluiksi. Nämä kaivavat onteloa luupintaan resorptiovaiheessa (kuva 1). Seuraavaksi aktivoituvat yksisoluiset osteoblastit eli luuta muodostavat solut, jotka synteesivaiheessa täyttävät osteoklastien muodostaman kuopan uudella luulla (kuva 2). Näin muodostuu osteoidia, johon alkaa kertyä mineraalia. Tämä nähdään lamellipinnan mineraalistumisvyöhykkeenä. Aikuisella luuta muodostuu vain resorboituneelle alueelle ja luun määrä pysyy normaalitilanteessa vakiona (Recker 1999, Alhava ja Kröger 2002, Seeman ja Delmas 2006). Osa osteoblasteista jää muodostuneen osteoidin sisään erikoistuen varsinaisiksi luusoluiksi, osteosyyteiksi. Luultavasti juuri osteosyytit säätelevät osteoklastien toimintaa ja uudelleen muotoutumista vastaamaan luuhun kohdistuvaa kuormitusta määräämällä resorboituvan alueen tarkan paikan ja suuruuden (Alhava ja Kröger 2002, Seeman ja Delmas 2006). Luubiopsian aiheet Kliinisessä työssä luusta tehtävän histomorfometrisen tutkimuksen yleisimmät aiheet on esitetty taulukossa 1. Menetelmä sopii myös osteoporoosin erotusdiagnostiikkaan ja hoitojen arviointiin, joskin sitä tarvitaan käytännössä vain poikkeustapauksissa. Histomorfometriaa käytetään niin ikään hoitopäätösten teossa ja uusien luunmittauslaitteistojen luotettavuuden arvioimisessa (Parfitt ym. 1987, Meunier 1988, Weinstein 1992, Recker ym. 1999, Alhava ja Kröger 2002). Luubiopsian suoritus ja näytteen käsittely Ennen biopsiaa potilaalle annetaan tetrasykliiniä kahdessa jaksossa merkkiaineeksi, kun halutaan tietoa luun uudistumisnopeudesta. Ylei- Taulukko 1. Luubiopsian aiheita Epäily metabolisesta luusairaudesta osteomalasia renaalisen osteodystrofia luun kiihtynyt resorptio ja luumassan nopea menettäminen hyperparatyreoosin luumuutokset osteoskleroosi Pagetin tauti selittämätön hypo- tai hyperfosfatemia Vaikea osteoporoosi hoidon suunnittelu ja seuranta Epämääräiset luustokivut Luuperäisen alkalisen fosfataasin selittämätön lisääntyminen Murtuman hidastunut luutuminen Pienienergiaisten traumojen aiheuttamat murtumat poikkeuksellisen nuorilla potilailla Epätyypilliset väsymismurtumat aikuisilla (pseudofraktuurat, pajunvitsatyyppiset murtumat) Lääkeaineiden farmakologisten ja toksisten luuvaikutusten selvittely 2562 I. Tamminen ym.

sin tetrasykliinin antoaikataulu on kaksi päivää tetrasykliiniä, kymmenen päivää taukoa, kaksi päivää tetrasykliiniä ja viisi päivää ilman lääkeainetta ennen biopsiaa. Tetrasykliinihydrokloridiannos on yleensä 250 mg neljästi vuorokaudessa. Tetrasykliini kertyy metabolisesti aktiivisille luualueille, ja osalle luupinnoista muodostuu antotavan vuoksi kaksoisleima. Mittaamalla leimojen välinen etäisyys voidaan määrittää luun aineenvaihdunnan ja mineraalistumisen nopeus (Hodgson ym. 1986, Alhava ja Kröger 2002). Luubiopsianäyte voidaan ottaa polikliinisesti, mutta tavallisimmin toimenpide on päiväkirurginen. Näyte otetaan suoliluun harjusta joko vertikaalisesti suoliluun siiven päältä tai transiliakaalisesti suoliluun siiven läpi (kuva 3). Jälkimmäinen menetelmä on suositeltavampi, sillä sitä käytettäessä näytteessä ovat mukana luun molemmat kortikaaliosat ja se säilyy näin laadukkaampana. Transiliakaalisessa (eli horisontaalisessa) biopsiassa näyte otetaan suoliluun anterioripuolelta 2 4 cm suoliluun harjun alapuolelta ja 2 cm suoliluun yläetukärjestä taaksepäin. Kairan sisäläpimitan olisi hyvä olla 7,5 8,0 mm, jotta saatava näyte on riittävän suuri laadukasta analyysiä varten. Vertikaalisessa biopsiassa näyte otetaan suoliluun siiven päältä luun kortikaaliosien välistä. Biopsiakairan sisäläpimitan tulisi tässä näytteenottotekniikassa olla vähintään 5,0 mm ja näytteen pituuden 2 3 cm. Näyte voidaan ottaa myös taltalla suoliluun siiven päältä. Näytteenottovälineistö on esitetty kuvassa 4. Syvempien kerrosten puudutus tehdään huolellisesti molemmin puolin luuta (periosti) (Hodgson ym. 1986, Recker 1988, 1999 ja 2006, Alhava ja Kröger 2002). Biopsiakohtaan tehdään noin 1,5 cm pitkä viilto, jonka tulee ulottua syvän faskian läpi periostiin asti. Teräväkärkinen obturaattori asetetaan holkkiin ja leikkauskohtaan niin, että sen kärki koskettaa luupintaa. Obturaattori vedetään ulos holkista ja sen tilalle asetetaan kaira, joka porataan suoliluun läpi mahdollisimman kohtisuorasti. Biopsianäyte voidaan ottaa myös käyttäen pienellä kierrosnopeudella toimivaa kirurgista poraa, johon kaira on yhdistetty. On tärkeää välttää liiallista voiman käyttöä, sillä suuri paine aiheuttaa näytteisiin merkittäviä artefaktoja varsinkin osteoporoottisessa luussa. Näyte irrotetaan kairasta ja asetetaan 70-prosenttiseen etanoliin (Hodgson ym. 1986, Recker 1999 ja 2006). Kuva 3. Luubiopsianäytteen ottopaikka suoliluun siiven anterioripuolella ja kairaus transiliakaalisesti suoliluun läpi (kuva Hodgsonin ym. 1986 mukaan). Kuva 4. Luubiopsiaa varten tarvittava välineistö. Vasemmalta: liitin kirurgiseen poraan, holkki, kairan terä, teräväkärkinen obturaattori ja puristin (Medical Innovations International Inc, Rochester Bone Biopsy). Luubiopsian histomorfometrinen tutkimus metabolisten luusairauksien diagnostiikassa 2563

Kuva 5. Histologinen luuleike. Oikealla kortikaalista luuta ja vasemmalla hohkaluun alueen palkistoa vihreäksi värjäytyneenä. Luuydin näkyy punertavana alueena palkistojen välissä. Masson Goldnerin värjäys, x 40. Kuva 6. Kaksoisleimautuminen tetrasykliinillä luunäytteessä. Kaksoisleiman perusteella voidaan määrittää luukudoksen mineraalistumisnopeus. Suurennos x 100. Luubiopsianäytteen tulee olla etanolissa vähintään 48 tuntia ennen histologisen näytteen valmistusta. Tämän jälkeen näyte dehydroidaan ja siitä poistetaan rasva. Näyte valetaan kovaan muoviin (esim. metyylimetakrylaatti) ja leikataan ohuiksi kovakudosleikkeiksi ilman mineraalien poistoa. Valomikroskopiaa varten leikataan 3 5 µm:n leikkeitä ja fluoresenssimikroskopiaan 10 µm:n leikkeitä. Leikkeet värjätään yleisimmin Masson Goldnerin trikromivärjäyksellä (kuva 5). Värjäämättömiä natiivileikkeitä käytetään epifluoresenssin avulla tetrasykliinileimojen analysointiin (kuva 6) (Baron ym. 1993, Recker 1999). Näytteenoton komplikaatiot Yleisimpiä haittavaikutuksia biopsianäytteen otossa olivat Duncanin ym. (1981) aineistossa hematoomat (0,2 %), yli seitsemän päivää kestävä kipu (0,1 %), femoraaliset neuropatiat (0,09 %) ja ihoinfektiot (0,07 %). Suurimmalla osalla potilaista esiintyi arkuutta biopsia-alueella neljästä viiteen päivää toimenpiteen jälkeen. Tutkimuksessa käsiteltiin 14 810 suoliluusiivestä otettua biopsianäytettä ja kokonaisuudessaan komplikaatioiden ilmaantuvuus oli 0,52 %. Horisontaalisen näytteenoton komplikaatioiden ilmaantuvuus oli hieman suurempi. Histomorfometriassa käytettävät parametrit ja viitearvot Kovakudosleike tutkitaan mikroskooppisesti tavallisimmin 200-kertaista suurennosta käyttäen. Histomorfometrisen tietokoneohjelmiston avulla luunäyte käydään systemaattisesti läpi mittauskenttä kerrallaan. Saatavilla olevia ohjelmia ovat Bioquant Osteo ja OsteoII sekä SkeleTechin OsteoMeasure. Niiden nimistö, symbolit ja yksiköt perustuvat standardisoituun termistöön (Parfitt ym. 1987). Valomikroskopiassa merkitään luupalkin pintaa seuraten erilaiset luualueet ja lasketaan solut. Polarisoivan linssin avulla natiivileikkeestä tarkastellaan luun lamellaarista rakennetta ja mitataan osteonin eli muodostuneen lamellipalkiston paksuutta (kuva 7). Fluoresenssimikroskopiassa mitataan fluoresoivien leimojen osuus ja kaksoisleimojen välinen etäisyys. Tietokoneohjelma laskee histomorfometristen parametrien arvot. Muuttujat voidaan jakaa neljään ryhmään, luun rakenne-, formaatio-, eroosio- ja dynaamisiin parametreihin (Parfitt ym. 1987, Recker ym. 1988). 2564 I. Tamminen ym.

Taulukko 2. Transiliakaalisen luubiopsian arvot 34 terveellä menopaussin ohittaneella naisella, jotka saivat fluorokromileimauksen ennen näytteenottoa (Recker ym. 1988). Taulukossa on esitetty luun rakenne-, formaatio-, eroosio- ja dynaamiset parametrit normaalivaihteluna (keskiarvo ± keskihajonta) ja mediaanina, kun mittaukset tehtiin hohkaluun alueelta. Mittauksissa käytetty suurennos x 100. Parametri Keskiarvo ± SD Mediaani Luun rakenneparametrit Hohkaluutilavuus (BV/TV, %) 21,2 ± 4,9 20,8 Palkkien paksuus (Tb.Th, µm) 132,4 ± 27,9 128,0 Lamellipalkiston paksuus (W.Th, µm) 30,9 ± 4,0 31,0 Kuva 7. Luunäytteen polarisaatiomikroskopia osoittaa kollageenisäikeiden kerroksellisen orientaation. Natiivileikkeestä voidaan polarisoivan valon avulla tarkastella luupalkkien lamellaarista rakennetta ja mitata lamellipalkiston paksuutta. Suurennos x 200. Kunkin muuttujan arvoa verrataan viitearvoihin, jotka vaihtelevat iän, sukupuolen ja rodun mukaan. Viitearvot perustuvat terveillä henkilöillä tai vainajilla saatuihin tutkimustuloksiin (Recker ym. 1988). Ne on esitetty taulukossa 2. Tutkimuksessa määritetyt viitearvot kuvastavat juuri potilasryhmää, jolla todetaan yleisimmin postmenopausaalista osteoporoosia. Muitakin tutkimuksia viitearvoista on julkaistu, ja niiden tulokset ovat nähtävillä artikkelin Internet-oheisaineiston taulukoissa 1 3 (www.duodecim.fi/aikakauskirja). Viitearvoja luun histomorfometriasta on saatavilla niukasti. Tämä johtuu hankaluudesta biopsoida terveitä koehenkilöitä. Aineistot ovat pieniä ja varsin heterogeenisia, minkä vuoksi viitealueiden rajat ovat leveitä. Kattavien vertailuarvojen puute on kuitenkin harvoin ongelma kliinisestä diagnoosista päätettäessä. Luun histomorfometrisen tutkimuksen virhelähteenä voi olla myös luutaudin esimerkiksi Pagetin taudin esiintyvyyden alueellinen vaihtelu luustossa. Näyte otetaan vain yhdeltä alueelta standardien mukaan, kun taas taudin yleisyys ja täten luun uudismuodostus saattaa vaihdella luuston eri osissa. Formaatioparametrit Osteoidin tilavuus (OV/BV, %) 1,9 ± 1,1 1,8 Osteoidin pinta-ala (OS/BS, %) 14,3 ± 6,3 12,8 Osteoblastipinta-ala (Ob.S/BS, %) 4,4 ± 3,2 4,2 Osteoidin paksuus (O.Th, µm) 9,3 ± 2,1 9,6 Eroosioparametrit Resorptiopinta-ala (ES/BS, %) 4,0 ± 2,0 3,4 Osteoklastipinta-ala (Oc.S/BS, %) 0,7 ± 0,7 0,5 Dynaamiset parametrit Mineralisaationopeus (MAR, µm/d) 0,53 ± 0,08 0,53 Mineralisaatiopinta-ala (MS/BS, %) 9,7 ± 5,5 8,5 Histomorfometrisia löydöksiä metabolisissa luusairauksissa Renaalinen osteodystrofia. Epäily renaalisesta osteodystrofiasta on luubiopsian yleisin aihe. Munuaisen vajaatoiminta voi johtaa monimuotoiseen luustosairauteen, jossa on sekä hyperparatyreoosin että osteomalasian piirteitä. Kalsiumin, fosfaatin ja D-vitamiinin aineenvaihdunta häiriintyy munuaisten kroonisessa vajaatoiminnassa jo silloin, kun munuaisten toiminta (glomerulusten suodatusnopeus) on vähentynyt noin puoleen normaalista. Sen johdosta D-vitamiini ei enää metaboloidu normaalisti aktiiviseen muotoon, mikä vähentää kalsiumin imeytymistä suolistosta, D-vitamiinin estovaikutusta lisäkilpirauhasissa ja johtaa sekundaariseen hyperparatyreoosiin. Fosfaatin erityksen heikkeneminen huonontaa osaltaan D-vitamiinin metaboliaa. Myös syntyvä asidoosi voi lisätä luun resorptiota (Alhava ja Kröger 2002). Kroonisen munuaissairauden vaikutuksia luustoon on totunnaisesti kutsuttu renaalisek- Luubiopsian histomorfometrinen tutkimus metabolisten luusairauksien diagnostiikassa 2565

si osteodystrofiaksi, mutta termiä on suositeltu käytettäväksi vain sellaisista munuaissairauksista, joissa luumuutokset voidaan osoittaa histomorfometrisesti luubiopsioista (Moe ym. 2006). Luumuutoksista tulisi suosituksen mukaan selvittää luun uudelleen muotoutuminen, mineraalistuminen ja tilavuus. Nämä kolme parametria luokitellaan luun uudelleen muotoutumisen osalta pieneksi, normaaliksi ja suureksi. Mineralistuminen luokitellaan joko normaaliksi tai epänormaaliksi ja luun määrä pieneksi, normaaliksi tai suureksi (Moe ym 2006). Renaalinen osteodystrofia voidaan jakaa parathormonivaikutuksen mukaisesti suuren ja pienen vaihtumisnopeuden ryhmiin. Ensimmäiseen ryhmään voidaan laskea kuuluvaksi sekundaarisen hyperparatyreoosin aiheuttama osteitis fibrosa ja toiseen adynaaminen luustotauti sekä osteomalasia (Goodman ym. 1999). Osteitis fibrosa on yleisin suuren vaihtumisnopeuden ryhmään kuuluva renaalisen osteodystrofian ilmentymä kaikenikäisillä. Histologinen tutkimus osoittaa siinä osteoklastien lisääntyneen lukumäärän ja koon. Resorptiokuoppien määrä ja syvyys ovat lisääntyneet hohkaluussa. Myös osteoblastien määrä ja aktiivisuus ovat lisääntyneet. Iso osa trabekkelien pinnasta on peittynyt osteoidilla. Osteoidi voi olla epäjärjestynyttä, mikä johtuu kollageenisynteesin nopeutumisesta. Luuytimen fibrotisoituminen kertoo pitkälle edenneistä muutoksista. Jos osteoklastien aktiivisuus on vain lievästi lisääntynyt eivätkä trabekkelit ole fibrotisoituneet, sairaus luokitellaan lieväksi osteodystrofiaksi (Goodman ym. 1999). Pienen vaihtumisnopeuden ryhmään kuuluva renaalisen osteodystrofian ilmentymä on osteomalasian lisäksi adynaaminen luustosairaus. Sen syynä ovat mm. fosfaatinsitojana käytetty alumiinihydroksidi, diabetes, glukokortikoidit, immobilisaatio, aliravitsemus, iänmukainen osteoporoosi sekä liiallinen D-vitamiinin tai kalsiumin saanti, jota esiintyy esimerkiksi peritoneaalidialyysissä. Histologisesti trabekulaarisen luun sekä osteoidin määrä ja paksuus ovat usein normaalin alarajoilla. Osteoblastien ja osteoklastien määrät ovat vähentyneet. Luun muodostumisnopeus on erittäin pieni. Alumiinin kertyminen luuhun voidaan todeta erityisvärjäyksellä (Goodman ym. 1999). Osteomalasia Osteomalasia on luuston häiriötila, jossa luun osteoidi ei mineraalistu normaalisti. Tämän seurauksena luu pehmenee ja sen mekaaniset ominaisuudet heikkenevät. Tyypillisiä oireita ovat luustokivut, luuston palpaatioarkuus, lihasheikkous ja murtumat. Osteomalasian erottaminen osteoporoosista on erityisen tärkeää, koska ensin mainittu on usein parannettavissa. Osteomalasian yleisimmät syyt ovat D-vitamiinin puute, D-vitamiinin metabolian häiriö ja fosfaatin puute. Histomorfometrisessä tutkimuksessa osteomalasian histologinen kuva vaihtelee mineralisaatiohäiriön vaikeuden ja mahdollisen sekundaarisen hyperparatyreoosin ilmenemisen mukaan. Tyypillisesti todetaan kuitenkin osteoidin määrän huomattava lisääntyminen ja mineralisaation hidastuminen (huono leimautuminen ja vähentynyt mineralisaationopeus). Luusolujen määrä on osteomalasiassa usein vähentynyt ja osteoblastit ovat litistyneitä. Osteoklasteja sisältävä luunpinta (Oc.S/BS) on yleensä alle 4 %. Resorptiokuopat voivat olla epätyypillisiä (Hodsman ym. 1982, Parfitt ym. 1987, Alhava ja Kröger 2002). Osteomalasian histomorfometrinen diagnoosi perustuu osteoidin määrän ja osteoidipaksuuden lisääntymiseen (OV/BV yli 10 % ja O.Th yli 15 µm) sekä pidentyneeseen mineraalistumisaikaan (yli 100 vuorokautta) (Parfitt ym. 1985). Osteoporoosi. Vaikka osteoporoosin diagnostiikka perustuu luuntiheysmittauksiin, on luubiopsialla käyttöä sekundaaristen muotojen erotusdiagnostiikassa ja arvioitaessa poikkeuksellisen vaikean osteoporoosin hoitovaihtoehtoja. Merkittävän osteoporoosin rajana on tyypillisesti pidetty hohkaluutilavuuden (BV/ TV) pienentymistä alle 16 %:n, ja vaikeasta osteoporoosista on kyse, kun arvo on alle 10 %. BV/TV:n laskiessa alle 10 %:n murtumat ovat lähes vääjäämättömiä (Meunier 1995). Osalla pienienergiaisen tai epätyypillisen murtuman saaneista taustalta voi löytyä luun mineraalistumisen häiriö ja osteomalasia, joita ei luuntiheys- 2566 I. Tamminen ym.

mittauksella pystytä toteamaan (Meunier 1995, Alhava ja Kröger 2002). Kortikosteroidien luuvaikutukset tunnetaan hyvin. Tyypillisesti todetaan negatiiviset vaikutukset osteoblastien aktiivisuuteen, mutta myös osteoklastien resorptio lisääntyy glukokortikoidihoidon aikana (Carbonare ym. 2005). Luubiopsiaa on käytetty myös osteoporoosilääkkeiden vaikutusten tutkimiseen. Odvina ym. (2005) biopsoivat yhdeksän potilasta, jotka olivat saaneet murtuman pitkäaikaisen alendronaattihoidon aikana ja joista kuudella murtuman paraneminen oli hidastunut. Osa potilaista käytti myös muita luuhun vaikuttavia lääkehoitoja. Trabekkelipinnoilla todettiin poikkeavan vähän osteoblasteja ja osteoklasteja, eikä UVmikroskopiassa nähty kaksoisleimoja. Nämä löydökset viittasivat luun heikentyneeseen aineenvaihduntaan ja muodostukseen. Bisfosfonaattihoidon vaikutusta luun laatuun ja muodostukseen postmenopausaalista osteoporoosia sairastavilla ovat selvittäneet myös Eriksen ym. (2002). Histomorfometriset mittaukset osoittivat, että risedronaattihoidon aikana luun mineraalistuvan pinnan määrä, aktivaatiotaajuus ja muodostumisnopeus vähenivät. Luun rakenteellisissa parametreissa ei ilmennyt merkitseviä muutoksia. Tutkimuksen mukaan risedronaattihoito aiheutti antiresorptiivisen luuvaikutuksen ja vähensi luun vaihtumisnopeutta, mutta luun rakenteeseen ja mineralistumiseen hoidolla ei ollut merkittävää vaikutusta (Eriksen ym. 2002, Odvina ym. 2005). Rekombinoidun hpth(1-34):n eli teriparatidihoidon vaikutusta luustoon on analysoitu käyttäen sekä kaksiulotteista histomorfometriaa että uudempaa kolmiulotteista mikro-tt-tekniikkaa (Jiang ym. 2003). Tutkimuksessa otettiin 102 naiselta kaksi luubiopsianäytettä, ensimmäinen ennen hoidon aloitusta ja toinen 11 24 kuukauden kuluttua. Tulosten mukaan teriparatidihoito vaikutti luun laatuun ja lujuuteen lisäämällä luun muodostusta ja parantamalla trabekkelien yhteenliittymiä. Arlot ym. (2005) ovat vertailleet teriparatidinhoidon ja alendronaatihoidon vaikutuksia luun histomorfometriaan. Ryhmä antoi kaksoissokkokokeessa menopaussin ohittaneille osteoporoosipotilaille jompaakumpaa lääkettä. Histomorfometriset analyysit tehtiin puolen ja puolentoista vuoden kuluttua. Luun muodostus todettiin huomattavasti suuremmaksi teriparatidiryhmässä molemmissa mittauksissa. Vaikka luun resorptio oli merkitsevästi suurempaa teriparatidiryhmässä puolen vuoden kuluttua, luun muodostuksen lisääntyminen ehkäisi luun määrän vähenemistä. Ryhmien välillä ei ollut eroa mineralisoitumisessa, mutta 18 kuukauden kuluttua mineralisaatio oli vähäisempää kuin kuuden kuukauden kuluttua. Tutkijoiden mukaan teriparatidihoidosta seurannut luun uudismuodostuksen kiihtyminen yhdistettynä vähäisempään resorptioon sai aikaan luun massan lisääntymisen. Välimäki (2007) on myös selvittänyt teriparatidin ja bisfosfonaattien luuvaikutuksen eroja histomorfometristen tutkimusten pohjalta aiemmin tässä lehdessä. Histomorfometrisen menetelmän toistettavuus omat tulokset Tutkimme histomorfometrian toistettavuutta mittaamalla tavanomaisia kliinisiä tutkimusy d i n a s i a t Luubiopsioiden kvantitatiivisella histomorfometrialla voidaan tutkia luun uudelleen muotoutumista (remodeling) ja aineenvaihduntaa kudos- ja solutasolla. Analyysi suoritetaan suoliluun siivestä otetusta luubiopsianäytteestä. Ennen biopsiaa potilas saa fluorokromileimauksen tetrasykliinillä kahdessa jaksossa. Histomorfometriaa käytetään metabolisten luusairauksien kuten osteomalasian, renaalisen osteodystrofian ja vaikean osteoporoosin diagnostiikassa sekä lääkehoidon tehokkuuden arvioinnissa. Luubiopsian histomorfometrinen tutkimus metabolisten luusairauksien diagnostiikassa 2567

näytteitä. Luun formaatio- ja eroosioparametrit määritettiin leikkeistä käyttäen 200-kertaista suurennosta. Kustakin näytteestä analysoitiin noin 20 30 kenttää hohkaluun alueelta. Mittausalue rajattiin siten, ettei se sisältänyt kortikaalista tai subkortikaalista luuta, joiden uudelleen muotoutumisen nopeus poikkeaa hohkaluun aineenvaihduntanopeudesta. Kaikki mittaukset suoritettiin ilman taustatietoja tapauksesta, ja mittauskertojen väli oli vähintään viikon mittainen. Mineraalistunut luu määritettiin vihreäksi värjäytyneinä alueina, jotka sisälsivät osteosyyttejä. Osteoidi määritettiin punaiseksi värjäytyneinä saumoina luun ja luuytimen rajapinnalla, ja mahdolliset osteoblastit laskettiin osteoidin yhteydessä. Eroosiopinta määritettiin rosoisena, kuoppamaisena alueena trabekkelien pinnassa, ja mahdolliset osteoklastit identifioitiin samalla. Dynaamiset parametrit määritettiin 10 µm:n natiivileikkeistä fluoresenssimikroskopialla (200- kertainen suurennos). Mineraalistumisnopeus määritettiin kahden tetrasykliinileiman välisenä etäisyytenä, joka jaettiin leimauksen välisellä ajalla. Kaikki parametrit analysoitiin käyttäen puoliautomaattista mittausohjelmaa (Bioquant Osteo, Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, USA). Tutkimme sekä saman tutkijan toistetun arvion että kolmen eri tutkijan arvion vaihtelua. Toistettavuuden variaatiokerroin (CV %) oli rakenneparametreissa samalla tutkijalla hyvä (0 10,1 %) ja tutkijoiden välilläkin kohtalaisen hyvä (0 15,4 %). Sen sijaan eroosioparametreissa toistettavuus oli huonompi erityisesti samalla tutkijalla (41,3 47,7 %) mutta myös eri tutkijoiden välillä (25,7 25,9 %). Formaatioparametrit ja dynaamiset muuttujat sijoittuivat näiden väliin. Solumuuttujien variaatiokerroin oli samalla tutkijalla 25,3 47,75 % ja tutkijoiden välillä 17,3 25,4 %. Tutkimme myös laboratorioiden välistä toistettavuutta (Addenbrookin sairaalan luututkimuslaboratorio, Cambridge, Iso-Britannia J. Compston ja S. Vedi). Variaatiokerroin oli hohkaluutilavuudessa (BV/TV) 9,9 %, osteioidin pinta-alassa (OS/BS) 29,6 % ja osteoidin paksuudessa (O.Th) 25,5 % (Internet-oheisaineiston taulukko 4). Taulukoidut tulokset ovat nähtävillä Aikakauskirja Duodecimin sähköisessä versiossa (www.duodecim.fi/aikakauskirja). Glorieux ym. (2000) tarkastelivat tutkimuksessaan histomorfometrian toistettavuutta lasten luubiopsia-aineistossa. Tutkijat saivat hohkaluutilavuuden (BV/TV) variaatiokertoimeksi 8,4 % ja vastaavaasti, osteoklastipinta-alalle (Oc.S/BS) 22,7 %. Chavassieux ym. (1985) saivat resorptiopinnan määrittämisen toistettavuudeksi renaalista osteodystrofiaa sairastavilla 25 % ja primaarista hyperparatyreoosia potevilla 69 %. Myös omassa tutkimuksessamme rakenneparametrien mittaaminen oli toistettavinta ja eroosion mittaaminen haastavinta. Näytteiden laatu vaikeuttaa selvästi eniten juuri resorptioalueiden tulkintaa. Toisaalta eroosion ja erityisesti osteoklastien määrä luunäytteessä voi olla hyvin vähäinen, jolloin pienikin tulkintaero nähdään suurempana vaihteluna. Resorption arvioimista voi helpottaa menetelmä, jossa mitataan resorptiokuopan syvyyttä. Tietääksemme laboratorioiden välisiä tutkimuksia histomorfometrian toistettavuudesta ei aikaisemmin ole julkaistu. On syytä kuitenkin huomioida, ettei edellä kuvatun suuruisilla toistettavuusvirheillä ole käytännön merkitystä diagnostisessa mielessä, eikä potilaan saama diagnoosi ollut missään tapauksessa erilainen mittausten mukaan (Chavassieux ym. 1985, Glorieux ym. 2000). Lopuksi Kliinisten potilasnäytteiden histomorfometrista analyysia tarjoavia laboratorioita on maailmassa suhteellisen vähän, ehkä 10 20. Yhdysvalloissa laboratorioita on kolmesta viiteen. Euroopassa kliinisiä potilasnäytteitä tutkitaan Englannissa, Sveitsissä, Ranskassa, Alankomaissa, Tanskassa ja Suomessa (International Society of Bone Morphometry meeting, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 19. 22.9.2006). Histomorfometristen laboratorioiden niukkuus rajoittaa menetelmän käyttöä, ja tämän vuoksi se ei ole kliinikoille usein kovinkaan tuttu. Myös tottumattomuus näytteenotossa voi johtaa epäedustavaan näytteeseen, jota ei voida luotettavasti analysoida. Koska suurta kokemusta omaavia laboratorioita on Suomessa vähän, on toiminnan keskittämi- 2568 I. Tamminen ym.

nen paikallaan. Kliinisiä potilasnäytteitä tutkitaan Kuopion yliopistossa. Suomessa noudatetaan näytteenotossa ja analyysissä tämän kirjoituksen mukaisia käytäntöjä. Luubiopsioiden kvantitatiivista histomorfometriaa voidaan pitää tärkeänä diagnostisena menetelmänä, kun tarvitaan tarkkaa tietoa luuston aineenvaihdunnan tilasta. Luubiopsia on invasiivinen tutkimus ja histomorfometria menetelmänä työläs, mutta tietyissä tapauksissa tutkimus on tarpeellinen. Sen antamaa tietoa voidaan hyödyntää erityisesti, kun luustosairauden syy on epäselvä ja esimerkiksi poikkeavien pienienergiaisten ja epätyypillisten murtumien yhteydessä. Osteomalasiaa ei voida erottaa osteoporoosista luuntiheysmittauksella, eikä sitä aina ole myöskään mahdollista diagnosoida pelkästään laboratoriotutkimuksilla. Renaalisen osteodystrofian luokittelu ja hoitomuodon valinta perustuvat nykyaikana luun kvantitatiiviseen histomorfometriaan. * * * Professori Heikki Kröger on saanut apurahan Sigrid Juséliuksen Säätiöltä. Kirjallisuutta Alhava E, Kröger H. Metaboliset luustotaudit. Kirjassa: Leirisalo-Repo M. ym., toim. Reumataudit. Rauma: Kirjapaino Oy West Point 2002, s. 369 78. Arlot M, Meunier PJ, Boivin G, ym. Differential effects of teriparatide and alendronate on bone remodeling in postmenopausal women assessed by histomorphometric parameters. J Bone Miner Res 2005 Jl;20:1244 53. Baron R. Anatomy and ultrastructure of bone. Kirjassa: Favus MJ, toim. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. New York: Raven Press, 1993 s. 3 9. Carbonare LD, Bertoldoa F, Valentia MT, ym. Histomorphometric analysis of glucocorticoid-induced osteoporosis. Micron 2005;36:645 52. Chavassieux PM, Arlot ME, Meunier PJ. Intermethod variation in bone histomorphometry: comparison between manual and computerized methods applied to iliac bone biopsies. Bone 1985; 6:221 9. Duncan H, Rao SD, Parfitt AM. Complications of bone biopsies. Kirjassa: Bone histomorphometry 1980. Paris: Armour Montagu 1981, s. 483 6. Eriksen EF, Melsen F, Sod E, Barton I, Chines A. Effects of long-term risedronate on bone quality and bone turnover with postmenopausal osteoporosis. Bone 2002;31:620 5. Frost HM. Bone remodeling and its relationship to metabolic bone diseases. Springfield IL: Charles C Thomas 1973. Glorieux FH, Travers R, Taylor A, ym. Normative data for iliac bone histomorphometry in growing children. Bone 2000;26:103 9. Goodman W, Copurn J, Satopolsky E, Salusky I. Renal osteodystrophy in adults and children. Kirjassa: Murray J Favus, toim. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. Illinois: Lippincott Williams & Wilkins 1999, s. 347 63. Hodgkinson A, Knowles CF. Laboratory methods. Kirjassa: Nordin BEC, toim. Calcium, phosphate and magnesium metabolism: clinical physiology and diagnostic procedures. New York: Churchill Livingstone 1976, s. 516 24. Hodgson SF, Johnson KA, Muhs JM, Lufkin EG, McCarthy JT. Outpatient percutaneus biopsy of the iliac crest: methods, morbidity, and patient acceptance. Mayo Clin Proc 1986;61:28 33. Hodsman AB, Sherrard DJ, Alfrey AC, ym. Bone aluminum and histomorphometric features of renal osteodystrophy. J Clin Endocrinol Metab 1982;54:539 46. Jiang Y, Zhao JJ, Mitlak BH, Wang O, Genant HK, Eriksen EF. Recombinant human parathyroid hormone (1-34) [teriparatide] improves both cortical and cancellous bone structure. J Bone Miner Res 2003; 18:1932 41. Jowsey J. The bone biopsy. New York: Plenum Press 1977, s. 59 89. Merz WA, Schenk RK. Quantitative structural analysis of human cancellous bone. Acta Anat 1970;75:54 66. Meunier PJ. Assesment of bone turnover by histomorphometry in osteoporosis. Kirjassa: Riggs BL, Melton LJ, toim. Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. New York: Raven Press 1988, s. 317 32. Meunier PJ. Bone histomorphometry. Kirjassa: Riggs BL, Melton LJ III, toim. Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers 1995, s. 307 15. Moe S, Drüke T, Cunningham J, Goodman W, ym. Definition, evaluation, and classification of renal osteodystrophy: a position statement from Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO). Kidney Int 2006;69:1945 53. Odvina C, Zerwekh J, Rao D, Maalouf N, Gottschalk F, Pak C. Severely suppressed bone turnover: a potential complication of alendronate therapy. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:1294 1301. Parfitt AM, Podenphant J, Villanueva AR, Frame B. Metabolic bone disease with and without osteomalacia after intestinal bypass surgery: a bone histomorphometric study. Bone 1985;6:211 20. Parfitt AM, Drezner MK, Glorieux FH, ym. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols and units. J Bone Miner Res 1987;2:595 610. Recker RR, Kimmel DB, Parfitt AM, Davies KM, Keshawarz N, Hinders S. Static ja tetracycline-based bone histomorfometric data from 34 normal menopausal females. J Bone Min Res 1988;3:133 44. Recker RR, Heaney RP. Effects of age, sex and race on bone remodeling. Kirjassa: Kleerekoper M, Krane SM, toim. Clinical disorders of bone and mineral metabolism. New York: Mary Ann Liebert 1989, s. 59 70. Recker RR. Bone biopsy and histomorphometry in clinical practice. Kirjassa: Favus MJ, toim. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. An official publication of the American Society for Bone and Mineral Research. Lippincott Williams & Wilkins 1999, s. 169 74. Recker RR. International Society of Bone Morphometry (ISBM) -kokous. Philadelphia PA, USA, 19. 22. syyskuuta 2006. Seeman E, Delmas PD. Bone quality the material and structural basis of bone strength and fragility. N Engl J Med 2006;354:2250 61. Välimäki MJ. Teriparatidi tuli, väheneekö bisfosfonaattien käyttö? Duodecim 2007;123:633 4. Weinstein RS, Bell NH. Diminished rates of bone formation in normal black adults. N Engl J Med 1988;319:1698 701. Weinstein RS. Clinical use of bone biopsy. Kirjassa: Coe FL, Favus MJ, toim. Disorders of bone and mineral metabolism. New York: Raven Press 1992, s. 455 74. INARI TAMMINEN, LK inari.tamminen@uku.fi HANNU KANTOLA, LK Kuopion yliopisto, luu- ja rustotutkimusyksikkö (BCRU) PL 1627, 70211 Kuopio HEIKKI KRÖGER, professori KYS:n ortopedian, traumatologian ja käsikirurgian klinikka PL 1777, 70211 Kuopio Kuopion yliopisto, luu- ja rustotutkimusyksikkö (BCRU) PL 1627, 70211 Kuopio ja University of Edinburgh, Medical School, MTEC 2569