Komplementti C3:n ilmentyminen syöttösoluissa keratinosyytti-ihosyövissä ja psoriaasissa.

Komplementti C3:n ilmentyminen syöttösoluissa keratinosyytti-ihosyövissä ja psoriaasissa. Joel Laitala Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Kliinisen lääketieteen yksikkö Iho- ja sukupuolitautien oppiaine Lokakuu 2018 1

Kiitokset professori Ilkka Harvimalle ja LL Salla Haimakaiselle tutkimuksen ohjauksesta ja avusta, tutkimusapulainen Anne Koivistolle ihosyöpänäytteiden värjäyksestä ja kuvantamisesta ja LL Antti Kaukiselle ihonäytteistä. 2

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Iho- ja sukupuolitaudit Tiivistelmä Laitala Joel: Komplementti C3:n ilmentyminen syöttösoluissa keratinosyytti-ihosyövissä ja psoriaasissa. Opinnäytetyötutkielma; 26 sivua. Ohjaajat: Professori Ilkka Harvima, LL Salla Haimakainen Lokakuu 2018 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Avainsanat: Komplementtisysteemi, C3, syöttösolu, tryptaasi, ihosyöpä, psoriasis Tavoitteena oli selvittää entsyymi- ja immunohistokemiallisin kaksoisvärjäyksin sitä, missä määrin komplementti C3c:n immunoreaktiivisuus ilmenee syöttösoluissa ihon tyvisolusyövässä, levyepiteelisyövässä, aurinkokeratoosissa ja psoriaasissa. Aiempien tutkimusten mukaan komplementtisysteemin osatekijät, kuten C3, voivat olla merkittäviä tekijöitä ihon levyepiteelisyövän kehittymisessä. Tutkimuksessa hyödynnettiin jo aiemmin kerättyjä ihonäytteitä. Näytteitä oli psoriaasista, tyvisolusyövästä, aurinkokeratoosista ja levyepiteelisyövästä. Näistä näytteistä tutkittiin C3cimmunopositiivisten syöttösolujen prosenttiosuus kaikista syöttösoluista käyttäen peräkkäistä entsyymi- ja immunohistokemiallista kaksoisvärjäystekniikkaa. Ensiksi syöttösolujen tryptaasi värjättiin entsyymihistokemiallisesti, jonka tuloksena syöttösolut ilmensivät jääleikkeissä punaista atsoväriä. Valokuvauksen jälkeen punainen atsoväri liuotettiin pois 15% Tween 20 liuoksella, minkä jälkeen leikkeet värjättiin immunohistokemiallisesti. Tässä värjäyksessä saatiin C3cimmunopositiiviset syöttösolut ilmentymään tummina. Immunohistokemiallisen värjäyksen jälkeen leikkeet valokuvattiin uudelleen mikroskooppiin kytketyllä kameralla täsmälleen samoista leikkeiden kohdista. Valokuvatuista kuvapareista voitiin laskea tietokoneen näyttöruudulla C3c-positiivisten syöttösolujen prosenttiosuus tutkituissa taudeissa leesioihossa ja terveen näköisessä ihossa. Tuloksena oli, että psoriaasissa (terve iho 45.3±16,8 %, leesioiho 56.1±9,12 %, keskiarvo± keskihajonta) ja tyvisolusyövässä (terve iho 62.6±13.7 %, leesioiho 83.3±11.9 %) C3c-positiivisten syöttösolujen prosenttiosuus oli merkittävästi suurempi leesioihossa kuin terveessä ihossa. Aurinkokeratoosissa C3c:n prosenttiosuus oli leesioihossa (50.5±17.7 %) hieman suurempi verrattuna terveeseen ihoon (40.7±17.7 %), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkittävä. Levyepiteelisyövän kohdalla tulokset olivat samat sekä terveessä että leesioihossa (terve iho 53,1±15,1 %, leesioiho 54,4±17,5 %). Levyepiteelisyövässä ja sen esiasteena pidetyssä aurinkokeratoosissa ei havaittu merkittävää eroa syöttösolun C3c:n ilmentymisessä leesio- ja terveen ihon välillä. Sen sijaan sekä psoriaasissa että tyvisolusyövässä syöttösolun C3c ilmentyi merkittävästi enemmän leesioihossa kuin terveessä ihossa. Löydös osoittaa, että eri ihotautien ja ihosyöpien välillä on eroavuuksia. Mahdollisesti levyepiteelisyövässä on tekijöitä, jotka estävät C3:n ilmentymistä syöttösoluissa. 3

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND Faculty of Health Sciences Institute of Clinical Medicine Dermatology and Venereology Abstract Laitala Joel: The expression of complement C3 in mast cells in keratinocyte skin carcinomas and psoriasis. Thesis; 26 pages Advisors: Professor Ilkka Harvima, Lic. Med. Salla Haimakainen October 2018 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Keywords: Complement protein C3, mast cell, tryptase, keratinocyte carcinomas, psoriasis The purpose of the research was to study the expression level of complement C3c in mast cells in basal cell carcinoma (BCC), squamous cell carcinoma (SCC), actinic keratosis (AK) and psoriasis by using enzyme- and immunohistochemical double-staining technique. Previous studies have shown that locally produced complement proteins, such as C3, can markedly be involved in the development of SCC. The frozen skin samples used in this study had been collected previously. The skin samples included psoriasis, BCC, AK and SCC. These samples were analyzed for the percentage of mast cells containing C3c immunoreactivity using the double-staining technique. First, tryptase was stained enzymehistochemically resulting in mast cells with red azo dye. After photographing the dye was dissolved away with 15% Tween 20 solution followed by immunohistochemical staining of C3c. This staining produced cells with black color. After the immunohistochemical staining, the same sections were photographed again at exactly the same sites using a camera connected to the microscope. The micrograph pairs were analyzed on the computer screen for the percentage of mast cells containing C3c in the nonlesional and lesional skin in the diseases examined. The results showed that in psoriasis (nonlesional skin 45.3±16,8 %, lesional skin 56.1±9,1 %, mean±standard deviation) and BCC (nonlesional skin 62.6±13.7 %, lesional skin 83.3±11.9 %) the percentage of C3c + mast cells was significantly higher in the lesional than nonlesional skin. In AK, the percentage of C3c + mast cells was slightly higher in the lesional (50,5±17,7 %) than nonlesional skin (40,7±17,7 %), but the difference was not statistically significant. In the case of SCC, the percentage values were approximately the same in both the nonlesional and lesional skin (nonlesional skin 53,1±15,1 %, lesional skin 54,4± 17,5 %). In AK and SCC, no significant difference was observed in the percentage of C3c + mast cells between the lesional and nonlesional skin. Instead, in BCC and psoriasis the percentage of C3c + mast cells was significantly higher in the lesional than nonlesional skin. The finding shows that there are differences between skin diseases and skin cancers. It is possible that there are factors in SCC that inhibit the expression of C3 in mast cells. 4

Sisältö...5 1 Johdanto.. 7 2 Ihon rakenne ja tehtävät... 8 3 Psoriaasi...10 Yleisyys.10.1 Syyt ja riskitekijät.10.2 Ilmeneminen 10.3 4 Aurinkokeratoosi...11 Yleisyys..11.1 Syyt ja riskitekijät...11.2 Ilmeneminen...11.3 5 Tyvisolusyöpä...12 Yleisyys...12.1 Syyt ja riskitekijät....12.2 Ilmeneminen...12.3 6 Levyepiteelisyöpä 13 Yleisyys...13.1 Syyt ja riskitekijät...13.2 Ilmeneminen...13.3 7 Syöttösolut......14 Syöttösolut osana puolustusjärjestelmää....14.1 Erilaiset syöttösolut...14.2 Aktivaation säätely.....14.3 8 Komplementtijärjestelmä ja C3....15 Mikä on komplementtijärjestelmä..15.1 Aktivaatio...15.2 9 Aineisto ja menetelmät.. 16 Syöttösolujen tryptaasin värjäys......16.1 Värin poisto syöttösoluista....16.2 Immunohistokemiallinen C3c värjäys...16.3 10 Tulokset. 19 11 Pohdinta. 23 12 Johtopäätökset...24 13 Lähteet...25 14 Liitteet ja taulukot.....26 5

Johdanto Komplementtisysteemi on osa luonnollista immuunijärjestelmää ja se toimii ensimmäisen linjan tekijänä vieraiden patogeenien torjunnassa. Se myös edistää muiden immunologisten kudosten toimintaa. Komplementtiproteiinit tuotetaan pääosin maksassa, mutta lisäksi tiedetään komplementtiproteiineja, jotka tuotetaan paikallisesti kudoksissa. Paikallisesti tuotetuilla komplementtiproteiineilla tiedetään olevan tärkeitä solutason tehtäviä. Tutkimusten mukaan komplementtisysteemin osatekijät, kuten C3, voivat olla merkittäviä tekijöitä ihon levyepiteelisyövän kehittymisessä [1]. Aiempien tutkimusten mukaan eristetyt ihon syöttösolut voivat ilmentää komplementti C3:a ja C5:tä, joten ne voivat säädellä immuniteettia ja tulehdusreaktiota paikallisesti [2]. Syöttösoluilla onkin merkittävä rooli ihon immuunijärjestelmän säätelyssä ja on arveltu, että nämä solut edistävät ihosyövässä immunosuppressiivista ympäristöä ja siten syövän kasvua [3]. Ihosyöpä on valkoihoisen väestön yleisin syöpätyyppi ja sen ilmaantuvuus on kasvanut hälyttävän nopeasti kaikkialla länsimaissa. Jo noin joka kolmas uusista syöpätapauksista on nimenomaan ihosyöpä. Suomen Syöpärekisterin huhtikuussa 2015 päivitetyn tilaston mukaan ihosyöpien määrä on lisääntynyt 1960-luvun lopulta noin 9-kertaiseksi (Kuva 1). Myös muiden syöpien osuus on kasvanut, mutta vain 2,6-kertaiseksi samalla aikavälillä. Uusien ihosyöpätapausten kasvun arvellaan johtuvan väestön vanhenemisesta, mutta myös immunosupressiivisten lääkkeiden lisääntyneestä käytöstä ja ihon lisääntyneestä altistumisesta auringon ultraviolettivalolle. Tapauksia on todennäköisesti enemmänkin, koska kaikki ihosyöpätapaukset eivät tule kirjatuiksi syöpärekisteriin, mitä tapahtuu erityisesti tyvisolusyövän kohdalla. Samalla potilaalla voi myös olla useita ihosyöpiä. Useilla tällaisilla potilailla on aurinkovaurioita iholla tai immuunivaje. Levyepiteelisyövän varhaisvaiheita, kuten hyvin yleistä aurinkokeratoosia, ei tilastoida lainkaan, joten niiden merkitystä terveydenhuoltojärjestelmän kuormituksessa aliarvioidaan [4]. Tämän taustan vuoksi Suomen ihotautien alan professorit ovat Suomen Lääkärilehden 7/2016 tiedepääkirjoituksessa kiirehtineet kansallisen ihosyöpäohjelman käynnistämistä, jotta kuvassa 1 esitetyt ilmaantuvuusluvut saadaan käännetyksi laskuun. Koska uusia ihosyöpätapauksia ilmaantuu jatkuvasti, kaikki ihosyövän patogeneesiin paneutuvat Uusien tilastoitujen ihosyöpätapausten määrä Suomessa 1967-2013 [Kuva 1]. 6

tutkimukset ovat tarpeellisia mietittäessä uusia hoitoja ihosyöpien torjumiseksi [4]. Tämän vuoksi tässä työssä tutkittiin C3:n ilmentymistä syöttösoluissa erilaisissa ihotaudeissa ja ihosyövissä. Ihon rakenne ja tehtävät Iho koostuu kahdesta pääkerroksesta, orvaskedestä eli epidermiksestä ja verinahasta eli dermiksestä. Epidermiksessä on useita solukerroksia, joista jokaisella on omanlaisiaan tehtäviä. Päällimmäisenä on stratum corneum, joka on keratinisoitunutta epiteeliä Ihon eri kerrokset:epidermis, dermis sekä ihon alainen rasvakudos eli subkutis [Kuva 2] [5,6,7]. Keratiinikerroksen paksuus riippuu ihoon kohdistuvasta kulutuksesta ja joissakin paikoissa keratiinikerros puuttuu lähes kokonaan. Epidermiksen alimmassa Ihon eri kerrokset:epidermis, dermis sekä ihon alainen rasvakudos eli subkutis [Kuva 2] solukerroksessa (tyvisolukerros eli stratum basale) epidermis uusiutuu ja kypsät solut alkavat siirtyä pintaa kohden. Okasolukerroksessa (stratum spinosum) soluja pitää toisissaan kiinni desmosomit, jotka ovat liitosproteiineja [5,8,9]. Samat desmosomit löytyvät ihosta peräisin olevista metastaaseista, joista voidaan päätellä lähtökudos. Pohjalta nousevista soluista tumat alkavat hävitä ja ne keratinisoituvat. Tyvisolukerroksessa sijaitsevat lisäksi melanosyyttisolut, jotka tuottavat melaniinia. Melaniinin tehtävänä on muodostaa tumien päälle melaniinikerros, joka suojaa ultraviolettisäteilyn mutageenisiltä vaikutuksilta. Tyvisolukerroksen alla on tyvikalvo, joka toimii tyvisolukerroksen kiinnittymispintana ja erottaa epidermiksen dermiksestä. Ihon ulkopuolelle esille tulevat karvat ja kynnet ovat ihon solujen erityisrakenteita[8,9] Dermis koostuu sidekudoksesta, verisuonista, hermoista ja imusuonista, tali- ja hikirauhasista ja karvatupista. Tärkeimmät soluväliaineen komponentit ovat kollageenit ja elastiini, jotka antavat dermikselle ja koko iholle sille ominaisen kimmoisuuden ja vetolujuuden. Dermiksessä on fibroblastien lisäksi syöttösoluja, makrofaageja sekä lymfosyyttejä. Dermiksessä olevilla hermopäätteillä aistitaan lämpöä, painetta, kipua, kosketusta, kutinaa ja tärinää. Lisäksi dermiksessä olevat hiki-ja talirauhaset saavat hermotuksen autonomisesta hermostosta ja ne osallistuvat elimistön säätelytehtäviin [5,8,9]. Hikirauhaset toimivat lämmönsäätelyssä haihduttamalla niiden erittämää nestettä ihon pinnalta ja talirauhaset tekevät ihon pinnan liukkaaksi ja vettä hylkiväksi. Tämä ominaisuus suojaa ihoa myös kuivumiselta. Suurempia apokriinisia hikirauhasia löytyy kainaloista ja nivusista. Näiden tarkkaa merkitystä ei tiedetä, mutta ne tuottavat yksilölle tyypillisen hajun. Dermiksen verisuonet toimittavat ihon soluille happea, mutta lisäksi huolehtivat lämmönsäätelystä supistamalla tai laajentamalla verisuonia. Dermiksessä karvatuppien yhteydessä on karvankohottajalihakset, jotka toimivat autonomisen hermoston kautta. Niiden käytännön merkitys on kuitenkin vähäinen [9]. Subkutis sijaitsee dermiksen alla ja se on pääasiassa rasvakudosta. Rasva toimii eristeenä, rasvavarastona, siteenä erilaisten kudosten välillä ja lisäksi se suojaa elimistöä iskuilta [5,8,9]. 7

Histologinen kuva ihosta, josta erotettavissa paksu keratiinikerros, epidermis, tyvikalvo ja dermis [Kuva 3]. Psoriaasi Yleisyys Ihopsoriaasia on suomessa noin 100 000:lla eli noin kahdella prosentilla suomalaisista [9,10]. Suurimmalla osalla (95%) on lievä tai keskivaikea tauti. Taudin diagnoosi tehdään usein pelkän kliinisen kuvan perusteella. Taudin kulkuun kuuluu rauhallisten ja oireilevien kausien vaihtelu [9]. Syyt ja riskitekijät Epidermiksen kerrokset eriteltynä [Kuva 4]. Psoriaasi on krooninen sekä immunologinen tulehdustauti, joka on osittain perinnöllinen ja jonka syntyyn tarvitaan ympäristötekijä. Ympäristötekijä voi olla esim. Streptococcus pyogenes -bakteerin aiheuttama nielutulehdus pisarapsoriaasissa. Patogeeni saa aikaan ihossa T-soluvasteen, joka sitten kroonistuu. Tulehdustila kiihdyttää keratinosyyttien jakautumista ja siten niiden erilaistuminen jää vajaaksi. Orvaskesi paksuuntuu, hilseilee ja dermispapillat pidentyvät. Hilseen raapiminen saa aikaan pientä verenvuotoa, koska papillojen pienet verisuonet ulottuvat lähelle pintaa [9,11]. Ympäristön patogeenien lisäksi haitallisia ovat alkoholin liikakäyttö, tupakointi, stressi ja infektiot (esim. hammasinfektiot). Lääkkeistä tunnettuja ovat litium, Tyypillinen psoriaasileesio [Kuva 5]. klorokiini ja beetasalpaajat. Psoriaatikoilla on muuta väestöä useammin sepelvaltimotauti, verenpainetauti, ylipainoa, diabetes, dyslipidemia, rasvamaksa ja masentuneisuutta [9,11] Ilmeneminen Pisarapsoriaasia esiintyy eniten nuorilla ihmisillä ja se on tyypillisesti nopeasti etenevä tauti. Juuri pisarapsoriaasin voi laukaista streptokokkitonsilliitti. Pisarapsoriaasia esintyy useimmiten vartalon alueella. Läiskäpsoriaasi on yleisin muoto, johon kuuluu tarkkarajaisia ja tiukkahilseisiä plakkeja päänahassa, kyynärpäissä, polvissa, pakaroissa sekä säärten etuosassa [9]. Muita muotoja ovat 8

taivepsoriaasi, märkärakkulainen psoriaasi, nivelpsoriaasi ja erytroderminen psoriaasi. Psoriaasia esiintyy myös kynsissä. Aurinkokeratoosi Yleisyys Aurinkokeratoosi eli aktiininen keratoosi on yleinen ihomuutos yli 60- vuotiailla. Aktiininen keratoosi on nykyään luokiteltu in situ tasoiseksi karsinoomaksi ja sitä pidetään levyepiteelisyövän varhaisvaiheena [12,13]. Arviolta noin joka neljäs aktiininen keratoosi paranee itsestään. Tarkkaa esiintyvyyttä ei Suomessa tiedetä, koska tapauksia ei tilastoida. Aktiinisen keratoosin kehittyminen levyepiteelisyöväksi vie vuosia, yleensä yli 15 vuotta [12,14]. Syyt ja riskitekijät Aktiinisessa keratoosissa on paljon erilaisia riskitekijöitä, joista kaikkein yleisimmät ovat ihon runsas altistuminen auringon UVsäteilylle sekä vaalea ihonväri. Ihon palaminen on lisäksi yksi riskitekijä. Muita keratoosia aiheuttavia tekijöitä ovat muun muassa solariumin käyttö, ionisoiva säteily, tupakointi, voimakas immunosupressio, immuunipuutostilat, perinnölliset ihotaudit ja altistuminen karsinogeeneille ulkoisesti, kuten esimerkiksi kemikaaleille [12,13]. Ilmeneminen Histologinen kuva psoriaasista. Pinnalla näkyy hilseilevä keratiini ja dermiksestä pintaa kohti kohonnut papilla [Kuva 6]. Histologinen kuva aurinkokeratoosista, jossa hilseilevä keratiinikerros sekä dysplastinen solukko [Kuva 7]. Aktiinista keratoosia esiintyy alueilla, jotka altistuvat runsaasti auringolle, kuten esimerkiksi kasvot, korvalehdet, käsivarret ja kädenselät. Myös muualla esiintyy aurinkokeratoosia kuten vartalolla, hartioissa, yläselässä ja säärissä. Tyypillisesti keratoosia löytyy keski-ikäisten ja sitä vanhempien ihmisten iholla. Monesti näillä henkilöillä on vaalea tai punertava iho [13]. Aurinkokeratoosia voi myös esiintyä huulissa, joissa se esiintyy hilseilevänä alueena tai kroonisena haavana [13]. Aktiinisen keratoosin ilmestyminen on merkkinä siitä, että ihon sietokyky auringonvalolle on ylittynyt koko elinkaaren aikana. Yhden keratoosiläiskän riski on pieni, mutta monen läiskän yhteenlaskettu ihosyöpäriski on jo huomattava. Keratoosi johtaa yleensä ennen kaikkea levyepiteelisyöpäriskiin, mutta myös tyvisolusyöpien kehittymiseen. Aktiinista keratoosia on pyrittävä hoitamaan, sillä sen muututtua levyepiteelisyöväksi se voi alkaa metastasoida. Tyypillinen keratoosiläiskä on hilseilevä, punoittava ja karhea pyöreähkö alue [13]. Alueiden koko vaihtelee millimetreistä senttimetreihin. 9

Basaliooma (tyvisolusyöpä, BCC) Yleisyys Tyvisolusyöpä eli basaliooma on yleisin kaikista pahanlaatuista ihokasvaimista. Suomessa basalioomatapauksia todetaan keskimäärin noin 8500 tapausta vuosittain, joista naisia on enemmän kuin miehiä [12]. Syöpien määrä on suurempi, koska kaikkia basalioomia ei raportoida sekä lisäksi samalta potilaalta tilastoidaan vain yksi basaliooma vuosittain ja vain yksi basaliooma samalta ihoalueelta koko elämän ajalta [15,16]. Tapauksia arvioidaan Ihon pinnalta otettu kuva aurinkokeratoosista [Kuva 8]. olevan 12000 14000 kappaletta vuodessa [10]. Keskimäärin siihen sairastuneet ovat yli 50-vuotiaita [10]. Basaliooman yleisyys kasvaa iän myötä ja niin ollen väestön vanhentuessa niiden määrä lisääntyy [15,16]. Basaliooma kehittyy hitaasti ja UV-säteilylle altistumisen jälkeen kuluu noin 20 30 vuotta, kun syöpä kehittyy. Syyt ja riskitekijät Basaliooma esiintyy ihoalueilla, jotka ovat altistuneet auringon UV-säteilylle. Tällaisia tyypillisiä alueita ovat esimerkiksi kasvot, päälaki, nenän ja silmien ympäristö ja ylävartalo. Basaaliomassa taudin syntyyn vaikuttaa pääasiassa saadun UV-säteilyn määrä ja satunnainen palaminen. Hoitamaton basaliooma aiheuttaa kivuttomia haavaumia ja kudostuhoja, jotka voivat johtaa esimerkiksi nenän menetykseen [14]. Ilmeneminen Nodulaarinen (kyhmyinen) dermikseen levinnyt basaliooma [Kuva 9]. Pinnallisen ja kyhmyisen tyvisolusyövän tunnistaa melko helposti kasvaimen ulkonäön perusteella. Se on haavautuva tai ehytpintainen kasvain [17]. Kasvain syntyy epidermiksen kantasoluista ja se pyrkii kasvamaan jatkuvasti ja monesti pienestä hoitamattomasta täplästä voi tulla kymmenenkin senttimetrin kasvain[17]. Diagnoosi voidaan varmistaa mikroskooppitutkimuksella. Basalioomassa ei yleensä tule etäpesäkkeitä ja sen vuoksi ennuste on erinomainen. Kasvaimet voivat silti uusiutua. Basalioomat voidaan leikkauksella saada kerralla pois [17]. Histologisesti basaliooma ilmenee dermiksen puolelle levinneenä selkeänä normaalista histologiasta poikkeavana kasvustona ja ne Pinnallinen ihon basaliooma [Kuva 10]. voidaan jakaa eri tyyppeihin jotka ovat nodulaarinen, mikronodulaarinen, pinnallinen, infiltroiden kasvava, sklerosoiva sekä välimuotoinen karsinooma [14,17]. Välimuotoinen karsinooma muistuttaa levyepiteelisyöpää. Vartalolla kasvaimet ovat usein pinnallista tyyppiä ja kasvojen alueella yleensä nodulaarisia [17]. Tuumorisolujen tumissa on nähtävissä merkittävä tuma-atypiä verrattuna normaaleihin soluihin. Kasvainkudoksessa näkyy lisäksi mitooseja ja polariteetin puuttumista [14]. 10

Levyepiteelisyöpä (okasolusyöpä, SCC) Yleisyys Levyepiteelisyöpä on ihon okasolujen pahanlaatuinen kasvain. Suomessa näitä diagnosoidaan vuosittain noin 1000-1500 lähteestä riippuen [17,18]. Levyepiteelisyöpä on kohtalaisen vaaraton, mutta osa nopeasti kehittyvistä syövistä voi lähettää etäpesäkkeitä. Elinsiirtopotilailla tauti on usein aggressiivinen. Tautia tavataan eniten iäkkäillä potilailla [18]. Syyt ja riskitekijät Kuten edellisissäkin ihosyövissä, myös tässäkin on auringon ultraviolettisäteilyllä suuri merkitys. Levyepiteelisyöpä ilmestyy useimmiten auringon vaurioittamille ihoalueille ja se alkaa aktiinisesta keratoosista tai Bowenin taudista, jotka ovat levyepiteelisyövän varhaisvaiheita [18]. Bowenin tauti tarkoittaa in situ -tasoista ihosyöpää, joka on koko orvaskeden kattava ihosyöpä. Okasolusyöpä voi ilmaantua alueelle, joka näyttää terveelle tai voi alkaa myös vuosia auki olleesta haavasta [18]. Pitkäaikainen immunosupressiivinen hoito voi myös altistaa okasolusyövälle, kuten esimerkiksi elinsiirtopotilailla [17,19,20]. Ilmeneminen Okasolusyöpä on luonteeltaan invasiininen ja se pyrkii työntymään epidermiksestä dermiksen alueelle. Kuten karsinoomille on luontaista, se pyrkii leviämään imusolmukkeiden kautta. Ihon okasolusyövissä metastasointi on kuitenkin harvinaisempaa kuin muissa kudoksissa [18]. Okasolusyöpä voi olla pinnaltaan karstaista ja muistuttaa aurinkokeratoosia. Muutamassa kuukaudessa voi ihon pinnalle tulla haavautuva näppylä. Sen läpimitta on yleensä 1-3 senttimetriä, mutta voi olla laajempikin [17,19,20]. Lisäksi syöpä voi olla ulkonäöltään sarveistuva ihosta ulkoneva kasvain [17]. Okasolusyöpää tavataan kasvoissa, päänahassa, käsissä ja pitkäaikaisessa haavassa [19,20]. Levyepiteelikarsinooma ihon pinnalla [Kuva 11]. Syöttösolut (mastsolut) Histologinen kuva levyepiteelikarsinoomasta [Kuva 12]. Syöttösolut osana puolustusjärjestelmää 11

Syöttösoluja on pääasiassa ihossa, hengitysteiden ja ruoansulatuskanavan limakalvossa, sydämen oikeassa eteisessä ja keuhkokudoksessa sekä harvakseltaan sidekudoksessa kaikkialla elimistössä, lähinnä verisuonten, hermojen ja imusuoniston ympärillä [21,22,23,24]. Mastsolujen ajatellaan kuuluvan olennaisena osana immuunijärjestelmään [22,23,24]. Syöttösolujen tehtävä on suojata elimistöä parasiitteja ja vierasaineita kohtaan [21,22]. Niillä on huomattu olevan merkitystä myös bakteeri-infektioissa [21]. Syöttösolujen solulimassa on paljon jyväsiä, jotka sisältävät hepariinia ja tulehdusta aiheuttavia aineita, kuten histamiinia, sytokiinejä ja proteolyyttisiä entsyymejä [21,22]. Solut vapauttavat nämä aineet allergisessa reaktiossa ja tulehdusreaktioiden yhteydessä, kun mastsolun pinnan FcɛRI-reseptoriin sitoutuneet IgE-vasta-aineet reagoivat antigeenin kanssa [21,22]. Solun aktivoiduttua muodostuu muitakin välittäjäaineita, kuten prostaglandiineja ja leukotrieeneja. Syöttösolut tuottavat runsaasti erilaisia sytokiineja, kemokiineja ja kasvutekijöitä sekä ilmentävät solukalvolla erilaisia reseptoreita ja ligandeja, jotka kaikki säätelevät immuunijärjestelmää joko tulehdusta edistämällä tai sitä vaimentamalla [3]. Myös basofiilisillä granulosyyteillä on samanlaisia vaikutusmekanismeja, mutta niiden sijainti on verenkierrossa. Vapautetut aineet houkuttelevat paikalle muita puolustusjärjestelmän soluja [21]. Mastsolu syntyy esiasteena luuytimen hematopoieettisesta CD34 + -solusta, joka vaeltaa kohdekudokseen ja erilaistuu siellä kypsäksi mastsoluksi kudostekijöiden vaikutuksesta. Erilaiset syöttösolut Syöttösolut muodostavat heterogeenisen solupopulaation. Ne jaetaan yleensä jyvästen sisältämien proteinaasien perusteella tryptaasia ja kymaasia sisältäviin TC-syöttösoluihin sekä pelkästään tryptaasia sisältäviin T-syöttösoluihin. TC-syöttösoluja esiintyy sidekudoksessa, kuten ihossa, ja T-syöttösoluja limakalvoilla ja keuhkoissa. Ne toimivat allergisissa reaktioissa, parasiitti-infektioissa ja niitä tavataan aktivoituneiden T-lymfosyyttien lähellä. Juuri tryptaasin värjäykseen perustuu leikkeistä tehdyt värjäykset [21]. Aktivaation säätely Syöttösoluja värjättyinä [Kuva 13]. Syöttösoluja säädellään tarkasti, sillä hallitsematon aktivaatio voi olla hengenvaarallinen [21]. Syöttösolujen vapauttamat histamiini ja vasoaktiiviset aineet voivat saada aikaan pahimmassa tilanteessa verisuoniston permeabiliteetin kasvun ja shokin, kuten vakavassa allergisessa reaktiossa. Pääasiassa syöttösolun aktivaatio tapahtuu edellä mainitusti antigeenin sitouduttua syöttösolun pinnan lge-vasta-aineeseen [21,22,23,24]. Syöttösoluja aktivoivat myös monet muutkin mekanismit, kuten komplementtijärjestelmän anafylatoksiinit C5a ja C3a, joiden on todettu olevan syöttösolujen aktivaattoreita [2,21]. Lisäksi syöttösoluja aktivoivat mm. lipopolysakkaridit, joita on erityisesti bakteereiden kapselirakenteessa, sekä jotkut lääkeaineet, kylmyys, mekaaninen paine, sekä neuropeptidinä toimiva substanssi P [21]. Komplementtijärjestelmä Mikä on komplementtijärjestelmä Komplementtisysteemiä tarvitaan mikrobien tuhoamisessa ja se kuuluu luonnolliseen immuniteettiin. Komplementtiin kuuluu noin 35 molekyyliä, joilla on paljon erilaisia tehtäviä. 12

Järjestelmä voi toimia itsenäisesti tai olla osa hankittua immuniteettia [1,25,26]. Komplementin päätehtävä on vieraiden ja viallisten tai vaurioituneiden omien rakenteiden opsonointi molekyyleillä, kuten C1q, C4b, C3b tai ic3b. Opsonoidut mikrobit fagosytoidaan pois sen jälkeen, kun ne on merkitty komplementin proteiineilla. Opsonointia käytetään myös elimistön jätteiden poistoon. Tulehdusreaktioon osallistuvat komplementtiproteiineista erityisesti C5a, C3a ja C5b-9, joista jälkimmäinen myös osallistuu bakteerien tuhoamiskompleksin muodostamiseen. Edellä mainitut anafylatoksiinit C3a ja C5a supistavat sileitä lihaksia, vapauttavat syöttösoluista välittäjäaineita sekä lisäävät verisuonten permeabiliteettia [25,26]. Aktivoituminen Komplementti aktivoituu kolmea reittiä, jotka ovat klassinen, lektiini- ja oikotie. Klassinen tie käynnistyy, kun vasta-aine sitoutuu antigeeniinsa. Se on olennainen osa luonnollista ja hankittua immuniteettia. Mikrobin pintaan sitoutunut C1- proteiini saa aikaan seuraavien komponenttien muodostumisen ja kaskadi etenee vesiputousmaisesti (kuva 14). CRP-proteiini voi myös aktivoida klassista tietä sitoutumalla solukalvojen fosfolipideihin [25,26]. Lektiinitie on hyvin samanlainen kuin klassinen tie, mutta olennaisena osana Kaavakuva komplementtijärjestelmästä [Kuva 14]. reittiin kuuluu mannoosia sitova lektiini, joka laukaisee signaalireitin sitoutumalla mikrobin seinämään [25,26]. Oikotiessä patogeenin pintarakenteet voivat laukaista komplementtijärjestelmän. Nämä reitit yhdistyvät loppupäästään ja muodostavat soluntuhoamiskompleksin, jota voidaan esimerkiksi käyttää bakteerien rakenteita vastaan [25,26]. Komplementtijärjestelmän konvertaasit muuttavat proteiineja eri alayksiköiksi; esimerkiksi C3:sta muodostetaan C3a:ta ja C3b:tä [26]. Komplementti C3c on C3:n hajoamisesta muodostuva alayksikkö, joka on myös osa C3b:tä. Aineisto ja menetelmät Tutkimusta varten oli aiemmin kerätty ihonäytteitä psoriaasista, tyvisolusyövästä, aurinkokeratoosista ja levyepiteelisyövästä [27]. Psoriaasipotilaita (ikä 41-85 vuotta, miehiä 5 ja naisia 3) oli yhteensä kahdeksan, tyvisolusyöpäpotilaita (ikä 55-91 vuotta, miehiä 9 ja naisia 2) yksitoista, aurinkokeratoosipotilaita (ikä 68-86 vuotta, miehiä 4 ja naisia 3) seitsemän ja levyepiteelisyöpäpotilaita (ikä 60-85 vuotta, miehiä 6 ja naisia 3) yhdeksän. Levyepiteelisyöpäpotilaista neljällä oli bowenin tauti (carcinoma in situ) ja viidellä 13

levyepiteelikarsnooma (gradus 1). Näytteet otettiin iholeesiosta sekä terveestä ihosta vähintään kahden senttimetrin etäisyydellä toisistaan. Ihonäytteet otettiin eripuolilta potilaan kehoa paikallispuudutuksessa käyttäen lidokaiini-adrenaliini-puudutetta. Biopsian oton jälkeen näytteet upotettiin OCT-liuokseen (optimal cutting temperature medium, Miles Scientific, Naperville, IL) ja jäädytettiin isopentaani-etanoli-liuoksessa kuivajään avulla. Tutkimuksessa laskettiin C3c-immunopositiivisten syöttösolujen prosenttiosuus kokonaissyöttösoluista käyttäen peräkkäistä entsyymi-ja immunohistokemiallista kaksoisvärjäystekniikkaa [27]. Menetelmässä ensiksi värjättiin entsyymihistokemiallisesti syöttösolun tryptaasi, minkä jälkeen värjätyt leikkeet valokuvattiin käyttäen 20-kertaisesti suurentavaa objektiivia ja mikroskooppiin kytkettyä kameraa. Punainen atsoväri poistettiin käyttäen yön yli inkubointia 15% Tween-liuoksessa. Sen jälkeen leikkeet kiinnitettiin kylmässä asetonissa ja värjättiin immunohistokemiallisesti käyttäen 0.75 µg/ml kanin polyklonaalista anti-c3c vastaainetta (koodi A0062, Dako Denmark A/S, Glostrup, Tanska) sekä vasta-aineen leimaamisessa kaupallista Vectastain Elite ABC kit:iä (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Immunohistokemiallisen värjäyksen jälkeen leikkeet jälleen kuvattiin tarkalleen samoista kohdista kuin edellisessä valokuvauksessa. Värjäyksen spesifisyys varmistettiin käyttäen kanin IgG-liuosta korvaamaan primäärivasta-aine samassa pitoisuudessa. Menetelmä on myös kuvattu tuoreessa artikkelissa [28]. Tutkimuksessa analysoitiin mikroskoopilla otettuja parittaisia valokuvia, jotka olivat kuvattu histokemiallisten värjäysten eri vaiheissa. Kuvia oli noin 1500 kappaletta, joista noin 560 kuvaa analysoitiin. Jokaisesta potilaasta oli leesio- sekä terveen ihon näyte, kustakin noin 20-30 kuvaa, joista valittiin 10 kuvaparia molemmista kategorioista. Vertailemalla kuvapareja vierekkäin tietokoneen näyttöruudulla todettiin C3c-immunovärjäyksen paikantuminen tryptaasi-positiivisiin syöttösoluihin. Vertailukuvat jokaisesta näytteestä löytyvät sivuilta 32 ja 33 (kuvat 15,16,17 ja 18). Tämän jälkeen laskettiin syöttösolujen kokonaislukumäärä sekä C3c-positiivisten syöttösolujen lukumäärä. Tulos ilmoitettiin C3c-positiivisten syöttösolujen prosenttiosuutena kokonaissyöttösoluista kyseisessä kuvaparissa. Lisäksi jokaisesta tutkitusta kuvaparista arvioitiin muiden solujen värjäytyvyys asteikolla 1-3. Kaikista lasketuista C3c-prosenttiosuuksista laskettiin lopuksi kyseisen ihonäytteen keskiarvo. Myös muiden solujen määrien keskiarvo laskettiin. Samaa menetelmää ja tarkkuutta käytettiin koko laskemisen ajan. Solujen laskeminen kesti noin viisi kuukautta. Saadut tulokset kirjattiin Excel-taulukkoon ja sen avulla suoritettiin myös tilastolliset testit. Menetelmän kuvaus 1. Entsyymihistokemiallinen värjäys syöttösolun tryptaasille Kemikaalit - Substraatin kantaliuos: Z-Gly-Pro-Arg-4-metoksi-2-naftyyliamidi (-MNA) (koodi J-1120, Bachem, Bubendorf, Sveitsi), joka liuotettiin 20 mm:n pitoisuuteen käyttäen dimetyyliformamidia. Liuosta säilytettiin - 20 ºC:ssa pakastimessa. - Kromogeenin kantaliuos: Fast Garnet GBC (koodi F-6504, Sigma, Saint Louis, USA), joka liuotettiin deionisoituun veteen. Liuos jaettiin pienempiin eriin ja säilytettiin - 20 ºC:ssa pakastimessa. 14

- Liuotin: Dimetyyliformamidi (DMF) (koodi 3053, Merck, Darmstadt, Germany). - Puskuriliuos: Trizma Base (koodi T-1503, Sigma, Saint Louis, USA), josta tehtiin 0.5 M liuos ja ph säädettiin 7.5:ksi käyttäen suolahappoliuosta. - Inhibiittorin kantaliuos: α1-antitrypsiini (koodi A-6150 / A-9024, Sigma, St. Louis, USA), joka liuotettiin deionisoituun veteen, jaettiin pienempiin eriin ja pakastettiin - 20 ºC:een. α1- Antitrypsiiniä valmistettiin 2 mg/ml pitoisuus. - Kiinnitysliuos: Asetoni (koodi 00570, Fluka, Milwaukee, USA). -Peitinaine: Aquatex (koodi 363123S, Merck, Darmstadt, Germany). Substraattiliuos Värjäyksessä käytetyn substraattiliuoksen koostumus oli seuraava: 1 mm Z-Gly-Pro-Arg-MNA, 0.5 mg/ml Fast Garnet GBC, 0.5 mg/ml α1-antitrypsiini, ja 0.5 M Tris-HCl, ph 7.5. Ensin jääleikkeet kiinnitettiin kylmällä asetonilla 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen leikkeet ilmakuivattiin saman ajan. Ilmakuivauksen jälkeen leikkeiden päälle lisättiin 200 µl sentrifugoitua substraattiliuosta, ja objektilaseja leikkeineen inkuboitiin kosteassa kammiossa ja huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. Inkubaation jälkeen leikkeet huuhdeltiin nopeasti deionisoidulla vedellä ja sen jälkeen lisättiin peitinaine ja peitinlasi. Värjäyksen lopputuloksena syntyi kirkkaanpunainen väri syöttösoluihin, mutta väri alkoi nopeasti kokkaroitua ja sakkautua. Tämän vuoksi peitinlasien asettamisen jälkeen leikkeet kuvattiin välittömästi. Vaihe suoritettiin jokaisen leikkeen kohdalla kaikissa ihotaudeissa ja ne värjääntyivät, kuten esimerkkikuvissa esitellään (kuvat 15a,16a,17a ja 18a). 2. Värin poisto Kemikaalit - Deionisoitu vesi - Tween 20 (koodi 93773, Fluka, Milwaukee, USA), joka laimennettiin 15%:n pitoisuuteen käyttäen deionisoitua vettä. Valokuvaamisen jälkeen peitinlasit poistettiin objektilaseilta laittamalla lasit likoamaan deionisoituun veteen. Tämä toimenpide irrottaa peitinlasit objektilaseilta itsestään. Objektilasit huuhdeltiin deionisoidulla vedellä peitinaineen poistamiseksi ja niille tehtiin kevyt ilmakuivaus. Värinpoistoa varten objektilasit asetettiin 15 % Tween 20 liuokseen yön ajaksi. Seuraavana päivänä Tween 20 liuos huuhdeltiin pois deionisoidulla vedellä ja lasit ilmakuivattiin kevyesti. Tämän jälkeen todennettiin mikroskoopilla, että väri oli poistunut ja voitiin siirtyä seuraavaan vaiheeseen immunohistokemiallista värjäystä varten. 3. Immunohistokemiallinen värjäys C3c:lle Kemikaalit 15

-Deionisoitu vesi -Kiinnitysliuos: Asetoni (koodi 00570, Fluka, Milwaukee, USA). -Leikkeiden värjäys: Kanin primääri polyklonaalinen anti-c3c vasta-aine (koodi A0062, Dako Denmark A/S, Glostrup, Tanska). -Normaali vuohen seerumi (koodi PK-6101, Vector, Burlingame, USA). -Sekundäärivasta-aine: Biotinyloitu vuohen anti-kani-igg, joka kiinnittyy primääriin polyklonaaliseen vasta-aineeseen (koodi PK-6101, Vector, Burlingame, USA). -Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ylimääräisen kemikaalin poistamiseen. -Vetyperoksidi endogeenisen peroksidaasin estämiseen (koodi 31642, Riedel de Haen, Seelze, Germany). -Sekundäärivasta-aineessa olevaan biotiiniin kiinnittyvä entsyymi-kompleksi: Valmistetaan kitin mukana tulleista kahdesta komponentista A ja B (koodi PK-6101, Vector, Burlingame, USA) sekä fosfaattipuskuroidusta suolaliuoksesta (PBS). -Yhdistelmäliuos (0.05 % diaminobentseeni + 0.8 % Nikkelikloridi + 3 % Vetyperoksidi + 0.05M PBS). Yhdistelmäliuos valmistetaan seuraavista kantaliuoksista: 90 ml 0.05M PBS, 500 µl 8% nikkelikloridi, 100 µl 30% vetyperoksidi sekä 10 ml 0.5% diaminobentsidiini. -Peitinaine: Aquatex, Aqueous mounting agent (koodi 363123S, Merck, Darmstadt, Germany). Värjäys aloitetaan asetonikiinnityksellä jääkaapissa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen lasit ilmakuivattiin 10 minuutin ajan. Leikkeiden päälle lisättiin vuohen normaalia seerumiliuosta (3 pisaraa sekoitettuna 10 ml:aan 0.05M PBS-liuosta) ja inkuboitiin kosteassa kammiossa huoneen lämpötilassa noin 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen näytteiden päälle lisättiin primäärivasta-aine 30 minuutin ajaksi. Vasta-aine huuhdeltiin pois PBS-liuoksella ja sitten lisättiin sekundäärivasta-aine 30 minuutin ajaksi. Myös tämän jälkeen leikkeet huuhdeltiin PBS-liuoksella. Näytteitä käsiteltiin 5% vetyperoksidilla 5 minuutin ajan, ABC-liuoksella (pisarat komponentteja A ja B, sekä 2.5 ml 0.05 PBS-liuosta) 40 minuutin ajan sekä yhdistelmäliuoksella 5 minuutin ajan. Kaikkien kolmen vaiheen välissä tehtiin PBS-pesu. Näiden vaiheiden jälkeen leikkeet pestiin deionisoidulla vedellä ja peitettiin peitinaineella ja -lasilla. Peitinlasin asettamisen jälkeen leikkeet valokuvattiin. Tuloksena oli harmaanmusta värjäytyminen. Värjätyistä leikkeistä C3c-positiiviset syöttösolut voitiin laskea vertaamalla valokuvaa aikaisemmassa vaiheessa otettuun valokuvaan [29,30,31,32,33]. C3cvärjäyksen tuloksena oli tummanharmaita leikkeitä, jossa syöttösolut erottuivat tummina läiskinä (kuvat 15b,16b,17b ja 18b). 16

Tulokset Taulukko 1. C3c-positiivisten syöttösolujen prosenttiosuus kaikista syöttösoluista psoriaasi-, tyvisolusyöpä-, aurinkokeratoosi- ja levyepiteelisyöpäpotilaiden terveessä ja leesioihossa. Terveiho Leesioiho P-arvo C3c (%) C3c (%) Psoriaasi 45.3± 16.8 56.1± 9.1 0,0023 (n=8) Tyvisolusyöpä 62.6± 13.7 83.3±11.9 0,0074 (n=11) Aurinkokeratoosi 40.7±17.7 50.5±17.7 0,13 (n=7) Levyepiteelisyöpä 53.1±15.1 54.4±17.5 0,88 (n=9) Tulokset ovat muodossa keskiarvo±keskihajonta. P-arvo perustuu paritettuun t-testiin vertailemalla leesioihon ja terveen ihon arvoja. Syöttösolujen C3c-prosenttiosuus oli tyvisolusyövässä ja psoriaasissa merkittävästi korkeampi leesioihossa kuin terveen näköisessä ihossa Tulokset osoittivat, että syöttösolujen C3c-prosenttiosuus oli tyvisolusyövässä merkittävästi korkeampi leesioihossa (83.3±11.9 %, keskiarvo±keskihajonta) kuin terveessä ihossa (62.6±13.7 %) (Taulukko 1). Yhtä miespotilasta lukuun ottamatta jokaisella potilaalla (n=11) leesioihossa tulos oli suurempi kuin terveen ihon näytteessä. Syöttösolujen värjääntyminen oli tyvisolusyövän kohdalla selkeää tryptaasivärjäyksessä (kuva 15a) sekä myös C3c-värjäyksessä (kuva 15b). Myös psoriaasin kohdalla syöttösolujen C3c-prosenttiosuus oli korkeampi leesioihossa (56.1±9,1 %) kuin terveessä ihossa (45.3±16,8 %) (Taulukko 1). Myös potilaskohtaisesti tarkasteltuna kaikissa psoriaasileesioissa ilmennettiin C3c-immunoreaktiivisuutta enemmän. Myös psoriaasissa syöttösolut värjääntyivät hyvin molemmissa värjäystavoissa (kuvat 18a,18b). Aurinkokeratoosissa ja levyepiteelisyövässä ei havaittu tilastollisesti merkittävää eroa. Levyepiteelisyövän esiasteessa, aurinkokeratoosissa, syöttösolujen C3c-prosenttiosuus oli lievästi korkeampi leesionäytteissä (50,5±17,7 %) verrattuna terveeseen ihoon (40,7±17,7 %), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkittävä (Taulukko 1). Seitsemästä aurinkokeratoosipotilaasta vain yhdellä tulos oli päinvastainen. Aurinkokeratoosileikkeiden tausta värjääntyi C3c-värjäyksessä (kuva 17b), mikä vaikeutti syöttösolujen erottamista taustasta. Myös syöttösolut värjääntyivät hieman heikommin verrattuna muiden näytteiden C3c-värjäyksiin (kuva 17b). 17

Levyepiteelisyövässä tulokset olivat likimain samat leesioihossa (54,4±17,5 %) ja terveessä ihossa (53,1±15,1 %) (Taulukko 1). Yllättäen huomattiin, että potilaat, joilla oli bowenin tauti, syöttösolut ilmensivät enemmän C3c-immunoreaktiivisuutta leesionäytteissä (p=0,052). Sen sijaan potilailla, joilla oli pidemmälle edennyt levyepiteelikarsinooma (gradus 1), terveen ihon syöttösolut ilmensivät C3c-immunoreaktiivisuutta leesiota enemmän (p=0,092). Levyepiteelisyövässä myös syöttösolujen erottaminen oli C3c- värjäyksessä välillä hankalaa (kuva 16b). Tyvisolusyövässä C3c-immunoreaktiivisuus oli leesioihossa koholla Tutkimuksessa arvioitiin myös taustakudoksen värjääntymistä asteikolla 1-3 (Taulukko 2). Taustan värjääntyvyys pysyi keskimäärin samana potilaan eri näytteiden kohdalla. Tyvisolusyövässä C3cimmunoreaktiivisuus oli leesioihossa tervettä ihoa voimakkaampi. Muiden tutkittavien tautien kohdalla taustat värjääntyivät saman verran eikä merkittävää eroa todettu. Taulukko 2. Taustakudoksen C3c-värjääntyminen Terveiho Leesioiho P-arvo C3c (score) C3c (score) Psoriaasi 2,50± 0,53 2,44± 0,47 0,723 (n=8) Tyvisolusyöpä 1,85± 0,41 2,46± 0,36 0,006 (n=11) Aurinkokeratoosi 2,84± 0,29 2,51± 0,38 0,230 (n=7) Levyepiteelisyöpä 2,50± 0,22 2,41± 0,30 0,719 (n=9) Tulokset ovat muodossa keskiarvo±keskihajonta. P-arvo perustuu Wilcoxon -menetelmään vertailemalla leesioihon ja terveen ihon arvoja. 18

Tryptaasivärjätty tyvisolusyöpänäyte [Kuva 15a]. Tyvisolusyövän C3c- värjäys [Kuva 15b]. Tryptaasivärjätty levyepiteelisyöpänäyte [Kuva 16a]. Levyepiteelisyövän C3c- värjäys [Kuva 16b]. 19

Tryptaasivärjäys aurinkokeratoosille [Kuva 17a]. Aurinkokeratoosin C3c- värjäys [Kuva 17b]. Tryptaasivärjätty psoriaasinäyte [Kuva 18a]. Psoriaasin C3c- värjäys [Kuva 18b]. 20

Pohdinta Syöttösolujen ilmentämä C3c levyepiteelisyövässä Tässä tutkimuksessa lähdettiin selvittämään, minkä verran eri ihosyövissä syöttösolut ilmentävät C3c-immunoreaktiivisuutta. Tutkimuksen alussa tiedettiin, että komplementtiproteiini C3 on merkittävässä roolissa levyepiteelisyövän kehityksessä [1]. Riihilän tutkimuksessa okasolusyöpäsolut tuottivat komplementti C3:a, komplementtitekijä B:tä sekä komplementin inhibiittoriproteiinia H:ta. Keratinosyytit ja okasolusyövän esiasteet tuottivat myös samoja tekijöitä, mutta vähemmässä määrin [1, 34]. Tässä tutkimuksessa arvioitiin syöttösolujen C3c:n prosenttiosuutta leesioihossa ja terveessä ihossa. Syöttösolujen kohdalla ei huomattu samanlaista yhteyttä kuin okasolusyövässä Riihilän tutkimuksessa. Syöttösolut ilmensivät C3cimmunoreaktiivisuutta saman verran yhdeksän potilaan ryhmässä, jossa oli gradus I -okasolusyöpää ja Bowenin tautia sairastavia potilaita (p=0.88). Yksi mahdollinen selitys tälle tutkimusten väliselle eroavuudelle on se, että pidemmälle ehtineessä gradus I karsinoomassa muutos voisi olla havaittavissa, mutta Bowenin taudissa ei. Tämän vuoksi tutkittavat potilaat jaoteltiin vielä ryhmiin vaikeusasteen perusteella, mutta okasolusyövässä (gradus 1) ei huomattu eroja (p=0,092). Myöskään Bowenin taudin kohdalla ei saavutettu tilastollisesti merkittävää eroa (p=0,052). Aurinkokeratoosissa, jota pidetään okasolusyövän esiasteena, tulos jäi myös tilastollisesti merkityksettömäksi (p=0.13). Syöttösoluilla ei siis näytä olevan samanlaista roolia okasolusyövissä, kuin mitä Riihilän tutkimuksessa raportoitiin. Kalproteiinien vaikutus komplementin ilmentymiseen psoriaasissa Tutkimuksessa huomattiin, että psoriaasileesiossa syöttösolujen C3c-prosenttiosuus oli korkeampi terveeseen ihoon verrattuna (p=0.0023) (Taulukko 1). Sen sijaan taustan C3c-värjääntymisessä tulokset olivat samat (p=0,723) (Taulukko 2). Yhtä C3:n ilmentymistä selittävänä tekijänä voitaneen pitää kalproteiinia S100A8-S100A9:ta [35]. Kyseisessä tutkimuksessa havaittiin, että tämä proteiinikompleksi säätelee komplementti C3:n ilmentymistä psoriaasissa sekä hiirissä että eläinsoluissa. Kun S100A9 puuttui tutkittavista soluista, C3:n määrä kudoksessa romahti ja samoin myös tulehdusoireet. Vaikka proteiinikompleksi ei yksin selitä psoriaasin oireita tai C3:n määrää, voisi taustalla olla kalproteiinin aktivaatio, joka lisää syöttösolujen C3:n eritystä ja tulehdustilaa. Kalproteiinin yhteyttä syöttösolujen komplementin tuottoon pitää tutkia tarkemmin sekä psoriaasissa että tyvisolusyövässä. Komplementin inhibiittioritekijät ihosyövissä Keratinosyyttien kyky tuottaa C3:a voisi selittää sen, miksi tausta värjääntyi tutkittavissa näytteissä liki samalla tavalla (Taulukko 2). Kuten aiemmin mainittiin, orvaskeden solujen eli keratinosyyttien tiedetään myös luonnostaan tuottavan komplementti C3:a [1,34]. Myös syöttösolut erittävät jatkuvasti C3:a [2]. Tätä komplementin ilmentymistä säätelee erityisesti komplementtijärjestelmän inhibiittoritekijä H. Inhibiittori H:n säätelyyn osallistuvat puolestaan erilaiset sytokiinit (IL-1α, IL- 2, IL-6, TGF-β, TNF-α ja interferoni-γ). Inhibiittorin vähentyessä C3:n määrä vuorostaan nousee. Inhibiittoritekijän yliaktiivisuus taas johtaa helpommin infektioihin, kun komplementtisysteemin aktiivisuus laskee [34]. Leesioissa mahdollinen inhibiittoritekijän inaktivaatio voisi nostaa komplementtiproteiini C3:n tasoa ja lisätä sitä kautta taustan värjääntymistä (Taulukko 2). Tyvisolusyövän ja psoriaasin yhteys Syöttösolujen C3c ilmentyi merkittävästi enemmän leesioihossa tyvisolusyövässä ja psoriaasissa verrattuna niiden terveisiin näytteisiin (Taulukko 1). Muissa ihosyövissä merkittävää eroa ei 21

huomattu C3c:n osalta. Syytä siihen, miksi kahdessa edellä mainitussa taudissa ilmennettiin paljon C3c:tä syöttösoluissa, ei tiedetä. Tarkemman mekanismin ymmärtämiseksi tarvittaisiin lisää solutason tutkimuksia. Psoriaasi ja tyvisolusyöpä muistuttavat kliinisesti toisiaan, joten voi olla, että niillä on yhteisiä osatekijöitä. Lisäksi levyepiteelisyöpä ja sen esiasteeksi lukeutuva aurinkokeratoosi muodostavat yhtenäisen tautikokonaisuuden. Tyvisolusyövässä huomattiin, että taustakudos värjääntyi leesiossa enemmän kuin terveessä ihossa (Taulukko 2). Kuitenkaan psoriaasin osalta ei tullut vastaavan kaltaista tulosta (Taulukko 2). On mahdollista, että terveen näköisessä psoriaasi-ihossa on ns. subkliininen tulehdus, joka aikaansaa C3:n vuotamista verenkierrosta ihoon. Tämän seurauksena merkittävää eroa ei havaittu terveen ja leesioihon välillä psoriaasissa (Taulukko 2). Menetelmien luotettavuuden arviointi Tutkimuksen tuloksia vääristävinä tekijänä voidaan pitää mekaanista solujen laskentaa. Vaikka solujen laskentaan varattiin huomattavasti aikaa, joitakin leikkeitä laskettiin useampaan kertaan ja kaikki tulokset kirjattiin välittömästi, niin silti oli olemassa laskemisen virheen mahdollisuus. Satunnaisia leikkeitä laskettiin lopuksi uudelleen tulosten varmistamiseksi. Entsyymihistokemiallisessa värjäyksessä punaiseksi värjäytyneistä syöttösoluista täytyi arvioida, mitkä vierekkäiset solut voidaan laskea erillisiksi soluiksi ja mitkä vierekkäiset solut ovat taas yksi solu. Soluja laskiessa täytyi valita tietty tarkkuus, minkälaiset värjäytymät lasketaan syöttösoluksi. Immunohistokemiallisessa värjäyksessä tummaksi värjäytyneet syöttösolut piti erottaa muiden solujen värjääntyvyydestä. Erottaminen oli helppoa silloin, kun taustan värjääntyminen oli matalaa. Syöttösolujen erottaminen oli kuitenkin huomattavasti helpompaa kuin entsyymihistokemiallisessa värjäyksessä. Laskettavat leikkeet valittiin sattumanvaraisesti, mutta jos leike oli huonosti värjäytynyt tai epäselvä, se jätettiin laskematta epätarkkuuden välttämiseksi. Pääsääntöisesti leikkeet olivat erinomaisesti värjääntyneet. Vain muutamissa leikkeissä oli väriaineiden leviämistä tai artefaktaa. Leikkeiden kuvausvaiheessa oli muutamiin leikkeisiin jäänyt ilmakuplia, jotka sitten valokuvassa näkyivät heijastumina. Kaikki teknisesti epämääräiset valokuvat sivuutettiin ja valittiin satunnaisesti toinen kuva tilalle. Taustakudoksen värjääntyvyyden arviointiasteikko 1-3 on myös kohtalaisen epätarkka. Erityisesti käytettäessä puolikkaita pisteitä, virheitä voi tulla helposti, koska arviointi on silmämääräistä. Esimerkiksi levyepiteelisyövässä taustakudos värjääntyi syöttösolujen kanssa liki yhtä hyvin C3c-värjäyksissä (kuva 16b), joka teki erottamisesta haastavampaa verrattuna muiden tutkittaviin näytteisiin. Vertaileminen rinnakkaiseen tryptaasivärjäykseen (kuva 16a) kuitenkin selkeytti tulkintaa huomattavasti. Laskettavien valokuvien määrää olisi voinut lisätä vielä esimerkiksi muutamalla sadalla virheiden välttämiseksi. Lisäksi leikkeet olisi voinut antaa laskettavaksi jollekin toiselle henkilölle, jotta tuloksien paikkansapitävyyttä olisi voitu verrata. Tämän tutkimuksen tulosten vahvistamiseksi tarvitaan lisää tutkimuksia. Johtopäätökset Tutkimuksessa löydettiin merkittävä komplementti C3c:n ilmentyminen syöttösoluissa psoriaasissa ja tyvisolusyövässä. Levyepiteelisyövän ja aurinkokeratoosin kohdalla ei todettu samankaltaista tulosta. Arvioitaessa taustan värjääntymistä vain tyvisolusyövässä tausta värjääntyi leesiossa tervettä ihoa enemmän. Varmoja syitä näille tuloksille ei ole, mutta mahdollisesti tulehdustekijöiden ja erilaisten solutason mekanismien kautta syöttösolut aktivoituvat tuottamaan runsaasti komplementti C3:a psoriaasissa ja tyvisolusyövässä, kun taas levyepiteelisyövässä vastaavat tekijät inhiboivat C3:n muodostusta. Tulosten vahvistaminen vaatisi lisää tutkimuksia aihealueelta. 22

Lähteet [1] Riihilä P, Nissinen L, Ala-aho R, Kallajoki M. Complement Factor H: A Biomarker for Progression of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. J Invest Dermatol 2013;134:498-506 [2] Fukuoka Y, Hite MR, Dellinger AL, Schwartz LB. Human skin mast cells express complement factors C3 and C5. J Immunol 2013;191:1827-1834 [3] Harvima IT, Nilsson G. Mast cells as regulators of skin inflammation and immunity. Acta Derm Venereol 2011;91:644-650 [4] Lomas A, Leonardi-Bee J, Bath-Hextall F. A systematic review of world-wide incidence of nonmelanoma skin cancer. Br J Dermatol 2012;166:1069-1080 [5] Keng Wooi Ng,Wing Man Lau. Skin Deep: The Basics of Human Skin Structure and Drug Penetration. Berlin: Springer 2015:2-8 [6] Mihm Martin Jr, Soter Nicholas. The Structure of Normal Skin And The Morphology Of Atopic Eczema. J Invest Dermatol 1976;67:305-312 [7] Harding C. The stratum corneum: structure and function in health and disease. Dermatol Ther 2004;1:6-15 [8] Prost-Squarcioni C. Histology of skin and hair follicle. Med Sci 2006;22:131-137 [9] Anna Hannuksela-Svahn. Ihotautien verkko-oppikirja. Duodecim 2011 [10] Seija-Liisa Karvonen, Suvi Cajanus, Anna Hannuksela-Svahn. Iho- ja nivelpsoriaasin diagnostiikka ja hoito. Duodecim 2008;124:1389-1390 [11] Huynh N, Cervantes-Castaneda RA, Bhat P, Gallagher MJ, Foster CS. Biologic response modifier therapy for psoriatic ocular inflammatory disease. Ocul Immunol Inflamm 2008;16:89-93 [12] Röwert-Huber J, Patel MJ, Forschner T. Actinic keratosis is an early in situ squamous cell carcinoma: a proposal for reclassification. Br J Dermatol 2007;156:8-12 [13] Fuchs A, Marmur E. The kinetics of skin cancer: progression of actinic keratosis to squamous cell carcinoma. Dermatol Surg 2007;33:1099-1101 [14] Werner RN, Sammain A, Erdmann R ym. The natural history of actinic keratosis: a systematic review. Br J Dermatol 2013;169:502-518 [15] Dandurand M, Petit T, Martel P, Guillot B. Management of basal cell carcinoma in adults Clinical practice guidelines. Eur J Dermatol 2006;16:394-401 [16] Pinkus H. Premalignant fibroepithelial tumors of skin. AMA Arch Derm Syphilol 1953;67:598-615 [17] Hernberg M, Jahkola T. Ihosyöpäpotilaan opas. Suomen ihosyöpäpotilaat ry 2017:7-12 [18] Laukkanen A, Rummukainen J, Kivinen J, Lappalainen K. Ihon okasolusyöpä ja sen esiasteet. Duodecim 2006;122:71-79 [19] Berhane T, Halliday GM, Cooke B, Barnetson RS. Inflammation is associated with progression of actinic keratoses to squamous cell carcinomas in humans. Br J Dermatol 2002;146:810-815 [20] Pitkänen S. Okasolusyövän esiasteet ja pinnallinen tyvisolusyöpä. Focus Oncologiae 2005;5:49-51 23

[21] Eklund K, Kovanen P. Uutta tietoa syöttösolujen tehtävistä elimistön immuunipuolustuksessa. Duodecim 1999;115:640-650 [22] Amin K, Ludviksdottir D, Janson C, Nettelbladt O, Bjornsson E. Inflammation and structural changes in the airways of patients with atopic and nonatopic asthma. Am J Respir Crit Care Med 2000;162:2295-3001 [23] Borish L, Joseph B.Z. Inflammation and the allergic response. Med Clin North Am 1992;76:765-787 [24] Ishizaka T, Mitsui H, Yanagida M, Miura T, Dvorak A.M. Development of human mast cells from their progenitors. Curr Opin Immunol 1993;5:937-955 [25] Janeway CA Jr, Travers P, Walport M. Immunobiology: The immune System in Health and Disease. New York: Garland Science 5th ed. 2001:40-53 [26] Meri S. Komplementtijärjestelmä, patologian verkko-oppikirja. Duodecim 2012 [27] Kaukinen A, Pelkonen J, Harvima IT. Mast cells express CYP27A1 and CYP27B1 in epithelial skin cancers and psoriasis. Eur J Dermatol 2015;25:548-555 [28] Lipitsä T, Naukkarinen A, Laitala J, Harvima IT. Complement C3 is expressed by mast cells in cutaneous vasculitis and is degraded by chymase. Arch Dermatol Res 2016;308:575-584 [29] Hsu Su-Ming, Raine L., Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 1981;29:570-580 [30] Sinclair RA, Burns J, Dunnill MS. Immunoperoxidase staining of formalin-fixed, paraffinembedded, human renal biopsies with a comparison of the peroxidase-antiperoxidase (PAP) and indirect methods. J Clin Pathol 1981;34:859-865 [31] Whicher JT, Higginson J, Riches PG, Radford S. Clinical applications of immunofixation: detection and quantitation of complement activation. J Clin Pathol 1980;33:781-785 [32] Becker W. Determination of antisera titres using the single radial immunodiffusion method. Immunochem 1969;6:539-546 [33] Hau J, Nilsson M, Skovgaard-Jensen H-J, de Souza A. Analysis of animal serum proteins using antisera against human analogous proteins. Scand J Lab Anim Sci 1990;17:3-7 [34] Timár KK, Pasch MC, van den Bosch NH, Jarva H. Human keratinocytes produce the complement inhibitor factor H: synthesis is regulated by interferon- gamma. Mol Immunol 2006;43:317-325 [35] Schonthaler HB, Guinea-Viniegra J, Wculek SK, Ruppen I. S100A8-S100A9 protein complex mediates psoriasis by regulating the expression of complement factor C3. Immunity 2013;39:1171-1181 24