Glykodeliinin sokerit siittiöiden toiminnan säätelyssä

Katsaus Markku Seppälä, Hannu Koistinen, Riitta Koistinen, Philip CN Chiu ja William S Yeung Glykodeliinin sokerit siittiöiden toiminnan säätelyssä Useissa eläinkokeissa on todettu hiilihydraattien osallistuvan sukusolujen sitoutumisreaktioon. Glykodeliini on hyvä esimerkki sokerirakenteiden merkityksestä ihmisen lisääntymisbiologiassa. Nimensä mukaisesti glykodeliini sisältää sokeriketjuja, jotka kiinnittyvät kahdesta kohdasta sen proteiinirungon asparagiineihin (ns. N-glykosylaatio). Rungon pysyessä ennallaan sokeriketjujen rakenne vaihtelee kudosten glykosylaatiokoneiston mukaan. Uudet tutkimustulokset korostavat sokeriketjujen tärkeää merkitystä siittiöiden kapasitaation, akrosomireaktion ja hedelmöityksen säätelyssä. S iemennesteen mukana emättimeen joutuneet siittiöt eivät ole heti hedelmöityskykyisiä, vaan niiden pitää ensin kapasitoitua (Austin 1952). Kapasitaation aikana siittiöiden sisään siirtyy kalsiumia, niistä vapautuu kolesterolia ja siittiöiden valkuaisaineissa tapahtuu voimakasta tyrosiinien fosforylaatiota (de Lamirande ym. 1997). Kapasitaatio tapahtuu siittiöiden vaeltaessa kohdunkaulan ja kohtuontelon läpi munanjohtimeen, missä siittiöt kohtaavat kumulussolukerroksen suojaaman munasolun. Siittiöiden on läpäistävä tämä solukerros, jotta ne voisivat kiinnittyä munasolun kuoren oligosakkarideihin (Benoff 1997). Akrosomireaktion käynnistymisessä vaikuttavat erityisesti kalsium, progesteroni ja munasolusta siittiöön tulevat viestit. Akrosomin ulokkeet ja entsyymit työntyvät siittiön päästä munasolun kuoreen. Glykodeliinin eri muodot Kuvasimme aiemmin tässä lehdessä miehen ja naisen erilaisten glykodeliinimuotojen vaikutuksia (Seppälä ym. 1998). Glykodeliini on 17 % hiilihydraattia sisältävä glykoproteiini, jonka rakenne tunnetaan hyvin (kuva 1). Sitä koodittava geeni sijaitsee kromosomissa 9. Geenin Duodecim 2006;122:1439 44 promoottorialueella sijaitsevat neljä glukokortikoidi-progesteroni vaste-elementtiä selittävät progesteronin vaikutuksen glykodeliinisynteesiin (Vaisse ym. 1990). Esimerkiksi kohdun limakalvon glykodeliini A:n synteesi tapahtuu progesteronivaikutuksen ylläpitämissä sekretorisissa rauhasissa (Julkunen ym. 1986). Kohdun ohella lisääntymiskudoksiin liittyvää glykodeliinia syntyy rintarauhasessa, munanjohtimissa, munasarjoissa ja miehen siemenrakkuloissa (Seppälä ym. 2002). Massaspektrometrianalyysi ja lektiinien sitoutumista koskevat kokeet paljastivat, että synteesipaikan mukaan glykodeliinin valkuaisainerunkoon voi liittyä hyvin erilaisia sokeriketjuja. Nämä vaikuttavat ratkaisevasti glykodeliinin biologisiin ominaisuuksiin (taulukko). Esimerkiksi kohtuperäinen glykodeliini A sisältää paljon terminaalisia siaalihappotähteitä ja fukoosia sisältäviä lacdinac- ja lacnac-rakenteita sekä mannoosia (kuva 1). Siemennesteen glykodeliini S ei sisällä lainkaan siaalihappoa. Munasarjojen luteinisoituneet granuloosasolut tuottavat kolmatta iso-tyyppiä glykodeliini F:ää, jota esiintyy follikkelinesteessä (Chiu ym. 2003b) ja munanjohtimissa (Yeung ym. 2006). Sokerirakenteeltaan glykodeliini F muistuttaa enemmän glyko 1439

Kuva 1. Glykodeliini kuuluu rakenteensa puolesta lipokaliiniperheeseen (Julkunen ym. 1988). Sen geenin, proteiinin ja sokeriketjujen rakenteet tunnetaan hyvin (Koistinen ym. 1997). Esitetty nauharakenne kuvaa glykodeliinin teoreettista tertiaarirakennetta (Koistinen ym. 1999). Keltainen»tynnyri» osoittaa rikkisillan sijaintia. Sokeriketjujen kiinnittymispaikat (asparagiinit) on merkitty niiden sijaintia kuvaavalla järjestysnumerolla glykodeliinin aminohappoketjussa. Kuvan alin osa havainnollistaa kohtuperäisen glykodeliini A:n ja siemennesteen glykodeliini S:n välistä glykosylaatioeroa (Dell ym. 1995, Morris ym. 1996). 1440 M. Seppälä ym.

Taulukko. Siittiöihin kiinnittyvät glykodeliinimuodot ja niiden biologiset vaikutukset. Glykodeliinimuoto Esiintymispaikka Tyypillinen sokeriketju Biologinen vaikutus S Siemenrakkulat Siemenneste Fukosyloitunut Lewis x ja Lewis y Estää kolesterolin vähentymistä siittiöistä ja niiden kapasitaatiota 1 A Kohdun limakalvo 2, desidua 3 Sialyloitunut tai fukosyloitunut lacdinac, mannoosi, E-selektiiniligandit 4 Estää siittiöiden kiinnittymistä munasoluun 5 F Luteinisoituneet granuloosasolut, follikkelineste, munanjohdin 1 Kuten glykodeliini A, mutta enemmän N-asetyyliglukosamiinia, mannoosi, fukoosi 4,6 Estää progesteronin aikaansaamaa akrosomireaktiota ja siittiöiden kiinnittymistä munasoluun 7 1 Chiu ym. 2005 2 Erittyy progesteronivaikutuksen aikana 3 Koistinen ym. 2003 4 Chiu ym. 2004 5 Oehninger ym. 1995 6 Chiu ym. 2003a 7 Chiu ym. 2003b deliini A:ta kuin S:ää, mutta se eroaa glykodeliini A:sta mm. suuremman N-asetyyliglukosamiinipitoisuutensa perusteella. Tämä vaikuttaa sen biologisiin ominaisuuksiin (Tse ym. 2002, Chiu ym. 2004). Vaikutustapa Glykodeliinin kaikki kolme sokerimuotoa A, F ja S sitoutuvat siittiöiden päähän. Sokeriketjujen poistaminen glykodeliinista johtaa sitoutumiskyvyn häviämiseen, ja samalla biologiset vaikutukset häviävät. Glykodeliini S estää kolesterolin vapautumista sekä adenylaattisyklaasin, proteiinikinaasin ja tyrosiinikinaasin kautta tapahtuvaa signaalinvälitystä siittiöissä (Chiu ym. 2005). Tämän seurauksena siittiöiden kapasitaatio estyy. Vaikka glykodeliinit A ja F sitoutuvat myös siittiöiden päähän, ne eivät kilpaile sitoutumisesta glykodeliini S:n kanssa. Spesifisiä sokeriketjuja sisältävillä keinotekoisilla neoglykoproteiineilla tehdyt kokeet paljastivat, että glykodeliini A:n sitoutumisessa ovat tärkeimpiä mannoosi, fukoosi ja E-selektiiniligandit, kun taas glykodeliini F:n sitoutumiseen osallistuu mannoosin ja fukoosin lisäksi N-asetyyliglukosamiini mutta E-selektiiniligandit eivät (Chiu ym. 2004). Sitoutuminen siittiöihin on edellytyksenä glykodeliinin aikaansaamille biologisille vaikutuksille. Glykodeliinin sokerit siittiöiden toiminnan säätelyssä Todennäköinen tapahtumaketju Siemensyöksyssä kiveksistä lähteneet siittiöt sekoittuvat siemenrakkulanesteeseen, joka sisältää paljon glykodeliini S:ää. Tämä aine kiinnittyy siittiöiden päähän ja estää niiden ennenaikaisen kapasitaation emättimessä. Kapasitaatio käynnistyy, kun glykodeliini S irtoaa siittiöistä niiden läpäistessä kohdunkaulan liman (Chiu ym. 2005). Ennen koeputkihedelmöitystä siemenneste pestään pois siittiöistä. Siitä, miten erilaiset pesumenetelmät vaikuttavat siittiöihin kiinnittyneeseen glykodeliiniin, ei ole systemaattista tietoa, mutta Percoll-käsittelyn tiedetään irrottavan glykodeliini S:n siittiöistä (Yeung ym. 2005). Munasolu voidaan hedelmöittää myös suoraan kiveksistä otetuilla siittiöillä. Tällöin siittiöt eivät joudu lainkaan tekemisiin glykodeliini S:n kanssa. In vitro menetelmissä siittiöiden kypsymisen ja kapasitaation aikaansaamiseksi on omat menettelytapansa eikä siemennesteen aineosien puuttumisesta ole hedelmöityksen kannalta haittaa vaan pikemminkin hyötyä. Glykodeliinit A ja F estävät molemmat siittiöiden kiinnittymistä munasolun kettoon, zona pellucidaan. Ominaisuus häviää kummastakin, kun sokeriketjut poistetaan. Jos glykodeliini A:ta on kohtunesteessä siittiöiden saapuessa kohtuun, se kiinnittyy siittiöihin ja estää nii 1441

Kuva 2. Glykodeliinin vaikutukset siittiöiden toimintaan. A) Siemennesteen glykodeliini S (GdS) sitoutuu siittiöiden päähän ja estää niiden kapasitaatiota (Chiu ym. 2003a, 2005). B) Munasolua ympäröivät kumulussolut poistavat glykodeliini F:n (GdF) siittiöiden päästä ja mahdollistavat siittiöiden kiinnittymisen munasolun pintaan. Akrosomireaktio käynnistyy (Tse ym. 2002). den kiinnittymisen munasoluun (Oehninger ym. 1995). Yleensä glykodeliini A:ta ei kuitenkaan ole kohtunesteessä vielä hedelmöityksen aikana, koska sen synteesi edellyttää joitakin päiviä kestänyttä progesteronivaikutusta (Seppälä ym. 2002). Normaalisti glykodeliini A:ta ilmaantuu kohtuun vasta 4 5 päivän kuluttua ovulaatiosta, jolloin hedelmöitys on jo ehtinyt tapahtua. Sen sijaan progestiinia sisältävien raskauden ehkäisymenetelmien myös jälkiehkäisyn aikana (Durand ym. 2005) ja joissakin patologisissa tiloissa, kuten endometrioosissa, glykodeliinia voi esiintyä myös keskikierron aikana. Endometrioosipesäkkeissä glykodeliinin syklinen vaihtelu on häiriintynyt siten, että glykodeliinia saattaa olla pesäkkeissä myös kierron keskivaiheessa (Cornillie ym. 1991). Endometrioosiperäisen glykodeliinin sokerirakennetta ei vielä tunneta tarkasti. Siittiöihin kohdistuvan vaikutuksensa ohella glykodeliini A:lla voi immunosuppressiivisten ominaisuuksiensa vuoksi olla vaikutusta myös implantaatioon. Molekyylin immunosuppressiivinen vaikutus ei kuitenkaan aina riipu glyko 1442 M. Seppälä ym.

sylaatiosta, joskin siaalihapon läsnäolo on tärkeä glykodeliinin T-lymfosyytteihin kohdistuvan apoptoottisen vaikutuksen kannalta (Mukhopadhyay ym. 2004). Glykodeliinin vaikutuksesta apoptoosiin on niukasti suoraa tietoa, mutta tähän viittaavat transfektiokokeet, joissa glykodeliini on vähentänyt antiapoptoottisen Bcl- XL -geenin ilmentymistä ja kohdun limakalvon syöpäsolujen kasvua (Koistinen ym. 2005). Kumulussoluissa tapahtuu apoptoosia, minkä on havaittu heikentävän munasolun kypsymistä ja kykyä muodostaa blastokysta hedelmöityksen jälkeen (Corn ym. 2005). Vielä ei tiedetä, aiheuttavatko siaalihappoa sisältävät glykodeliinimuodot A ja F apoptoosia sitoutuessaan kumulussoluihin. Munasarjojen luteinisoituneissa granuloosasoluissa syntyvä glykodeliini F ja progesteroni siirtyvät kypsyvän munarakkulan nesteeseen. Ovulaatiossa ne seuraavat kumulussolujen ympäröimää munasolua munanjohtimeen (Yeung ym. 2006). Vaikka munasolua ympäröivät kumulussolut erittävät progesteronia ja niissä on glykodeliinia, ne eivät kuitenkaan sisällä glykodeliinin lähetti-rna:ta. Tämä merkitsee sitä, että kumulussolujen glykodeliini on tullut sinne muualta. In vitro kokeet ovat osoittaneet, että kumulussolut poistavat glykodeliinia siittiöiden pinnalta (Tse ym. 2002). Glykodeliini F estää siittiöissä progesteronin käynnistämää akrosomireaktiota toisin kuin siittiöihin sitoutunut kohtuperäinen glykodeliini A. Tämä ominaisuus voi olla tärkeä, jottei akrosomireaktio pääsisi tapahtumaan ennenaikaisesti siittiöiden kulkiessa progesteronia erittävän kumulussolukerroksen läpi. Normaaliolosuhteissa akrosomireaktio tapahtuu vasta siittiöiden saavuttaessa munasolun pinnan. Kumulussolujen on havaittu myös muokkaavan glykodeliinia hedelmöitystä edistävään muotoon (Yeung ym. 2006). Tämän muodon sokerirakenteita ei vielä tunneta, ei myöskään löydöksen biologista merkitystä in vivo. Kumulussolujen uudenlaisen merkityksen selviämisen myötä on tullut ymmärrettäväksi, miksi koeputkihedelmöityksen alkuvaiheissa käytetty kumulussolujen mekaaninen poisto munasolun ympäriltä ei parantanutkaan hedelmöitysmahdollisuuksia vaan pikemminkin huononsi niitä. Nykyisin nämä solut poistetaan vain mikrohedelmöityksen yhteydessä, kun siittiö ruiskutetaan suoraan munasoluun. On todennäköistä, että saavuttaessaan munasolun pinnan in vivo hedelmöitykseen kykenevä siittiö ei kanna päässään enää mitään kuvaamistamme kolmesta glykodeliinimuodosta. Lopuksi Vain prosentti ihmisen geeneistä säätelee valkuaisaineiden glykosylaatiota. Silti 80 % valkuaisaineistamme on glykoproteiineja, joiden sokerit voivat muodostaa monimuotoisia ketjuja, ns. kompleksityyppisiä glykaaneita. Glykodeliini y d i n a s i a t Siittiöiden hedelmöityskyvyn edellytyksiä ovat niiden kapasitaatio, kiinnittyminen munasoluun ja sitä seuraava akrosomireaktio. Glykodeliini vaikuttaa kaikkiin näihin tapahtumiin sokeriketjujensa välityksellä. Kiinnittymällä siittiöiden päähän siemennesteen glykodeliini S estää siittiöiden ennenaikaista kapasitaatiota emättimessä. Munanjohtimessa glykodeliini F estää siittiöiden kiinnittymistä munasoluun ja ennenaikaista akrosomireaktiota. Kohdunkaulan eritteet irrottavat glykodeliini S:n siittiöistä, ja munasolua ympäröivät kumulussolut kaappaavat glykodeliini F:n siittiöiltä. Glykodeliinin irtoaminen mahdollistaa kapasitaation ja aikaansaa siittiöiden kyvyn kiinnittyä munasoluun ja sitä seuraavan akrosomireaktion käynnistymisen.»glykobiologian» merkitys ihmisen hedelmöityksen säätelyssä korostuu entisestään. Glykodeliinin sokerit siittiöiden toiminnan säätelyssä 1443

on malliesimerkki siitä, miten kompleksityyppisten glykaanien biologiset vaikutukset säätelevät tärkeitä ihmisen hedelmöitykseen liittyviä toimintoja. Luonteenomaista on, että glykodeliinin sokerirakenteiden vaikutukset kohdistuvat spesifisesti tiettyihin toimintoihin. Siemennesteen glykodeliini S estää siittiöiden ennenaikaista kapasitoitumista toisin kuin kohdun glykodeliini A, mutta sillä ei ole vaikutusta siittiöiden kykyyn kiinnittyä munasoluun. Glykodeliini S ei myöskään vaikuta akrosomireaktioon niin kuin glykodeliini F. Vaikka glykodeliinit A ja F estävät molemmat siittiöiden kiinnittymistä munasoluun, vain F-muoto estää akrosomireaktiota. Edellä kuvattujen havaintojen ohella glykodeliinien tutkimus on lisännyt tietoa myös munasolua ympäröivien kumulussolujen toiminnasta paljastamalla niiden kyvyn kaapata glykodeliini F siittiöistä. Tämä kyky mahdollistaa akrosomireaktion käynnistymisen.»glykobiologian» merkitys ihmisen hedelmöityksen säätelyssä korostunee tulevaisuudessa entisestään. Kirjallisuutta Austin CR. The capacitation of the mammalian sperm. Nature 1952; 170:326. Benoff S. Carbohydrates and fertilization: an overview. Mol Hum Reprod 1997;3:599 637. Chiu PCN, Koistinen R, Koistinen H ym. Binding of zona binding inhibitory factor-1 (ZIF-1) from human follicular fluid on spermatozoa. J Biol Chem 2003(a);278:13570 7. Chiu PCN, Koistinen R, Koistinen H, ym. Zona binding inhibitory factor- 1 from human follicular fluid is an isoform of glycodelin. Biol Reprod 2003(b);69:365 72. Chiu PCN, Tsang HY, Chung MK, ym. Glycodelin-S in human seminal plasma reduces cholesterol efflux and capacitation of spermatozoa. J Biol Chem 2005;280:25580 9. Chiu PCN, Tsang H-Y, Koistinen R, ym. The contribution of D-mannose, L-fucose, N-acetylglucosamine and selectin residues on the binding of glycodelin isoforms to human spermatozoa. Biol Reprod 2004;70:1710 9. Corn CM, Hauser-Kronberger C, Moser M, ym. Predictive value of cumulus cell apoptosis with regard to blastocyst development of corresponding gametes. Fertil Steril 2005;84:627 33. Cornillie FJ, Lauweryns JM, Seppälä M ym. Expression of endometrial protein PP14 in pelvic and ovarian endometriotic implants. Hum Reprod 1991;10:1411 5. De Lamirande E, Leclerc P, Gagnon C. Capacitation as a regulatory event that primes spermatozoa for the acrosome reaction and fertilization. Mol Hum Reprod 1997;3:175 94. Dell A, Morris HR, Easton R, ym. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycodelin, a human glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities. J Biol Chem 1995; 270:24116 26. Durand M, Seppälä M, del Carmen Carvioto M ym. Late follicular phase administration of levonorgestrel as an emergency contraceptive canges the secretory pattern of glycodelin in serum and endometrium during the luteal phase of the menstrual cycle. Contraception 2005;71:451 57. Julkunen M, Koistinen R, Sjöberg J ym. Secretory endometrium synthesizes placental protein 14. Endocrinology 1986;118:1782 6. Julkunen M, Seppälä M, Jänne O. Complete amino acid sequence of human placental protein 14: A progesterone-regulated uterine protein homologous to b-lactoglobulins. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:8845 9. Koistinen H, Koistinen R, Kämäräinen M, ym. Multiple forms of messenger ribonucleic acid encoding glycodelin in male genital tract. Lab Invest 1997;76:683 90. Koistinen H, Koistinen R, Seppälä M, ym. Glycodelin and b-lactoglobulin, lipocalins with high structural similarity differ in ligand binding properties. FEBS Lett 1999;450:158 62. Koistinen H, Easton RL, Koistinen R, ym. Differences in glycosylation and sperm-egg binding inhibition of pregnancy-related glycodelin. Biol Reprod 2003;69:1545 51. Koistinen H, Seppälä M, Nagy B, ym. Glycodelin reduces carcinoma-associated gene expression in endometrial adenocarcinoma cells. Am J Obstet Gynecol 2005;193:1955 60. Morris HR, Dell A, Easton RL, ym. Gender specific glycosylation of human glycodelin affects contraceptive activity. J Biol Chem 1996; 271:32159 67. Mukhopadhyay D, Sundar Raj S, Alok A ym. Glycodelin-A, not glycodelin- S, is apoptotically active. Relevance of sialic acid modification. J Biol Chem 2004;279:8577 84. Oehninger S, Coddington CC, Hodgen CD ym. Factors affecting fertilization: Endometrial placental protein 14 reduces capacity of human spermatozoa to bind to the human zona pellucida. Fertil Steril 1995;63:377 83. Seppälä M, Koistinen H, Mandelin E, Koistinen R. Glykodeliinit lisääntymisen säätelyssä. Duodecim 1998;114:761 7. Seppälä M, Taylor RN, Koistinen H ym. Glycodelin: a major lipocalin protein of the reproductive axis with diverse actions in cell recognition and differentiation. Endocr Rev 2002;23:401 30. Tse JYM, Chiu PCN, Lee KF ym. The synthesis and fate of glycodelin in human ovary during folliculogenesis. Mol Hum Reprod 2002; 8:142 8. Vaisse C, Atger M, Potier B ym. Human placental protein 14 gene: sequence and characterization of a short duplication. DNA Cell Biol 1990;9:401 13. Yeung WSB, Lee K-F, Koistinen R, ym. Roles of glycodelin in modulating sperm function. Mol Cell Endocrinol 2006;250:149 56. MARKKU SEPPÄLÄ, LKT, emeritusprofessori mseppala@welho.com HANNU KOISTINEN, tekn. tri, tutkija Biomedicum Helsinki, kliininen kemia Haartmaninkatu 8, 00290 HUS PHILIP CN CHIU, PhD, tutkija WILLIAM S YEUNG, PhD, apulaisprofessori Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Hong Kong Queen Mary Hospital, Pokulfam Road, Hong Kong, China RIITTA KOISTINEN, FT, dosentti Biomedicum Helsinki, kliininen kemia Haartmanin katu 8, 00290 HUS ja HUS:n naistenklinikka Haartmaninkatu 2, 00290 HUS 1444