Mikä on ns. multiplex-pcr tutkimus?

Transkriptio

1 Sidonnaisuudet kahden viimeisen vuoden ajalta Multiplex-PCR ym. uudet monianalyyttimenetelmät - Laboratorion näkökulma Dos., osastonylilääkäri Maija Lappalainen HUSLAB, Virologian ja immunologian osasto Shp-SIRO-FiRe-päivät LT, Dosentti, Kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, hallinnon pätevyys, lääkärikouluttajan erityispätevyys Päätoimi HUSLAB, Osastonylilääkäri, vastuuyksikön päällikkö, Virologian ja immunologian osasto Sivutoimet konsultoiva erikoislääkäri, Yhtyneet Medix Laboratoriot Kierrosasiantuntija, Labquality Koulutustoiminta Luentopalkkiot: Astellas Pharma, Pfizer, Labquality, Roche Osallistunut lääkealan yrityksen koulutusten suunnitteluun: Orion Diagnostica Osallistunut yrityksen maksamaan koulutukseen: Roche Diagnostics Luottamustoimet terveydenhuollon alalla STM, tartuntatautien neuvottelukunnan/pandemiajaoksen pysyvä asiantuntija Kuntaliitto, laboratorionimikkeistötyöryhmän jäsen THL, mikrobinimikkeistötyöryhmän jäsen Labquality, hallituksen jäsen Muut sidonnaisuudet Osakkeen omistaja Medviro Oy Vaatimuksia diagnostiselle mikrobiologian laboratoriolle Luotettavat tulokset Vieri- ja kotitestaukset lisääntyvät Diagnostiikan nopeus lyhyemmät hoitoajat, avohoidossa käynnit lisääntyvät Infektion aiheuttaja selvillä 2 tunnin kuluttua sairaalaan tulosta Näytteenoton (ja logistiikan) kehittäminen Analytiikka keskittyy isoihin keskuslaboratorioihin, integraatio Toimiva tietojärjestelmä Jatkuva valmius seurata kehitystä ja pystyttää/evaluoida/ottaa käyttöön moderneja diagnostisia menetelmiä Yhteistyötä alan tutkimuslaboratorioiden kanssa Diagnostiset sirut, Syväsekvensointimenetelmät (highthroughput) Clinical Microbiology and Infection Volume 19, Issue 9, pages , 19 AUG 2013 DOI: / Mikä on ns. multiplex-pcr tutkimus? Esitelty v (Chamberlain ym.), käyttökohteena sikiödiagnostiikassa useiden mutaatioiden yhtäaikainen tutkiminen pienestä näytemäärästä. Samasta näytteestä voidaan monistaa useita tutkittavia geenisekvenssejä yhtäaikaisesti samassa reaktioputkessa käyttämällä useita eri alukkeita Monta PCR-testiä samassa putkessa 2, 3, jopa kymmeniä Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22: mikä on ns. multiplex-pcr tutkimus? Monistustuotteet voidaan osoittaa/tunnistaa useilla eri tekniikoilla Geelielektroforeesi, Sekvensointi Reaaliaikainen tuotteiden osoittaminen Ns. microarray -menetelmät esim. Luminex-teknologia ns. suspensioarray; oligonukleotideillä, peptideillä tai polysakkarideilla päällystettyjä mikropartikkeleita->kalastavat kohdemolekyylejä Hyödynnetään liuoskinetiikan lyhyttä reaktioaikaa ja hyvää toistettavuutta Miller M B, Tang Y Clin. Microbiol. Rev. 2009;22:

2 Käyttöalueita virusdiagnostiikassa Verenluovuttajien ja verituotteiden seulonta (Fournier-Wirth C ym. Transfusion 2010). HIV-, HCV-, HBV Lyhentää infektioiden ns. ikkunavaihetta Respiratoriset infektiot Diagnostiikka Monitorointi (Madan RP, Herold BC. Current Opinion in Organ Transplantation 2010, 15: ) Keskushermostoinfektiot Gastroenteriitit (Higgins RR ym. J Clin Microbiol 2011;49: ). Ns. superserologia (ns. serosiru) Matkailijoiden kuumetaudit Verenvuotokuumeet Rokkotaudit Multiplex-PCR:n vaatimukset ja haasteet Hyödyt: Vähentää reagenssien ja näytteen kulutusta Sopivien alukkeiden suunnittelu on vaativaa Reaktio-olosuhteet ja potilasnäytteiden käsittely tulee optimoida Kullekin näytelaadulle erikseen Sopivat testikontrollit pitää määritellä (Loens K ym. J Clin Microbiol 2012) Multiplex-reaktion riippumattomuus esim. erilaisista templaattimääristä pitää testata huolellisesti Mitä enemmän alukkeita samassa reaktiossa, sitä todennäköisemmin epäspesifistä monistumista.-> monistusreaktion teho -> Herkkyys kärsii (Azzari C, PlosOne 2010) Jokaisen alukeparin toimivuus, spesifisyys ja sensitiivisyys tulee testata erikseen ja yhdessä Useampi taudinaiheuttaja näytteessä?: Sopiva ja luotettava erotus-/tunnistusmenetelmä (esim. Luminex) Illustration of the FilmArray RP pouch and the steps involved in processing a specimen for testing using the FilmArray system. Multiplex-PCR:n vaatimukset ja haasteet Semi- ja täysautomaattiset(kin) mikrobiologiset PCR-testit laitteineen vaativat: Osaavaa henkilökuntaa Tinkimättömiä ja hyviksi todettuja työtapoja Asianmukaiset työtilat ja olosuhteet Pierce V M et al. J. Clin. Microbiol. 2012;50: Lisäksi, arvioitavia seikkoja (Babady E ym. J Clin Microbiol 2012): Hands-on aika? Hinta per näyte? TAT, montako näytettä per ajo Miten tulkitaan? PCR-testeillä löydetään oireisten potilaiden näytteistä enemmän viruksia kuin muilla testeillä Sekainfektiot ovat tavallisia, kliininen merkitys? 5-8%:ssa lasten ja aikuisten hengitystienäytteistä löytyy kaksi tai kolme virusta (Mahony ym, 2007; Mahony 2008;, Pabbaraju ym 2008) Peräkkäin sairastetut infektiot Samanaikaisesti sairastetut infektiot Kvantitaatiosta apua? (Jansen RR ym., J Clin Microbiol 2011) Haasteita kliinisesti merkittävien raja-arvojen määrittämiselle: näytteenoton ajoitus, näytteen laatu ja standardointi Kontrollien löydökset: oireeton ikkunavaiheen infektio, postinfektioosi eritys, subkliininen infektio. Viruseristyksen kesto? Miten kauan on tartuttava? CNS-infektioiden etiologian selvittäminen on haasteellista Ennen geenimonistustestien aikaa: etiologinen aiheuttaja selville meningiiteissä n. 50%:ssa Geenimonistustestien myötä etiologia selville meningiiteissä 66-85%; enkefaliiteissa 36-75% 1-3, 5 HSV etiologinen tekijä 5-35%:ssa enkefaliiteista 2,4 1 Koskiniemi M, ym., J Neurovirol Kupila L, ym., Neurology Huttunen P, ym. Acta Paediatrica Elbers J, ym., Pediatrics Leveque N, ym., J Clin Microbiol 2011

3 Multiplex-herpesvirus testi (ProveIt, Mobidiag Ltd, Helsinki) Likvor-näytteet testattiin sekä referenssi-pcr-menetelmällä että Prove-it Herpes -testillä helmi-kesäkuun 2009 aikana Kliininen evaluaatio, monikeskustutkimus (Suomi: HUSLAB, Virologian osasto, Turun yliopisto Virusopin laitos, ISLAB, Kuopio) Näytemäärä (CSF) yhteensä 495 Prospektiiviset näytteet 340 Retrospektiiviset näytteet 155 Laadunarviointikierrosnäytteitä (QCMD, TY) 51 Prospektiiviset näytteet testattiin on-line rinnan referenssi-pcr:n kanssa mahdollisuuksien mukaan DNA-ekstraktio ja Prove-it tehtiin samana päivänä Jos referenssi-pcr-testiä ei ollut saatavana, tulosta verrattiin sekvensointitulokseen (HHV-7-tapaukset) Mannonen ym. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;73:74-79 Tulokset Tuotteen herkkyys ja spesifisyys 93 % ja 99 % Jokela P ym. J Virol Meth 2012;182:82-86

4 Tuuminen T ym., J Med Virol 2013 Ivaska L ym. J Clin Virol 2013 maripoc-evaluaatio/huslab (R. Loginov) Näytteet: Lastenklinikan imulimanäytteet epidemiakaudella marraskuu huhtikuu 2012 Yhteensä 265 näytettä Näistä ajettu rinnan RVirAg (FA) ja maripoc Eriävät näytteet: mikroskopoitu uudelleen ja ajettu RVP Tulokset Tulokset 74/ 265 näytteessä löydös FA:ssa, löydöksiä 75 (yksi kaksoisinfektio) Näistä 75 löydöksestä maripoc löysi 49 (65%) Maripoc spesifisyys 99.2% ( 2 virheellisesti positiivista RSV:tä) Löydös FA:ssa Maripoc Parainfluenssa Parainfluenssa Parainfluenssa (100%) Adenovirus 3 3 (100%) Influenssa A 10 9 (90%) Influenssa B 1 0 RSV (62%) Kaikki Lkm Yhtenevät Yhtenevät % Eriävät RSV:t , , , , ,9 16 Harmaa= ei-immuunipuutteiset potilaat Vihreä= immuunipuutteiset potilaat

5 Yhteenveto Diagnostisia testejä päivitettävä jatkuvasti, menetelmät myös monianalyyttitestit - kehittyvät Multiplex-paneelit tulleet diagnostiikkaan Koinfektiot ovat yleisiä Tulokseen vaikuttavat: Preanalyyttiset tekijät: näytteen laatu, kuljetus ja näytteenkäsittely Potilasaineisto! Löydösten merkitys? Lisätutkimuksia kaivataan. Oikeat näytteet oikeasta paikasta oikeaan aikaan oikein otettuna