Bakteerivasta-ainetestin validointi

Transkriptio

1 Bakteerivasta-ainetestin validointi Millainen käyttö odotettavissa? -Diagnoosin teko? seulontatesti vai varmistustesti? yksi näyte parinäytteet -Hoidon seuranta? sarjanäytteet

2 Mikä on etsityn taudin insidenssi väestössä? Sisältääkö otos normaaliväestöstä taudin jo sairastaneita henkilöitä? Voidaanko normaaliaineistosta karsia nämä jo sairastaneet pois? Millä perusteilla? Jos tauti on harvinainen, niin onko todennäköistä, että kliinikko osaisi asettaa potilaan kohdatessaan tämän diagnoosin millään muulla kriteerillä? Paljonko on alidiagnostiikkaa? Vaikuttaa testin sensitiivisyyden ja spesifisyyden laskentaan, jos vain tyypillisimmät tapaukset osataan luokitella oikein kliinisin tai patologisin perustein.

3 Validoinnin kulku 1. Testin hajonnan mittaaminen (CV%). Jos hajonta ei ole hallinnassa, ei lisätyöllä voida paljonkaan parantaa tuloksia. Metodi on ensin hiottava päätöksenteon kannalta riittävän pieneen hajontaan. 2. Normaaliaineiston mittaus ja valikoitu sarja oikeita potilaita. Tarkastellaan jakaumaa: Vasta-ainepitoisuudet ovat yleensä vinosti jakautuneita. Silloin tunnusluvut on parempi laskea geometrisestä keskiarvosta eli datat muunnetaan logaritmisiksi.

4 Keskiarvon ja keskipoikkeaman laskenta normaaleista. +2 SD raja on käyttökelpoinen seulontatestissä, jota seuraa jatkossa varmistus. +2 SD raja voi olla käyttökelpoinen myös, jos tauti ei ole leimaava ja hoito on jokseenkin vaaraton tai kliininen diagnoosi voidaan epäilyn herättyä tehdä melko hyvällä varmuudella. +3SD rajan käyttö tarpeen, jos laboratoriodiagnoosin tulee olla edes kohtuullisenkin tarkka ilman jatkotutkimuksia.

5 Tulosten havainnollistaminen Esimerkiksi: Lasketaan aineiston tulokset etäisyytenä normaaliaineiston keskiarvosta käyttäen mittayksikkönä keskipoikkeamaa. -Vähennetään kunkin näytetuloksen logaritmista keskiarvon logaritmi ja jaetaan tulos logaritmisen aineiston keskihajontaarvolla.

6 Etäisyysarvoja keskihajonta-yksikköinä on helppo käyttää arvioitaessa tuloksen jakaumaa. Jos laskenta meni oikein, saadaan sataa näytettä kohti noin 5 tulosta, jotka ovat joko yli tai alle 2.0 SD-yksikköä.

7 A. Frey et al. / Journal of Immunological Methods 221 (1998) 35-41

8 SD-yksikköjen laskenta 16-kesŠ-04 Count Count Count-apu Log-SD Log-SD SD-yksikkšero Dil IgG-TyMu Log-IgA-Ent -Blank keskiarvoon Blank Stand TyMu 1/ Stand Stand Stand Stand Stand NHS-pooli Pos-kontrol Labq Labq NHS-pooli

9 Alkuperäistulokset Salmonellavasta-aineet TR-FIA RV 1/500 laimennetut nšytteet ENT-IgA ENT-IgM ENT-IgG tymuiga tymuigm tymuigg 1 NHS/rut su su spr/nhs.m nhs.fm NHS/rut su su spr/nhs.fm nhs.m OUT

10 Logaritmit Log ENT-IgA ENT-IgM ENT-IgG tymuiga tymuigm tymuigg NHS/rut su su spr/nhs.m nhs.fm NHS/rut su su spr/nhs.fm nhs.m

11 Poikkeamat normaaliaineistossa SD-etŠisyys geometrisestš keskiarvosta ENT-IgA ENT-IgM ENT-IgG tymuiga tymuigm tymuigg NHS/rut su su spr/nhs.m nhs.fm NHS/rut su su spr/nhs.fm nhs.m

12 Numerusarvot, taso normalisoitu haluttuun +2SD ylärajalukemaan Tasokorjattu tulos ENT-IgA ENT-IgM ENT-IgG tymuiga tymuigm tymuigg NHS/rut su su spr/nhs.m nhs.fm NHS/rut su su spr/nhs.fm nhs.m

13 Lisää normaaliaineistoa varmennukseksi ENTERITIDIS TYPHIMURIUM SPR IgA IgM IgG IgA IgM IgG N N nro 17 hylštty. IgA tasot niin matalat. N N Keskiarvo N SD N SD N SD N SD N SD N Numerukset N Keskiarvo N SD N SD N SD N SD N SD N N NHS-pooli k N N N N N M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M NHS pos pos

14 Lisätty normaaliaineisto tasokorjattuna pooliseerumin avulla Titteri +2SD-rajaksi 4000 asetettuna ENTERITIDIS TYPHIMURIUM SPR IgA IgM IgG IgA IgM IgG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M NHS pos pos

15 Intra-assay toistettavuus Eu-salmonella intra assay näyte 1 = 03su :4 titte ri näyte 2 = 04su Ent-G näyte 1 Ent-G näyte 2 pvm tulos tulos Me a n 7370, ,00 SD 156, ,83 CV% 2,12 5,07 Mean - SD 7213, ,17 Mean + SD 7526, ,83 Mean - 2SD 7057, ,34 Mean + 2SD 7683, ,66 Mean - 3SD 6900, ,51 Mean + 3SD 7839, ,49 Tavoite alue

16 CV% ja näytteen vasta-ainepitoisuus Salmonella - FIA ag-levyjen sšilyvyys VŠliajat pšiviš Log Aritmeettinen ag kouttaus keskiarvo keskihajonta CV% keskiarvo keskihajonta CV% levyn pesu sarjan aloitus nšyte inc log-arvot Ent-IgA nhs rut nhs rut pos pos pos pos nhs m nhs m nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm su : su su su su su su su

17 CV% riippuvuus vasta-ainekonsentraatiosta Enteritidis IgM aritmeettinen 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 CV% 50,00 Sarja1 40,00 30,00 20,00 10,00 0, Tulos

18 Enteritidis IgA-vasta-aineet ja konjugaatin konsentraatio

19 Toiminta-alue ja konjugaatin konsentraatio TYMU IgA 3X count N 62, laim

20

21

22

23 Toiminta-alue ja konjugaatin konsentraatio TYMU IgG 3X N count , laim

24 Toiminta-alue ja konjugaatin konsentraatio count TYMU IgM 3X N 62, laim

25 Lineaarisuustesti ENT IgA ENT IgM ENT IgG TYPH IgA TYPH IgM TYPH IgG 1 NHS/R posko NHS40fm NHS32M ent1/03 1:2 >13353 > > ent1/03 1: ent2/03 1:2 >13353 > > ent2/03 1: ty2/03 N ty2/03 1: ty1/04 N ty1/04!:3 337 OUT su >13353 > > 4770 > su > su > su su su su su OUT su <55,00 OUT <165, <67,60 22 NHS40fm NHS32M posko NHS/R 400 OUT

26 Lineaarisuus Enteritidis IgA Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 log esilaimennuskerroin

27 Lineaarisuus Enteritidis IgM Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2 log esilaimennuskerroin

28 Lineaarisuus Enteritidis IgG Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2 log esilaimennus

29 Lineaarisuus Typhimurium IgA Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2 log esilaimennus

30 Lineaarisuus Typhimurium IgM Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2 log esilaimennus

31 Lineaarisuus Typhimurium IgG Tulos ,5 0 0,5 1 1,5 2 2 log esilaimennus

32 Antigeenilla päällystettyjen levyjen säilyvyys Salmonella - FIA ag-levyjen sšilyvyys ag kouttaus levyn pesu sarjan aloitus nšyte inc O/N 2h O/N 2h O/N Ent-IgA nhs rut nhs rut pos pos pos pos nhs m nhs m nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm nhs fm < < nhs fm < nhs fm < < nhs fm su : su su su su su su su

33 Logaritmin ottoon tarvitaan alle tai yli skaalan olevien tulosten koodaus Alle ja yli arvot muunnettuina Ent-IgA

34 Seerumin inkubaatioaika levyllä Typhimurium IgG inkubaatioaika y = 1,1852x + 16,341 R 2 = 0, h O/N

35 Interassay toistettavuus -kesken, koska käytettävät olosuhteet vasta saatu kasaan EntIgA EntIgM EntIgG TymuIgA TymuIgM TymuIgG 03su tuore levy O/N tuore levy 2h sšil 1 O/N sšil 2 2h sšil 3 O/N sšil 4 2h sšil 5 O/N tuore levy O/N

36 Viljelypositiiviset näytteet ta-aineet TR-FIA LPS-antigeenit bakt.viljely Ottoaika vrk pos viljelyn O-antigeeni H-antigeeni H-antigeeni jälkeen faasi 1 faasi 2 S. Paratyphi A 0 1,2,12 a [1.5] S. Enteritidis 1 1,9,12 g,m [1,7] S. Rissen 3 6,7,14 f,g --- S. Panama 9 1,9,12 l,v 1,5 S. Enteritidis 27 1,9,12 g,m [1,7] S. Typhi 1 (veriviljely) 9,12 d --- S. Paratyphi B 1 (veriviljely) 1,4,[5],12 b 1,2 S. Typhi 2 (veriviljely) 9,12 d --- S. Typhi 3 (veriviljely) 9,12 d --- C. jejuni 0 C. jejuni 1 C. jejuni 1 C. jejuni 1 C. jejuni 2 C. jejuni 10 C. jejuni 13 yer.va posit. yer.va posit. yer.va posit. yer.va posit. yer.va posit. yer.va posit.

37 Viljelypositiiviset näytteet Ent-IgA Ent IgM Ent IgG Tymu IgA Tymu IgM Tymu IgG

38 Viljelypositiiviset näytteet: modifioitu Widal Widal agglutinaatio (huoneenlämpö!) O:4,5,12 O:9,12 O:6,7 H:d H:b H:i H:1,2 H:g,m H:a < < Salmonella < < < < <80 <80 <160 <160 <160 <160 <160 < < < < < < < <160 <160 < < < < < < < < < < < < <80 <80 < Campylobacter <80 80 < <160 < < <80 <80 < < < <160 < <80 <160 < <160 <80 <80 < <160 < <160 < < <160 <160 <160 <160 <160 Yersinia <80 <80 <80 <160 <160 <160 < < < <160 <160 < <160 <160 <80 <80 <80 <160 < <160 <160 < < <160 <160 <160 <160 < < <160 <160 <160 <160 <160

39 Sensitiivisyyden laskenta -Tarvitaan riittävän iso aineisto viljelypositiivisia tapauksia, joista on kattava serologisen näytteen otto. Onnistuu vain prospektiivisessa tutkimusprojektissa. Veriviljelypositiivisten tapausten koonti erityisen työlästä. Sensitiivisyys siksi puuttuu eikä positiivista tai negatiivista ennustearvoakaan siksi voida laskea, saatikka ROC-käyrää.

40 Kliininen epidemiologia Jyrki Elo, Esa Läärä, Pertti Happonen Diagnostisen testin arviointi ja tulkinta I - sensitiivisyys ja spesifisyys

41 Yleispätevän mittayksikön luonti? Lähinnä toteutumista on konjugaatin kiinnittymistehon määritys rekombinanttivasta-aineilla, joissa yksi tietty vasta-aineen variaabeliosa on kiinnitetty humaanivastaaineiden eri luokkiin ja alaluokkiin. Esimerkkinä anti-nip. Tämä ei tiettävästi ole vielä kaupallisesti saatavilla. -Jos olisi kaupallinen, niin reagenssin sitoutumiselle non-amplifioivassa määrityksessä tai entsyymikineettisessä määrityksessä voitaisin saada massavastine käytetyn immunoglobuliinin määrästä.