Immunohistokemian ja tekniikan kierrosten arviointi ja ongelmakohdat värjäysmenetelmissä

Transkriptio

1 Immunohistokemian ja tekniikan kierrosten arviointi ja ongelmakohdat värjäysmenetelmissä Minnamaija Lintunen Sairaalasolubiologi Tyks-Sapa-Liikelaitos Patologian palvelualue

2 Labquality Oy:n patologian kierrokset Ulkoisen laadunarvioinnin kierrokset laboratorioille = EQAS-kierrokset (External Quality Assessment Schemes) menetelmien toimivuus diagnostiikan toimivuus

3 1992 immunohistokemian koekierros 2014: 2 x immunohistokemia Melan A, HMB-45, S-100, MelPan CGA, SYP, CD30, TTF-1 2 x tekniikka PAS, E-PAS, Kongo Retikuliini, Giemsa, Leder 2 x histopatologian diagnostiikka (virtuaalimikroskopiakierros) 2 x sytologinen diagnostiikka (virtuaalimikroskopiakierros)

4 Kierroksen valmistelu n. 1 kk Kudosten valinta, leikkaaminen ja testaaminen: kierrosasiantuntijat, laboratoriohoitaja/bioanalyytikko Saatekirje: kierrosasiantuntijat, EQA-koordinaattori Päivi Rauvo Lasien lähetys asiakkaille: EQA-koordinaattori

5

6 Asiakkaiden värjäykset n 1 kk palautusaikaa värjätyille laseille, menetelmätiedoille (valmiille kaavakkeille) omalle arviolle värjäyksen onnistumisesta

7 Värjäysten arviointi Kierrosasiantuntijat ja arvioijat: 1-useampi patologi 1-useampi sairaalasolubiologi Tiedossa vain asiakasnumerot Yhdessä mikroskopointi keskustelu konsensuspisteiden antaminen

8 Arviointiasteikko 5 pistettä = erinomainen värjäytyminen 4 pistettä = lähes moitteeton värjäytyminen 3 pistettä = hyvä, diagnoosin kannalta riittävä värjäytyminen, mutta selkeästi jotain parannettavaa 2 pistettä = heikko värjäytyminen, diagnoosi jää epävarmaksi 1 piste = tosi heikko värjäytyminen, epäonnistunut 0 pistettä = täysin negatiivinen/kokonaan positiivinen värjäytyminen, epäonnistunut

9 Tulokset Raportti n 1 kk kuluessa Laboratoriokohtainen pisteraportti Pistetaulukko, jossa kaikkien pisteet ja kommentit ilman mitään tunnistetietoja 5 pistettä: ei kommentoitavaa 4-0 pistettä: mitä vikaa värjäyksessä 2-0 pistettä: korjausehdotus menetelmän/tuloksen parantamiseksi

10

11

12 Värjäysten arviointiperusteet Oikea/ei-haluttu värjäytyminen Yleisimmät ongelmat Yleisimmät menetelmät Kriittiset kohdat: a) Histologiset värjäykset: värjäysliuosten konsentraatio ja säilyvyys, inkubaatioaika- ja lämpötila, pesut, taustaväri b) Immunohistokemialliset värjäykset: esikäsittely, osoitusmenetelmä, hyvä primaarivasta-aine, oikea laimennos, inkubaatioaika ja lämpötila

13 Esimerkkikierrokset Tekniikka 1, 2013: Helicobakteeri ja AB-PAS Immunohistokemia 2, 2012: CD3, CD20, CD117, CD138

14 Helikobakteeri pylori Osallistujia 45 kpl (26 Suomesta, 19 ulkomailta) 5 p: 15 kpl 4 p : 19 kpl 3 p: 7 kpl 2 p: 2 kpl 1 p: 1 kpl 0 p: 1 kpl Keskiarvo 3,9 Giemsa-värjäys: 43 kpl Automaatilla 24 kpl (1 epäonnistunut) Manuaalisesti 19 kpl (2 epäonnistunutta) Warthin-Starry: 2 kpl Automaatilla 1 kpl Manuaalisesti 1 kpl (1 epäonnistunut)

15 Warthin-Starry: Ruskeanmustat helikobakteerit

16 Giemsa: Siniset helikobakteerit

17 Liian voimakas tausta: 2 pistettä

18 Hyvin heikot bakteerit: 2 pistettä liuoksen käyttöikä, etikkahappo pesuliuoksessa

19 Ei reaktiota: 0 pistettä Giemsa liuotettu happoon

20 Eniten käytetty 4% Giemsa 60 min RT Jos vahvempi Giemsa, tuli myös värjäysaikaa lyhentää (esim. 25% Giemsa 5 min) Onnistuu pesuilla tai ilman Etikkahappo pesuliuoksessa haalistaa Liuoksen vaihto joka kerta tai vähintään kerran viikossa

21 AB-PAS Osallistujia 43 kpl (27 Suomesta, 16 ulkomailta) 5 p: 16 kpl 4 p : 12 kpl 3 p: 9 kpl 2 p: 4 kpl 1 p: 0 kpl 0 p: 2 kpl Keskiarvo 3,8 Automaatilla 24 kpl (ei epäonnistuneita) Manuaalisesti 19 kpl (6 epäonnistunutta) Taustaväri Hematoksyliini 29 kpl (4 epäonnistunutta) Muu/ilman taustaväriä 14 kpl (2 epäonnistunutta)

22 Alcian blue (AB): sininen hapan lima

23 AB: sininen hapan lima liian heikko 2 pistettä liuosten käyttöikä, värjäysajan pidentäminen

24 Periodic acid Schiff (PAS): punainen neutraali lima

25 AB: sininen hapan lima PAS: punainen neutraali lima

26 Pelkkä PAS: 0 pistettä

27 Molemmat liian heikkoja 2 pistettä liuosten käyttöikä, värjäysaikojen pidentäminen

28 Eniten käytetty 0,5-1% AB 30 min AB-liuoksen käyttöikä 1-2 kk Pesut etikkahapolla tai ilman Eniten käytetty 0,5-1% PA 10 min PA-liuoksen käyttöikä 1 viikko Eniten käytetty kaupallinen Schiff 10 min Vaihto ehdottomasti ennen kuin punertaa eli noin 1-2 viikon välein

29 CD3 Osallistujia 37 kpl (19 Suomesta, 18 ulkomailta) 5 p: 8 kpl 4 p : 16 kpl 3 p: 8 kpl 2 p: 4 kpl 1 p: 1 kpl 0 p: 0 kpl Keskiarvo 3,7 Automaatilla 31 kpl (2 epäonnistunutta) Manuaalisesti 19 kpl (2 epäonnistunutta) Polymeeri/multimeeri detektio 30 kpl (5 epäonnistunutta) Biotiini detektio 2 kpl (0 epäonnistunutta) Esikäsittelypuskuri ph kpl (4 epäonnistunutta) Esikäsittelypuskuri ph 6 1 kpl (1 epäonnistunut)

30 CD3: T-lymfosyytit solumembraanin myötäisesti Tonsilla T-solulymfooma

31 Liian heikko: 2 pistettä Esikäsittelypuskuri ph 9:ksi, vasta-aineen väkevöiminen Tonsilla T-solulymfooma

32 Taustaa: 3 pistettä Polyklonaalinen vasta-aine, josta liian vahva laimennos Tonsilla T-solulymfooma

33 Hyviä vasta-aineita: 2GV6 (RTU) LN10 (RTU) F (1:50 1:300) PS1 (1:50) SP7 (1:50) Dako polyklonaalinen (1:50 1:500) Ei sitraattipuskuria ph 6 esikäsittelyyn vaan ph:n 8-9 esim. Tris-EDTA puskuri Oikea detektiomenetelmä suhteutettuna vastaaineen laimennokseen ja inkubaatioaikaan

34 CD117 Osallistujia 33 kpl (14 Suomesta, 19 ulkomailta) 5 p: 1 kpl 4 p : 12 kpl 3 p: 7 kpl 2 p: 9 kpl 1 p: 1 kpl 0 p: 3 kpl Keskiarvo 2,8 Automaatilla 26 kpl (9 epäonnistunutta) Manuaalisesti 6 kpl (4 epäonnistunutta) Polymeeri/multimeeri detektio 27 kpl (10 epäonnistunutta) Biotiini detektio 5 kpl (3 epäonnistunutta) Esikäsittelypuskuri ph kpl (10 epäonnistunutta) Esikäsittelypuskuri ph 6 2 kpl (2 epäonnistunutta) Ei esikäsittelyä 1 kpl (1 epäonnistunut)

35 CD117: membraanipainotteisen sytoplasmisesti GIST-kasvain Tonsilla

36 Liian heikko: 2 pistettä Esikäsittelypuskuri ph 9:ksi, vasta-aineen väkevöiminen, herkän detektiomenetelmän käyttö GIST-kasvain Tonsilla

37 Epäonnistunut: 0 pistettä Klooni ja detektiomenetelmä eivät toimi yhdessä GIST-kasvain Tonsilla

38 Väärä värjäytyminen: 0 pistettä Kaikki membraaninmyötäisesti Polyklonaalinen vasta-aine, josta aivan liian vahva laimennos Kaikki tumat Huono klooni

39 Hyviä vasta-aineita: Dako polyklonaalinen (1:50 1:500) YR145 (1:100) Klooni SP26 aiheuttaa ongelmia Aina tulee käyttää esikäsittelyä, mutta ei sitraattipuskuria ph 6 vaan ph 8-9:n puskuria Tarpeeksi herkkä detektiomenetelmä suhteutettuna vasta-aineen laimennokseen ja inkubaatioaikaan sekä klooniin

40 Kiitos