Kontrollinäytteet. Heikki Aho TYKS patologia

Transkriptio

1 Kontrollinäytteet Heikki Aho TYKS patologia

2 Kontrollityypit Positiivinen kontrolli Negatiivinen kontrolli Metodikontrolli Lääketieteellinen kontrolli

3 FINAS S44/1998 Suositus EN ja EN standardien sekä ISO Guide 25 oppaan soveltamisesta patologian laboratorion akkreditoinnissa Värjäysten toimivuus todetaan tarvittaessa positiivisin ja negatiivisin kontrollein Niiden avulla voidaan varmentaa erikoismenetelmät

4 FINAS S44/1998 Esimerkkejä kontrolleja vaativista menetelmistä Limojen ja hiilihydraattirakenteiden osoitusmenetelmät Nukleiinihappojen osoitusmenetelmät Amyloidin osoitusmenetelmät Mineraalien ja metallien osoitusmenetelmät t (alumiini, kalsium, kupari, rauta) Argentaffiinireaktio Argyrofiilireaktio Haponkestävien sauvabakteerien osoitusmenetelmät Mikrobien osoitukseen käytettk ytettävät t hopeamenetelmät Nukleiinihappohybridisaatio Immunohistokemia (immunoperoksidaasi, immunofluoresenssi ja muut menetelmät) t) Entsyymihistokemia

5 FINAS S44/1998 Mikroskooppivalmisteissa on usein patologisissakin tiloissa helposti tunnistettavia normaaleja solu- ja kudosrakenteita, joiden värjäytyminen voi ilman erillistä kontrollinäytett ytettä suoraan osoittaa menetelmän n toimivuuden (sisäinen inen kontrolli)

6 ISO/IEC Menetelmien validointi (5.4.5) Menettely, jonka avulla tutkimalla ja puolueettomalla näytn ytöllä varmistetaan, että menetelmä täyttää käyttötarkoituksen tarkoituksen asettamat vaatimukset Kalibrointi referenssinormaaleja tai referenssimateriaaleja käyttk yttäen

7 ISO Laboratorion tulee käyttk yttää validoituja menettelyjä (5.5.2) Menettelyt tulee katselmoida käyttk yttöönoton alussa ja tietyin ajanjaksoin (5.5.2) Laboratorion tulee suunnitella sisäinen inen laadunohjausjärjestelm rjestelmä,, joka varmistaa sen, että tulosten laatutaso saavutetaan (5.6.1)

8 ISO Mittausjärjestelmien kalibrointiohjelma ja oikeellisuuden varmistusohjelma (5.6.3) Kun kalibrointi ei ole mahdollista tulee käyttk yttää muita keinoja tulosten luotettavuuden varmistamiseen Käyttämällä sopivia vertailumateriaaleja, joiden on varmistettu ilmentävän n käytettk ytettävän n materiaalin ominaisuuksia

9 Qualisan,, patologian laatutunnus Patologian laboratorion toimintajärjestelm rjestelmä, versio 4.2, kappale Perinteisillä värjäysmenetelmillä ymmärret rretään kemiallisia menetelmiä Värjäysten toimivuus todetaan positiivisin ja negatiivisin kontrollein Jos itse näytteeseen n ei sisälly vertailukudosta, pitää kontrollinäytteit ytteitä tutkia sääs äännöllisesti

10 Qualisan,, patologian laatutunnus Patologian laboratorion toimintajärjestelm rjestelmä,, versio 4.2, kappale 7.4 Menetelmävalidointi validointi, validointiraportin sisält ltö Menetelmän n käyttk yttötarkoitustarkoitus Menetelmän n kuvaus ja laatuvaatimukset Tulos ja sen tulkinta Vastuuhenkilöt Validoinnin suorittajat Validointitestauksen tulokset Suositus menetelmän n käyttk yttöönotosta ja käyttk yttöönottoajankohdasta Menetelmän n käytk ytön n edellyttämät t sääs äännönmukaiset nmukaiset kontrollit (laadunvarmistus) Validointitestauksen suorittajien allekirjoitukset ja päivp iväys Hyväksyj ksyjän n allekirjoitus ja päivp iväys

11 Kontrollivärj rjäyksen tarve Päivittäinen inen tarve epätodenn todennäköinen Perusvärj rjäykset (HE, van Gieson) Tutkittava näyte n sisält ltää miltei aina sisäisen isen kontrollin Muodon ja muun rakenteen perusteella tunnistettavaa ainesta, jonka värjv rjäytyminen tunnetaan Teknisesti yksinkertaiset ja lyhyet menetelmät Vaikea arvioida menetelmän n yksinkertaisuutta Kokemuksen perusteella ongelmattomat menetelmät Useiden vuosien aikana ei ole havaittu epäonnistuneita värjäyksiä

12 Kontrollivärj rjäyksen tarve Päivittäinen inen tarve todennäköinen Monimutkaiset värjv rjäysprosessit, jos sisäist istä kontrollia ei ole Mikrobivärj rjäykset Immunoperoksidaasimenetelmät,, jos sisäist istä kontrollia ei ole Immunofluoresenssi? Nukleiinihappomenetelmät

13 Histologisten värjäysten kontrollinäytteet aoh Tuula Aarikka Värjäyksen nimi Kontrolliblokin nro Kongo Ziehl-Nielsen mykobakteeri Metyylivihreä-pyroniini, MGP Preussinsininen Rauta Gram bakteeri Verhoeff elastiini Steiner spirokeetta Rodaniini kupari Rubeaanihappo kupari Leder kloroasetaattiesteraasi Amyloidoosi Tbc-bakteeri Plasmacytoma Keuhko, makrofagi Aivoabskessi, G+ kokki, keinotekoinen Aorta, keuhko Keinotekoinen, aivopala Maksa Maksa Luuydin A I, A III (PO5 TUBI KEUHKO ARTIF loppu), A286 VII B B E (B on hyvä) (B loppu) STAF-06 I-VI A VII B F V 4 vrk A K maksa CU K maksa CU B edta

14 Kontrollikäyt ytäntö Suomessa Eberhardt K, Winter J, Stadia (Anneli Kekkonen): Kontrollikäytäntö histologisissa värjv rjäyksissä Berliininsini (rauta) 11 /12 Oil red O (rasva) 2 /5 Bielschowsky (aksonit)) 6 /12 Fontana-Masson (melaniini) 4 /12 Gram (bakteerit) 6 /8 Kupari 1 ei käytk ytä Eberhardt ja Winter 2007

15 Kontrollikäyt ytäntö Suomessa Grimelius (karsinoidi)) 8 /9 Giemsa (helikobakteeri)) 1 /12 Leder (leukosyyttisarja) 10 /12 Luxol fast blue (myeliini)) 2 /3 Metyylivihreä-pyroniini (RNA) 6 /12 Musikarmiini (lima) 1 /2 Orseiini (elastiini)) 6 /12 Van Gieson (sidekudos) ei Warthin-Starry (spirokeetta) 7 /12 Verhoeff (elastiini)) 1 /4 Eberhardt ja Winter 2007

16 Tinktoriaalisia kontrolleja PAS neutraali lima, tyvikalvo, mikrobit Rauhaset, suoli, iho, sieni Alcian blue hapan lima Suoli, rusto, myxedema Giemsa helikobakteeri Ziehl-Neelsen tuberkuloosi, muu mykobakteeri Gram bakteeri G ja G + Warthin-Starry Borrelia,, spirokeetta MGP RNA DNA Plasmasolu, fibroblasti, immunoblasti Oil red rasvakudos

17 Tinktoriaalisia kontrolleja Masson-Fontana Ihon melanosyytit Suolen neuroendokriiniset solut Melanooma Grimelius Karsinoidi,, haima Orseiini elastiini Iho Verhoeff elastiini Aorta Toluidiinisini Mastosytooma,, iho Rauta Hemosideriinikertymä Kongo amyloidi AA- ja AL-amyloidi Muu amyloidi Munuainen, sydän

18 Kontrollivärj rjäysten teko Liitetää ään n mukaan värjv rjäyssarjaan Kontrollilasi kaikille tutkijoille Yksi kontrollilasi sarjaan, jonka tutkii laboratorion valtuutettu vastuuhenkilö tai muu asiantuntija Kemiallisissa värjv rjäyksissä ei yleensä tarvetta metodikontrolleihin Negatiivinen kontrolli

19 Pigmentit, rauta, Prussian blue

20 Kupari, maksa

21 Negatiivinen kontrolli Harvoin tarpeen Osoittaa, että kudosrakenteet itse eivät t aiheuta spesifistä reaktiota Entsyymihistokemia

22 Lääketieteellinen kontrolli Tautimuutoksen osoittava morfologinen positiivinen kontrolli Tietyn taudinaiheuttajan tai tunnetun rakennemuutoksen etsiminen näytteestn ytteestä Käytännössä referenssikirjallisuus korvaa tällaisen kontrollin Harvinaisten mikro-organismien organismien ja kasvaintyyppien kontrollikirjasto

23 Mikrobivärj rjäykset Kontrollivärj rjäys ei ainoastaan validoi menetelmää ää,, vaan toimii viitemateriaalina harvinaisille mikro-organismeille organismeille Kontrollileike samalle lasille Eliminoi lasikohtaisen värjv rjäysvaihtelun Huolehdittava, ettei sekaannusta varsinaiseen näyteleikkeeseen tapahdu Leikkeet saman paksuisia

24 Mikrobivärj rjäykset Kontaminaatio voi tapahtua useassa prosessin vaiheessa Kuljetus, leikkaaminen, värjv rjääminen Yleisin kontaminaatiolähde leikkeiden kelluntahaude ( o C) Bakteerit, levät t ja sienet Vesijohtovedessä mikro-organismeja organismeja Käytettävä tislattua vettä

25 Mikrobivärj rjäykset Kontaminanttiorganismit fokustason alle Näin käy k y myös s jos adhesiivi (gelatiini, albumiini, poly-l-lysiini lysiini) ) on kontaminoitunut Bakteerit ja sienet voivat kasvaa puskureissa, reagensseissa ja väriliuoksissav Päällystysvaiheen kontaminantti fokusoituu leikkeen fokustason yläpuolelle

26 Mikrobivärj rjäykset Kontaminantit jakautuneet sattumavaraisesti leikkeen pääp äälle ja lasille Kontaminaatio bakteereilla voi tapahtua jo ennen fiksaatiota Joissain värjv rjäyksissä voi syntyä bakteereja muistuttavia kiteitä Gram-värj rjäyksessä sauvamaisia kiteitä,, polarisoivat

27 Gram-värj rjäys,, kokkibakteeri

28 Ziehl-Neelsen Neelsen, tbc,, keuhko

29 Grocott, Pneumocystis,, keuhko

30 Methyl-Green Green-Pyronin,, RNA

31 Entsyymihistokemia Kontrollileikkeet oleellisia Useita syitä reaktion epäonnistumiselle Esimerkiksi varastoliuos tullut tehottomaksi, joten tunnettu positiivinen leike liitettävä värjäykseen Negatiiviset kontrollit Substraatti jätetty j pois Leike esikäsitelty sitelty entsyymin inhiboimiseksi

32 Kloroasetaattiesteraasi (Leder)

33 Immunohistokemian suositeltavat kontrollit Kontrollinäyte, joka sisält ltää testattavaa antigeeniä Positiivinen kontrolli Teollisesti tuotettuja spesifisyyden takaavia standardinäytteit ytteitä ei ole tarjolla

34 Positiivinen kudoskontrolli Leikkeessä pitäisi isi olla pieni hennommin positiivinen alue, negatiivisia alueita ja vahvasti positiivisia alueita Normaalien ja neoplastisten kudosten kontrollikirjasto Monikudosblokit

35 Negatiivinen kudoskontrolli Prosessoidaan samalla tavalla kuin varsinainen näyte Esimerkiksi normaalia aivoa, jota verrataan herpes simplexin infektoimaan aivoon

36 Sytokeratiini 7 NordiQC Rinnan duktaalinen karsinooma + Sappitiehytepiteeli + Mahan fundusepiteeli heterogeeninen Huonosti erilaistunut colonkarsinooma + Hyvin erilaistunut colonkarsinooma Maksasolut Merkelin solut -

37 EMA NordiQC Maligni mesoteliooma membraani + Keuhkon adenokarsinooma sytoplasma + Tonsillan levyepiteeli + Meningeooma heterogeeninen + Glioblastooma dot-tyyppinen tyyppinen +

38 CEA NordiQC Umpilisäke enterosyytit kohtalainen / vahva + Ruokatorvi pinnallinen levyepiteeli + Paksunsuolen adenokarsinooma membraani + Neutrofiilit, histiosyytit,, maksasolut Mesoteliooma -

39 Kalretiniini NordiQC Umpilisäke ganglionsolut, aksonit, makrofagit + Epiteliaalinen mesoteliooma + Granulosasolutuumorin luteinisoituneet solut kohtalainen + Munuaisen tubulus tai korkeintaan paikallinen +

40 Melan A NordiQC Ihon melanosyytit + Maligni metastaattinen melanooma + Desmoplastinen melanooma kohtalainen + Lisämunuaisen kuorikerros + Luteinisoitunut granulosasolutuumori +

41 AMACR NordiQC Eturauhasen adenokarsinooma + tai kohtalainen Hyperplastinen eturauhanen - Stroomasolut -

42 Estrogeenireseptori NordiQC Kohdunkaulan lieriö- ja levyepiteeli +, suurin osa stroomasta + Mastopatia + Duktaalinen rintasyöpä +

43 Alfa-SMA NordiQC Muscularis propria, muscularis mucosae, myofibroblastit + Rinnan myoepiteeli + Maksan perisinusoidaaliset solut suurin osa + Verisuonet +

44 CD 10 NordiQC Itukeskuksen B-solut B + Sappikanalikulukset + Burkittin lymfooma + Kirkassoluinen munuaiskarsinooma + Neutrofiilit + KLL -

45 Kalponiini,, rintarauhanen

46 HMW-keratiini CK 34beetaE12, prostata

47 Her2/neu neu,, DCIS

48 Her2/neu neu,, rintasyöpä

49 CD1a, Langerhansin solu

50 CD15, Reed-Sternbergin solu

51 Sykliini D1, manttelisolulymfooma

52 Periferiini,, suolen seinämä

53 CMV, keuhko

54 Sytologia Ei yleensä tarvetta metodologisiin kontrolleihin Positiivisen esimerkiksi mikrobeja sisält ltävän kontrollin tai immunohistokemiallisen kontrollin saaminen on hankalaa Ylimää ääräiset sivelyt runsaista näytteistn ytteistä Kudosleikkeet, vaikka eivät t täysin t vastaakaan sytologista näytettn ytettä

55 Johtopää äätökset Kontrolleja ei koskaan voi laadulliselta kannalta käyttk yttää liikaa Rajaksi nousevat voimavarat Jokainen kontrolli vähentv hentää varsinaiseen tuotannolliseen toimintaan kohdistettua panosta Jos laboratorio ei jossain menetelmäss ssä käytä säännöllistä kontrollia, on se voitava perustella Tällaisia perusteita voivat olla sisäisen isen kontrollin esiintyminen, menetelmän n yksinkertaisuus ja pitkäaikainen käyttk yttökokemus.

56 Johtopää äätökset Jos sääs äännöllinen positiivinen kontrolli on vuosikausia ollut poikkeuksetta onnistunut eikä ristiriitaisuuksia tuloksissa ole esiintynyt, on mahdollista harkita kontrollivälin lin harventamista tai jopa kontrollista luopumista Menettelyt tulee kuitenkin katselmoida tietyin ajanjaksoin