Glykoproteiinihormonien analytiikka. Henrik Alfthan HUSLAB Kliinisen kemian laitos

Transkriptio

1 Glykoproteiinihormonien analytiikka Henrik Alfthan HUSLAB Kliinisen kemian laitos

2 Glykoproteiinihormonit Rakenne Molekyylimuodot Määritystekniikat Menetelmien kehitys Määritysongelmat

3

4

5

6

7

8 Yazaki K et. al. Am J Obstet Gynecol 138:189, 1980

9 Wide L et. al. JCEM 76:885, 1993

10

11

12

13 IFCC työryhmä hcg-määritysten standardoimiseksi Peter Berger, Innsbruck Jean-Michel Bidart, Paris Steven Birken, New York Rudolf Lequin, Eindhoven Rob Norman, Adelaide Cathie Sturgeon, Edinburgh (secretary) Ulf-Håkan Stenman, Helsingfors (chairman)

14 hcg-työryhmän tehtävät Uudet standardit Selkeä nimikkeistö Epitooppikartta Referenssimenetelmät?

15 Istukkagonadotropiini Standardit ja lyhenteet hcg, CG, human chorionic gonadotropin hcgβ: vapaa β-ketju hcgα: vapaa α-ketju hcgβcf: vapaan β-ketjun core fragmentti hcgn: nicked hcg, katkos aa β- ketjussa hcgβn: nicked hcgβ

16 3D epitope map of hcg hcgβ hcgα hcgβctp P.Berger 2000

17 Menetelmien kehitys Vasta-aineet Immunisointi (pudistetulla) antigeenillä Vasta-aineiden puhdistus Vasta-aineiden karakterisointi

18 Birken S et. Al. Methods 21, 3 (2000)

19

20

21

22 Sandwich immunoassay

23 solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G F144-6G F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E F144-4F

24 solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G F144-6G F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E F144-4F

25 solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G F144-6G F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E F144-4F

26 solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G F144-6G F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E F144-4F

27 solidi F19-9C11 F19-9C11 F19-9C11 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 F144-6G8 F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C11 F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E11 F144-4F

28 solidi F19-9C11 F19-9C11 F19-9C11 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 F144-6G8 F52-3C F142-7F F144-12E F140-2F F143-1C F140-11C F132-13C F132-9F F130-8D F140-5E F19-9C11 F94-8F F132-3C F95-5C F95-1E F95-1B F20-4E F20-6E11 F144-4F

29 Antibody reactivity with hcgβn Tracer-Eu Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11 9C11 0-sample hcgßn (2000 pmol/l) hcgß intact (2000 pmol/l) hcg (2000 pmol/l)

30 Antibody reactivity with hcgβn Tracer-Eu Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11 9C11 0-sample hcgßn (2000 pmol/l) hcgß intact (2000 pmol/l) hcg (2000 pmol/l)

31 Istukkagonadotropiini Kliininen käyttö Raskausdiagnostiikka Raskaustestit Raskauskomplikaatiot Downin syndrooma Syöpädiagnostiikka Istukkasyöpä ja rypäleraskaus Gastrointestinaalisyöpä Gynekologinen syöpä

32 Serum hcg and hcgβ in nonpregnant women and men FEMALES MALES hcg (pmol/l) hcgβ (pmol/l) < >70 0 < >70 Age (years) Age (years)

33 Serum hcg during early fetal loss and abortion Two individuals hcg ( IU/ L) Days af t er LMP

34 Serum hcg and hcgβ during treatment of choriocarcinoma Levonova Hysterectomy Lung metastases hcg (pmol/l) [ ] hcgβ (pmol/l) [ ] Days

35 1.0.9 Survival probability hcgβ <2.0 pmol/l 21 died, 82 censored p< Time (months) Figure 1. Survival curves for ovarian cancer patients presenting with a preoperative hcgß concentration < or 2 pmol/l. 36 hcgβ 2.0 pmol/l 34 died, 9 censored

36 Frequency of elevated serum levels of hcgβ in pancreatic diseases CA19-9 CEA hcgβ (%) (%) (%) Benign diseases Pancreatic cancer

37 Aiheita pohdiskeluun Menetelmien herkkyys Menetelmien spesifisyys Mittausalue Ristireaktiot Eri molekyylimuodot Analyytin labiilisuus

38 Sensitivity of various pregnancy tests hcg (IU/L) AuraTek OriPreg Concise Plus Clearview II Biocard hcg U Biocard hcg S/U Rapipreg

39 Recognition of hcgβ Sample description: Base pool spiked with hcgb IRP 75/551. Expected response in an assay recognizing hcg and hcgβ on an equimolar basis is 388 IU/L. Total Methods Method Development 124 In-house Dab RIA, L/P (1) 248 Tosoh-A1A (Total) 251 Bayer Immuno-I 311 Bayer ADVIA Centaur (New) 319 In-house Dab RIA, L/P (2) 320 Bayer ACS: 180 (New) 324 Bayer ACS: 180 (Old) 326 Bayer ADVIA Centaur (Old) 347 Socolab PCx 366 Abbott Architect 380 Roche ElecSys (Total) 387 Roche Cobas Core 461 Beckman Access 521 Abbott AxSYM 528 Abbott IMx (Total) 566 DPC Immulite 584 J&J Vitros Eci 630 DPC Immulite Roche Enzymun 874 UKNEQAS, November 14th, 2000

40 Recognition of hcgβ Sample description: Base pool spiked with hcgβ IRP 75/551. Expected response in an assay recognizing hcg and hcgb on an equimolar basis is 388 IU/L. Intact Methods Behring DADE Dimension -2 BioMérieux Vidas -1 Wallac Delfia 2 Roche ElecSys (Intact) 6 Biochem MAIAclone 30 Tosoh-AIA (Intact) 118 UKNEQAS, November 14th, 2000

41 Stability of hcg in pregnancy serum C Concentration (pmol/l) hcg hcga hcgß 100, Time (h)

42 C Concentration (pmol/l) hcg hcga 100, Time (h) 100 hcgß 1000

43 C Concentration (pmol/l) hcg hcga 100, Time (h) 100 hcgß 1000

44 Epäspesifiset häiriötekijät Suola ja ph EDTA ja sitraatti Proteiinieffekti Komplementti Ei IgG2 vasta-aineita* Humaanivasta-aineita eläimiä vastaan Heterofiiliset vasta-aineet Reumatoidifaktori Human anti-mouse antibodies (HAMA) * Bormer OP. J Immunol Methods 1989;121:85

45 Potilastapaus Direct hcg (IU/L) 2213 LHspec (IU/L) 56 LH (IU/L) >6500 FSH (IU/L) 77 PRL (mu/l) 1244 hcgβ (pmol/l) >16000 hcgα (pmol/l) >36000 hgh (mu/l) >453 PSA (µg/l) 56

46 1000 hcg LHspec LH* FSH PRL hcgß* hcga* hgh* Recovery (%) Dilution factor

47 After Ref. Direct dil 1:2 values NMS hcg (IU/L) ,7 <5 LHspec (IU/L) 56 12, LH (IU/L) > , FSH (IU/L) 77 9, PRL (mu/l) , hcgβ (pmol/l) > <2 hcgα (pmol/l) > <40 hgh (mu/l) >453 9,1 <12 PSA (µg/l) 56 2,2 <0,1

48 Solid: 5008 Sample (1:100) Rabbit anti-human-igm (µ-chain) Tracer: Swine anti-rabbit-igg-eu Patients Mean+SD A.P. R.U Fluorescence (cps)

49 Seerumi vai virtsa? Biologinen yhdiste metaboloituu kehossa Seerumin ja virstan pitoisuudet eivät välttämättä korreloidu Korrelaatiot menetelmäkohtaisia Spesifisyys

50 Korrelaatio seerumin ja virtsan hcg-pitoisuuksien välillä raskauden aikana U-hCG (IU/L, uncorrected) U-hCG (IU/L, corrected) y = ,72x R = 0, S-hCG (IU/L) S-hCG

51 Luteinisoiva hormoni (LH) Glykoproteinihormoni Heterodimeeri, α- ja β-alayksikkö Seerumissa pääasiallinen muoto intakti αβ-dimeeri Virtsassa esiintyy vaihtelevassa suhteessa LH, LHβ, LHβcf

52 40 LH DELFIA LHspec DELFIA LH immunoreactivity (IU/L) Day of cycle

53 100 +4C LH (IU/L) Days of storage

54 100-20C LH (IU/L) Days of storage

55 Ongelmien välttäminen Preanalyyttiset tekijät Menetelmien valinta Ongelmien tiedostaminen Työkalupakki