Siklosporiinin määritysmenetelmät

Transkriptio

1 Siklosporiinin määritysmenetelmät elinsiirroissa ii i Kaija Inkinen HUSLAB Kirurginen sairaala Labquality-päivät

2 Elinsiirrot Suomessa Kiinteiden elinten siirrot ovat vakiintuneet käyväksi hoidoksi viimeisten parin vuosikymmenen aikana Suomessa saavutetut siirtotulokset ovat kansainvälisesti erittäin hyvää tasoa

3 Elinsiirrot Suomessa Vuosittain tehdään vajaat 400 elinsiirtoa Näistä 250 on kiinteiden id elinten siirtoja ja 125 luuytimen- tai veren kantasolujen siirtoja Siirteen saajista noin 40 on lapsia Tavanomaisten elin- ja kudossiirtojen ohella tehdään myös kuodosten kuten luun, ihon, verisuonten ja sarveiskalvon siirtoja

4 Elinsiirrot Suomessa Elinsiirtojen alkamisvuosi Suomessa Munainen 1964 Mk Maksa 1982 Sydän 1985 Sydänkeuhko 1988 Keuhko 1990

5 Elinsiirrot Suomessa Kiinteiden elinten siirrot Suomessa Elin 2008 Yhteensä Munainen Maksa Sydän Keuhko Sydänkeuhko - 35 Yhteensä 6786

6 Elinsiirteiden hyljinnän esto immunosuppressiolla pyritään estämään haitallinen immunolginen vaste, akuutti rejektio elinsiirroissa käytössä yleisesti kolmois- hoitoa, jossa yhdistettään kolmea erityyppistä lääkettä: immunofiliineihin sitoutujat solusalpaaja glukokortikoidit

7 Kaavamainen yleiskuva solujen vuorovaikutuksesta T-solu aktivaatiossa Sytotoksinen Tsolu IFN-γ γ Il-2 Makrofagi Aktivoitunut Tsolu Il-2 B solu Il-4 IL-5 Il-6 Plasma solu T solujen klonaalinen ekspansio Va sta -a ine

8 Activation of IL-2 gene Antigen-preseting cell Costimulatory signal T- cell receptor Calcineurin T-c ell CTLA4 NFAT NFAT Activa ted ca lcineurin Il-2 Il-2

9 No activation i of transcription i Antigen-preseting cell Costimulatory tory signa l T-cell receptor Tcell T-cell Ca lcineurin Cyclophilin NFAT CTLA4 Ca 2+ Cyclosporin Ina ctive NFAT AP1 Il-2- gene promotor Tra nsc riptio Il-2

10 Siklosporiinin molekyylirakenne Eristettiin sienestä: Tolypocladium inlatum 1970 (Thiele ja Kies) Immunosuppressiivinen ominaisuus keksittiin 1972 (Borel) On lipofiilinen polypeptidi Mw 1203

11 Siklosporiini veri/plasma suhde Siklosporiini on hyvin lipofiilinen Siklosporiinista sitoutuu n. 58% veren punasoluihin ja 33% plasmaan Plasmafraktio pääasiallisesti sitoutunut proteiineihin lähinnä lipoproteiineihin

12 Siklosporiinin farmakokinetiikka Annetaan sekä laskimoon että suun kautta, jolloin imeytymisen i huippu saavutetaan noin 2-4 tunnissa Imeytyy maha-suolikanavasta Imeytyminen vaihtelee samallakin henkilöllä päivästä toiseen Biologinen hyötyosuus on vaihteleva (alle 50%) Eliminaation puoliintumisaika veressä on h

13 Siklosporiinin farmakokinetiikka CYP3A4 isoentsyymin toimintaa indusoivien tai estävien lääkkeiden samanaikainen käyttö voi aiheuttaa huomattavia lääkepitoisuuden muutoksia Osa annnoksesta erittyy virtsan kautta metaboliitteina

14 Siklosporiinin farmakokinetiikka Metaboloituu maksassa mikrosomallisen sytokromi P450-isoentsyymin CYP3A4:n välityksellä CYP3A4 isoentsyymin geneettinen vaihtelu on osasyynä yksilöiden välisiin eroavaikusksiin CyAn metaboloitumisessa

15 Pharmacokinetic profile (AUC)

16 Inter-patient variability in absorption of CyA

17 Siklosporiinin haittavaikutukset munaistoksisuus verenpaineen kohoaminen hermostosivuvaikutukset infektiot suurentuntu syöpäriski diabetes yhteisvaikutukset muiden lääkkeiden kanssa

18 Siklosporiinin metaboliitit Noin 30 eri metaboliittia, joiden immunosuppressiivinen aktiivisuus on alle 10% Merkittävää ristireaktiota anti- CyA vasta- aineiden kanssa on todettu metaboliiteilla: AM1, AM9, AM4N, AM19 ja AM1C

19 Siklosporiinin pitoisuusmääritykset pitoisuusmääritykset tarpeellisia hyljinnän ja toksisuuden välttämiseksi i kapea terapeuttinen alue imeytyminen vaihetelevaa tehtävä säännöllisesti mitataan yleensä pohjapitoisuus (trough) terapeuttinen taso n µg/l kokoveressä

20 Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Tällä hetkellä maailmalla on ainakin 8 erilaista CA CyAn immunologista i määritysmenetelmää. ääi Niissä kaikissa on yleensä monoklonaalinen CyAlle spesifinen vasta-aine. Menetelmät ovat erilaisia kompetitiivisia immunomenetelmiä, joissa mittaus perustuu joko entsyymireaktioon, kemiluminometriaan tai fluoresenssipolarisaatioon (FPIA).

21 Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Myös radioimmunomenetelmää on käytetty, mutta se on väistymässä. Mittaukset t ovat pitkälle automatisoituja, j, mutta vaativat aina jonkinasteisen esikäsittelyn punasolujen hajottamiseksi.

22 Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Immunologiset menetelmät mittaavat vaihtelevasti myöskin CyA:n metaboliitteja Menetelmän spesifisyyden kannalta on tärkeää, että siinä käytetty vasta-aine mahdollisimman vähän ristireagoi metaboliittien kanssa Spesifisin menetelmä CyAn emolääkkeen määrittämiseen on nestekromatografia tandem-massaspektrofotometri (LC/MS/MS) HPLC ja LC/MS/MS toimivat referenssimenetelminä.

23 Suositukset CyA lääkeainemääritykseen Koko verinäyte ja EDTA antikoagulantti Menetelmän on oltava spesifinen emolääkkeelle ll Ulkoinen laadunvarmistus on tärkeää CyAn pohjakonsentraatio (trough level) l) on määritettävä Näyteenottoaika on vakioitava yhden tunnin sisään ennen seuraavaa lääkeannosta Tiedot lääkkeen viimeisimmästä annostuksesta ja ajankohdasta Suositeltava monitorointi heti elinsiirron jälkeen on kerran tunnin sisällä

24 Suositukset CyA lääkeainemääritykseen Laboratorion pitää pystyä tarjoamaan määritykset saman päivän aikana heti elinsiirron jälkeisenä ajanjaksona CyA tulos tulee aina tulkita yhdessä muiden laboratoriotulosten, kliinisen tilanteen ja muun immunosuppressiolääkityksen kanssa On tarvetta kehittää menetelmiä jotka pystyisivät mittaamaan yksittäisen potilaan immunosuppressiivista tilaa

25 Suositukset tcya määritysmenetelmien t i Toistuvuus: suoritusominaisuuksille CyA konsentraatiossa 50 µg/l: CV% 10% CyA konsentraatiossa 300 µg/l: CV% 5% Oikeellisuus (menetelmän vertailu validoituun i LC/MC/MC menetelmään): regressiosuoran kulmakerroin k 1,00 00± 01 0,1, intercept 15 µg/l Hyväksyttävä ä tilastollinen t lli menetelmävertailu t on esim. Deming ja Passing Bablok metodi

26 CyA:n määritysmenetelmiä Menetelmän Määritys detektio Valmistaja Laite FPIA Fluoesenssipolarisaatio Abbott TDx FPIA Fluoesenssipolarisaatio Abbott AxSYM CMIA Kemiluminometria Abbott Architect RIA CYCLO- Trac SP Jodi 125 DiaSorin Gammalaskuri CEDIA PLUS Entsymaattinen Microgenics Emit Advia ACMIA Entsymaattinen Kemiluminometria Kolorimetria Siemens medical Siemens medical Siemens medical Olympus AU, Hitach Integra800 Centaur Dimension RxL Referenssimenetelmä LC/MS/MS nestekromatografia tandem massaspektrofotometri

27 CyA:n määritysmenetelmiä Suomessa Menetelmä Laite Tekopaikka ADVIA Centaur ADVIA Centaur OYS Lab/Pori/Jyväskylä CMIA Architect HUSLAB, ISLAB, TYKSLAB, Vaasa FPIA AxSYM Päijät-Hämeen shp Emit Integra800 Ph Pshp Lbk Lab.keskusk

28 CyA menetelmien suorituskyky Toitettavuus, sarjojen välinen CV% Menetelmä Low Medium High Advia 3,8 2,9 4,1 AxSYM* 6,7 4,4 7,2 CMIA 10,5 7,9 8,6 CMIA HUSLAB** 10,2 8,0 8,1 EMIT 6,5 4,8 *Sabaté et al., Ther Drug Monit Aug;22(4): Muut: Pakkausselosteesta ** Validointiraportti

29 CyA menetelmien suorituskyky Regressio vs LC/MC/MC Menetelmä Siirto n Slope Intersept Mean d% Advia** Mun 105 0,98 16,0 Maksa 69 0,95 16,0 Sydän 68 0,89 20,0 AxSYM* Mun 99 1,17 13,2 32,0 Maksa ,30 40,2 47,5 Sydän 97 1,09 30,0 33,9 CMIA** Kaikki 227 1,20-24,9 EMIT* Mun 99 1,07 16,2 23,9 Maksa 95 1,15 14,7 31,2 Sydän ,01 40,44 20,22 *Schütz E et al., Clin Chem Oct;44(10): ** Pakkausseloste

30 CyA metaboliittien ristireaktiot FPIA TDx % RIA Meta- boliitti CYCLO- Trac % CMIA* ADVIA EMIT FPIA % % % AxSYM AM <1.7 NS <0.3 7 AM1C NS ND <3.33 NS ND NS AM4N NS 0.8 <3.1 NS <0.3 NS AM < AM19 NS <0.1 <2.1 NS 3.0 NS % NS = not signicant (lower than CV), ND = not determined * : Abbott pakkausseloste Muut: Steimer W., Clin Chem Mar;45(3):

31 CyA:n määritys HUSLABissa HUSLABin Kirurgisen sairaalan laboratoriossa siirryttiin CyA-määrityksissä joulukuussa 2008 Abbottin TDxlaitteella tehtävällä FPIA-menetelmästä saman valmistajan CMIA-menetelmään Architect-analysaattorilla Samalla lopetettiin HUSLABin Naistenklinikan laboratoriossa tehty RIA-määritys. RIA-menetelmää käytettiin pääasiassa sydän-, keuhko ja luuydinsiirtopotilaiden CyA-määrityksiin. Tällä hetkellä HUSLABissa on siten käytössä yksi CyAmenetelmä CMIA. Sillä tutkitaan kaikkien elinsiirtopotilaiden ii il id CyA-näytteet.

32 CMIA Chemiflex TM 2-Step Testi

33 Architect detektiomekaniikka

34 Architect Siklosporiini

35 CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla Menetelmävaihdon yhteydessä teimme menetelmävertailut paitsi TDx:ään ja RIA-menetelmään myös LC/MS/MS:ään sekä pienimuotoisia vertailuja muualla Suomessa käytettyihin y menetelmiin (Emit ja ADVIA) Uusi menetelmä validoitiin tuorenäytteillä Architect vs TDx (n=149). Tasoero menetelmien välillä riippui pitoisuudesta Siksi tulokset jaettiin kahteen ryhmään, alle ja yli 300 µg/l, ja käsiteltiin tilastollisesti

36 CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla Alle 300 µg/l Yli 300 µg/l CMIA vs FPIA n = 93 n = 56 R 2 0,94 0,73 Bias plot -7,1 % 16,0 % Passing & Bablok y=1,07x-20,66 y=1,34x-70,23 CMIA vs LC/MS/MS n = 174 n =79 R 2 0,94 0,95 Bias plot 0,9 % 5,2 % Passing & Bablok 0,97x+3,05 1,08x-15,67

37 CMIA vs LC/MC/MC Pitoisuus alle 300 µg/l Pitoisuus yli 300 µg/l Scatter Plot with Passing & Bablok Fit Scatter Plot with Passing & Bablok Fit CMIA 150 Identity CMIA Identity LC/MS/MS, R2=0,94 (n=174) Passing & Bablok (I) fit ( x) LC/MS/MS, R2=0,95 (n=79) Passing & Bablok (I) fit ( x)

38 CyA vertailuja HUSLAB ja OYKS Menetelmä n R2 Slope Intercept Ero % *CMIA vs LC/MC/MC 229 0,98 1,04-3,39 2,2 *CMIA vs TDx 149 0,95 1,26-48,33 1,6 *CMIA vs Advia 13 0,92 1,24-9,07 11,2 *CMIA vs EMIT 17 0,98 0,92-0,37-7,5 **Advia vs TDx 485 0,92 0,74-4,53-28,5 *HUSLAB HUSLAB ** OYKS

39 CyA vertailuja CMIA vs FPIA HUSLAB Advia vs FPIA OYKS CMIA µg/l Advia µg/l Identity FPIA µg/l R2=0.95 (n=149) Passing & Bablok (I) fit ( x) FPIA µg/l R2 =0,92 (n=485) Passing & Bablok (I) fit ( x)

40 CyA vertailuja HUSLAB CMIA vs Advia n = 13 HUSLAB CMIA vs EMIT n = 17 Ero 11,2% Ero -7,5% Passing & Bablok Fit Passing & Bablok Fit CM MIA 150 Identity MIA C EMIT Advia Identity

41 CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla CMIA-menetelmällä pitoisuusalueella alle 300 µg/l CyA- tulokset ovat matalampia kuin FPIA-menetelmällä mitatut, mutta tämän yläpuolella tulokset ovat merkittävästi korkeampia. Tasovertailu referenssimenetelmään (LC/MS/MS) osoitti CMIA-menetelmän toimivan verrattain yhtenevästi alle 300 µg/l pitoisuusalueella, mutta yli 300 µg/l pitoisuusalueella CMIA-tulokset olivat n. 5% korkeampia ki kuin referenssilaiteen ilit tulokset. tlk t

42 UKNEQAS International Proficiency testing Sh Scheme kierros Yli 400 osallistujaa yli 30 maasta Pääasiassa Euroopasta Kerran kuussa

43 CyA hoitotasoja t munaissiirtopotilaille ii til ill 35:stä eri transplantaatioyksiköstä v Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin monitoring in organ transplantation: report of the consensus panel. Oellerich M et al., Ther Drug Monit Dec;17(6):

44 UKNEQAS International Proficiency testing Scheme kierros Eri menetelmien tulokset esitettynä BOX and Whisker plotilla, näytteenä poolattu potilasnäyte

45 UKNEQAS International Proficiency testing Scheme kierros Eri menetelmien tulokset esitettynä BOX and Whisker plotilla, näytteenä kokoveri johon lisätty tietty määrä siklosporiinia (mittaa vain emolääkettä)

46 UKNEQAS eri CyA menetelmien osallistujamääriä v Kierros CMIA RIA TDX AxSYM Advia EMIT

47 Lopuksi Suomessa elinsiirrot on keskitetty HYKSin alueelle, mutta potilaiden jatkohoidot ja CyA- seuranta tapahtuvat eri puolilla Suomea kotipaikkakuntien keskussairaaloissa, usein eri menetelmillä Koska immunologiset menetelmät voivat merkittävästi erota tulostasoiltaan ja potilaan hoito on elinikäistä, olisi toivottavaa, että käytössä olisi yhteinen valtakunnan kattava immunologinen menetelmä. Tämä ä ei aina toteudu, johtuen esim. labrotorioiden id erilaisesta laitekannasta

48 Lopuksi Yhteistoiminta menetelmien vertailussa on välttämätöntä Kansainvälisiin ii laaduntarkkailukierroksiin ki k ii osallistuminen i on tärkeää

49 Viitteitä Immunosuppressant drugs--the role of therapeutic drug monitoring. Johnston A, Holt DW. Br J Clin Pharmacol. 2001;52 Suppl 1:61S-73S. Cyclosporin therapeutic drug monitoring - an established service revisited. Morris RG. Clin Biochem Rev May;24(2): Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin monitoring in organ transplantation: report of the consensus panel. Oellerich M et al., Ther Drug Monit Dec;17(6): Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin and tacrolimus. Oellerich M et al., Clin Biochem Jul;31(5):