ELEC-C2210 Molekyylibiologia Proteiinisynteesi, muokkaus ja kohdentuminen

Transkriptio

1 ELEC-C2210 Molekyylibiologia Proteiinisynteesi, muokkaus ja kohdentuminen Vuento & Heino ss ; Alberts et al., ECB, 4. p., luku 7 Dos. Tuomas Haltia

2 DNA RNA Proteiini Geeni mrna Proteiini Transkriptio (lyhyesti) ja lähetti-rna:n synty Siirtäjä-RNA:n ja aminohapon reaktio Ribosomi Translaatio (aloitus, pidennys ja lopetus) Syntyvän polypeptidin kohtalot [(ER, Golgi, PM, lysosomi)], sytoplasma tai muut organellit (esim. mitokondrio)

3 Fig. 17-3b-3 Nuclear envelope TRANSCRIPTION DNA RNA PROCESSING Pre-mRNA mrna TRANSLATION Ribosome Polypeptide (b) Eukaryotic cell

4 Fig DNA molecule Gene 1 Gene 2 Gene 3 DNA template strand TRANSCRIPTION mrna TRANSLATION Codon Protein Amino acid

5 Fig Second mrna base 64 emästriplettiä Aloituskodoni AUG (aloitusmetioniini) Stop-kodoneja kolme kpl Monilla aminohapoilla useita kodoneja Suosituin synonyymi voi olla eri eri eliöissä pitää ottaa huomioon proteiinin tuottoyrityksissä First mrna base (5 end of codon) Third mrna base (3 end of codon)

6 Transkriptio (DNA mrna) Templaatti-DNA -juoste (geenin toinen juoste) TATA-laatikko geenin 5 -päässä; transkription aloitustekijät (proteiineja) sitoutuvat tähän promoottoriin RNA-polymeraasi II sitoutuu aloitustekijöiden jälkeen RNA-synteesin aloitus DNA:n kaksoiskierre avataan emäksen matkalta Transkriptio päättyy tiettyyn sekvenssiin 3 -päässä Tuote: esi-mrna Tämä prosessoidaan tumassa edelleen lähetti-rna:ksi, joka siirtyy sytoplasmaan

7 Fig. 17-7b Elongation Nontemplate (or coding) strand of DNA RNA polymerase RNA nucleotides 3 3 end 5 5 Newly made RNA Direction of transcription ( downstream ) Template strand of DNA

8 Fig. 17-3b-3 Nuclear envelope Transkriptiossa syntyy ensin pre-mrna. Se täytyy muokata mrna:ksi TRANSCRIPTION RNA PROCESSING mrna DNA Pre-mRNA TRANSLATION Ribosome Polypeptide (b) Eukaryotic cell

9 Fig Tumassa: Esi-lähetti-RNA:n prosessointi 1: 5 tulppa ja 3 poly-a häntä lisätään Protein-coding segment Polyadenylation signal 5 G P P P AAUAAA AAA AAA 3 5 Cap 5 UTR Start codon AUG Stop codon 3 UTR Poly-A tail

10 Fig Tumassa: Esi-mRNA:n prosessointi 2: intronien poisto mrna siirtyy tumakalvon läpi sytoplasmaan Pre-mRNA 5 Cap 5 Exon Intron Exon Intron 105 Exon Poly-A tail Coding segment Introns cut out and exons spliced together mrna 5 Cap UTR 3 UTR Poly-A tail 1. kodoni: AUG, koodaa metioniinia

11 Aloituskodoni ATG STOP-kodoni 5 TATA 3 DNA Esi-mRNA 5 5 mrna 3 AAAA 3 AAAAAA Introni Tuma Eksoni Transkriptio Tumahuokonen Translaation aloitusvaihe Proteiinivaihto (mrna sitoutuu ribosomin pieneen alayksikköön) Solulima

12 Fig DNA Gene Exon 1 Intron Exon 2 Intron Exon 3 Transcription RNA processing Kukin eksoni koodaa usein yhtä proteiinin domeenia; proteiinien evoluution kiihtyminen? Translation Domain 3 Domain 2 Domain 1 Polypeptide

13 Translaation (mrna polypeptidi) komponentit Lähetti-RNA käännetään proteiiniksi siirtäjä-rna- (trna)-molekyylien ja ribosomien avulla trna:t (n erilaista): Jokainen sitoo spesifistä aminohappoa toisessa päässään Toisessa päässä jokaisella on antikodoni, joka tunnistaa aminohappoa vastaavan kodonin mrna:ssa Aminoasyyli-tRNA-syntetaasit (oikean aminohapon liittäminen oikeaan trna:han, ATP:tä kuluu) Ribosomi (hieman erilaiset prokaryooteilla ja eukaryooteilla) Muut proteiinit, esim. aloitus-, pidennys- ja lopetusfaktorit Energianlähde (ATP, GTP) Copyright 2008 Pearson Education Inc., publishing as Pearson Benjamin Cummings

14 Fig Polypeptide Amino acids Ribosome trna with amino acid attached trna Anticodon 5 Codons 3 mrna

15 Proteiinisynteesin vaiheet -video QH0GqFn6k&feature=endscreen

16 Aminoasyyli-tRNA syntetaasit lukevat geneettistä koodia Ne liittävät aminohapon oikeaan trna:han ja samalla aktivoivat aminohapon ATP:n energian avulla peptidisidoksen muodostamista vasten (ei saa sekoittaa aktivaatioenergiaan katalyysissä!) Jos trna:ssa on aminohappo, joka ei vastaa sen antikodonia, tuloksena on väärä aminohappo polypeptidissä

17 Fig Siirtäjä-RNA:n rakenne Amino acid attachment site 3 5 Hydrogen bonds (a) Two-dimensional structure Anticodon 5 3 Amino acid attachment site Hydrogen bonds Anticodon (b) Three-dimensional structure 3 5 Anticodon (c) Symbol used in this book

18 Fig Amino acid Aminoacyl-tRNA synthetase (enzyme) Kukin aminoasyyli-trna syntetaasi liittää aminohapon sitä vastaavaan trnamolekyyliin P P P ATP Adenosine ATP AMP + 2 Pi Aminohappo on aktivoitu muodostamaan peptidisidos. P i trna P P i P i P Adenosine trna Aminoacyl-tRNA synthetase Ribosomi käyttää aminoasyyli-trna:t polypeptidin tekemiseen. P Adenosine AMP Computer model Aminoacyl-tRNA ( charged trna )

19 Aminohappo-tRNA syntetaasi (treoniini-) Thr-tRNA-syntetaasin rakenne Aktivaatiokohdassa aa-amp reagoi trna:n 3 CCA:n kanssa Kun ah kiinni trna:ssa, syntetaasi tarkastaa, että ah vastaa trna:n antikodonia Aktivaatiokohta pystyy erottamaan suuremmat väärät ah:t (esim. Val) Editointikohta on hydrolyyttinen kohta, pienemmät väärät aatrna:t hajoitetaan (esim. SertRNA

20 Thr-tRNAsyntetaasi pystyy tarkastamaan myös trna:n antikodonin (täytyy olla Thr:n antikodoni)

21 Ribosomi onkin ribotsyymi: E. colin ribosomi: RNA katalysoi peptidisidoksen syntyä 30S = 21 proteiinia + 16S rrna (vihreä) 50S = 34 proteiinia + 23S rrna (keltainen) + 5S (oranssi) Proteiinisynteesi: mrna, trna, rrna, (RNAi); muisto RNAmaailmasta? Sininen ja punainen = PROTEIINIA; ribosomista noin 1/3 on proteiinia ja 2/3 rrna:ta;ribosomin ydin on RNA:ta

22 Fig Ribosomin rakenne: trna molecules Growing polypeptide E P A Exit tunnel Large subunit Ydin rrna:ta Suuri ja pieni alayksikkö A-, P- ja E-kohta trna:n sitoutumiskohdat Polypeptidin exittunneli mrna:n sitoutumiskohta 5 mrna 3 Small subunit (a) Computer model of functioning ribosome P site (Peptidyl-tRNA binding site) E site (Exit site) mrna binding site A site (AminoacyltRNA binding site) E P A Large subunit Small subunit (b) Schematic model showing binding sites Amino end mrna E Growing polypeptide Next amino acid to be added to polypeptide chain trna 3 5 Codons (c) Schematic model with mrna and trna

23 Video: translaatio

24 Fig Translaation aloitusvaihe: P-paikassa oleva initiaattori-trna-met tunnistaa lukuraamin alussa olevan AUG-kodonin 3 U 5 A A U C G 5 3 P site Large ribosomal subunit Initiator trna mrna 5 mrna binding site Start codon 3 GTP Small ribosomal subunit GDP E A 5 3 Translation initiation complex

25 Fig Amino end of polypeptide mrna Met E 3 Pidennysvaihe: aa-trna:t saapuvat A-paikan kautta Ribosome ready for next aminoacyl trna 5 P site A site GTP GDP Peptidisidos syntyy E E P A P A mrna siirtyy yhden kodonin verran eteenpäin GDP GTP E P A

26 Fig Translaation terminaatiovaihe: Spesifinen proteiini (Release factor) tunnistaa stop-kodonin ilmaantumisen A-paikkaan Release factor Free polypeptide 5 3 Stop codon (UAG, UAA, or UGA) GTP 5 2 GDP 3

27 Proteiinin laskostuminen ja postranslationaalinen modifiointi Synteesin aikana tai sen jälkeen polypeptidi laskostuu kolmiulotteiseen rakenteeseensa Monille proteiineille tehdään ns. posttranslationaalisia modifikaatioita, jotka ovat sekä osoitelappuja että tärkeitä proteiinien biologiselle aktiivisuudelle Jotkut proteiinit aktivoidaan proteolyyttisesti, joihinkin liitetään sokereita, rasvahappoja yms. Kvaternäärirakenteen muodostus (alayksiköt muodostavat proteiinikompleksin) Copyright 2008 Pearson Education Inc., publishing as Pearson Benjamin Cummings

28 Polypeptidien kohdentaminen solun eri osastoihin Vapaat (sytosoliset) ribosomit tuottavat sytoplasmisia proteiineja (ja esim. useimmat mitokondriaaliset proteiinit) Endoplasmakalvostoon (ER) kiinnittyneet ribosomit tuottavat ER:n, Golgin, lysosomin, solukalvon ja solusta eritettävät proteiinit Kummatkin ribosomityypit ovat samanlaisia; ribosomin tyyppi riippuu sen kulloinkin tuottaman proteiinin signaalipeptidistä ER:ssä tehtävä /alkava sokerointi ja muut modifikaatiot toimivat myös osoitelappuna Copyright 2008 Pearson Education Inc., publishing as Pearson Benjamin Cummings

29

30 Fig Signaalipeptidi eli signaalijakso ohjaa syntetisoituvan polypeptidin ER:ään ER, ER:n kalvo, Golgi, Golgin kalvo, lysosomi, solukalvo tai eritys solun ulkopuolelle Ribosome mrna Signalrecognition particle (SRP) CYTOSOL ER LUMEN Signal peptide SRP receptor protein Translocation complex Signal peptide removed ER membrane Protein

31 Fig Modifikaatioita: N-kytketty sokerointi (ER ja Golgi) O-kytketty sokerointi (ER, Golgi, sytoplasma) Lipidylaatio (useita erilaisia) Osoitelappuja: Mannoosi-6P lysosomi N-kytketty sokeri solukalvo Tietty lipidylaatio tietty solukalvon osa KDEL proteiini pysyy ER:ssä YM Secretory protein Glycolipid Golgi apparatus Vesicle Secreted protein 2 3 ER 1 Transmembrane glycoproteins 4 Plasma membrane: Cytoplasmic face Extracellular face Transmembrane glycoprotein Membrane glycolipid Myös sytosolissa syntyvillä proteiineilla voi olla osoitelappuja, esim. mitokondriaalinen signaalipeptidi, jonka seurauksena polypeptidi kuljetetaan mitokondrioon.