Mehiläistautien diagnostiikka

Transkriptio

1 Mehiläistautien diagnostiikka Savonia Ammattikorkeakoulu, Iisalmi Sirpa Heinikainen Evira, Tutkimus- ja laboratorio-osasto Eläintautibakteriologian tutkimusyksikkö Kuopio

2

3 Evira, Kuopio Tutkimus- ja laboratorio-osaston Kuopion toimipaikka 23 vakinaista henkilöä (8 asiantuntijaa, 13 laboranttia ja 2 toimistosihteeriä) Akkreditoitu laboratorio (ISO 17025:2005, FINAS T014) Tehtäviimme kuuluvat Eläintautidiagnostiikka (tarttuvat eläintaudit, zoonoosit eli ihmisten ja eläinten välillä tarttuvat taudit sekä kuolinsyytutkimukset), erityisalueina: Nauta-, mehiläis-, rapu- ja kalataudit Molekylaariset menetelmät (diagnostiikka, genotyypitykset) Eläintauteihin liittyvät epidemiologiset kartoitukset Kansallinen ja kansainvälinen vertailulaboratoriotoiminta OIE:n rapuruttovertailulaboratorio Kansallinen vertailulaboratorio mm. salmonella (muut kuin humaanikannat), mehiläistaudit, äyriäistaudit, non-o157 EHEC

4 Mehiläistautitutkimukset Kuopiossa Kuopion laboratorio nimetty kansalliseksi mehiläistautien vertailulaboratorioksi keväällä 2011 EU:n vertailulaboratorio ANSES Ranskassa Saamme vuosittain noin mehiläisiin liittyvää näytettä Vuoden 2012 muut kuin projektinäytteet: Tauti / aiheuttaja näytteitä kpl positiivisia tarhaajia tarhaajia, joilla positiivisia näytteitä P. larvae - bakteeri * hunaja, joista: (20 %) (43 %) yli 40 pes. (kliininen) 79 alle 40 pes. (piilevä) 523 * mehiläiset EKM (sikiökakut) Nosema Varroa

5 Mehiläistautitutkimukset Kuopiossa Tällä hetkellä mahdollista tutkia / tunnistaa EKM:n aiheuttaja Paenibacillus larvae (akkreditoitu viljelymenetelmä) toukkamädän aiheuttaja Melissococcus plutonius, PCR-tutkimus hunajasta tai toukkajäänteestä, viljely kehitteillä Nosema sp. tunnistus ja lkm mikroskopoimalla, N. apis ja N. ceranae lajien erottelu PCR:llä varroapunkki (Varroa destructor) sisuspunkki (Acarapis woodi) kalkkisikiö (Ascosphaera apis) ja kivisikiö (Aspergillus flavus) virukset: akuutti paralyysivirus ABPV, siivensurkastajavirus DWV, krooninen paralyysivirus CBPV, pussisikiövirus SBV, mustaemokennovirus BQCV, Kashmir-virus KBV pieni pesäkuoriainen (Aethina tumida) Tropilaelaps spp. punkit (T. clarae, T. koenigerum) aasianherhiläinen (Vespa velutina)

6 Esikotelomätä (Paenibacillus larvae) Esikotelomätätutkimuksiin lähetettävät näytteet Hunaja pesäkohtaiset tai korkeintaan 3 pesän yhdistelmänäytteet kartoitusmielessä myös useamman pesän yhdistelmänäytteet tai tankkinäytteet vähintään 2 ruokalusikallista / pesä, oma näytteenottoväline per näyte (esim. lusikka) mikä tahansa puhdas purkki (muovipussia ei suositella) Sikiökakku lankojen välistä n. 5 x 20 cm pala, jossa muutoksia pakkaus paperiin ja tukevaan pahvilaatikkoon (ei litisty matkalla) lähetettävä niin, etteivät jää matkalle viikonlopuksi (homehtuminen) Mehiläiset n. 50 aikuista mehiläistä sikiökakulta lasipurkkiin => n. 1 vrk pakastimessa => lähetys esim. pienessä pahvirasiassa

7 EKM-näytteiden käsittely laboratoriossa hunaja esilämmitys +37 C kaapissa noin 0,5 tuntia, jos hunaja ei ole juoksevaa sekoitetaan ja siirretään n. 3-7 ml koeputkeen 10 min. kiehuvassa vesihauteessa viljely 10 µl agarmaljoille (YGP ja YGP+nal) inkubointi 9-10 vuorokautta 35 ± 1 C, maljat muovipussissa mehiläiset noin 30 mehiläistä murskataan ja lisätään 10 ml vettä kuumennetaan 10 min 85 C viljely 10 µl agarmaljoille (YGP ja YGP+nal) inkubointi 9-10 vuorokautta 35 ± 1 C, maljat muovipussissa

8 EKM-näytteiden käsittely laboratoriossa Sikiökakku tarkastellaan hyvässä valossa ja kirjataan oireet tyypillinen puuliimaa muistuttava haju aukkoinen sikiöala sisään painuneita ja/tai rikkipurtuja kennonkansia venyvää tummanruskeaa mätää ruskeita tahmeita tai kuivia toukkajäännöksiä kennon alalaidalla, osalla kieli pystyssä tässä yhteydessä katsotaan myös mahdolliset varroat, kalkkisikiöt, toukkamätäepäilyt yhdestä kakusta viljellään yhdestä kolmeen (jos todetaan) toukkajäännöstä 0.9% NaCl:aan kostutettu vanutikku työnnetään kennoon ja annetaan seisoa siellä n. 5 min, jos toukkajäännös on kuiva tikkua pyöritellään kennossa, jonka jälkeen näyte viljellään agarmaljoille inkubointi 6-10 vuorokautta +35 ± 1 C, maljat muovipussissa

9

10 Maljojen luku ja jatkotutkimukset Maljat luetaan joka toinen päivä Paenibacillus-pesäkkeet ilmaantuvat yleensä 2-4 vrk kuluessa, mutta pesäkkeitä voi ilmaantua lisää 6-10 vrk inkuboinnin jälkeen noin 4 vrk inkuboinnin jälkeen pesäkkeet ovat pyöreitä, n. 2 mm läpimittaisia vaaleita tai joskus harvoin punertavia ja sileäreunaisia Tyypillisille pesäkkeille jatkotutkimukset Gram-värjäys: grampositiivisia itiöllisiä sauvoja, 2,5-5 μm pituisia ja 0,5-0,8 μm paksuisia, yksittäin tai ketjuissa, itiö kooltaan noin 1,3 x 0.3 µm Tunnusomainen haju: kasvusto haisee homeiselle perunakellarille Katalaasi (ja oksidaasi): katalaasinegatiivinen, oksidaasipositiivinen PCR: tunnistuksessa voidaan käyttää apuna 16S rdna -PCR:ää

11 Kuvia P. larvae -pesäkkeistä Tyypillinen pesäke Hidaskasvuinen epätyypillinen pesäke

12 P. larvae gram-värjäys 1000 x suurennos mikroskoopilla

13 P. larvae -PCR Molekyylipainomarkkerit päissä, vesi, näytteet, positiivikontrolli P. larvae (973 ep), negatiivikontrolli P. alvei, vesi

14 Plarvae low range Genotyypitys Plarvae low range Plar2018/08 Plar9909/07 Plar3196/10 Plar4741/1/11 Plar4926/1/11 Plar6358/1/11 Plar6338/1/11 Plar4926/2/11 Plar6338/2/11 Plar6358/2/11 Plar4741/2/11

15 Mahdollisia virhelähteitä Itiöt saattavat olla epätasaisesti jakautuneena hunajanäytteessä (etenkin, jos sekoitettu usean pesän hunajaa) Muiden nopeasti kasvavien bakteerien ylikasvu (toisinaan hunajanäytteissä) voimakasta => keitetty hunajanäyte viljellä uudelleen usealle maljalle edelleen liian voimakasta => näyte vastataan tutkimuskelvottomaksi ja tarvittaessa pyydetään uusi näyte Jos sikiökakku on täysin pilaantunut kuljetuksen aikana, näyte vastataan tutkimuskelvottomaksi ja tarvittaessa pyydetään uusi näyte

16 Tutkimustodistus Sikiökakkunäyte Näytteessä todettiin esikotelomätä / Esikotelomätää ei todettu Hunajanäyte Positiivinen tulos: Paenibacillus larvae Jos kasvu on vähäistä, tutkimustodistukseen lisätään lause: Bakteerikasvu oli vähäistä, mikä viittaa piilevään tartuntaan. Jos kasvu on runsasta, lisätään lause: Bakteerikasvu on runsasta, mikä viittaa kliiniseen tautiin. Vähäisen ja runsaan kasvun raja-arvona on 40 pmy/malja Saksalaisessa tutkimuksessa tutkittiin yli 3500 hunajanäytettä (hunajaa tai talviruokaa) Kun näytteissä todettiin n tai enemmän itiöitä grammassa näytettä, pesät hyvin todennäköisesti osoittivat jo kliinisiä oireita Kielteinen tulos: Esikotelomädän aiheuttajaa, Paenibacillus larvae -bakteeria ei todettu.

17 Tutkimustodistus (2) Jos hunaja-, sikiökakku- tai mehiläisnäytteestä löytyy esikotelomätä tai Paenibacillus larvae -bakteereita, tutkimustodistus tai sen tiedoksi saanti kappale lähtee lakisääteisesti: omistajalle kunnaneläinlääkärille läänineläinlääkärille Eviran valvontaosaston Eläinten terveys- ja hyvinvointi yksikölle Jos näytteissä ei todeta esikotelomätää tai Paenibacillus larvae bakteereita, tutkimustodistus tai sen tiedoksi saanti - kappale lähtee: omistajalle kunnaneläinlääkärille läänineläinlääkärille Olisi hyvin tärkeää saada hoitavan kunnaneläinlääkärin tiedot lähetteen mukana pesiä monesti usean kunnan alueella erilaiset kuntaliitokset ja terveydenhuoltoyhtymät hankaloittavat oikean tiedonsaajan selvittämistä

18

19

20

21 Toukkamätä (Melissococcus plutonius) Näytteet Sikiökakku lankojen välistä n. 5 x 20 cm pala, jossa muutoksia pakkaus paperiin ja tukevaan pahvilaatikkoon (ei litisty matkalla) lähetettävä niin, etteivät jää matkalle Hunaja pesäkohtaiset näytteet (ei yhdistelmänäytteitä) vähintään 1 ruokalusikallinen / pesä (EKM-näytteen 2 rkl riittää molempiin tutkimuksiin) mikä tahansa puhdas purkki (muovipussia ei suositella)

22 Toukkamätänäytteiden käsittely laboratoriossa Sikiökakku tarkastellaan hyvässä valossa ja kirjataan oireet kuolleita kellertäviä, ruskeita tai mustia avotoukkia kuolleet toukat vaihtelevan asteisesti mätiä tai kuivuneita, mätä ei veny suora gram-värjäys toukkajäänteestä näytteessä gram-positiivisia kokkeja DNA:n eristys ja PCR toukkajäänteestä viljely haastavaa (ehdoton anaerobi, seuralaisbakteerit) ja epäherkkää, ei sovellu ainoaksi diagnostiikan menetelmäksi kenttäkäytössä pikatesti, tarkkuus? Hunaja DNA:n eristys ja PCR EKM-viljelyssä saatetaan havaita toukkamädän seuralaisbakteeri Paenibacillus alvei

23 Melissococcus plutonius

24 Nosemoosi (Nosema spp.) Näytteet Aikuisia mehiläisiä vähintään 20 kpl voi tappaa pakastamalla 1 vrk ennen lähettämistä, lähetys paperiin tai pahviin pakattuna (homehtuvat herkästi) myös itsestään kuolleet mehiläiset käy, elleivät ole pitkälle pilaantuneita

25 Nosemanäytteiden käsittely laboratoriossa Mehiläiset mehiläisten peräpäät homogenisoidaan steriilissä vedessä ja suodatetaan pois suurimmat partikkelit nosemaitiöt tunnistetaan mikroskopoimalla voimakkaasti valoa heijastavia soikeita itiöitä itiöiden lukumäärä lasketaan Bürkerin kammiossa tulos ilmoitetaan itiöiden lkm yhdessä mehiläisessä nosemalaji (N. apis/n. ceranae) tunnistetaan PCR-testillä

26 Sisuspunkki (Acarapis woodi) Näytteet Aikuisia mehiläisiä noin 50 kpl voi tappaa pakastamalla 1 vrk ennen lähettämistä, lähetys paperiin tai pahviin pakattuna (homehtuvat herkästi) myös itsestään kuolleet mehiläiset käy, elleivät ole pitkälle pilaantuneita

27 Sisuspunkkinäytteiden käsittely laboratoriossa Mehiläiset mehiläisten keskiruumiista preparoidaan esiin ilmaputket ylimääräinen pehmytkudos poistetaan KOH- tai proteinaasikäsittelyllä ilmaputkissa olevat punkit tai niiden aiheuttamat vauriot tunnistetaan mikroskopoimalla laji varmistetaan PCR-testillä

28 Kalkkisikiö (Ascopheara apis) Näytteet Muuntuneita sikiöitä pesästä tai pesän pohjalta tai pala niitä sisältävää sikiökakkua Tunnistus Silmämääräinen tarkastelu, tyypillinen ulkomuoto Viljely ja tunnistus mikroskopoimalla

29 Varroapunkki (Varroa destructor) Näytteet Aikuisia mehiläisiä 300 mehiläistä/pesä Sikiökakku kuten ekm Pesänpohjaroskia pari desiä

30 Varroanäytteiden käsittely laboratoriossa Mehiläiset mehiläiset pestään 50 % etanolilla tai vahvalla astianpesuaineliuoksella irtoavat punkit suodatetaan eroon mehiläisistä ja lasketaan lukumäärä per 100 mehiläistä Sikiökakku ja pesänpohjaroskat punkki havaitaan paljain silmin, tarkastellaan erityisesti peitettyjä sikiöitä tulos ilmoitetaan todettiin/ei todettu, joskus kommenttina runsaasti/vähän, ei kvantitoida tarkemmin

31 Tuholaisten tunnistaminen Varroa Mehiläistäi Varroa Varroa ja Tropilaelaps sp. Tropilaelaps sp. Pieni pesäkuoriainen

32 Virukset akuutti paralyysivirus ABPV, siivensurkastajavirus DWV, krooninen paralyysivirus CBPV, pussisikiövirus SBV, mustaemokennovirus BQCV, Kashmir-virus KBV Näytteet Eläviä aikuisia mehiläisiä virukset tuhoutuvat nopeasti kuolleissa mehiläisissä, näytteet on saatava laboratorioon elävänä vähintään 20 kpl lähetetään esim. rei itetyssä muovirasiassa tai emonkuljetushäkissä Sikiökakku epäiltäessä pussisikiövirusta

33 Virusnäytteiden käsittely laboratoriossa Mehiläiset mehiläiset tapetaan pakastamalla homogenisoidaan puskurissa eristetään RNA ja käännetään cdna:ksi todetaan virukset PCR-testillä Sikiökakku havainnoidaan mahdolliset pussisikiöt PCR kuten aikuisista mehiläisistä

34 Näytteiden lähetys Lähetysosoitteet - tuonti, pikakirjeet ja Postin Ovelle-paketti: Evira Kuopio, Neulaniementie 4, Kuopio - kirjeet ja Postin postipaketti: Evira Kuopio, PL 92, Kuopio - linja-autorahti: Evira Kuopio, Matkahuolto Kuopio

35 Professori, yksikönjohtaja ELT Sinikka Pelkonen Tutkija, FM Sirpa Heinikainen Erikoistutkija, ELL Henry Kuronen Erikoistutkija, ELT Tiina Autio Erikoistutkija, ELL Tarja Pohjanvirta Projektitutkijat FM Rauna Riva ja FM Nella Vähänikkilä

36 Kiitos mielenkiinnosta!