Mycoplasma bovis -diagnostiikka. Tarja Pohjanvirta, Nella Vähänikkilä, Tiina Autio, Sinikka Pelkonen Eläintautibakteriologia, Kuopio

Transkriptio

1 Mycoplasma bovis -diagnostiikka Tarja Pohjanvirta, Nella Vähänikkilä, Tiina Autio, Sinikka Pelkonen Eläintautibakteriologia, Kuopio

2 Esityksen kulku Mykoplasmaviljely M. boviksen osoittaminen suoraan näytteestä PCRllä M. bovis vasta-aineiden osoittaminen Eri näytteenottotapojen soveltuvuus M. bovis diagnostiikassa M. bovis antibioottiherkkyys?

3 Mykoplasmaviljely Mykoplasmaviljely vaatii käsityönä valmistettavia erikoiselatusaineita suora viljely maljalle + laimennussarja liemiviljelynä näytteiden lähetys kuljetuselatusaineessa (tai kokonainen raato/elin) näytteet lähetettävä viileässä ja nopeasti, eivät saa kuivua antibioottihoito saattaa antaa väärän negatiivisen tuloksen, samoin voimakas muiden bakteerien kasvu ainoa keino saada kantoja talteen jatkotutkimuksia varten (esim. genotyypitys, herkkyysmääritys) Ollut käytössä v Eviran Kuopion toimipaikassa syväsivelynäytteet, kaikki nautojen raadonavauksessa todetut keuhkotulehdukset sekä luodut sikiöt viljellään M. bovis -bakteerin varalta

4 M. bovis bakteerin suora osoitus näytteestä PCRllä Suomessa käytössä: Maitonäytteille (kaupallinen Pathoproof-testi) Mycoplasma bovis-vastustusohjelma (sierainlimanäytteet) Testeissä mukana sisäinen monistuskontrolli joka osoittaa PCRää estävät aineet (mm. veri) DNA-eristys validoitava eri materiaaleille

5 M. bovis bakteerin suora osoitus näytteestä PCRllä Evirassa käytössä oppd-geenin osoittamiseen perustuva julkaistu menetelmä (Sachse et al. 2010) Menetelmä on validoitu ja sille on saatu FINAS-akkreditointi toukokuussa 2016 Käytetään M. bovis-vastustusohjelman sierainlimanäytteille ja positiivisten maitonäytteiden (Pathoproof ) varmistukseen Sierainlima näytteenottotikuista: Testattu kolme eri tikkua 40 vasikasta kahdella hanketilalla (Amies, iso ja pieni nukkatikku) Amies-elatusainetikku (15/40 +) ja iso nukkatikku (16/40 +) ei merkitsevää eroa, pientä nukkatikkua ei voi suositella (10/40 +)

6 M. bovis näytteenottovertailututkimus M. bovis positiivisia lypsykarjoja Ikä 1 vk-6 kk, lähes kaikki vasikat oireettomia Tutkittiin 5 vasikkaa/tila, 19 tilaa, yhteensä 185 näytettä Jokaisesta vasikasta sierainlima- ja syväsivelynäyte Näyte Positiivisia n (%) Negatiivisia n (%) Sierainlima 56 (30) 129 (70) Syväsively 61 (33) 124 (67) ss+sl ss+, sl - ss-, sl +

7 M. bovis vasta-aineiden osoittaminen ELISA-testillä Kaupallinen ELISA Bio-X BIO K302 ja serokonversion osoittamiseen tarkoitettu BIO K260 Antigeenina tuntematon yksittäinen rekombinantti proteiini Vertailu Bio-X K302 ja APHA:n in-house ELISA (kokosolulysaatti antigeenina): 34 Bio-X:n ELISAlla positiivista (pp ) seeruminäytettä 13 tilalta 14/34 positiivisia APHAn ELISAlla 19 Bio-X:n ELISAlla positiivista lihakarjan seeruminäytettä (pp 37-55) ja 2 epäilyttävää (pp 34 ja 35) 2/19 ja 1/2 positiivisia APHAn ELISAlla

8 M. bovis vasta-aineiden osoittaminen ELISA-testillä MilA IgG- ELISA versus BIOK 302 ja BIO K260 (Wawegama ym. JCM May 2016): ELISA tulos M. bovis positiivinen (n=30) M. bovis negatiivinen (n=40) MilA MilA BIO K BIO K BIO K BIO K

9 M. bovis vasta-aineiden osoittaminen ELISA-testillä Parametri BIO K302 BIO K260 MilA Sensitiivisyys 37 (22-54) 13 (5-30) 87 (70-95) Spesifisyys 95 (83-99) 100 (91-100) 90 (77-96) Serologian käyttökelpoisuus Bio-X:n testeillä tehtynä epäselvää Testin sensitiivisyys eli kyky todeta oikein infektoituneet eläimet huono? Infektion luonne vasta-aineita ei muodostu? Esim. näytteenottovertailun 29 M. bovis-positiivista kliinisesti sairasta vasikkaa vasta-aineita todettiin yhdellä vasikalla Myös viitteitä heikosta spesifisyydestä (kts. vertailu APHAn ELISA-tuloksiin) ELISA soveltuu vain karjatason tutkimiseen, ei voida tehdä varmoja johtopäätöksiä yksittäisen eläimen tilanteesta

10 Näytteenottotapojen käyttökelpoisuus M. bovis-diagnostiikassa Näytetyyppi Sierainlimanäyte Näytteenottovälineet, taitotaso Kaupalliset tikut helposti saatavilla, edullisia, näytteenotto ei vaativaa Soveltuvuus Vain oireettomille vasikoille M. boviksen kantajuuden osoittamiseen Syväsively Kaupalliset tikut vain yksi toimittaja, kalliita, näytteenottopaketti tilattava Evirasta, näytteenotto vaatii taitoa Kliinisesti sairaille eläimille, mykoplasma- ja bakteeriviljely, kantoja saadaan jatkotutkimuksiin, virusosoitus (taudin alkuvaiheessa virukset löytyvät parhaiten syväsivelynäytteestä) Trakeobronkiaalihuhtelu Ei kaupallisia näytteenottovälineitä, vaatii taitoa Kliinisesti sairaille eläimille, mykoplasma- ja bakteeriviljely, kantoja saadaan jatkotutkimuksiin, virusosoitus Verinäyte Kaupalliset näytteenottovälineet helposti ja edullisesti, näytteenotto ei vaativaa M. bovis vasta-aine ELISAn sensitiivisyys? Ei sovellu yksilödiagnostiikkaan, voidaan tutkia virusvasta-aineita

11 M. bovis ja antibioottiresistenssi Eläinten mykoplasmojen ab-resistenssin tutkimiseen ja arvojen tulkintaan ei ole virallista ohjetta Nestelaimennosmenetelmällä tutkittu APHAssa 19 suomalaista M. boviskantaa Kannoissa eroja varsin paljon: Oksitetrasykliini 15/19 (79 %) MIC > 8 μg/ml Makrolideista 4/19 korkeat MIC-arvot, näistä neljästä kolme vasikkakasvattamokantoja Yksi vasikkakasvattamo korkea florfenikoli MIC Myös fluorokinoloniresistenssiä todettiin M. bovista vastaan vaikea taistella antibiooteilla Hengitystietulehdusbakteerit Pasteurella, Mannheimia ja Histophilus edelleen enimmäkseen herkkiä penisilliinille penisilliini hengitystietulehdusten hoitoon? Fluorokinolonit kriittisen tärkeitä antibiootteja ihmisten lääkinnässä ja niiden käyttö nautojen hengitystietulehdusten hoitoon on eettisesti kestämätön vaihtoehto myös resistenssi niille kehittyy nopeasti