SISÄLLYSLUETTELO LYHENTEET JOHDANTO...

Transkriptio

1 SISÄLLYSLUETTELO LYHENTEET JOHDANTO Ilves (Lynx lynx) Levinneisyys ja elinympäristö Elinpiiri ja ravinto Lisääntyminen, dispersaali ja kuolleisuus Ilveksen historiaa Suomessa Ilveksen kannan seuranta ja nykyinen tila Suomessa Ilveskanta Skandinaviassa Ilveksen asema Suomen lainsäädännössä ja kansainväliset sitoumukset Ilveksen suojelu ja tulevaisuuden uhkatekijät Geneettiset tekijät populaation elinvoimaisuuden taustalla Geneettinen muuntelu Geneettisen muuntelun mittaaminen Ilveksen geneettinen muuntelu Euroopassa Efektiivinen populaatiokoko Efektiivisen populaatiokoon arviointi geneettisillä menetelmillä Pullonkaula Sukusiitos ja sukusiitosheikkous Sukusiitoksen mittaaminen Sukusiitos luonnon populaatioissa Migraatio Migraation määrän mittaaminen luonnon populaatioista Dispersaali ja populaation sisäinen rakenne Mikrosatelliitit Esiintyminen Evoluutio Mikrosatelliittien käyttöön liittyviä ongelmia Työn tarkoitus AINEISTO JA MENETELMÄT Tutkimusaineisto

2 2.2 DNA:n eristys, DNA-pitoisuuden mittaus ja näytteen laimennus Polymeraasiketjurektio Agaroosigeelielektroforeesi Polyakryyliamidigeelielektroforeesi Näytteiden genotyypin määritys Skandinavian genotyyppien yhdenmukaistaminen Suomen genotyyppien kanssa Genotyyppiaineiston tutkimus Suomen genotyyppiaineiston nolla-alleelit Fennoskandian ilveksen populaatiorakenne Suomi Skandinavia Populaatioiden kytkentä- ja Hardy-Weinbergin tasapaino Fennoskandian populaatiorakenne ja geneettinen erilaistuminen Geneettinen muuntelu ja sukusiitos Migraatio Efektiiviset populaatiokoot Fennoskandiassa Fennoskandian ilvespopulaatioiden pullonkaulat TULOKSET Aineiston käyttökelpoisuus Populaation sisäinen rakenne Suomessa ja Skandinaviassa Suomi Skandinavia Populaatioiden kytkentä- ja Hardy-Weinbergin tasapaino Fennoskandian ilvesten populaatiorakenne ja erilaistuminen Geneettinen muuntelu ja sukusiitos Suomi Suomi ja Skandinavia Migraatio Efektiivinen populaatiokoko Suomi Skandinavia Fennoskandian ilvespopulaatioiden pullonkaulat POHDINTA Aineiston luotettavuus

3 4.2 Geneettinen muuntelu Populaatiorakenne Fennoskandiassa Suomi Skandinavia Fennoskandian populaatiorakenne ja geneettinen erilaistuminen Sukusiitos Suomessa ja Skandinaviassa Fennoskandian ilvesten mahdolliset pullonkaulat Suomen ja Skandinavian ilvesten efektiivinen populaatiokoko Migraatio Migraation vaikutus Fennoskandiassa ja tulevan tutkimuksen tarve Suositukset YHTEENVETO KIITOKSET LÄHTEET LIITTEET

4 LYHENTEET A AMOVA df DNA F F IS F ST H e H o HWE IAM IBD IUCN ka LD MCMC MMM n N N b N e p PCR RKTL R s SE SMM TPM alleelien lukumäärä molekyylivarianssianalyysi (Analysis of Molecular Variance) vapausasteet (degrees of freedom) deoksiribonukleiinihappo (deoxyribonucleic acid) sukusiitoskerroin (todennäköisyys, että kaksi alleelia IBD) sukusiitoskerroin (sukusiittoisille yksilöille tietyssä alapopulaatiossa) erillisten alapopulaatioiden välistä geneettistä erilaistumista kuvaava kerroin odotettu heterotsygotia, geenidiversiteetti (expected) havaittu heterotsygotia (observed) Hardy-Weinbergin tasapaino (equilibrium) äärettömien alleelien malli (Infinite Allele Model) yksilön kaksi alleelia homologisia yhteisen alkuperän takia (Identical By Descent) kansainvälinen luonnonsuojeluliitto (International Union for Conservation of Nature.) keskiarvo kytkentäepätasapaino (linkage disequilibrium) Markovin ketju Monte Carlo -menetelmä (Markov Chain Monte Carlo) maa- ja metsätalousministeriö lukumäärä populaation yksilömäärä naapuruston koko efektiivinen populaatiokoko p-arvo, tilastollisen merkitsevyyden raja-arvo polymeraasiketjureaktio (Polynerase Chain Reaction) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos alleelirikkaus, näytekokoon suhteutettu alleelien lukumäärä keskivirhe (Standard Error) portaittainen mutaatiomalli (Stepwise Mutation Model) kaksivaiheinen malli (Two Phase Model) 4

5 1 JOHDANTO Euraasian ilveksen (Lynx lynx) geneettisen muuntelun määrää ja jakautumista on 2000-luvulla tutkittu useilla sen esiintymisalueilla Euroopassa (Hellborg ym. 2002, Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003, Rueness ym. 2003a, Schmidt ym. 2008, Gugolz ym. 2008). Erityisesti Skandinaviassa ilves on ollut intensiivisen tutkimuksen kohteena (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a), ja niemimaan populaation huomattava erilaistuminen pohjois etelä-suunnassa on herättänyt keskustelua mahdollisista tekijöistä, jotka ovat saaneet aikaan nykyisin havaittavan muuntelun jakautumisen (Rueness ym. 2003a, Pamilo 2004, Jorde ym. 2006). Sen sijaan Suomen ilveksiä koskeva geneettinen tutkimus on ollut vähäistä. Suomessa näyttäisi esimerkiksi esiintyvän kaksi ravinnonkäytön suhteen erilaistunutta populaatiota (Pulliainen ym. 1995), mutta niiden geneettisen erilaistumisen määrää ei ole vielä tutkittu, joten tämän ainoan luonnonvaraisen kissapedon kannan geneettinen rakenne Suomessa on ollut avoin kysymys. Kuitenkin populaation geneettisen rakenteen tunteminen on tärkeää mahdollisten uhkien tunnistamiseksi ja suojelutoimien riittävyyden arvioimiseksi, koska useat geneettiset tekijät vaikuttavat populaation elinvoimaisuuteen ja selviämismahdollisuuteen tulevaisuudessa. 1.1 Ilves (Lynx lynx) Euraasian ilves kuuluu petoeläinten lahkossa (Carnivora) kissaeläinten heimoon (Felidae) (Tumlison 1987), ja se on Euroopan kolmanneksi suurin petoeläin karhun ja suden jälkeen (Breitenmoser ym. 2000). Samaan sukuun kuuluu ilveksen lisäksi kolme muuta lajia (Werdelin 1981), joista Espanjassa ja Portugalissa tavattava iberianilves (L. pardinus) on ilmeisesti läheisin sukulainen (Johnson ym. 2004). Kanadanilves (L. canadensis) sekä hieman kaukaisempaa sukulinjaa edustava punailves (L. rufus) esiintyvät Pohjois-Amerikassa (Johnson ym. 2004, Mattern & Mclennan 2000, Werdelin 1981). Euraasian ilves on kooltaan suurempi kuin kolme muuta sukulaislajiaan (Werdelin 1981), ja sukupuolten välillä esiintyy kokoeroa (Pulliainen 1995): Aikuiset naaraat painavat keskimäärin 16 kg ja urokset 18 kg (Pulliainen 1974, s. 194, Pulliainen 1995), mutta yksilöllinen vaihtelu on suurta (Nyholm 1996, s. 80) Levinneisyys ja elinympäristö Euraasian ilves on yksi maailman laajimmalle levinneistä kissaeläimistä, ja sen muinainen levinneisyysalue on kattanut suuren osan Eurooppaa, Venäjää ja Keski-Aasiaa (Breitenmoser ym. 5

6 2000). Lajin fenotyyppinen muuntelu on suurta, koska jääkaudet ja ihmisen toiminta ovat aikojen saatossa pirstoneet laajaa levinneisyysaluetta, joten ilveksestä voidaan erottaa useita eri alalajeja (mm. von Arx ym. 2004, Kratochvil ym. 1968). Alalajien luokittelua ei ole vielä lopullisesti ratkaistu, mutta von Arx ym. (2004) esittivät, että ilveksestä voitaisiin muun muassa morfologisten ja geneettisten erojen perusteella erottaa yhdeksän alalajia. Tämän luokittelun mukaan Euroopassa tavattaisiin kolmea alalajia ja Suomen ilvekset kuuluisivat pohjoiseen alalajiin (L. l. lynx) (von Arx ym. 2004). Euroopassa ilveksen historiallinen levinneisyysalue on ulottunut mantereen pohjoisosista Välimerelle saakka, lukuun ottamatta metsättömiä rannikkoseutuja ja Iberian niemimaata, jossa iberianilves on esiintynyt (Kratochvil ym. 1968). Viimeisten vuosisatojen aikana ihminen on hävittänyt ilveksen suuresta osasta Eurooppaa, ja pienimmillään ilveskanta kävi 1950-luvun tienoilla (Breitenmoser ym. 2000), jolloin se oli hävinnyt suurimmasta osasta Eurooppaa. Tuolloin ilves säilyi Karpaateilla, Balkanin ja Skandinavian niemimaalla, sekä Venäjän populaatioon yhteydessä olleessa Baltiassa, ja mahdollisesti myös Suomessa. Kuitenkin näilläkin alueilla sen levinneisyysalue kutistui huomattavasti (Kratochvil ym. 1968). Aallonpohjan jälkeen kanta alkoi hitaasti toipua, kun lajin rauhoittaminen tai ainakin kontrolloitu metsästys esti monin paikoin ilveksen vainon. Myös saaliseläinkantojen lisääntyminen ja elinkelpoisen ympäristön palautuminen mahdollistivat ilveksen levittäytymisen takaisin osaan sen entisistä elinalueista, joko luonnollisin keinoin tai siirtoistutusten avulla. Ilveksen nykyinen levinneisyysalue Manner-Euroopassa on rikkonainen, ja yhtenäisempi levinneisyysalue Baltiassa ja Fennoskandiassa on yhteydessä suurempaan Venäjän populaatioon (liite I) (von Arx ym. 2004). Ilves on lähinnä metsien asukas (mm. Tumlison 1987, Sunde ym. 2000a), mutta se voi asuttaa myös avarampia ja vähän puita kasvavia alueita (Breitenmoser ym. 2000, Sunde ym. 2000a). Pohjoisessa ilvestä on tavattu jopa tundralla (Breitenmoser ym. 2000). Suomessa ilves viihtyy parhaiten syrjäisillä metsäalueilla ja louhikkoisessa kalliomaastossa, mutta se on sopeutunut elämään myös ihmisasutuksen läheisyydessä (Nyholm 1996, s. 82, Pulliainen 1974, s. 256) Elinpiiri ja ravinto Ilves on yleensä yksineläjä, ja jokaisella yksilöllä on oma elinpiiri (Schmidt ym. 1997). Poikkeuksen muodostaa emo ja saman vuoden pennut, jotka muodostavat perheryhmän (Schmidt 1998). Ilveksen elinpiirin koko voi vaihdella jopa kymmenkertaisesti eri alueilla Euroopassa 6

7 (Herfindar ym. 2005, Linnell ym. 2001), ja suurimmat elinpiirit on havaittu Skandinaviassa: uroksilla jopa 1400 km 2 ja naarailla 800 km 2 (Linnell ym. 2001). Saaliseläinten runsautta pidetään tärkeänä elinpiirin kokoon vaikuttavana tekijänä (Grigione ym. 2002, Linnell ym. 2001), ja Euroopassa ilveksen elinpiirin koko pieneneekin pohjoisesta etelää kohti, kun ympäristön tuottavuus ja saalistiheys kasvavat (Herfindal ym. 2005). Urosten elinpiirit ovat suurempia kuin naaraiden (Linnell ym. 2001, Herfindal ym. 2005, Sunde ym. 2000a, Schmidt ym. 1997, Jedrzejewski ym. 1996, Breitenmoser ym. 1993), ja niiden kokoon voi vaikuttaa myös naaraiden esiintymistiheys (Schmidt ym. 1997, Jedrzejewski ym. 2002). Uroksen elinpiiri voi olla päällekkäin yhden tai useamman naaraan elinpiirin kanssa (Schimdt ym. 1997, Sunde ym. 2000a, Breitenmoser ym. 1993), mutta samaa sukupuolta olevat yksilöt jakavat harvemmin yhteisiä elinalueita (Zimmermann ym. 2005, Schmidt ym. 1997, Jedrzejewski ym. 1996). Ilveksen saalistus perustuu saaliin aktiiviseen etsintään ja yllätyshyökkäykseen (Jedrzejewski ym. 1996, Pulliainen 1974, s. 206) (kuva 1.1 A). Ilveksen pääasiallista ravintoa Skandinaviassa ja Manner-Euroopassa ovat keskikokoiset sorkkaeläimet, ja vain harvoin suuremmat sorkkaeläinlajit (Odden ym. 2006, Sunde 2000b, Okarma ym. 1995, Jedrzejewski ym. 1993). Myös jäniseläimet, lampaat, linnut ja jyrsijät ovat ilveksen saalista, mutta niiden merkitys sen ravinnossa on vähäisempi (Odden ym. 2006, Sunde ym. 2000b, Jedrzejewski ym. 1996). Suomessa jänikset ovat ilveksen pääasiallista ravintoa (Pulliainen 1981, Pulliainen & Hyypiä 1975), joten suomalaiset ilvekset poikkeavat ravintotottumuksiltaan Skandinavian ja Manner-Euroopan ilveksistä A B 7

8 Kuva 1.1 Ilves on yllättänyt teeren kuusen juuresta (A) ja ruokaillut keväthangella (B) Kuhmon Vuosangassa (kuva Satu Pääkkönen ). (Pulliainen ym. 1995). Myös Pohjois-Amerikasta Suomeen istutetusta valkohäntäkauriista (Odocoileus virginianus) on tullut tärkeä saaliseläin Lounais-Suomen ilveksille, mutta itäisessä Suomessa jänikset ovat edelleen ilveksen tärkeintä ravintoa (Pulliainen ym. 1995). Ravinnon vaikutus näkyy Lounais-Suomen ilvesten parempana kuntona itäisiin lajitovereihin verrattuna ja onkin esitetty, että ekologisesti Suomessa esiintyisi kaksi ilvespopulaatiota (Pulliainen ym. 1995). Ilvesten muuta ravintoa Suomessa ovat metsäkanalinnut (kuva 1.1 B), ketut, supikoirat, kissat, jyrsijät, oravat ja poronhoitoalueella poro (K. Holmala, suullinen tieto, Pulliainen ym. 1995, Pulliainen 1981, Pulliainen & Hyypiä 1975). Euraasian ilves on suurikokoisempi kuin muut saman suvun ilveslajit, joiden pääravintoa ovat jänikset, ja suurempi koko on ilmeisesti sopeutuma metsäkauriin (Capreolus capreolus) käyttämiseen pääravintona (Werdelin 1981, Pulliainen 1981). Koska metsäkauris on ilveksen luontaista ravintoa, sen merkitys suomalaisen ilveksen ravinnossa varmaankin kasvaa metsäkauriskannan voimistuessa (Salo 2007) Lisääntyminen, dispersaali ja kuolleisuus Ilves on ennemmin moniavioinen kuin pysyvässä parisuhteessa elävä, sillä urokset pyrkivät pariutumaan usean naaraan kanssa, jos se on mahdollista (Zimmermann ym. 2005). Naaraat voivat lisääntyä viimeistään kahden vuoden ikäisinä saavuttaessaan sukukypsyyden, ja urokset vuotta myöhemmin (Henrikson ym. 2005). Naaraiden kantoaika kestää noin 10 viikkoa (mm. Tumlison 1987, Kvam 1991), ja ne synnyttävät yleensä 2 3, harvemmin 1 tai 4, pentua (Henrikson ym. 2005, Schmidt 1998, Pulliainen ym.1995). Urokset eivät huolehdi jälkeläisistään, vaan perheryhmän muodostaa naaras poikasten kanssa (Schmidt 1998). Poikaset itsenäistyvät yleensä 10 kk ikäisinä, ja voivat jäädä itsenäistymisen jälkeen emonsa elinpiirille useiksi kuukausiksi, ennen kuin jättävät synnyinalueensa ja suuntaavat etsimään omaa elinpiiriä (Zimmermann ym. 2005, Breitenmoser ym. 1993). Naaraspentujen on joskus havaittu jäävän emonsa elinpiirille, mutta urosten lisäksi myös naaraat dispersoivat (Zimmermann ym. 2005, Breitenmoser ym. 1993). Nuorten yksilöiden dispersaalietäisyydet omaa elinpiiriä etsiessä vaihtelevat suuresti, mutta urosten kulkemat matkat ovat pääsääntöisesti pidempiä kuin naarailla (Zimmermann ym. 2005, Schmidt 1998), kuten nisäkkäillä yleensä (Greenwood 1980). Esimerkiksi Ruotsissa urospennut ovat kulkeneet noin km, kun taas naaraat ovat vaeltaneet km päähän synnyinseudultaan (Liberg 1998). 8

9 Sveitsissä näyttäisi siltä, että tiheään asutuilla alueilla dispersaalietäisyydet ovat lyhyempiä, sillä Juravuoriston harvaanasutussa populaatiossa (0,7 0,8 yks/100 km 2 ) nuoret urokset vaelsivat noin km ja naaraat km, kun taas Alppien tiheämmin asutussa populaatiossa (1,4 1,5 yks/100 km 2 ) dispersaalimatkat olivat uroksilla noin 5 60 km ja naarailla 5 35 km (Zimmermann ym. 2005). Toisaalta, urosten dispersaalietäisyydet olivat tiheään asutussa Puolan Bielowiezan kansallispuistossa (5 yks./ 100 km 2, Jedrjezewski ym. 1996) km, mutta naarailla jäivät alle kymmeneen kilometriin (Schmidt 1998). Harvaan asutussa Keski-Norjassa (0,3 yks/100 km 2 ) dispersaalietäisyydet vaihtelivat 4 79 km välillä (Sunde ym. 2000a). Vaikka Puolan ja Norjan tutkimuksissa käytetty aineisto oli pieni (Puola, n = 6, Norja, n = 5), näyttäisi nuorten ilvesten dispersaalietäisyyteen vaikuttavan populaatiotiheyden lisäksi muutkin tekijät. Luultavasti ympäristöllisillä tekijöillä on suuri vaikutus (Zimmermann ym. 2005), sillä pirstoutunut elinympäristö, josta puuttuu sopivat metsäkäytävät, muodostaa esteen ilvesten levittäytymiselle (Schmidt 1998). Ilveksellä ei ole luontaisia vihollisia, vaikka ahma ja sudet voivat tappaa niitä satunnaisesti (Pulliainen 1974, s ). Poikasten kuolleisuus on suurta, ja noin puolet niistä ei selviä aikuisiksi (Jedrzejewski ym. 1996, Breitenmoser ym. 1993). Pentujen kuolleisuus näyttäisi useimmiten johtuvan luonnollisista syistä, kuten nääntymisestä tai taudeista, kun taas nuorten ja aikuisten ilvesten kuolemat ovat suurelta osin ihmisen aiheuttamia (Andren ym. 2006, Stahl & Vandel 1999). Norjassa aikuiskuolleisuus vaihteli 2 17 % välillä, kun taas salametsästys ja metsästys aiheuttivat yli puolet aikuisten ja nuorten kuolemista. Nuorista ilveksistä kuoli pieni osa liikenneonnettomuuksissa (Andren ym. 2006). Manner-Euroopassa liikenne sen sijaan on merkittävin kuolinsyy, mutta siellä esiintyy myös salametsästystä (Stahl & Vandel 1999, Kramer- Schadt ym. 2004, Schmidt-Posthaus ym. 2002), ja esimerkiksi Puolassa salametsästys aiheutti 71 % nuorten ja aikuisten kuolemista (Jedrzejewski ym. 1996). Dispersoivien nuorten yksilöiden kuolleisuusriski on suuri, ja Saksassa liikenteen aiheuttamat nuorten kuolemat voivat jopa rajoittaa alueiden välistä dispersaalia (Kramer-Schadt ym. 2004). Tautien osuutta kuolleisuuden aiheuttajana ei ilveksen kohdalla tunneta tarkasti. Kuitenkin erilaisista infektiotaudeista johtuvia kuolemia ilmenee kaikissa ikäluokissa, ja erityisesti pienten populaatioiden, joissa esiintyy jo ihmislähtöistä kuolleisuutta, tulevaisuus voi olla uhattuna erilaisten infektiotautien takia (Schmidt-Posthaus ym. 2002) Ilveksen historiaa Suomessa 9

10 Suomessakin ilvestä on muiden petojen tapaan metsästetty voimakkaasti jo keskiajalta lähtien (Ermala 2003). Ilvestä ei yleisesti vihattu kuten muita suurpetoja, mutta sen kaunis turkki oli arvokasta kauppatavaraa ja liha syötävää (Ermala 2003, Pulliainen 1974, s. 218). Ilveksen muinainen levinneisyysalue käsitti koko Suomen lukuun ottamatta pohjoista Lappia ja Keski- Pohjanmaan rannikkoa. Kanta alkoi pienentyä 1800-luvun lopulla, kun susikannan vähentyessä metsästyspaine kohdistui enenevässä määrin ilvekseen. Kanta ei kestänyt voimakasta verotusta, ja 1900-luvulle tultaessa ilves oli kadonnut Länsi- ja Lounais-Suomesta (Pulliainen 1974, s ). Ilveksen metsästys jatkui voimakkaana 1900-luvulla, mutta saalismäärät laskivat huomattavasti 1800-luvun vastaavista (Liite II) (Ermala 2003). Ilveskanta taantui, ja ja 1930-luvuilla kanta oli niin pieni, että koko maassa vuosittainen saalismäärä oli vain muutamia yksilöitä (Pulliainen 1974, s. 253, Ermala 2003). Sota-aikana ilveskanta runsastui hieman, mutta sodan jälkeen tehokkaana jatkunut metsästys pienensi kantaa jälleen mahdollisesti jopa sukupuuton partaalle (Pulliainen 1974, s. 253) ja esimerkiksi professori Lauri Siivosen mukaan Suomen ilveskanta oli 1950-luvulla riippuvainen muualta tulevista vaeltajista (Pulliainen 1974, s. 253) luvun lopulla ja 1960-luvulla Suomeen vaelsi ilveksiä Ruotsista ja idän suunnalta (Pulliainen 1974, s. 253), ja Suomeen alkoi jälleen muodostua pysyvämpi ilveskanta. Ilves rauhoitettiin vuonna 1962, ja 1963 Suomessa arvioitiin olevan noin ilvestä (Pulliainen & Rautiainen 1999), mutta rauhoituksen ja muuttovoiton ansiosta ilveskanta alkoi vähitellen kasvaa. Suomen rajoilla tapahtuvasta petojen mahdollisesta muuttoliikkeestä on saatu tietoa vuodesta 1968 alkaen Rajavartiolaitoksen suorittamien jälkilaskentojen avulla (Pulliainen 1974, s.254, MMM 1996). Ilvesten minimikanta kasvoi vuoden 1978 runsaasta sadasta ilveksestä melko yhtäjaksoisesti vuoden 1988 lähes 900 yksilöön (MMM 1996). Rajanylityshavainnot olivat runsaimpia 80-luvun lopulla, mutta laskivat 90-luvun alkupuoliskolla (MMM 1996). Ilveskannan kehityksessä tapahtui samaan aikaan huomattava notkahdus, kun vuonna 1991 kannan koko laski arviolta 600 yksilöön. Tästä eteenpäin kannan kehitys on ollut nousujohteista (MMM 1996, Kojola ym. 2005). Rajanylityshavaintojen perusteella vaikuttaisi siltä, että Suomeen on tullut ainakin jonkin verran muuttovoittoa 1970-luvulta alkaen (MMM 1996) luvulla suoritetuilla siirtoistutuksilla ei ole ollut merkittävää vaikutusta kannan kehitykseen, sillä Kuusamosta on siirretty Keski-Suomeen vain kolme yksilöä (Nyholm 1995, 1996, s. 80). 10

11 1.1.5 Ilveksen kannan seuranta ja nykyinen tila Suomessa Ilveksen seuranta ja tutkimus kuuluvat maa- ja metsätalousministeriön alaisille tutkimuslaitoksille (Lyytikäinen ym. 2004, s. 50). Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos (RKTL) julkaisee vuosittaiset minimikanta-arviot Suomen suurpedoista. Ilveksen kanta-arviot perustuvat pääasiassa petoyhdyshenkilöiden kirjaamiin pentuehavaintoihin, sillä ilman pidempiaikaista seurantaa on mahdotonta arvioida, onko alueella liikkunut yksittäinen eläin ollut paikallinen asukas vai pelkästään läpikulkumatkalainen. Pentuehavainnot sijoitetaan kartalle, ja niistä arvioidaan erillisten pentueiden lukumäärä (Kojola 2003). Arviota tehtäessä otetaan huomioon viereisten havaintojen etäisyydet toisistaan, pentujen määrä havainnoissa, sekä lajikohtaiset tiedot pentueiden liikkuvuudesta ja elinpiirin koosta (RKTL:n verkkosivut, Kojola 2003). Vuoden 2006 laskennan mukaan Suomessa oli noin ilvestä. Tuolloin kantaan syntyi noin 200 pentuetta ja loppuvuodesta pentuja arvioitiin olevan noin 300 yksilöä (RKTL:n verkkosivut). Ilveskanta on poronhoitoalueen ulkopuolella jakautunut melko tasaisesti koko maahan: itäisen Suomen alueella ilveksistä elää 31 %, Sisä-Suomen alueella 30 % ja läntisen Suomen alueella 33 %. Loppuosa kannasta elää poronhoitoalueella (Kojola ym. 2005). Lisäksi kannan sukupuolirakenne on tasapainoinen, ja ilveksen onkin arvioitu olevan Suomen elinvoimaisin suurpeto (Kojola 2003). Suomessa ilveksen levinneisyysalue on viimeisen kymmenen vuoden aikana laajentunut idästä länteen (RKTL:n verkkosivut), ja nykyisin ilvestä tavataan kaikkialla Suomessa aivan pohjoisinta Lappia lukuun ottamatta (Kojola ym. 2006a). Tihein ilveskanta esiintyy Pohjois-Karjalan ja -Savon riistanhoitopiireissä (Kojola 2003, Pöri 2008) Ilveskanta Skandinaviassa Skandinaviassa ilvekset säilyivät 1900-luvulla ainakin niemimaan keskiosissa (von Arx ym. 2004). Norjassa ilveskanta on viime aikoina laskenut monin paikoin liiallisen metsästyksen vuoksi. Vielä vuonna 1999 Norjassa esiintyi lähes 500 ilvestä, mutta vuonna 2003 maassa arvioitiin elävän enää noin 300 yksilöä (Linnell & Brøseth 2004). Nykyisin kanta on levittäytynyt niin, että ilveksiä esiintyy harvakseltaan koko maassa pohjois- ja lounaisosia lukuun ottamatta (Linnell & Brøseth 2004), mutta kanta vaikuttaisi olevan riippuvainen Ruotsista tulevasta immigraatiosta (von Arx ym. 2004). Ruotsin ilveskanta puolestaan vaikuttaisi hieman taantuneen huippuvuodestaan 2000, jolloin maassa havaittiin 340 perheryhmää (Liberg & Andren 2006), ja kanta arvioitiin yksilön vahvuiseksi (Liberg & Andren 2004). Vuoden 2003 laskennoissa havaittiin 265 perheryhmää, jonka perusteella arvioituna Ruotsin kanta koostuisi noin yksilöstä (Liberg & Andren 2006). 11

12 Ruotsissa ilveskanta on alkanut vähitellen levittäytyä maan eteläosaan, jossa se on tähän mennessä ollut vähälukuinen (Liberg & Andren 2004, 2005), mutta se on vähentynyt pohjoisesta poronhoitoalueelta (Liberg & Andren 2005). Skandit eivät estä geenivirtaa maiden välillä, joten Ruotsin ja Norjan ilvekset muodostavat yhtenäisen populaation (Hellborg ym. 2002). Skandinavian ja Suomen ilvekset luokitellaan samaan alalajiin (von Arx ym. 2004), mutta populaatioiden välillä on havaittu geneettistä erilaistumista (Hellborg ym. 2002) Ilveksen asema Suomen lainsäädännössä ja kansainväliset sitoumukset Metsästyslaissa /615 5 :ssä ilves määritellään riistaeläimeksi (Wikberg 2007, s. 1093), joka on kuitenkin metsästysasetuksen / :n toisen momentin mukaan aina rauhoitettu (Wikberg 2007, s. 1105). Rauhoituksesta voidaan poiketa metsästysasetuksen 28 :n ensimmäiseen momenttiin perustuvista syistä, ja riistanhoitopiirit voivat myöntää maa- ja metsätalousministeriön antamien piirikohtaisten kiintiöiden rajoissa pyyntilupia metsästykseen 1.12 ja 28.2 väliselle ajalle (Lyytikäinen ym. 2004, Wikberg 2007, s. 1105) Kuitenkin vuotta nuoremman pennun seurassa liikkuva naaras on aina rauhoitettu (Wikberg 2007, s. 1105). Euroopan Unionin luontodirektiivin (92/43/ETY) mukaan ilves kuuluu IV liitteen tiukkaa suojelua edellyttäviin lajeihin, ja sitä saa metsästää vain poikkeusperusteiden nojalla, jotka ovat yhteneväisiä metsästysasetuksen 28 :n kanssa. Suomi sitoutui lisäksi Bernin sopimuksella (1979) suojelemaan luonnonvaraista kasvistoa ja eläimistöä sekä niiden elinympäristöä. Sopimuksen mukaan ilves kuuluu II liitteeseen eli suojeltaviin lajeihin. Suomea sitoo myös biodiversiteettisopimus, jonka se hyväksyi Rio de Janeiron ympäristö- ja kehityskonferenssissa (1992) sekä CITES-sopimus, jolla rajoitetaan uhanalaisilla eliölajeilla käytävää kansainvälistä kauppaa (lisätietoja mm. MMM:n verkkosivut, Lyytikäinen ym. 2004, s ) Ilveksen suojelu ja tulevaisuuden uhkatekijät Kansainvälinen luonnonsuojeluliiton (IUCN) uhanalaisuusluokituksia käyttäen ilves on luokiteltu Suomessa vuonna 2000 silmälläpidettäväksi harvinaiseksi lajiksi (near threatened) (Rassi ym. 2001, s. 52, 75 76), koska kannan koko oli tuolloin alle 1000 yksilöä. Ilveksen ei kuitenkaan arvioitu olevan häviämisvaarassa, koska kanta oli kasvava metsästyksestä huolimatta, lisääntymistulos hyvä ja täydennystä saapui todennäköisesti rajojen ulkopuolelta. Ilveksen uhkatekijöiksi arvioitiin metsästys ja laiton tappaminen (Rassi ym. 2001, s ). Nykyisin ilveskannasta metsästetään vuosittain noin 5 8 %, vaikka laji kestäisi arviolta % verotuksen, 12

13 ja kanta on kasvanut (Kojola 2003) Näyttäisikin siltä, ettei metsästys aiheuta uhkaa lajin tulevaisuudelle Suomessa pysyessään nykyisen suuruisena. Toisaalta, tiheimmillä ilveskannan alueilla Itä-Suomessa esiintyy halukkuutta voimakkaampaan metsästykseen (Pöri 2008). Suomen ilveskannan hoitosuunnitelma valmistui alkuvuodesta 2007, ja siinä ilveksen suojelussa katsottiin tärkeäksi lisätä ihmisten tietämystä suurpedoista, koska sosiaalisen sietokyvyn rajallisuuden arveltiin olevan ilveksen suurin uhkatekijä Suomessa (MMM 2007). Kansainvälisen luonnonsuojeluliiton (IUCN) mukaan ilveksen lisääntyvien yksilöiden kokonaismäärä maailmassa on alle yksilöä. Lisäksi koko kannan suuntaus on laskeva, johtuen sekä elinympäristöjen että saaliskantojen hupenemisesta ja metsästyksestä. Mikäli suuntaus jatkuu, tulisi IUCN:n mukaan lajin uhanalaisuusluokitusta tarkistaa, ja muuttaa luokasta silmälläpidettävät luokkaan vaarantuneet (vulnerable) (Breitenmoser ym. 2000). 1.2 Geneettiset tekijät populaation elinvoimaisuuden taustalla Populaatio voidaan määritellä ryhmäksi saman lajin lisääntyviä yksilöitä, jotka esiintyvät alueellisesti yhdessä tiettynä ajankohtana (Hedrick 2005, s ), mutta käsitteen määritelmä herättää edelleen keskustelua (ks. Waples & Gaggiotti 2006). Usein laajalle levinneillä lajeilla esiintyy runsaasti geneettistä muuntelua (esim. Schwartz ym. 2003), kun taas pienissä ja eristyneissä populaatiossa muuntelu voi olla huomattavasti vähäisempää (Johnson ym. 2004). Saaripopulaatioiden muuntelu jää usein vähäisemmäksi, kuin vastaavissa mannerpopulaatioissa esiintyvä muuntelu (mm. Carmichael ym. 2001). Myös niemimaiden sekä reunapopulaatioiden muuntelu voi olla pienempää, kuin lajin levinneisyysalueen ydinaluilla elävillä populaatioilla (Walker ym. 2001, Randi ym. 2001, Schwartz ym. 2003, Gaines ym. 1997). Tällaiset populaatioiden väliset erot johtuvat maantieteellisten ja historiallisten tekijöiden, kuten jääkausien (von Arx ym. 2004, Gugolz ym. 2008), lisäksi myös populaatiossa vaikuttavista evolutiivisista tekijöistä (Hedrick 2005, s. 30) Geneettinen muuntelu Geneettinen muuntelu on populaatiossa esiintyvää alleelien ja genotyyppien monimuotoisuutta (Frankham ym. 2002, s. 47). Populaation geneettinen muuntelu kuvaa sen evolutiivista potentiaalia, koska evoluutiota voi tapahtua vain populaatiossa esiintyvän muuntelun kautta (Frankham ym. 2002, s. 46). Tällöin luonnonvalinta voi johtaa adaptiiviseen evoluutioon, ja mahdollistaa 13

14 populaation sopeutumisen muuttuvaan ympäristöön (Frankham ym. 2002, s. 128, Reed & Frankham 2003). Luonnon populaatioiden elinympäristö on alati muuttuva, ja vähän muuntelua omaava populaatio on haavoittuvaisempi erilaisille ulkoisille tekijöille, kuten sairauksille, loisille tai kilpailijoille (mm. Lacy 1987). Nykyisin sopeutumiskyky on useiden populaatioiden kohdalla tarpeen, koska ilmastomuutos haastaa eliöitä siirtymään uusille elinalueille, tai sopeutumaan muuttuviin ilmasto- ja ympäristöoloihin (Hughes 2000). Sopeutumiskyvyn lisäksi geneettinen muuntelu liittyy populaation kelpoisuuteen (Reed & Frankham 2003). Geneettisen muuntelun tärkeys onkin tunnustettu, sillä kansainvälinen luonnonsuojeluliitto luokittelee sen yhdeksi kolmesta suojeltavasta biologisen monimuotoisuuden muodosta lajien ja elinympäristöjen rikkauden lisäksi (McNeely ym. 1990, s. 17). Mutaatiot ovat kaiken muuntelun alkuperäinen lähde, ja ne luovat populaatioon uudenlaisia alleeleja (Hedrick 2005, s. 357, Lacy 1987). Kuitenkin lyhyessä ajallisessa mittakaavassa mutaatioiden vaikutus muuntelun määrään on vähäinen, jolloin migraatio on populaatiossa esiintyvän muuntelun kannalta merkittävämpi tekijä (Lacy 1987). Äärellisen populaatiokoon seurauksena menetetään neutraalia muuntelua, mutta suurissa populaatioissa sattumalla on vähäisempi merkitys muuntelun määrään (Hedrick 2005, s ), kun taas pienissä populaatioissa sattumasta tulee merkittävin evolutiivinen tekijä (Lacy 1987) Geneettisen muuntelun mittaaminen Populaation geneettisen muuntelun kuvaamiseen voidaan käyttää erilaisia estimaatteja. Odotettu heterotsygotia (H e ) eli geenidiversiteetti (Nei 1987, s ) voidaan yksinkertaistettuna kuvata todennäköisyydeksi, että populaatiosta otannalla saadut kaksi alleelia ovat erilaisia (Petit ym. 1998). Lokuksen Hardy-Weinbergin tasapainon (HWE) mukainen odotettu hetorotsygotia voidaan laskea kaavan n 2 H e = 1 p i (1.2.1) i= 1 mukaan (Nei 1987, s. 177, Hedrick 2005, s. 97), jossa p i on alleelin i frekvenssi ja n alleelien lukumäärä. Havaittu heterotsygotia (H o ) kuvaa populaation heterotsygotiaa, joka on arvioitu näytteen genotyyppifrekvenssien avulla, ja se lasketaan heterotsygoottien yksilöiden suhteena näytteen yksilömäärään (Hedrick 2005, s. 71). Muuntelua voidaan kuvata myös lokuksessa 14

15 esiintyvien alleelien lukumäärällä (A), mutta näytekoolla on siihen huomattava vaikutus (Nei 1987, s ). Esimerkiksi vertailtaessa sellaisten populaatioiden geneettisen muuntelun määrää, joista on ollut saatavilla erilainen näytekoko, saadaan paremmin vertailukelpoisia arvioita suhteuttamalla alleelien lukumäärä näytekokoon laskemalla alleelirikkaus (R s ) (Leberg 2002, Petit ym. 1998) Ilveksen geneettinen muuntelu Euroopassa Euroopan ilveksen geneettistä muuntelua on tutkittu autosomaalisilla (Breitenmoser-Wursten ja Obexer-Ruff 2003, Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a, Schmidt ym. 2008) ja Y- kromosomaalisilla (Hellborg & Ellegren 2004) nukleaarisilla markkereilla, sekä mitokondriaalisen DNA:n avulla (Hellborg ym. 2002, Gugolz ym. 2008). Mikrosatelliitteihin perustuvissa tutkimuksissa on käynyt ilmi ilveksen kohtalainen (Breitenmoser-Wursten ja Obexer-Ruff 2003, Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a), ja Y-kromosomin ja mtdna:n sekvenssimuunteluun perustuvissa tutkimuksissa suorastaan vähäinen (Hellborg ym. 2002, Hellborg & Ellegren 2004, Gugolz ym. 2008) muuntelun määrä Euroopassa. Keski-Eurooppaan siirtoistuttamalla palautettujen ilvespopulaatioiden geneettisen muuntelun määrä on ollut pääsääntöisesti vähäisempää, kuin Karpaateilla ja Euroopan pohjoisosissa säilyneiden alkuperäispopulaatioiden (Breitenmoser- Wursten ja Obexer-Ruff 2003). Myös Puolassa, jossa ilvekset kuuluvat lajin länsireunan rikkonaiseen levinneisyysalueeseen, on muuntelun määrä pienempi, kuin yhtenäisempää levinneisyysalueeseen kuuluvien Baltian ilvesten (Schmidt ym. 2008). Ilveksen levittäytymistä Eurooppaa viimeisen jääkauden jälkeen valotetaan tuoreessa mitokondriaalisiin haplotyyppeihin perustuvassa tutkimuksessa (Gugolz ym. 2008). Sen mukaan ilveksellä vaikuttaisi olleen useita jääkauden aikaisia lähdepopulaatioita, ja levittäytyminen Pohjois-Eurooppaan on ilmeisesti tapahtunut yhdestä Välimeren läheisyydessä sijainneesta lähdepopulaatiosta. Suomeen ilves on luultavasti levittäytynyt Baltian kautta (Gugolz ym. 2008), koska populaatiot ovat geneettisesti samankaltaisia (Hellborg ym. 2002, Gugolz ym. 2008), mutta Skandinaviaan ilves on voinut levittäytyä myös Tanskan salmen kautta (Gugolz ym. 2008). Skandinavian ilveskanta laski voimakkaasti 1900-luvun alkupuolella, ja nykyisin niemimaalla esiintyy huomattavaa geneettistä erilaistumista pohjois etelä-suunnassa (Hellborg ym. 2002). Simulaatiotutkimusten pohjalta on esitetty, ettei alueiden välinen erilaistuminen selity pelkästään kannan laajenemisella yhdestä niemimaan keskiosassa säilyneestä populaatiosta (Rueness ym. 2003a, Jorde ym. 2006). Myös Skandinavian pohjoisosassa ja etelässä esiintyviä privaattialleeleja 15

16 on pidetty merkkeinä, että nykyinen ilveskanta on peräisin useammasta niemimaalla säilyneestä ilvesesiintymästä (Rueness ym. 2003a). Toisaalta privaattialleelien esiintyminen voi selittyä yksinkertaisilla demografisilla tapahtumilla. Simulaatioiden avulla onkin osoitettu, että otettaessa huomioon sattuman vaikutukset, myös yhdeltä ydinalueelta tapahtunut kannan laajeneminen voi saada aikaan nykyisin havaittavan muuntelun jakautumisen (Pamilo 2004) Efektiivinen populaatiokoko Äärettömän suuressa populaatiossa alleelifrekvenssit pysyvät vakaina, kun sattuman lisäksi muut evolutiiviset tekijät eivät vaikuta niihin. Sen sijaan äärellisessä populaatiossa sattuma johtaa ajan kuluessa alleelifrekvenssien muutokseen, ja sen suuruus riippuu populaation efektiivisestä koosta (Wang 2005). Populaation yksilömäärä ei kuvaa populaation efektiivistä kokoa (Crow & Denniston 1988), koska evoluution kannalta tärkeää on lisääntyvien yksilöiden lukumäärä kaikkien ikäluokkien yksilöiden lukumäärän sijaan (Wright 1931). Toisaalta lisääntyvien yksilöiden määrä kuvaa harvoin populaation todellista efektiivistä kokoa, koska monet demografiset tekijät, kuten tuotettujen jälkeläisten lukumäärän suuri varianssi tai sukupolvesta toiseen vaihteleva populaatiokoko, vaikuttavat evolutiivisesti merkitykselliseen populaatiokokoon (Crow & Denniston 1988). Demografisten tekijöiden lisäksi populaation sisäinen rakenne (Wang & Caballero 1999) ja lisääntymisjärjestelmä (Kaeuffer ym. 2004) voivat myös laskea populaation efektiivistä kokoa. Koska edes lisääntyvien yksilöiden lukumäärä ei anna luotettavaa kuvaa populaatiossa vaikuttavan sattuman voimakkuudesta, ja populaation geneettisestä panostuksesta seuraavaan sukupolveen (Wright 1931, Hedrick 2005, s. 318), on Wrightin (1931) määrittelemästä efektiivisestä populaatiokoosta tullut tärkeä käsite evoluutio- ja suojelubiologiassa (Wang 2005, England ym. 2006). Efektiivinen populaatiokoko kuvaa populaatiossa esiintyvien geneettisten tekijöiden äärellisestä populaatiokoosta aiheutuvia vaikutuksia, ja se voidaan määritellä eri tavalla riippuen siitä, mitä geneettistä tekijää määrittelemiseen käytetään (Crow & Kimura 1988). Perinteisesti on erotettu käsitteet sukusiitos- ja varianssiefektiivinen populaatiokoko (inbreeding and variance effective population size, N e(i) ja N e(v) ) (Crow & Denniston 1988, Crow & Kimura 1970, s ). Sukusiitosefektiivinen populaatiokoko kuvaa homotsygotian kasvua, ja varianssiefektiivinen populaatiokoko alleelifrekvenssien muutoksen varianssin kasvua sattuman vaikutuksesta tutkittavassa populaatiossa, verrattuna ihanteelliseen populaatioon (Crow & Denniston 1988, Hedrics 2005, s. 319). Toisin sanoen efektiivinen populaatiokoko on sellaisen ihannepopulaation 16

17 koko, jossa esiintyy saman verran sukusiitosta tai alleelifrekvenssien varianssia, kuin tutkittavassa populaatiossa (Hedrick 2005, s. 319). Usein eri määritelmiä ei eroteta toisistaan, vaan käytetään yleisnimitystä efektiivinen populaatiokoko (ks. Wang 2005). Efektiivisen populaatiokoon määritelmässä käytettävä ihannepopulaatio on Wrightin (1931) ja Fisherin (1930) mukaan lähes äärettömän suuri populaatio, jossa kaikki yksilöt ovat potentiaalisia lisääntyjiä ja pariutuminen on satunnaista. Tuotettujen jälkeläisten määrä noudattaa Poissonjakaumaa, ja lisääntyvien yksilöiden määrä pysyy samana sukupolvesta toiseen. Myös sukupolvet ovat erilliset, eivätkä muut evolutiiviset tekijät vaikuta populaatioon. Tällainen ihanteellinen populaatio käsittää suuren joukon oletuksia, jotka tuskin toteutuvat luonnon populaatioissa (Wright 1931). Kuitenkin suhteuttamalla tutkittavan populaation koko ihanteellisen populaation kokoon, voidaan tehdä johtopäätöksiä tutkittavasta populaatiosta, koska ihannepopulaation teoreettinen perusta on hyvin määritelty (Frankham ym. 2002, s. 189, Crow & Kimura 1970, s. 345). Efektiivinen populaatiokoko vaikuttaa muiden evolutiivisten voimien kanssa populaatiossa esiintyvän muuntelun määrään ja jakautumiseen (Wang 2005). Äärellisen populaatiokoon vaikutukset on nähtävissä esimerkiksi Sveitsin Alpeille ja Juravuoristoon siirtoistuttamalla palautetuissa pienissä ja eristyneissä ilvespopulaatioissa, jotka ovat menettäneet lähes kolmanneksen alleeleistaan sattuman vaikutuksesta verrattuna niiden suurempaan lähdepopulaatioon Karpaateilla (Ryser-Degiorgis ym. 2004). Pieni populaatio menettää geneettistä muuntelua nopeammin kuin suuri, ja tätä suhdetta voidaan kuvata kaavalla H t /H 0 = [1 1/(2N e )] t = 1 F t (1.2.2) jossa H 0 ja H t ovat heterotsygotia alkusukupolvessa ja sukupolvessa t, N e efektiivinen populaatiokoko ja F t sukusiitoskerroin (Frankham ym. 2002, s. 267, Reed & Frankham 2003, Falconer & Mackay 1996, s ). Kaavasta nähdään, että heterotsygotian menetyksen suuruus sukupolvea kohti riippuu populaation efektiivisestä koosta, ja heterotsygotian vähentyessä vastaavasti sukusiitoksen määrä kasvaa. Neutraalin muuntelun lisäksi efektiivinen populaatiokoko vaikuttaa valinnan kohteena olevien alleelien, sekä haitallisten että hyödyllisten, fiksoitumisnopeuteen (Driscoll 1999, Crow & Kimura 1970, s ). Vaikka hyödyllisten alleelien fiksoituminen on avaintekijä lajien evoluutiossa (Crow & Kimura 1970, s. 418), esiintyy pienissä populaatioissa vaara ajautua sukupuuttoon haitallisten mutaatioiden kertymisen (mutational 17

18 meltdown) kautta. Näin ollen populaation kelpoisuuden ja sukupuuttoriskin arvioimiseksi on tärkeä määrittää populaation efektiivinen koko (Lynch ym. 1995) Efektiivisen populaatiokoon arviointi geneettisillä menetelmillä Useat demografiset tekijät vaikuttavat populaation efektiiviseen kokoon (ks. esim. Caballero 1994, Wang & Caballero 1999), mutta efektiivisen populaatiokoon arviointiin tarvittavien demografisten parametrien arviointi on vaikeaa, ja joskus lähes mahdotonta, joten nykyisin efektiivistä populaatiokokoa arvioidaan useimmiten geneettisten menetelmien avulla (Wang 2005). Efektiivistä populaatiokokoa voidaan arvioida useiden erilaisten geneettisten menetelmien avulla, ja ne perustuvat sattuman vaikutukseen populaatiossa esiintyviin geneettisiin piirteisiin (ks. Hedrick 2005, s ). Ajalliset menetelmät ovat olleet käytetyimpiä efektiivisen populaatiokoon arvioinnissa, vaikka ne vaativat samasta populaatiosta kaksi näytettä eri ajankohdilta (Tallmon ym. 2008). Kyseiset menetelmät perustuvat alleelifrekvenssien muutokseen näiden ajankohtien välillä, ja ne olettavat, että sattuman lisäksi muut tekijät eivät vaikuta populaation alleelifrekvensseihin. Populaatioiden välillä tapahtuneiden ajallisten alleelifrekvenssien muutoksen avulla voidaan laskea ajallisen muutoksen standardisoitu varianssi (F), jota voidaan käyttää efektiivisen populaatiokoon arviointiin (Waples 1989). Ajallisten menetelmien haittapuolena on se, että populaatiosta vaaditaan näytteet eri sukupolvista, ja pitkäikäisillä lajeilla sukupolven väli voi olla kohtuuttoman pitkä (Tallmon ym. 2008). Yhdestä näytepopulaatiosta voidaan arvioida efektiivistä kokoa kytkentäepätasapainon (LD) avulla, jota sattuma saa aikaan eri lokusten alleelien välille (Hill 1981, Hedrick 2005, s ). Toisaalta, äärellisessä populaatiossa esiintyy Hardy-Weinbergin tasapainon mukaisiin odotuksiin verrattuna heterotsygotian ylimäärä jälkeläisten sukupolvessa, vanhempien sukupolveen vaikuttaneen sattuman johdosta (Wang 2005). Tätä ylimäärää voidaan käyttää efektiivisen populaatiokoon arviointiin (Pudovkin ym. 1996). Kuitenkin näiden menetelmien käyttö on jäänyt varsin vähäiseksi (Waples & Do 2007), koska niiden on osoitettu olevan harhaisia ja antavan puoltavia arvioita populaation efektiivisestä koosta (Luikart & Cornuet 1999, England ym. 2006). Nykyisin on kehitetty uudenlaisia bayesilaisia menetelmiä efektiivisen populaatiokoon arviointiin yhdestä näytepopulaatiosta (Tallmon ym. 2008), ja parannettu esimerkiksi kytkentäepätasapainoon perustuvaan arviointimenetelmää (Waples 2006). 18

19 Pullonkaula Populaatio voi olla lähtöisin pienestä määrästä yksilöitä perustajavaikutuksen tai populaation pullonkaulan takia (Hedrick 2005, s. 342). Pullonkaulan seurauksena populaation efektiivinen koko laskee, ja populaatio menettää geneettistä muuntelua sekä evolutiivista potentiaalia (England ym. 2003). Myös sukusiitosta on mahdoton välttää pienessä eristyneessä populaatiossa. Tämä lisäksi populaatio erilaistuu geneettisesti muista populaatioista, koska pienessä populaatiossa sattuma muuttaa alleelifrekvenssejä (Frankham ym. 2002, s ). Heterotsygotian vähenemisen määrä riippuu populaation koosta pullonkaulan aikana, sekä populaation sisäisestä kasvunopeudesta pullonkaulan jälkeen. Alleelien lukumäärän väheneminen sen sijaan riippuu ainoastaan pullonkaulapopulaation koosta, ja alleeleja menetetään runsaasti ensimmäisessä pullonkaulasukupolvessa. Koska pienessä populaatiossa sattuma on vallitseva evoluutiovoima, erityisesti pienellä frekvenssillä esiintyvät alleelit karsiutuvat pullonkaulan seurauksena (Nei ym. 1975, England ym. 2003). Alleelien menetyksen ja heterotsygotian vähenemisen avulla voidaan arvioida, onko populaatio todennäköisesti kokenut pullonkaulaa (Cornuet & Luikart 1996, Luikart ym. 1998), sillä pullonkaulan jälkeen alleelien lukumäärä kasvaa hitaammin kuin heterotsygotia suljetussa populaatiossa (Nei ym. 1975) Sukusiitos ja sukusiitosheikkous Populaatiossa esiintyy sukusiitosta silloin, kun lisääntyvät yksilöt ovat keskenään keskimääräistä läheisempää sukua, kuin mitä sattuman vaikutuksesta olisi odotettavissa (Crow & Kimura 1970,s. 61). Sukusiitoksen määrää voidaan kuvata Wrightin (1922) sukusiitoskertoimen avulla, joka voidaan määritellä yksilössä havaittavien homologisten alleelien todennäköisyydeksi olla samanlaisia alleelien yhteisen alkuperän johdosta (identical by descent, IBD) (Crow & Kimura 1970, s ). Toisin kuin eräät evolutiiviset tekijät, sukusiitos ei muuta populaation alleelifrekvensejä, vaan lisää populaatiossa esiintyvien homotsygoottien yksilöiden määrää. Sukusiitoksen vaikutus kohdistuu genomin kaikkiin lokuksiin, mutta sen vaikutus voi myös olla ohimenevä, jos populaation pariutumisjärjestelmä muuttuu. Sukusiitoksen vaikutus populaation genotyyppifrekvensseihin on suuri varsinkin harvinaisten alleelien osalta. Esimerkiksi harvinaisten resessiivisten tautien esiintyvyys voi lisääntyä sukusiitoksen vaikutuksesta huomattavasti resessiivisten homotsygoottien yksilöiden lukumäärän lisääntyessä (Hedrick 2005, s ). 19

20 Kaavasta nähtiin, kuinka äärellisessä populaatiossa sukusiitoksen määrä kasvoi joka sukupolvessa. Tämän muutoksen suuruus riippuu populaation efektiivisestä koosta F = 1/(2N e ) (Falconer & Mackay 1996, s. 66, Caballero 1994, Reed & Frankham ym. 2003). Sukusiitoksesta aiheutuvan heterotsygotian menetys on haitallista populaation tulevaisuuden kannalta, koska heterotsygotian menetys altistaa populaation sukusiitosheikkouden haitallisille vaikutuksille. Tämä voi johtaa populaation kelpoisuuden laskuun (Reed & Frankham 2003), ja vähentää populaation evolutiivista potentiaalia (England ym. 2003). Sukusiitosheikkoudella tarkoitetaan yksilön tai populaation kelpoisuuden laskua sukusiitoksen seurauksena, ja sen geneettiselle taustalle on esitetty kaksi hypoteesia: ylidominanssi- ja osittaisdominanssihypoteesi (Wright 1977). Ylidominanssihypoteesin mukaan sukusiitosheikkous johtuu heterotsygoottien paremmuudesta homotsygootteihin verrattuna. Koska sukusiitos vähentää heterotsygoottien määrää, kelpoisuus vastaavasti laskee. Osittaisdominanssihypoteesin mukaan alentunut kelpoisuus on seurausta siitä, että sukusiitoksessa resessiiviset, tai osittain resessiiviset, haitalliset alleelit homotsygoituvat (Charlesworth & Charlesworth 1987) Sukusiitoksen mittaaminen Ajan myötä tapahtuneen heterotsygotian menetyksen avulla voidaan arvioida populaation sukusiitoskertoimen suuruutta, mutta silloin on tunnettava heterotsygotia myös alkusukupolvessa. Jos tämä tiedetään, voidaan ratkaista, että F t = 1 H t /H 0, jossa H 0 kuvaa heterotsygotiaa alkusukupolvessa (Frankham ym. 2002, s. 267). Sukusiitoskerroin yhdessä sukupolvessa voidaan määrittää populaation alleeli- ja genotyyppifrekvenssien avulla siten, että F t = 1 H o /H e, jossa H o on populaatiossa havaittu heterotsygotia, ja H e on HW-tasapainon mukaan odotettu heterotsygotia. Sukusiittoisessa populaatiossa havaittu heterotsygotia on pienempi kuin HW-tasapainon mukaan odotettu heterotsygotia, ja siihen vaikuttaa populaation sukusiitoksen aste, jolloin H o = H e 2Fpq (Hedrick 2005, s ). Populaation sukusiittoisuutta voidaan arvioida myös Wright kehittämän F-statistiikan avulla, jossa geneettinen muuntelu jaetaan kolmelle hierarkiatasolle: koko populaation tasolle (T), alapopulaatiotasolle (S) ja yksilötasolle (I) (Hedrick 2005, s. 488). F-statistiikan laskemiseen voidaan käyttää useampaa lähestymistapaa (ks. Weir & Cockerham 1984, Hedrick 2005, s ), ja F IS kuvaa yksilöiden poikkeamaa HW-tasapainon mukaan odotetuista genotyyppisuhteista alapopulaatioiden sisällä (ks. Hedrick 2005, s ). Positiiviset arvot osoittavat alapopulaatiossa esiintyvän heterotsygotian puutetta ja mahdollisesti sukusiitosta, negatiiviset arvot 20

21 taas kertovat heterotsygotian ylimäärästä (Hedrick 2005, s. 488) ja sukusiitoksen välttämisestä. Sukusiitoksen lisäksi myös muut tekijät, kuten Wahlundin ilmiö (Wahlund 1928) tai alidominanssi, voivat saada aikaan heterotsygotian vähenemisen (Hedrick 2005, s. 96) Sukusiitos luonnonpopulaatioissa Lajeilla, jotka normaalisti välttävät lisääntymistä läheisten sukulaisten kanssa, on luonnossa esiintyvä sukusiitos yleensä seurausta pienestä populaatiokoosta (Frankham ym. 2002, s. 263). Sukusiitosheikkouden tutkiminen luonnonpopulaatioista on vaikeaa ja sen esiintymiseen luonnossa on suhtauduttu epäillen (ks. Crnokrak & Roff 1999 ja viitteet). Nykyisin on kuitenkin osoitettu, että sukusiitosheikkoutta esiintyy luonnon populaatioissa (Crnokrak & Roff 1999), ja sen haitallinen vaikutus on itse asiassa suurempi luonnossa kuin tarhapopulaatioissa (Crnokrak & Roff 1999, ks. myös Ralls ym. 1988). Sukusiitosheikkouden haitallinen vaikutus on ilmeisesti voimakkaampi luonnostaan ristisiittoisilla lajeilla, joilla se ilmenee muun muassa keskimääräistä heikompana elinkykynä ja lisääntymiskelpoisuutena. Erityisesti tuotettujen jälkeläisten määrä ja lisääntymiskyky ovat alttiimpia sukusiitosheikkoudelle, kuin esimerkiksi kelpoisuuteen epäsuoremmin liittyvä yksilön koko (ks. Frankham ym. 2002, s ). Sukusiitos näyttäisi lisäävän luontaisesti sukusiitosta välttävien lajien sukupuuttoriskiä merkittävästi, erityisesti pienten populaatioiden kohdalla (Frankham 1995, Bijlsma ym. 2000). Monet lajit pyrkivät välttämään sukusiitosta, ja niille on kehittynyt erilaisia käyttäytymismalleja sen ehkäisemiseksi, kuten dispersaali ja sukulaisten tunnistaminen (ks. yhteenveto Pusey & Wolf 1996) Migraatio Migraatio on homogenisoiva evolutiivinen voima (Slatkin 1985a, Wang & Caballero 1999), joka vähentää geneettistä erilaistumista. Populaation efektiivinen koko ja sukusiittoisuuden aste vaikuttavat populaatiossa jo esiintyvän muuntelun määrään, mutta migraatio voi tuoda populaatioon kokonaan uudenlaisia alleeleja, ja näin lisätä populaation geneettistä monimuotoisuutta (Frankham ym. 2002, s. 167, Lacy 1987). Migraatiolla onkin havaittu olevan huomattavan positiivinen vaikutus populaation selviytymismahdollisuuksiin tulevaisuudessa (Vila ym. 2003). Migraatiolla tarkoitetaan populaatioiden välistä geenivirtaa, kun taas dispersaali on populaation sisällä tapahtuvaa alleelien levittäytymistä (Neigel 1997). Kokonaisuudessaan geenivirralla tarkoitetaan populaatioissa tapahtuvaan geenien liikettä, joka muuttaa alleelien alueellista jakautumista, ja se voi tapahtua gameettisessa tai tsygoottisessa elämänvaiheessa (Slatkin 1985a). 21

22 Maantieteelliset, historialliset, ekologiset tai käyttäytymiseen liittyvät syyt voivat johtaa erillisten populaatioiden esiintymiseen (Hedrick 2005, s , Pilot ym. 2006, Carmichael ym. 2001, Stenseth ym. 2004), mutta myös ihmisen aiheuttama elinympäristöjen hävitys voi saada aikaan yhtenäisten populaatioiden pirstoutumisen erillisiksi saarekkeiksi (Kramer-Schadt ym. 2004). Migraatio ehkäisee alapopulaatioiden välistä alueellista erilaistumista (Lacy 1987), mutta siitä, monta migranttia sukupolvessa on riittävästi estämään populaatioiden erilaistumisen sattuman vaikutuksesta, ei olla täysin yhtä mieltä. Saarimallin mukaan on teoreettisesti arvioitu, että yksi migrantti sukupolvessa riittäisi estämään populaation muuntelun menetyksen ja erilaistumisen muista populaatioista (Wright 1931). Kuitenkin luonnon populaatiot poikkeavat monin tavoin mallin ihanteellisesta populaatiosta, ja tämän takia on esitetty, että populaatioiden geneettisen erilaistumisen ehkäisemiseksi tarvitaan viisi (Lacy 1987), tai jopa yli kymmenen populaatioiden välistä migranttia sukupolvessa (Vucetich & Waite 2000) Migraation määrän mittaaminen luonnon populaatioista Migraation määrää voidaan arvioida maastohavaintoihin perustuvilla suorilla menetelmillä, joissa pyydystetään uudelleen merkittyjä yksilöitä (ks. esim. Berry ym. 2004), tai seurataan radiolähettimillä varustettuja yksilöitä (mm. Schmidt 1998). Nämä ovat kuitenkin työläitä menetelmiä ja niiden arviot ovat monesti epäluotettavia (Koenig 1996), joten migraation määrää populaatioiden välillä tutkitaankin usein geneettisten menetelmien avulla. Perinteiset geneettiset menetelmät perustuvat erillisten alapopulaatioiden välisen migraation tutkimiseen matemaattisten mallien avulla. Eri mallit sisältävät erilaisia oletuksia esimerkiksi alapopulaatioiden lukumäärästä, ja sopivimman mallin pohjalta voidaan populaatioiden alleelifrekvenssien avulla arvioida migraation määrää (Slatkin 1985a). Yksinkertaisessa mannersaari -mallissa oletetaan, että geenivirta suuntautuu mantereelta saarelle ja migraation lisäksi muut tekijät eivät vaikuta alleelifrekvensseihin (Hedrick 2005, s. 472). Migraation vaikutusta saaripopulaation alleelifrekvensseihin yhdessä sukupolvessa voidaan kuvata kaavalla q = m(q 0 q m ) (Wright 1931), josta nähdään muutoksen suuruuden riippuvan migraation määrästä (m), ja alleelifrekvenssien eroista migranttien (q m ) ja paikallisten (q 0 ) yksilöiden välillä (Hedrick 2005, s ). Populaatioon tulevan migraation määrä voidaan laskea, jos tunnetaan alleelifrekvenssit ennen migraatiota (q 0 ) ja sen jälkeen (q 1 ), koska q 1 = q 0 m(q 0 q m ), jolloin migraation määrä on m = (q 0 q 1 )/(q 0 q m ) (Hedrics 2005, s. 484). Migraation määrää voidaan tutkia myös Wrightin kehittämän F ST -estimaatin avulla (Slatkin 1985a). F ST kuvaa populaatioiden välistä erilaistumista, ja 22

23 se voidaan määritellä usealla tavalla (Balloux & Lugon-Moulin 2002). Wrightin määritelmän mukaa F ST kuvaa kahden satunnaisesti valitun alleelin välistä korrelaatiota alapopulaatiossa verrattuna kahteen satunnaiseen alleeliin poimittuna koko populaatiosta (ks. Balloux & Lugon- Moulin 2002). Migraation määrää voidaan arvioida Wrightin (1931) saarimallin pohjalta, jolloin F ST 1/(4Nm + 1) (Slatkin 1985a). Harvinaiset alleelit ovat erityisen herkkiä geenivirralle, koska niiden liikkuminen ei ole todennäköistä ellei geenivirta ole verrattain yleistä, joten myös niitä voidaan käyttää erillisten alapopulaatioiden välisen migraation arviointiin (Slatkin 1985b). Perinteisten geneettisten menetelmien käyttöä migraation määrän arvioimiseen on arvosteltu niiden epätodellisten oletusten takia. Ne perustuvat yksinkertaistettuihin malleihin, jotka tuskin vastaavat luonnossa esiintyviä olosuhteita. Perinteiset menetelmät myös olettavat populaatioiden saavuttaneen tasapainotilan migraation ja sattuman suhteen, mikä tuskin on todennäköistä ihmisen muokkaamassa ympäristössä (Whitlock & McCauley 1999, Manel ym. 2005). Lisäksi mallien tuottamiin estimaatteihin liittyy usein suuri varianssi (Paetkau 2004), ja ne heijastavat pidempiaikaista geenivirtaa, eivätkä näin ollen pysty kuvaamaan luonnossa tällä hetkellä tapahtuvia muutoksia (Paetkau 2004, Manel ym. 2005). Kuitenkin populaatioiden suojelun kannalta on tärkeää tuntea geenivirran nykyinen määrä (Paetkau 2004), joten lähiaikoina on kehitetty lukuisia menetelmiä, joiden avulla voidaan tutkia populaation nykyistä dynamiikkaa (yhteenvetona ks. Manel 2005). Näistä voidaan käyttää yhteisnimitystä osoitusmenetelmät (assignment methods) (Manel ym. 2005), ja ne perustuvat yksilöiden monilokusgenotyyppien luokitteluun sopivimpaan populaatioon todennäköisyyksien avulla (Rannala & Mountain 1997, Cornuet 1999, Paetkau 1995, Peatkau 2004). Menetelmät tarjoavat suoria arvioita nykyisestä geenivirrasta yksilötasolla (Manel ym. 2005), ja niiden on osoitettu toimivan luonnon oloissa (Berry ym. 2004) Dispersaali ja populaation sisäinen rakenne Nisäkkäillä dispersoivat yksilöt ovat yleensä nuoria uroksia (Greenwood 1980), ja dispersaalikäyttäytymisen on esitetty johtuvan esimerkiksi sukusiitoksen välttämisestä, tai samaa sukupuolta olevien yksilöiden välisen kilpailun vähentämisestä (ks. esim. Dopson & Jones 1985). Toisaalta on korostettu, ettei dispersaaliin välttämättä johda mikään yksittäinen syy, vaan yksilön dispersointi voi olla tulosta useiden tekijöiden yhteisvaikutuksesta (Hilborn & Sterns 1982, Dopson & Jones 1985). Dispersaalilla on tärkeä rooli erillisten alueiden geneettisen samankaltaisuuden säilyttämisen kannalta esimerkiksi metapopulaatiossa, jossa lajille sopivat elinympäristöt sijaitsevat laikuittaisesti (Ferreras ym. 2004, Kramer-Schadt ym. 2004). Myös maantieteellisesti yhtenäisen 23

24 populaation eri osien välinen geneettinen samankaltaisuus riippuu populaatiossa esiintyvän dispersaalin määrästä ja etäisyydestä. Erityisesti suuressa populaatiossa voi lajin rajallisen dispersaalietäisyyden takia syntyä etäisyysisolaatiosta (isolation by distance) aiheutuvaa populaatiorakennetta (Wright 1943). Yhtenäisen populaation sisäistä rakennetta ja geenivirtaa on vaikea tutkia alleelifrekvensseihin perustuvilla menetelmillä, kuten molekyylivarianssianalyysillä (AMOVA) tai F-statistiikalla, jotka perustuvat erillisten alapopulaatioiden väliseen vertailuun. Tällöin yksilöpohjaiset menetelmät ovat käyttökelpoisempia (ks. yhteenveto Manel ym. 2003). Populaation sisäisen rakenteen tutkimiseen voidaan käyttää osoitusmenetelmiä (Manel ym. 2003, 2005). Bayesilaiset ryhmittelymenetelmät ovat varsin käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen, sillä populaation rakenteesta ei tarvita ennakkotietoa, vaan menetelmät pyrkivät löytämään populaation geneettistä rakennetta parhaiten selittävän ryhmittelyn yksilöiden monilokusgenotyyppien perusteella (Pritchard ym. 2000, Corander ym. 2003, 2006). Populaatiorakenteen selvittäminen ryhmittelyn avulla perustuu siihen, että oikea ryhmittely minimoi ryhmien sisäisen kytkentä- ja HW-epätasapainon (Pritchard ym. 2000, Corander ym. 2003, 2006). Kuitenkin populaation sisäisen rakenteen lisäksi, myös muut tekijät voivat saada aikaan poikkeamia kytkentä- ja HW-tasapainosta (Manel ym. 2003). Yhtenäisen populaation sisällä esiintyvää etäisyysisolaatiota voidaan arvioida yksilöiden välisen sukulaisuuden ja maantieteellisen etäisyyden avulla (Hardy & Vekemans 1999, Hardy 2003). Etäisyysisolaation mallia seuraavasta populaatiosta voidaan arvioida naapuruston koko (neighborhood size, Nb) (Hardy 2003), joka on sen populaatiorakenteen perusyksikkö, ja kuvaa sattuman vaikutuksen laajuutta paikallisesti (Wright 1943). Naapuruston koko voidaan määritellä populaation tiheyden (D) ja aksiaalisen dispersaalietäisyyden varianssin (σ 2 ) avulla siten, että Nb = 4πDσ 2 (Wright 1943, Hardy & Vekemans 1999). Kaava mahdollistaa keskimääräisen dispersaalietäisyyden, tai vastaavasti naapuruston koon arvioinnin, jos tutkittavasta populaatiosta tunnetaan toinen parametreista sekä populaation yksilötiheys (Hardy 2003). Toisaalta useat tekijät vaikuttavat dispersaalietäisyyksiin (Hedrick 2005, s. 336), joten ne eivät välttämättä seuraa normaalijakaumaa (Rousset 1997). Tämän takia naapuruston koon teoreettinen perusta ei ole vankkumaton (Rousset 1997), joten naapuruston koon biologista tärkeyttä ei tule yliarvioida, mutta silti sen avulla voidaan havainnollistaa geenivirran ja sattuman tasapainoa populaation sisällä (Vekemans & Hardy 2004). 1.3 Mikrosatelliitit 24

25 Työssä käytettiin geneettisenä markkerina mikrosatelliitteja, jotka ovat hyvin muuntelevia ja nykyisin paljon käytettyjä populaatioiden geneettisissä tutkimuksissa. Mikrosatelliitit eli lyhyet tandemtoistot (short tandem repeats, STR) tai yksinkertaiset toistot (simple sequence repeats, SSR) muodostuvat peräkkäin esiintyvistä, 1 6 emäsparin pituisista perusyksiköistä eli toistoista (ks. esim. Ellegren 2000, Schlötterer 2000, Toth ym. 2000). Mikrosatelliitit ovat hyvin muuntelevia, ja niiden muuntelu perustuu lokuksessa esiintyvien alleelien pituuden vaihteluun toistojen lukumäärän mukaisesti (Koreth ym. 1996, Field & Wills 1998, Kashi & King 2006). Toistojaksojen rakenteen mukaan mikrosatelliitit voidaan luokitella täydellisiin (CACACACA), yhdistelmätoistoihin (ACACTCTC) ja epätäydellisiin toistoihin (CACACTCA) (Weber 1990). Suurissa mikrosatelliiteissa toistojen lukumäärä voi olla useita kymmeniä, ja esimerkiksi normaaleissa mononukleotiditoistossa on ihmisellä havaittu 65 perusyksikön mittaisia alleeleja (Lai & Sun 2003). Kuitenkin eräissä ihmisellä esiintyvissä trinukleotidisairauksissa, kuten fragiili-x -oireyhtymässä, toistojaksossa voi esiintyä yli 200:n trinukleotiditoiston mittaisia mikrosatelliitteja (Cummings & Zoghbi 2000). Mikrosatelliitit ovat kodominantteja ja periytyvät mendelistiseen tapaan (Litt & Luty 1989), ja niiden genotyypin määritys onnistuu nopeasti PCR:n ja polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla (Weber & May 1989). Mikrosatelliittien käyttöönoton työläin vaihe on lokusten tunnistaminen ja alukkeiden suunnittelu (ks. esim. Tenzer ym. 1999), mutta tämän jälkeen niiden käyttöä helpottaa toistojaksoa reunustavien sekvenssien konservatiivisuus, joka usein mahdollistaa homologisten lokusten tutkimisen sukulaislajeilla samoja alukkeita käyttäen (mm. Jarne & Lagoda 1996). Mikrosatelliittien runsas muuntelu tuo esimerkiksi Hardy-Weinbergin tasapainon testaamiseen enemmän tilastollista voimaa (Rousset & Raymond 1995, Raymond & Rousset 1995). Nykyisin uudet kehittyneet tilastotieteelliset menetelmät sekä tietokoneohjelmat ovat lisänneet niiden käytön tehokkuutta entisestään (ks. Luikart & England 1999). Mikrosatelliitteja käytetään geneettisenä markkereina hyvin monenlaisilla tutkimusalueilla, kuten syöpä- (Sturzeneker ym. 2000) tai trinukleotiditoistosairauksien tutkimuksessa (Ashley & Warren 1995, Leeflang ym. 1999), sekä geneettisessä kartoituksessa (Kong ym. 2002). Ilveksillä mikrosatelliitteja on käytetty esimerkiksi geneettisen muuntelun ja populaatioiden välisen erilaistumisen, sekä migraation ja populaation sisäisen rakenteen tutkimiseen (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a, Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003) Esiintyminen 25

26 Mikrosatelliitteja on löydetty kaikkien tutkittujen eliöiden genomeista (Hancock 1995, Kashi & King 2006) nisäkkäistä aivan pienimpiin bakteereihin (Katti ym. 2001, Hancock 1995, 1996, Field & Wills 1996), mutta ne ovat kuitenkin huomattavasti yleisempiä eukaryoottien kuin prokaryoottien genomeissa (Hancock 1996, ks. myös Brown 2006, kpl 7 ja 8). Mikrosatelliittien määrän on yleensä havaittu korreloivan positiivisesti eliön genomin koon kanssa (Toth 2000, Hancock 1996, Katti ym. 2001), mutta kasveilla mikrosatelliittien esiintymistiheys näyttäisi laskevan genomin koon kasvaessa (Montagne ym. 2002). Tämän ilmiö johtuu ilmeisesti toistoina (repetetive) esiintyvän DNA:n runsastumisesta kasvien genomissa, sillä näillä alueilla ei yleensä esiinny mikrosatelliitteja (Montagne ym. 2002). Mikrosatelliitit ovat kuitenkin runsaslukuisempia kasveilla kuin esimerkiksi sienillä, sukkulamadolla tai hiivalla (Katti ym. 2001, Toth ym. 2000), ja vaikka erilaisten mikrosatelliittityyppien esiintyminen vaihtelee organismista riippuen, on löydettävissä tiettyjä säännönmukaisuuksia. Mononukleotiditoistoista (A/T)-toistot näyttäisivät olevan yleisempiä kuin (C/G)-toistot (Field & Wills 1998, Toth ym. 2000, Katti ym. 2001), ja dinukleotiditoistoja tarkasteltaessa selkärankaisilla (AC)-toistot ovat yleisimpiä (Katti ym. 2001, Toth ym. 2000), kun taas kasveilla (AT)- ja (AG)-toistot esiintyvät runsaina (Katti ym. 2001, Toth ym. 2000, Morgante ym. 2002). Mikrosatelliitteja on kaikkialla genomissa, mutta niiden esiintyminen ei ole täysin satunnaista. Mikrosatelliitin koon kasvaessa niiden esiintymistiheys laskee (Lai & Sun 2003), ja niitä esiintyy enemmän ei-koodaavilla sekvenssialueilla kuin koodaavissa sekvensseissä (Hancock 1996, Field & Wills 1998, Toth ym. 2000, Morgante 2002). Myös intronien ja geenien välisten alueiden mikrosatelliittikoostumus näyttäisi poikkeavan toisistaan, sillä esimerkiksi Toth ym. (2000) havaitsivat tietyn toistojakson esiintyvän selkärankaisilla runsaana geenien välisillä alueilla, mutta puuttuvan tyystin introneista. Geenien eksoneissa trinukleotidi- ja heksanukleotiditoistot ovat yleisimpiä geenien kodonirakenteen takia (Toth ym. 2000, Morgante ym. 2002) Evoluutio Mikrosatelliittien alkuperästä ei ole toistaiseksi varmuutta, mutta yleisesti oletetaan, että lyhyitä toistoja voi syntyä sattumalta DNA-sekvenssiin ja pidentyä erilaisten mutaatiomekanismien kautta (Levinson & Gutman 1987a, Schlötterer 2000). Mikrosatelliittien mutaationopeus on paljon suurempi kuin koodaavien geenien pistemutaatioiden (Moniz de Sa & Drouin 1996, Kumar & Subramanian 2002). Vaikka mutaatiotaajuus vaihteleekin huomattavasti eri lokuksissa sukupolvea kohti ( ) (Lai & Sun 2003), on mikrosatelliittien evoluutio nopeaa ja muuntelu runsasta 26

27 (Kashi & King 2006). Mutaationopeus vaihtelee eri lajien (esim. Rubinsztein ym. 1995), toistotyyppien, lokusten (Schlötterer ym. 1998, Primmer & Ellegren 1998) ja jopa saman lokuksen eri alleelien välillä (Schlötterer ym. 1998). Sairauksiin liittyvillä trinukleotiditoistoilla on erityisen suuri mutaationopeus (Chackraborty ym. 1997). Mutaationopeus vaikuttaisi laskevan mikrosatelliitin toiston pituuden kasvaessa (Chackraborty ym. 1997), mutta kasvavan kun toistojakson pituus kasvaa (Primmer & Ellegren 1998, Primmer ym. 1996, Schlötterer ym. 1998). Mikrosatelliittilokuksen lyhyet alleelit näyttäisivät useammin pidentyvän mutaation seurauksena, kun taas pitkien alleelien mutaatiot johtavat yleensä alleelin lyhenemiseen (Lai & Sun 2003). Mutaatio voi myös johtaa toistojakson pituuden muutokseen useamman kuin yhden toiston verran (Primmer ym. 1996, Schlötterer ym. 1998, Xu ym. 2000, Levinson & Gutman 1987b). Mikrosatelliitin rakenteen lisäksi mutaationopeuteen voi vaikuttaa myös toistoa reunustavien sekvenssien emäskoostumus sekä rekombinaationopeus (ks. Schlötterer 2000). Mikrosatelliittien suurten mutaationopeuksien selitykseksi on esitetty kaksi erilaista mutaatiomekanismia, jotka voivat johtaa toistojen lukumäärän muutoksen (mm. Li ym. 2002). DNA:n kahdentumisen tai korjauksen aikana tapahtuva DNA-juosteen luiskahdus ja väärinpariutuminen (slipped strand mispairing, SSM) voivat saada aikaan alleelin pituuden muutoksen (Levinson & Gutman 1987a, Tachida & Iizuka 1992), jos korjausmekanismi (mismatch repair, MMR) ei korjaa muutosta (ks. esim. Li ym. 2002). Myös epätasainen tekijäinvaihdunta (unequal crossing over, UCO) (ks. Brown 2006, s. 573), tai homologisen sekvenssin korvautuminen toisen kromosomin homologisella sekvenssillä (gene conversion) (ks. Brown 2006, s. 545), rekombinaation aikana voi johtaa mikrosatelliitin toistojakson pituuden muutokseen (Harding ym. 1992, Richards & Paques 2000). DNA-juosteen luiskahdus ja väärinpariutuminen näyttäisivät vastaavan suuresta osasta mikrosatelliiteissa havaittavista mutaatioista (Levinson & Gutman 1987a). Esimerkiksi meioottisissa soluissa ei esiinny enempää mikrosatelliittien mutaatioita kuin mitoottisesti jakautuvissa soluissa, vaikka niissä tapahtuukin enemmän rekombinaatioita (Strand ym. 1993). DNA-juosteiden väärinpariutumisen korjaukseen liittyvissä geeneissä tapahtuvat mutaatiot lisäävät mikrosatelliittien mutaatioita (Strand ym. 1993, Levinson & Gutman 1987b), kun taas rekombinaatioiden väheneminen ei ole mallieliöillä vähentänyt mutaatioiden määrää (Henderson & Petes 1992, Levinson & Gutman 1987b). On myös todennäköistä, että rekombinaatio saa osan mutaatioista aikaiseksi, ja vaikuttaa erityisesti useamman toiston pituuden muutoksiin (Richards & 27

28 Paques 2000). Mekanismit voivat myös toimia yhdessä ja saada aikaan paljon suurempia mutaationopeuksia, kuin erillisinä mekanismeina toimiessaan (ks. Li ym 2002). Mikrosatelliittien mutaatiomekanismi näyttäisi siis poikkeavan huomattavasti esimerkiksi koodaavien geenien spontaaneja pistemutaatioita aiheuttavista tekijöistä (ks. esim Hedrick 2005, s ). Geneettisiä analyyseja ajatellen on kehitetty erilaisia mutaatiomalleja, jotka ottavat huomioon mikrosatelliittien mutaatiomekanismin, kuten portaittainen mutaatiomalli (stepwise mutation model, SMM) (Ohta & Kimura 1973, Kimura & Ohta 1987) ja kaksivaiheinen malli (twophase model, TPM) (Di Rienzo ym. 1994). Äärettömien alleelien malli (infinite allele model, IAM) (Kimura & Crow 1964) olettaa, että jokainen mutaatio luo uuden uniikin alleelin ja lisää täten alleelien lukumäärää. Portaittainen mutaatiomalli taas ottaa huomioon, että alleelikoon pidennys tai lyhennys yhdellä toistolla voi saada aikaan alleelin, jollainen esiintyy jo lokuksessa (Hedrick 2005, s ). SMM kehitettiin alun perin allotsyymien muuntelua ajatellen, ja sovellettiin myöhemmin mikrosatelliittien evoluutioon, joten malli ei aivan ota huomioon mikrosatelliiteissa esiintyvien mutaatioiden mekanismia (Hedrics 2005, s ). SMM olettaa, että mutaatio johtaa aina yhden toiston muutokseen, mutta myöhemmin Di Rienzo ym. (2004) ovat esittäneet mikrosatelliiteilla havaittujen useamman toiston muutokset sisältävän kaksivaiheisen mallin, joka mahdollisesti kuvaa paremmin mikrosatelliittien mutaatiomekanismia ja muuntelua. Kaksivaiheisen mallin mukaan tietty osa mutaatioista johtaa yhden toiston muutokseen (p), ja loppuosa (1 p) useamman toiston muutokseen (Hedrick 2005, s. 383) Mikrosatelliittien käyttöön liittyviä ongelmia Mikrosatelliiteista on nopeasti tullut suosittuja markkereita geneettisessä tutkimuksessa, mutta niiden käyttöön liittyy useita mahdollisia virhelähteitä. Mikrosatelliittien monistaminen PCR:n avulla ei ole ongelmatonta, vaan yhden tai useamman alleelin heikko monistuminen voi johtaa niin sanotun nolla-alleelin ilmenemiseen. Nolla-alleeli on mikrosatelliittilokuksessa esiintyvä alleeli, jonka monistuminen havaittavalle tasolle toistuvasti epäonnistuu (ks. esim. Dakin & Avise 2004). Nolla-alleeli voi johtaa genotyyppiaineiston vääristymiseen, koska todellisuudessa heterotsygootteja yksilöitä tulkitaan homotsygooteiksi lokuksessa esiintyvän nolla-alleelin takia. Genotyyppiaineiston vääristyminen voi puolestaan saada aikaiseksi virheellisiä tulkintoja tutkittavasta populaatiosta (Jones ym. 1998). 28

29 Mikrosatelliittilokuksessa voi esiintyä nolla-alleeleja useasta syystä (ks. Dakin & Avise 2004, van Oosterhout ym. 2004). Templaatti-DNA:n huono laatu tai vähäinen määrä voi johtaa tiettyjen alleelien olemattomaan monistumiseen esimerkiksi käytettäessä museonäytteistä tai karvoista eristettyä DNA:ta (mm. Miller & Waits 2003). Joissakin tapauksissa heterotsygootin yksilön alleelit eivät monistu yhtä tehokkaasti, vaan toinen jää havaitsematta (allelic dropout) (Miller & Waits 2003, Wattier ym. 1998). Edellä mainituista syistä johtuvia nolla-alleeleja voidaan yrittää saada näkyviksi tunnistamalla ongelma ja optimoimalla PCR-oloja (Wattier ym. 1998). Nolla-alleeli voi kuitenkin aiheutua myös alukkeen sitoutumissekvenssissä tapahtuneen muutoksen, esimerkiksi deleetion, takia (Callen ym. 1993), jolloin PCR-alukkeen kiinnittyminen kohdesekvenssiin epäonnistuu ja alleeli jää havaitsematta (Jones ym. 1998). Tällöin on tarpeen kehittää uudenlaiset alukkeet mikrosatelliittilokuksen monistamisen mahdollistamiseksi kaikkien alleelien osalta (ks. Shaw ym. 1999). Myös eräät biologiset ilmiöt, kuten sukusiitos tai Wahlundin ilmiö, saavat aikaan homotsygoottien ylimäärää verrattuna HW-tasapainon mukaan odotettuihin genotyyppisuhteisiin (Hedrick 2005, s. 96), mutta ne vaikuttavat kaikkiin lokuksiin samalla tavalla, kun taas nollaalleelin vaikutus kohdistuu vain tiettyyn lokukseen (Dakin & Avise 2004). Mikrosatelliittien oikeaa tulkintaa voi myös vaikeuttaa DNA-polymeraasientsyymin luiskahduksesta johtuva takelteluilmiö, jossa PCR-tuoteen pituus eroaa alkuperäisestä templaatista yhden tai useamman toiston verran (Shinde ym. 2003). Tämä ongelma esiintyy enemmän lyhyempien, erityisesti dinukleotidien, kuin pidempien toistojen kohdalla (Beckman & Weber 1992). Koska mikrosatelliittien käyttöön näyttäisi liittyvän useita mahdollisia virhelähteitä, on PCR:stä ja aineiston tulkinnasta johtuvien virheiden tunnistamiseksi kehitetty useita erilaisia tietokoneohjelmia, jotka helpottavat aineiston luotettavuuden arviointia (esim. van Oosterhout ym. 2004). Mikrosatelliittien käytössä tulee myös muistaa, että mikrosatelliittien mutaatiomekanismien takia niillä esiintyy kokohomoplasiaa (size homoplazy, SH), koska lokuksen kaksi alleelia voivat olla kooltaan samanlaisia (identical in state, IIS) olematta kuitenkaan samaa alkuperää (IBD). Tämä voi aiheuttaa ongelmia tutkittaessa populaatioiden välisiä fylogeneettisiä suhteita tai populaatiorakenteita, ja vaikuttaa esimerkiksi populaatiossa havaittavaan muuntelun määrään. Mikrosatelliittien muuntelu on kuitenkin niin suurta, että se usein kumoaa niiden homoplastisen evoluution aiheuttaman ongelman populaatiogeneettisissä tutkimuksissa (Estoup ym. 2002). 1.4 Työn tarkoitus 29

30 Ilves on noussut sukupuuton partaalta Suomen suurimmaksi ja mahdollisesti jopa elinvoimaisimmaksi suurpetokannaksi. Kiinnostavasta historiasta huolimatta ilveksen tutkimus Suomessa on keskittynyt lajin ekologiaan (mm. Pulliainen ym. 1995, Pulliainen 1981, Kauhala & Helle 2000), ja ulkomailla suoritetuissa tutkimuksissa Suomen ilves on ollut mukana lähinnä vertailupopulaationa (esim. Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003, Hellborg ym. 2002). Suomen ilveskannan hoidon tulisi kuitenkin perustua Suomesta saatuihin tutkimustuloksiin (Holmala & Kojola 2007), joten tämän työn tarkoitus oli tarjota tietoa Suomen ilveksen geneettisen muuntelun määrästä ja populaatiorakenteesta kattavan aineiston avulla. Koska Suomen ilveskanta on todennäköisesti käynyt hyvin pienenä (Ermala 2003), haluttiin tutkia löytyykö Suomesta geneettisesti merkkejä pullonkaulasta, tai siitä mahdollisesti seuraavasta sukusiitoksesta. Lajin tulevaisuuden näkymien arvioimiseksi on tärkeä tuntea evolutiivisesti merkityksellisten yksilöiden määrä, joten työssä selvitettiin ilveksen efektiivinen populaatiokoko Suomessa. Migraatio voi kumota pullonkaulan ja sukusiitoksen haitalliset vaikutukset, joten erityisen kiinnostuneita oltiin tunnistamaan Suomeen mahdollisesti naapurimaista saapuvia immigrantteja. Skandinavian ilvespopulaatiosta saatavilla ollut genotyyppiaineisto mahdollisti migraation tarkemman tutkimuksen populaatioiden välillä, koska tässä työssä käytettiin samoja mikrosatelliitilokuksia, kuin Skandinavian ilveksiä käsitelleessä tutkimuksessa (Rueness ym. 2003a). Tämän lisäksi tutkittiin Skandinavian ilveksen geneettistä rakennetta, sekä arvioitiin ensimmäistä kertaa Skandinavian ilvesten efektiivistä populaatiokokoa. Suuremmassa mittakaavassa haluttiin tutkia muuntelun jakautumista Fennoskandiassa, ja vertailla Suomen ja Skandinavian ilvesten geneettisen erilaistumisen voimakkuutta. Kokonaisuudessaan työn tarkoitus oli selvittää, että millainen on geneettisen muuntelun määrä ja jakautuminen Fennoskandiassa, sekä arvioida millainen vaikutus historiallisilla ja nykyisillä evolutiivisilla tekijöillä on ollut havaittuihin tuloksiin. 2 AINEISTO JA MENETELMÄT 2.1 Tutkimusaineisto Tässä työssä tutkittiin kudosnäytteet 184 suomalaisesta ilvesyksilöstä. Näytteet olivat peräisin laillisesti metsästetyistä, kuolleena löydetyistä tai auton alle jääneistä ilveksistä vuosilta , ja ne saatiin tutkittavaksi Riista- ja kalatutkimuslaitoksen (RKTL) kautta. Näytteet olivat lihaskudosta, ja niitä oli säilytetty huoneenlämmössä 70 % etanolissa. Lähes kaikista näytteistä tiedettiin yksilön sukupuoli, paino, näytteenkeruun ajankohta ja paikka sekä paikan maantieteelliset koordinaatit. Näytteistä oli tutkittu myös kantoiko yksilö trikinelloosia aiheuttavaa sukkulamatoa 30

31 (Trichinella spiralis) vai ei. Ikä tunnettiin osasta näytteitä. Näytteistä 83 oli peräisin naarasyksilöistä ja 96 uroksista, mutta kolmesta näytteestä ei tunnettu yksilön sukupuolta. Näytteiden keruupaikat Suomessa on esitetty kuvassa 2.1, ja ne vastaavat melko hyvin Suomen ilveksen tunnettua levinneisyysaluetta sekä kannan tiheyttä (vrt. kuva 2, Kojola ym. 2006). Kuva 2.1 Tässä työssä tutkittujen ilvesnäytteiden keräyspaikan maantieteellinen sijainti Suomessa (vihreä) ja Skandinaviassa (violetti) on esitetty värillisillä pisteillä. Vertailun Skandinavian ilvespopulaatioon mahdollisti Eli Ruenessilta saadut tiedot 303 ilvesyksilön genotyypiestä (kuva 2.1), sekä hänen toimittamat kudosnäytteet neljästä yksilöstä. Näiden yksilöiden genotyyppi tunnettiin, ja niiden avulla selvitettiin tämän työn ja Skandinavian ilvesten genotyyppiaineiston alleelikokojen vastaavuus. Kudosnäytteet ja genotyyppiaineiston tiedot olivat peräisin Ruotsissa ja Norjassa vuosina laillisesti metsästetyistä ilveksistä. Kyseistä aineistoa on aiemmin käytetty Skandinavian ilvespopulaation geneettisen rakenteen selvittämiseen (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). 2.2 DNA:n eristys, DNA-pitoisuuden mittaus ja näytteen laimennus 31

32 DNA eristettiin kudosnäytteistä DNeasy -menetelmän (Qiagen) totaali-dna:n puhdistus eläinkudoksista -ohjeen mukaisesti (DNeasy tissue handbook, s ). Eristysmenetelmän toimivuuden varmistamiseksi, ja eristetyn DNA:n puhtauden määrittämiseksi, DNA-näytteistä mitattiin spektrofotometrilla (Eppendorf BioPhotometer) DNA-pitoisuus ja A 260 /A absorbanssisuhde. Eristetyt totaali-dna -näytteet laimennettiin mittausta varten steriilillä vedellä suhteessa 5:95 (5 µl DNA:ta ja 95 µl steriiliä vettä). DNA:n mitattu pitoisuus vaihteli välillä 3,0 134,9 ng/µl, ja puhtautta kuvaava A 260 /A 280 -absorbanssisuhde välillä 1,46 2,96. Puhtaan DNA:n suhde on 1,8, ja tätä suuremmat tai pienemmät arvot viittaavat proteiini- tai RNA-jäämiin (Manchester 1995). DNA-pitoisuuden perusteella DNA-näytteistä tehtiin PCR:ää varten käyttölaimennukset, joissa DNA-pitoisuus oli noin 16,7 ng/µl. Näytteitä, joissa oli tätä pienempi pitoisuus, ei laimennettu. 2.3 Polymeraasiketjurektio Polymeraasiketjureaktiolla (polymerase chain reaction, PCR) voidaan monistaa haluttua DNAsekvenssiä jopa kertaisesti lähtötilanteesta. Menetelmä perustuu DNA-sekvenssin rajaamiseen kahden oligonukleotidi-alukkeen avulla, ja niiden välisen alueen monistumiseen toistamalla sykleissä eri lämpötilaoloja. Syklissä käytetään kolmea eri lämpötilaa, joissa DNA denaturoituu, alukkeet kiinnittyvät, ja DNA-polymeraasi pidentää alukkeita. PCR:ssä käytetään lämpöstabiilia DNA-polymeraasientsyymiä, ja tuotteen monistuminen tapahtuu eksponentiaalisesti (Saiki ym. 1988). Työssä tutkittiin jokaisesta DNA-näytteestä kymmenen eri mikrosatelliittilokuksen alleelien koot. Käytetyistä lokuksista kuusi oli dinukleotiditoistoja (Fca008, Fca031, Fca043, Fca149 ja Fca506), yksi yhdistelmädinukleotiditoisto (Fca001), yksi tetranukleotiditoistoa (Fca559), yksi yhdistelmätetranukleotiditoisto (Fca391), ja yksi monimutkainen A- ja G-rikas toistojakso (F115) (taulukko 2.1). Alukkeet on suunniteltu kotikissan mikrosatelliittilokusten monistamiseen (Menotti- Rymond & O`Brien 1995, Menotti-Raymond ym. 1999), mutta niiden on todettu monistavan myös ilveksen vastaavia mikrosatelliittilokuksia (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). Kotikissan kytkentäkartan mukaan kaikki kymmenen lokusta sijaitsevat eri kromosomeissa (Menotti-Raymond ym. 1999). 32

33 Taulukko 2.1 Työssä käytettyjen mikrosatelliittilokusten tiedot. Lokus Forward-aluke (5-3 ), F Reverse-aluke ( 5`-3`), R Fca001 F TGCTTGTCCTCTCCCTCG R TGACTGCGCCATAGCTTTC Fca008 F ACTGTAAATTTCTGAGCTGGCC R TGACAGACTGTTCTGGGTATGG Fca031 F GCCAGGGACCTTTAGTTAGATT R GCCCTTGGAACTATTAAAACCA Fca043 F GAGCCACCCTAGCACATATACC R AGACGGGATTGCATAAAAG Fca045 F TGAAGAAAAGAATCAGGCTGTG R GTATGAGCATCTCTGTGTTCGTG F115 F CTCACACAAGTAACTCTTTG R CCTTCCAGATTAAGATGAGA Fca149 F CCTATCAAGTTCTCACCAAATCA R GTCTCACCATGTGTGGGATG Fca391 F GCCTTCTAACTTCCTTGCAGA R TTTAGGTAGCCCTTTTCATCA Fca506 F AATGACACCAAGCTGTTGTCC R AGAATGTTCTCTCCGCGTGT Fca559 F GCCAAAATGTTCAAGAGGG R TTTTGGCTTGATGAGCATCA * Sekvenssi on esitetty Hellborg ym. (2002) julkaisussa. toisto (GT)n(GA)m (CA)n (CA)n (CA)n (CA)n Monimutkainen A- ja G-rikas toisto* (CA)n (TGGA)n(AGAT)m (CA)n (GAAA)n Leima PET NED FAM NED FAM NED VIC FAM VIC PET PCR:n reaktiotilavuus oli 10 µl, ja useimmat monistettavista lokuksista toimivat olosuhteissa, joissa käytettiin 50 ng templaatti-dna:ta, 1 x PCR-puskuria (100 mm Tris-HCL, 500 mm KCl, ph 8,3), 0,5 µm kumpaakin aluketta, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 mm dntp-seosta (datp, dttp, dgtp, dctp), ja 0,5 U DNA-polymeraasientsyymiä (AmpliTaq GOLD, Applied Biosystems) sekä steriiliä vettä. Lokukset Fca001, Fca506 ja Fca559 eivät monistuneet edellä kuvatuissa PCR-olosuhteissa. Lokukset vaativat reaktio-olot, joissa käytettiin 75 ng templaatti-dna:ta, ja 2,0 mm (Fca506) tai 2,5 mm (Fca001 ja Fca559) MgCl 2 :a. Mahdollisten kontaminaatioiden havaitsemiseksi jokaisessa PCR-reaktiossa oli mukana negatiivinen kontrolli, jossa templaatti-dna:n sijasta käytettiin steriiliä vettä. Taulukossa 2.2 on esitetty eri lokuksille käytetyt PCR-reaktioseokset. 33

34 Taulukko 2.2 Tässä työssä tutkituille lokuksille käytetyt PCR-reaktioseokset (µl). Muut lokukset Lokus Fca001 Lokus Fca056 Lokus Fca559 Templaatti-DNA (16.7 ng/µl) 3 4,5 4,5 4,5 dntp-seos (10 mm) 0,1 0,1 0,1 0,1 Forward-aluke (5µM) Reverse-aluke (5µM) MgCl 2 (25 mm) 0,6 1 0, x puskuriliuos AmpliTaq GOLD (5 U/µl) 0,1 0,1 0,1 0,1 Steriili H 2 O 3,2 1,3 1,5 1,3 Yhteensä Kaikkien lokusten monistamiseen käytettiin Mastercycler gradient konetta (Eppendorf). Sama PCR-profiili sopi seitsemälle lokukselle: alkudenaturaatiossa lämpötila pidettiin 94 C kolme minuuttia. Tätä seurasi 30 sekunnin denaturaatio 94 C lämpötilassa, jonka jälkeen lämpötila laskettiin 55 C 30 sekunniksi. Tässä lämpötilassa alukkeet sitoutuvat monistettavan alueen kohdesekvensseihin. Lämpötila nostettiin 72 C lämpötilaan minuutiksi, jolloin DNApolymeraasientsyymi syntetisoi templaatti-dna:n sekvenssin mukaisesti uutta juostetta. Sykli toistettiin 32 kertaa, ja tämän jälkeen seurasi kymmenen minuutin loppusynteesi 72 C lämpötilassa. PCR-profiilia piti muokata Fca001-, Fca506- ja Fca559-lokuksille sopivaksi siten, että alukkeiden kiinnittymislämpötila laskettiin 49 C:n Fca001- ja Fca506-lokuksille ja 51 C:n Fca559- lokukselle. Lokukset Fca506 ja Fca559 vaativat useampia reaktiosyklejä riittävän monistumisen saavuttamiseksi, joten Fca506-lokukselle käytettiin 38 sykliä ja Fca55- lokukselle 37 sykliä. 2.4 Agaroosigeelielektroforeesi PCR-tuotteet ja negatiiviset kontrollit tarkastettiin agaroosigeelielektroforeesilla PCR:n toimivuuden varmistamiseksi, sekä mahdollisten kontaminaatioiden havaitsemiseksi. Tätä varten 3 µl:n PCR-tuotetta lisättiin 1 µl latauspuskuria (1/4 kokonaistilavuudesta) (liite III). Ajossa käytettiin 0,5 x TBE-puskuriliuokseen (liite III) valmistettua 2 % agaroosigeeliä, johon oli lisätty etidiumbromidia. Etidiumbromidi on UV-valossa fluoresoiva levymäinen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan DNA-juosteen emästen väliin. PCR-tuotteiden kanssa geelillä ajettiin myös molekyylikokostandardia (100 bp ladder, New England Biolabs). 34

35 Agaroosigeeliajossa käytettiin 150 voltin jännitettä ja näytteitä ajettiin noin 40 minuuttia. DNA:han sitoutuneen etidiumbromidin ansiosta näytteiden ajautumista voitiin tarkastella UV-valossa, ja arvioida niiden kokoa molekyylikokostandardin perusteella. Viitteitä PCR:ssä monistuneesta DNA:n määrästä saatiin näytejuovan voimakkuuden perusteella. Sellaisille näytteille, joiden PCR oli epäonnistunut ja tästä syystä tuotetta ei näkynyt geelillä, tehtiin uusi PCR ja sitä seuraavat vaiheet. 2.5 Polyakryyliamidigeelielektroforeesi PCR:ssä käytetyt forward-alukkeet oli leimattu fluoresoivilla merkkiaineilla. Käytetyt leimat olivat 6-FAM (sininen), PET (punainen), NED (keltainen) ja VIC (vihreä). Eriväristen leimojen käyttö mahdollisti eri merkkiaineella leimattujen näytteiden ajamisen samassa kapillaarissa. Myös samalla leimalla merkittyjä näytteitä oli mahdollista ajaa samassa kapillaarissa, jos ne olivat selkeästi erikokoisia. Polyakryyliamidigeelielektroforeesia varten PCR-tuotteita laimennettiin agaroosigeeliltä UVvalossa nähdyn juovan voimakkuuden perusteella jopa 50-kertaisesti steriilillä vedellä. Heikosti näkyviä tuotteita ei laimennettu. 1 3 µl laimennettua PCR-tuotetta lisättiin 96-kuoppalevylle, jossa jokaisessa kaivossa oli 8 µl formamidia (Hi-Di TM, Applied Biosystems) ja 0.3 µl LIZmolekyylikokostandardia (GeneScan TM -500 LIZ Size Standard, Applied Biosystems). LIZ on sisäinen kokostandardi, jota ajetaan samassa kapillaarissa näytteen kanssa, ja se on leimattu LIZ - merkkiaineella. PCR-tuotteille suoritettiin elektroforeesi polyakryyliamidigeelillä ABI PRISM 3730 DNA analyzer -automaattisekvensaattorilla (Applied Biosystems). 2.6 Näytteiden genotyypin määritys Polyakryyliamidigeelielektroforeesin tulokset tallentuivat tietokoneelle ja niitä tarkasteltiin Genemapper Software -ohjelmalla (versio 4.0). Ohjelma havaitsee näytteen leiman intensiteetin ja arvioi mikrosatelliitin koon analyysimenetelmän asetusten, kokostandardin leiman intensiteetin ja kokostandardin määritelmän mukaan. Ohjelma myös arvioi näytteen ja kokostandardin laatua, sekä ehdottaa näytteelle genotyyppiä. Epäonnistuneille, huonolaatuisille ja heikosti näkyville tuotteille tehtiin uusi polyakryyliamidigeelielektroforeesi, tai tarvittaessa uusi PCR ja sitä seuraavat vaiheet, kuten edellä on kuvailtu. Valmiista genotyypeistä koottiin taulukko Microsoft Excel -ohjelmalla, jossa näkyi kaikkien yksilöiden genotyyppi lokuksittain. 35

36 2.6.1 Skandinavian genotyyppien yhdenmukaistaminen Suomen genotyyppien kanssa Skandinaviasta lähetetyn neljän kudosnäytteen genotyypit selvitettiin (erillinen tutkimus) käyttäen samoja menetelmiä, kuin mitä käytettiin Suomen kudosnäytteiden tutkimuksessa. Tulosten perusteella Skandinavian genotyyppiaineiston alleelikoot yhdenmukaistettiin vastaamaan tämän työn alleelikokoja. 2.7 Genotyyppiaineiston tutkimus Suomen ajallisista näytteistä muodostettiin yksi populaationäyte, ja samoin tehtiin Skandinavian näytteiden osalta. Näiden genotyyppiaineisto kirjoitettiin aluksi Convert-ohjelman (versio 1.2, Glaubitz 2004) formaatin muotoon, ja tällä ohjelmalla aineisto muunnettiin sopivaksi muihin populaatiogeneettisiin tietokoneohjelmiin. Jatkossa käytettiin hyväksi myös näiden ohjelmien sisältämiä, formaatin muutoksen mahdollistavia, toimintoja Suomen genotyyppiaineiston nolla-alleelit Suomen genotyyppiaineisto tarkastettiin Micro-Checker-ohjelman (versio 2.2.3, van Oosterhout ym. 2004) avulla. Micro-Checker tutkii diploidien populaatioiden genotyyppien määrityksen onnistumista, ja auttaa tunnistamaan määritysvirheitä, jotka voivat johtua esimerkiksi nollaalleeleista tai käyttäjän kirjaamisvirheistä. Ohjelma käyttää Monte Carlo -menetelmää luodakseen havaittujen alleelifrekvenssien perusteella satunnaistettuja genotyyppejä. Satunnaistetuista genotyypeistä luodaan homo- ja heterotsygoottikokoluokat, joihin havaittuja genotyyppifrekvenssejä verrataan. Ohjelma myös arvioi todennäköisyyttä, että tietyssä homotsygoottikokoluokassa esiintyy havaittu määrä homotsygootteja binomijakauman ja simulaatiolla luodun jakauman avulla. Eri homotsygoottikokoluokkien todennäköisyysarvoja käytetään Fisherin nelikenttätestissä arvioimaan, esiintyykö koko lokuksessa tilastollisesti merkitsevää poikkeamaa homotsygoottien esiintymisessä. Ohjelma tunnistaa merkittävät poikkeamat HW-tasapainon mukaisista suhteista ja tekijän, joka mahdollisesti saa sen aikaan. Nolla-alleelien olemassaoloon viittaa homotsygoottien ylimäärä tietyssä lokuksessa, kun se on tasaisesti jakautunut eri homotsygoottikokoluokkiin. Ohjelma sisältää neljä eri menetelmää, joiden avulla voidaan arvioida mahdollisten nolla-alleelien frekvenssejä (van Oosterhout ym. 2004). 36

37 2.7.2 Fennoskandian ilveksen populaatiorakenne Suomi Suomen ilveksen geneettistä rakennetta tutkittiin suosituksen mukaisesti kahden bayesilaisen ryhmittelymenetelmän avulla, sillä ne eivät tarvitse ennakkotietoa tutkittavan populaation rakenteesta (Latch ym. 2006). Structure-ohjelma (versio 2.1, Pritchard ym. 2000) käyttää mallipohjaista ryhmittelymenetelmää populaation sisäisen rakenteen tutkimiseen. Menetelmässä oletetaan malli, jonka mukaan aineistossa on K populaatiota (K voi olla tuntematon), joilla on tunnusomaiset alleelifrekvenssit kussakin lokuksessa. Yksilöt yritetään luokitella populaatioihin niiden genotyyppien perusteella samanaikaisesti arvioiden näiden mahdollisten populaatioiden alleelifrekvenssejä. Käytettyjen markkereiden tulisi olla kytkeytymättömiä ja populaatioiden todennäköisimmän määrän osoittaa sellainen ryhmittely, joka minimoi populaatioiden sisäinen kytkentä- ja HW-epätasapainon (Pritchard ym. 2000). Suomen aineistolle käytettiin mallia, jossa yksilön perimä voi olla peräisin useammasta kuin yhdestä populaatiosta, ja populaation sisällä voi olla korrelaatiota alleelifrekvenssien välillä. Aineistolle suoritettiin viisi toisistaan riippumatonta ajoa erilaisilla K:n arvoilla (K = 1 15). Alkuvaiheessa (burn-in period) Markov Chain Monte Carlo -menetelmässä käytettiin toistoa ja aineistonkeruuvaiheessa toistoa. Mallin mukaan K:n eri arvoille laskettiin logaritmiset uskottavuusarvot (ln prx K), joista populaatiorakennetta parhaiten selittävä ryhmittely saa suurimman arvon. Uskottavuusarvojen avulla voitiin laskea K:n eri arvoille todennäköisyydet (prk X) bayesilaisen säännön (Bayes rule) mukaan (Pritchard ym. 2007, Huelsenbeck & Bollback 2001): prk i X = e ln prx Ki / k j= 1 e ln pr Kj X (2.7.1) BAPS (Bayesian Analysis of Population Structure) -ohjelman (versio 3.2, Corander ym. 2003, 2006) bayesilainen menetelmä käyttää satunnaistettua optimointia ryhmien lukumäärän (K) tutkimiseen. Structuren käyttämän menetelmän tapaan pyritään löytämään ryhmittely, jossa ryhmien sisäinen kytkentä- ja HW-epätasapainossa on pienimmillään. Samanaikaisesti todennäköisten ryhmien määrää tutkiessaan, ohjelma luokittelee yksilöitä muodostettuihin ryhmiin ja arvioi ryhmien alleelifrekvenssejä. Suomen aineistolle tehtiin neljä itsenäistä ajoa, joissa ryhmien 37

38 lukumäärää tutkittiin yksilötasolla (individual level mixture analysis) käyttäen K:n ylärajana 20 ryhmää. Ryhmittelyn lisäksi haluttiin selvittää esiintyykö aineistossa geneettisiä rajoja, joissa tapahtuu jyrkkä muutos populaation geneettisessä koostumuksessa. Tällaista voidaan tutkia alleelien alueellisen jakautumisen perusteella Monmonierin (1973) algoritmia käyttäen, kun tunnetaan yksilöiden maantieteellinen sijainti (Manni ym. 2004, Manel ym. 2003). Työssä käytettiin Alleles In Space -tietokoneohjelman (Miller 2005) sisältämää Delaunayn kolmiomittausta luomaan vierekkäisiä näytteitä yhdistävä verkosto niiden maantieteellisen sijainnin mukaan. Ohjelman laskee viereisten näytteiden välille niiden geneettistä etäisyyttä kuvaavat arvot (Nein 1983), ja käyttää Monmonierin algoritmia mahdollisten geneettisten esteiden tunnistamiseen (Miller 2005). Ilvekset ovat levittäytyneet lähes koko Suomeen, ja maan eri osien väliset maantieteelliset etäisyydet ovat huomattavasti pidempiä, kuin ovat ilveksellä havaitut keskimääräiset dispersaalietäisyydet (mm. Zimmermann ym. 2005). Tällaisessa tilanteessa voi esiintyä etäisyydestä johtuvaa erilaistumista (Wright 1943), ja sen esiintymistä Suomessa tutkittiin SPAGeDi (Spatial Pattern Analysis of Genetic Diversity) -ohjelman (versio 1.1b, Hardy & Vekemans 2002) avulla. SPAGeDi on erityisesti suunniteltu tutkimaan maantieteellisen sijainnin ja geneettisen sukulaisuuden välistä yhteyttä (Hardy & Vekemans 2002). Aineistosta laskettiin ohjelmaa käyttäen kaikkien yksilöparien välille geneettinen sukulaisuus Loiselle ym. (1995) mukaan. Arvot jaettiin yksilöparien maantieteellisistä etäisyyksistä, sekä logaritmisista etäisyyksistä muodostettuihin kymmeneen etäisyysluokkaan. Näihin luokkiin kuuluvien yksilöiden välisistä sukulaisuusarvoista laskettiin keskiarvot kuvaamaan keskimääräistä sukulaisuutta kyseisessä etäisyysluokassa. Ohjelma tutkii luokkiin jaettujen sukulaisuusestimaattien harhattomuutta linkkuveitsi (jackknife) - uudelleenotantamenetelmällä (ks. Ranta ym. 2002, s ), ja laskee niille keskivirheet (SE). Permutaatiotestillä tutkittiin estimaattien tilastollista merkitsevyyttä satunnaisen muunnoksen avulla. Lopuksi estimaateista piirrettiin kuvaaja kuvaamaan logaritmisen maantieteellisen etäisyyden ja geneettisen sukulaisuuden välistä yhteyttä spatiaalisen autokorrelaatioanalyysin tapaan. SPAGeDi:lla tutkittiin geneettisen sukulaisuuden ja maantieteellisen etäisyyden välistä yhteyttä myös regression avulla, jossa kulmakertoimen laskemiseen käytettiin kaikkia pareittaisia arvoja. Regressiossa käytettiin maantieteellisestä etäisyydestä logaritmisia arvoja, koska dispersaali voi luonnon oloissa tapahtua kaikkiin suuntiin. Linkkuveitsi-menetelmällä tutkittiin kulmakertoimen 38

39 harhattomuutta, ja permutaatiotestillä tilastollista merkitsevyyttä kuten edellä. Etäisyysisolaation mallia seuraavassa populaatiossa naapuruston kokoa ja dispersaalia pystytään arvioimaan epäsuoralla menetelmällä regression kulmakertoimen avulla (Hardy 2003). Wrightin (1943) mukaan tasaisesti jakautuneessa populaatiossa geneettisen rakenteen pienin perusyksikkö on naapurusto. Naapuruston koko voidaan laskea epäsuorasti regressiosuoran kulmakertoimesta (Hardy & Vekemans 1999) siten, että Nb = (1 F 1 )/b, jossa F 1 on viereisten yksilöiden i ja j sukulaisuuskerroin ja b on regressiosuoran kulmakerroin (Hardy 2003). Jos aineistosta tunnetaan naapuruston koko ja yksilötiheys, voidaan arvioida dispersaalietäisyyttä normaalijakaumaoletusta käyttäen Skandinavia Toisin kuin Suomen ilvesten, Skandinavian ilvesten populaatiorakennetta on tutkittu varsin tarkkaan. Näissä tutkimuksissa on havaittu, että niemimaalla esiintyy ainakin etäisyydestä johtuvaa geneettistä erilaistumista, mutta myös mahdollisesti kolme alapopulaatiota (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). Tässä työssä Skandinavian ilvekset jaettiin kahdeksaan ryhmään Norjan ja Ruotsin välisen rajan sekä maiden sisäisten maakuntien rajojen mukaan, kuten Rueness ym. (2003a) tutkimuksessa (liite IV). Structure-ohjelmalla tutkittiin kuinka monta mahdollista alapopulaatiota aineistossa esiintyi käyttäen samoja malleja ja asetuksia kuin Suomen aineiston kohdalla. Rueness ym. (2003a) mukaan K = 3 selittää parhaiten Skandinavian geneettistä rakennetta, joten analyysiajan lyhentämiseksi tässä työssä käytettiin K:n arvoja väliltä 1 5. Suurimman uskottavuusarvon saaneesta ajon perusteella yksilöt ryhmiteltiin sen ehdottamiin alapopulaatioihin Skandinavian ryhmäjakoa hyväksikäyttäen (liite IV). Alapopulaatiojaon käyttökelpoisuuden varmistamiseksi Structure-ohjelmalla tarkasteltiin yksilöiden kuulumista niiden oletettuihin alapopulaatioihin ennakkotiedon käytön sallivan mallin avulla. Tässä mallissa käyttäjä voi jakaa populaation ennakkotiedon perusteella ryhmiin, ja tutkia kuinka suurella todennäköisyydellä yksilöt kuuluvat näihin oletettuihin ryhmiin. Ajon alkuvaiheessa käytettiin toistoa ja aineistonkeruuvaiheessa toistoa olettaen, että alleelifrekvenssien välillä voi esiintyä korrelaatiota populaatioiden sisällä. Alapopulaatioiden välillä oletettiin esiintyvän jonkin verran migraatiota (v = 0.05). 39

40 2.7.3 Populaatioiden kytkentä- ja Hardy-Weinbergin tasapaino Kytkentäepätasapainossa eri lokusten alleelit eivät yhdisty satunnaisesti gameeteiksi. Tämä voi johtua siitä, että lokukset sijaitsevat samassa kromosomissa, mutta lokukset voivat sijaita myös eri kromosomeissa ja olla silti kytkentäepätasapainossa. Kytkentäepätasapaino riippuu usein rekombinaation määrästä, mutta myös evolutiiviset tekijät vaikuttavat kytkentäepätasapainon syntymiseen (Hedrick 2005, s ). Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden sisäistä kytkentäepätasapainoa tutkittiin Genepop-ohjelman (Raymond & Rousset 1995) internet-versiota (versio 3.4, käyttäen, sillä ohjelman käyttämä menetelmä ei tarvitse tietoa kaksoisheterotsygoottien haplotyyppisestä muotosta (Raymond & Rousset 1995). Ohjelma luo kontingenssitaulun kaikista lokuspareista populaation sisällä, ja laskee Markovin ketju - menetelmällä p-arvon harhattoman estimaatin sekä sen keskivirheen (SE), ja suorittaa Fisherin tarkan nelikenttätestin jokaiselle lokusparille. Markovin ketjussa käytettiin ohjelman oletusarvoja. Satunnaisesti pariutuvan populaation alleeli- ja genotyyppifrekvenssit saavuttavat Hardy- Weinbergin tasapainon, kun populaatiossa ei esiinny mutaatioita, valintaa tai migraatiota (mm. Guo & Thompson 1992). Suomen ja Skandinavian, sekä Skandinavian alapopulaatioiden HWtasapainon testaamiseen käytettiin Genepop-ohjelmaa (Raymond & Rousset 1995). Ohjelma testaa HW-tasapainoa laskemalla populaation jokaiselle lokukselle Markovin ketju -menetelmällä p-arvon harhattoman estimaatin (Guo & Thompson 1992), ja suorittaa näitä arvoja käyttäen merkitsevyystestauksen Fisherin tarkalla nelikenttätestillä yli kaikkien lokusten Fennoskandian populaatiorakenne ja geneettinen erilaistuminen Fennoskandian ilvesten geneettistä rakentumista tutkittiin molekyylivarianssianalyysin (AMOVA) (Excoffier ym. 1992) avulla Arlequin-ohjelmalla (versio 3,1, Excoffier ym. 2005). Tutkimusta varten Suomi ja Skandinavia ryhmiteltiin erillisiksi ryhmiksi, ja Skandinavian ryhmän sisällä kolme alapopulaatiota ryhmiteltiin erillisiksi populaatioiksi. Tämän ryhmittelyn avulla tutkittiin, miten varianssi jakautuu eri hierarkiatasoille niiden välillä. Hierarkkinen varianssianalyysi jakaa kokonaisvarianssin eri kovarianssin osiksi, ja kovarianssin osien avulla voidaan laskea Wrightin fiksaatioindeksit kuvaamaan populaatioissa esiintyvää geneettistä erilaistumista. Fiksaatioindeksien merkitsevyyden testaamiseen käytettiin Excoffierin ym. (1992) kehittämää ei-parametrista permutaatiomenetelmää 1000 muunnoksella. 40

41 Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välistä geneettistä erilaistumista tutkittiin tarkemmin Wrightin kehittämän F-statistiikan avulla. F-statistiikka sopii R-statistiikkaa (Slatkin 1995) paremmin geneettisen erilaistumisen arviointiin silloin, kun populaatioilla on äskettäinen yhteinen alkuperä (Paetkau 1997), ja tutkimuksessa käytetään alle 20 lokusta (Gaggiotti ym. 1999). Populaatioiden välistä erilaistumista kuvaavat F ST -estimaatit laskettiin Weirin ja Cockerhamin (1984) mukaan Genepop-ohjelmalla (Raymond & Rousset 1995) Geneettinen muuntelu ja sukusiitos Geenidiversiteetti, havaittu heterotsygotia ja alleelien lukumäärä, sekä alleelifrekvenssit laskettiin kaikista lokuksista Suomesta Genetix-ohjelmalla (versio , Belkhir 2004). Ohjelmaa käytettiin myös Suomen ja koko Skandinavian ilveksien, sekä Skandinavian alapopulaatioiden ilveksien, sukusiittoisuutta kuvaavan F IS -indeksin laskemiseen Weirin & Cockerhamin (1984) mukaan. F IS - indeksin merkitsevyyttä testattiin 1000 uudelleenotanta (bootstrap) -toiston avulla (ks. Ranta 2002, s ). Tulos katsottiin tilastollisesti merkitseväksi, jos uudelleenotanta-toistoilla saatujen arvojen 95 % luottamusväli sai vain positiivisia tai negatiivisia tuloksia. FSTAT-ohjelmalla (Versio 2.9.3, Goudet 2001) laskettiin geenidiversiteetti, alleelien lukumäärä ja frekvenssit Skandinaviasta kokonaisuudessaan, sekä jokaisesta alapopulaatioista. Samalla ohjelmalla laskettiin myös alleelirikkaus Suomen ja Skandinavian, sekä Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden väliltä, suhteuttamalla alleelien lukumäärä pienimpään näytekokoon. FSTAT käyttää tähän tarkoitukseen Petit ym. (1998) kehittämää harvennusmenetelmää (rarefaction method). Menetelmässä lokuksen alleelifrekvenssien jakaumaa käytetään arvioimaan esiintyvien alleelien lukumäärä pienimmän näytekoon mukaan. Suomen ja Skandinavian välisessä vertailussa pienin näytekoko oli 164 yksilöä, koska Suomessa Fca506-lokuksen genotyypin määritys onnistui tuosta määrästä yksilöitä. Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välisissä vertailuissa pienin näytekoko oli 36 yksilöä Migraatio Yksilöiden kuulumista Suomen ilvespopulaatioon arvioitiin itseluokittelumenetelmällä, joka mahdollistaa migranttien yksilöiden tunnistuksen näiden monilokusgenotyyppien perusteella (Piry ym. 2004). Yksilöille laskettiin uskottavuusarvot bayesilaista kriteeriä käyttäen (Rannala & Mountain 1997) GeneClass2-ohjelmalla (Piry ym. 2004). Menetelmä olettaa käytettyjen lokusten olevan kytkentätasapainossa (Rannala & Mountain 1997), ja käyttää uskottavuusarvon laskemiseen 41

42 leave one out -menettelytapaa (Piry ym. 2004). Tällöin yksilö jätetään pois laskuista, kun sille lasketaan uskottavuusarvoa kuulua populaatioon. Yksilön genotyypin todennäköisyyttä kuulua Suomen populaatioon arvioitiin Paetkau ym. (2004) Monte Carlo -menetelmällä, jossa ei esiinny aiemmissa Monte Carlo -menetelmissä (Cornuet ym. 1999, Rannala & Mountain 1997) havaittua taipumusta yliarvioida populaatiossa esiintyvien migranttiyksilöiden määrää (Paetkau 2004). Paetkau ym. (2004) Monte Carlo -menetelmässä luodaan simulaation avulla kohdepopulaation kokoisia näytepopulaatioita, joiden yksilöille lasketaan uskottavuusarvot samalla tavalla kuin tutkittavan populaation yksilöille. Koska simulaatiossa luodaan kohdepopulaation kokoisia näytepopulaatioita yhden suuren populaation sijaan, menetelmä ottaa paremmin huomioon näytteenotossa syntyvän alleelifrekvenssien varianssin (Paetkau ym. 2004). Menetelmää toistetaan, kunnes 1000 simuloidusta yksilöstä on laskettu kyseessä oleva uskottavuusarvo. Todellisten yksilöiden todennäköisyyttä kuulua tutkittavaan populaatioon voidaan sitten arvioida simulaatiosta saatujen uskottavuusarvojen jakauman perusteella. Tutkimuksessa käytettiin 1 % hylkäämisrajaa eli sellainen yksilö, jonka todennäköisyys kuulua Suomen ilvespopulaatioon oli alle 1 % (p < 0.01), katsottiin todennäköiseksi immigrantiksi. Suomen ja Skandinavian välistä geenivirtaa arvioitiin Bartonin ja Slatkinin (1986) kehittämällä privaattialleelimenetelmällä Genepop-ohjelmaa (Raymond & Rousset 1995) käyttäen. Privaattialleelimenetelmässä arvioidaan efektiivisten migranttien lukumäärä (Nm) sukupolvessa Slatkinin (1985b) teorian mukaan, joka pohjautuu Wrightin saarimalliin (Wright 1931). Sen mukaan migranttien määrän logaritmi sukupolvessa on suunnilleen lineaarisesti verrannollinen privaattialleelien keskimääräisen frekvenssin logaritmiin (Slatkinin 1985b). Genepop-ohjelma laskee näytekoolla korjatun estimaatin Slatkinin (1985b) ehdotuksen mukaisesti, Bartonin ja Slatkinin (1986) esittämien regressiosuorien avulla. Privaattialleelimenetelmällä voidaan arvioida pitkällä aikavälillä tapahtunutta geenivirtaa, mutta se kuvaa huonosti nykyistä migraatiota populaatioiden välillä (Manel ym. 2005). Lähiaikaisen migraation tunnistamiseksi käytettiin GeneClass2-ohjelman (Piry ym. 2004) Rannalan ja Mountainin (1997) kehittämää luokittelumenetelmää, jolla voidaan tunnistaa ensimmäisen sukupolven migrantit yksilöt. Tämä tarkoittaa sellaisia yksilöitä, jotka ovat syntyneet toisesta populaatiossa, kuin missä ne on havaittu (Rannala & Mountain 1997). Nämä yksilöt voidaan tunnistaa laskemalla populaatioiden jokaiselle yksilölle kahden uskottavuusarvon suhde (L_home/L_max) silloin, kun immigrantin yksilön lähdepopulaatio on edustettuna näytteissä (Piry ym. 2004). Yksilön todennäköisyyttä kuulua populaatioon, josta se oli peräisin, arvioitiin Paetkau 42

43 ym. (2004) Monte Carlo -menetelmällä 1000 simuloidun yksilön avulla. Alle 1 % todennäköisyydellä populaatioon kuuluva yksilö katsottiin migrantiksi Efektiiviset populaatiokoot Fennoskandiassa Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden efektiiviset populaatiokoot arvioitiin kahden erilaisen, yhteen populaationäytteeseen perustuvan menetelmän avulla. Skandinavian koko aineistosta ei laskettu efektiivistä populaatiokokoa, koska alapopulaatiorakenteen vuoksi se tuskin kuvaisi todellista tilannetta (Wang & Caballero 1999). Otostunnuslukuihin perustuva likimääräinen bayesilainen laskentamenetelmä antaa Markov Chain Monte Carlo -pohjaisiin menetelmiin verrattuna nopeasti tuloksia, ja on lisäksi helppo toteuttaa (Beaumont ym. 2002). OneSamp-ohjelma (versio 1.0, Tallmon ym. 2008) toimii internetissä ( ja käyttää kyseistä menetelmää efektiivisen populaatiokoon arviointiin olettaen, että tutkimuksessa käytetyt lokukset ovat kytkeytymättömiä ja neutraaleja. Ohjelmaan kirjattiin sen vaatimat ennakkotiedot yksilöiden ja lokusten lukumäärästä sekä mikrosatelliittilokusten toiston pituudesta. Efektiivisen populaatiokoon ylä- ja alarajoina käytettiin arvoja 2 ja Ohjelma laskee tutkittavasta aineistosta kahdeksan efektiiviseen populaatiokokoon liittyvää otostunnuslukua. Menetelmä perustuu siihen, että ennakkotiedon perusteella luodaan simuloitua populaatiota, joiden efektiiviset koot ovat käyttäjän määrittämien rajojen välillä. Simuloiduista populaatioista otetaan tutkittavan populaation kokoisia näytteitä, ja niistä laskettuja otostunnuslukuja verrataan tutkittavasta populaatiosta laskettuihin otostunnuslukuihin. Niiden simuloitujen populaatioiden, joiden otostunnusluvut ovat samanlaisia kuin tutkittavassa populaatiossa, efektiivisiä populaatiokokoja käytetään painotetussa lineaarisessa regressiossa (Tallmon ym. 2008), jolla lasketaan efektiivisen populaatiokoon piste-estimaatti sekä luottamusvälit (Beaumont ym. 2002, Tallmon ym. 2008). Toinen tutkimuksessa käytetty ohjelma, LDNe (versio 1.3.1,Waples & Do 2007), perustuu sattuman vaikutuksesta syntyvään kytkentäepätasapainoon. Ohjelma käyttää Waplesin (2006) menetelmää efektiivisen populaatiokoon arviointiin perustuen Hillin (1981) teoriaan, mutta korjaa siinä esiintyvää harhaa, joka johtuu aineiston hankinnassa syntyvästä kytkentäepätasapainosta (England ym. 2006). Waplesin (2006) menetelmä käyttää Burrowin menetelmää (Burrows ) aineiston kytkentäepätasapainon arvioimiseen, ja korjaa -estimaatin näytekoolla Weirin (1979) mukaan. - 43

44 estimaatti standartisoidaan alleelifrekvenssien huomioimiseksi, jolloin saadaan korrelaatiokerroin r (Waples 2006), joka lasketaan jokaisen lokusparin jokaisesta alleeliparista. Korrelaatiokertoimista lasketaan r 2 kokonaiskeskiarvo ottaen huomioon alleelien lukumäärä ja näytekoko, ja sitä käytetään efektiivisen populaatiokoon arviointiin (Waples & Do 2007). Ohjelma käyttää efektiivisen populaatiokoon arvioimiseen Waplesin (2006) kehittämää paranneltua estimaattoria (taulukko 1, Waples & Do 2007). Tässä työssä Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden efektiivisen populaatiokoon arviointiin käytettiin mallia, jossa populaation oletettiin olevan satunnaisesti pariutuva, ja laskujen ulkopuolelle jätettiin hyvin pienellä frekvenssillä (< 0,01) esiintyvät alleelit. Luottamusvälien laskemiseen käytettiin linkkuveitsi-menetelmää, jossa korrelaatiokerroin ja efektiivisen populaatiokoon estimaatti lasketaan aina uudelleen aineistosta eliminoimalla vuorollaan yksi lokuspari. Alustavien analyysien perusteella kyseisen menetelmän luottamusvälit ovat käyttökelpoisempia kuin parametriset luottamusvälit, jotka ovat usein liian kapeat (Waples 2006, Waples & Do 2007). Menetelmä antaa tietoa vanhempien sukupolven efektiivisestä koosta, mutta siihen voi vaikuttaa myös lähimenneisyydessä muuttunut populaatiokoko. Menetelmän oletukset ovat, että populaatio on erillinen, siihen ei tule migraatiota ja sukupolvet ovat erilliset (Waples & Do 2007) Fennoskandian ilvespopulaatioiden pullonkaulat Lähimenneisyydessä efektiivisen populaatiokoon pienenemisen kokeneen populaation alleelien lukumäärän ja heterotsygotian vähenemisen välillä esiintyy korrelaatiota. Alleelien lukumäärä vähenee nopeammin, koska harvinaiset alleelit karsiutuvat suurella todennäköisyydellä pullonkaulan aikana sattuman vaikutuksesta (Cornuet & Luikart 1996). Heterotsygotia vähenee hitaammin, koska harvinaisilla alleeleilla on siihen vähemmän vaikutusta (Nei ym. 1975). Bottleneck (versio , Piry ym. 1999) on populaatiogeneettinen ohjelma, jota käytettiin pullonkaulan havaitsemiseksi Suomesta sekä Skandinavian jokaisesta alapopulaatiosta. Ohjelma laskee alleelien lukumäärän perusteella odotetun heterotsygotian jakauman jokaiselle lokukselle olettaen, että populaatio on tasapainossa mutaatioiden ja satunnaisajautumisen suhteen. Ohjelma laskee tämän jakauman simuloimalla koalessenssi-menetelmää ja, koska työssä käytettiin mikrosatelliittilokuksia, olettaa mutaatioiden seuraavan kaksivaiheista mutaatiomallia (TPM). Mallissa SMM osuudeksi valittiin suosituksen mukaan 95 % (Piry ym. 1999), ja useamman toiston mutaatioiden varianssiksi 16. Ohjelma laskee simuloidusta jakaumasta tasapainoheterotsygotian keskiarvon, jota se vertaa HW-tasapainon mukaiseen heterotsygotiaan Wilcoxonin testiä käyttäen. 44

45 Testi on käyttökelpoisin silloin, kun aineistosta on tutkittu alle 20 lokusta (Piry ym. 1999). Jos HW-tasapainon mukaisesti odotetun heterotsygotian määrä on tasapainoheterotsygotiaan verrattuna tilastollisesti merkitsevällä tavalla suurempi (H e > H eq ), on populaatio todennäköisesti kokenut pullonkaulan (Cornuet & Luikart 1996). Bottleneck-ohjelma esittää myös alleelifrekvenssien jakauman eri alleelifrekvenssiluokissa ja ilmoittaa noudattaako se L-muotoista jakaumaa, jollainen esiintyy vakaassa populaatiossa. Pullonkaulan kokeneissa populaatioissa jakauman muoto muuttuu väliaikaisesti, koska harvinaisten alleelien alleelifrekvenssiluokka pienenee (Luikart ym. 1998). 3 TULOKSET 3.1 Aineiston käyttökelpoisuus DNA:n eristys kudosnäytteistä onnistui hyvin kahta näytettä lukuun ottamatta. Näiden kahden näytteen PCR-tuotteen monistuminen epäonnistui toistuvasti, joten ne jätettiin pois jatkotutkimuksista. Mikrosatelliittien monistaminen onnistui kaikista lokuksista, mutta kolme lokusta vaati optimointia, ja silti osa näytteistä monistui heikommin. Negatiivisten kontrollien mukaan aineistossa ei esiintynyt kontaminaatioita. Kahdesta lokuksesta genotyypin määritys ei onnistunut kaikkien yksilöiden osalta: Fca001-lokuksesta genotyyppi saatiin määritetty 170 näytteestä ja Fca506-lokuksesta 164 näytteestä. Micro-Checker-ohjelman mukaan Suomen genotyyppiaineiston Fca506-lokuksessa esiintyi yksi tai useampi nolla-alleeli, mutta muissa lokuksissa ei ilmennyt merkkejä nolla-alleeleista. Ohjelmalla arvioitiin nolla-alleelin todennäköiset frekvenssit, ja ne olivat eri menetelmien mukaan 0,044 (1), 0,236 (2) (Brookfield 1996), 0,055 (van Oosterhout ym. 2004) ja 0,056 (Chackraborty 1992). Esimerkiksi vanhemmuusanalyysejä koskevissa tutkimuksessa on simulaatioiden perusteella arvioitu, että pienellä frekvenssillä (< 0,2) esiintyvät nolla-alleelit eivät suuresti vääristä tuloksia (Dakin & Avise 2004). Koska kolme menetelmää neljästä arvioi nolla-alleelin frekvenssin varsin pieneksi, Fca506-lokus päätettiin säilyttää jatkotutkimuksissa. Skandinaviasta saatujen kudosnäytteiden genotyypin määritys onnistui useimpien lokusten osalta hyvin, mutta eräissä lokuksissa saatiin ristiriitaisia tietoja omien ja odotettujen tulosten suhteen. Kahden lokuksen kohdalla tässä työssä käytetyt menetelmät tunnistivat kolme homotsygoottia, joiden olisi pitänyt olla heterotsygootteja Skandinaviassa suoritetun genotyypin määrityksen 45

46 perusteella, ja yhdestä lokuksesta löytyi heterotsygootti, jonka olisi pitänyt olla homotsygootti. Yhdestä lokuksesta löytyneiden heterotsygoottien yksilöiden alleelien väliset kokoerot olivat suurempia, kuin mitä ennakkotiedoissa oli ilmoitettu. Näistä vaikeuksista huolimatta oli mahdollista suhteuttaa Skandinavian ilvesten genotyyppiaineisto vastaamaan tässä työssä määritettyjen alleelien kokoja. Suomen ja Skandinavian ilvesten alleelikokojen vastaavuuksien määrityksen onnistumista oli mahdollista arvioida Hellborg ym. (2002) julkaisun liitteestä löytyvien lokuskohtaisten tietojen avulla, koska heidän tutkimuksensa käsitti samat mikrosatelliittilokukset, kuin mitä tutkittiin tässä työssä. Tämän työn lokuskohtaisten alleelikokojen ja -frekvenssien vertailu (liite V) osoitti, että lokusten tiedot olivat suurelta osin samansuuntaiset näiden tutkimusten välillä. 3.2 Populaation sisäinen rakenne Suomessa ja Skandinaviassa Suomi Bayesilaisten ryhmittelymenetelmien arvioivat Suomen ilvesten geneettisestä rakenteesta olivat varsin erilaiset. Structure-ohjelman mallipohjaisen menetelmän mukaan Suomessa ei esiintynyt populaatiorakennetta. Malli, jossa K = 1, sai viidessä itsenäisessä ajossa suurimmat uskottavuusarvot (ka 4688), ja myös sen uskottavuusarvoista laskettu keskihajonta oli pienin (SD = 2,805). Muiden mallien suuremmilla K:n arvoilla uskottavuusarvot olivat pienempiä, ja niiden keskihajonta oli huomattavasti suurempi. Bayesilaisen säännön mukaan K:n eri arvoille lasketut todennäköisyydet olivat olemattomat (p = 0,000) kaikkien muiden mallien, paitsi K = 1 (p = 1,0) kohdalla. Sen sijaan BAPS-ohjelman satunnaistettuun optimointiin perustuvan algoritmin tulokset vaihtelivat eri ajojen välillä, ja tulosten mukaan ryhmää selitti parhaiten Suomen ilvesten geneettistä rakennetta (taulukko 3.1). BAPS-ohjelmalla on havaittu vaikeuksia rajata alapopulaatioita (Latch ym. 2006), ja tämän takia on suositeltu, että K:n estimaattiin laskettaisiin vain ne ryhmät, joissa on yli 3 yksilöä (Corander ym. 2006, Latch ym. 2006). Tällä perusteella eri ajoista muodostettujen ryhmien lukumäärät vaihtelivat välillä. Yksilöiden kuulumista erillisten ajojen mukaisesti muodostettuihin optimaalisiin ryhmiin tarkasteltiin, mutta ryhmien ei havaittu vastaavan tiettyä maantieteellistä aluetta. Taulukko 3.1 Suomen ilvespopulaatiosta BAPS-ohjelmalla muodostettujen todennäköisimpien ryhmien lukumäärä ja niiden todennäköisyydet, sekä sellaisten ryhmien lukumäärä, joihin kuului 46

47 yli 3 yksilöä (n). Ajo Ryhmien lkm (K) Todennäköisyys (I) Ryhmien lkm (K) kun n > , , , , Kuvaaja 3.1 Suomen ilvesyksilöistä muodostettu Delaunayn kolmiomittausverkosta ja Monmonierin algoritmin tunnistama segmentti, joka on esitetty sinisellä rajattuna. Alleles In Space -ohjelman Delaunayn kolmiomittauksella saavutettu yksilöitä yhdistävä verkosto on esitetty kuvaajassa 3.1. Monmonierin algoritmi havaitsi aineistossa yhden erillisen lohkon (kuvaaja 3.1), ja se esiintyi Etelä-Suomessa Kouvolan seudulla. Lohko sijoittui maantieteellisesti varsin pienelle alueelle, sillä sen ala oli vain noin 600 km 2. Se oli siis pienempi kuin esimerkiksi Skadinaviassa havaitut suurimmat ilvesten elinpiirit (Linnell ym. 2001). Näin ollen sen merkitys Suomen ilvespopulaation geneettiselle rakenteelle on todennäköisesti hyvin vähäinen. Erillisten alapopulaatioiden sijaan Suomessa näytti esiintyvän etäisyysisolaation mallia seuraavaa geneettistä rakennetta. SPAGeDi-ohjelmalla lasketun regressiosuoran kulmakerroin oli hieman negatiivinen (b = -0,0076), ja se oli permutaatiotestin mukaan tilastollisesti erittäin merkitsevä (p = 0,000). Spatiaalisen autokorrelaatioanalyysin muodostamien maantieteellisten etäisyysluokkien ja sukulaisuuskertoimien välinen yhteys on esitetty kuvaajassa 3.2. Linkkuveitsi-menetelmän mukaan kaikkien etäisyysluokkien estimaatit olivat harhattomia, joten estimaatit kuvaavat hyvin tilannetta kyseisessä etäisyysluokassa. Kuvaajasta nähdään, että maantieteellisesti läheisimmät eli 47

48 ensimmäisen etäisyysluokan, yksilöt olivat geneettisesti keskimääräistä samankaltaisempia. Tulkinta sai myös tilastollista tukea, koska permutaation mukaan tulos oli erittäin merkitsevä (p = 0,000). Ensimmäisessä etäisyysluokassa yksilöt sijaitsivat keskimäärin 44 km etäisyydellä toisistaan, ja tämä etäisyys on pienempi kuin ilveksellä havaitut keskimääräiset dispersaalietäisyydet (mm. Zimmermann ym. 2005, Sunde 2000a). Vastaavasti hyvin etäällä toisistaan sijaitsevat yksilöt olivat geneettisesti keskimääräistä erilaisempia (kuvaaja 3.2), sillä toiseksi suurimmassa etäisyysluokassa yksilöiden välinen etäisyys oli keskimäärin 377 km, ja luokan negatiivinen sukulaisuuskerroin sai tilastollisesti erittäin merkitsevän arvon (p = 0,003). Kuvaaja 3.2 Suomen ilvesten keskimääräiset sukulaisuuskertoimet kymmenenessä maantieteellisessä etäisyysluokassa. Etäisyysluokat on esitetty logaritmisessa mitta-asteikossa (ln km), ja tilastollisesti merkitsevät arvot on merkitty *-merkillä (tarkat tilastolliset merkitsevyydet on esitetty tekstissä). Suurimmassa etäisyysluokassa yksilöiden väliset etäisyydet olivat keskimäärin 503 km, mutta tilastollisesti merkitsevä sukulaisuuskerroin (p = 0,018) oli suurempi kuin edellisessä etäisyysluokassa. Tämä johtui kuitenkin siitä, että suurin etäisyysluokka pitää sisällään kauimmaksi dispersoivat yksilöt, jotka eivät seuraa etäisyysisolaatio-mallia (Vekemans & Hardy 2004). Kuudennen etäisyysluokan keskimääräinen sukulaisuuskerroin oli positiivinen, mutta tämän etäisyysluokan arvo ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,082), kuten eivät olleet muidenkaan keskipitkien etäisyysluokkien arvot. Regressiosuoran kulmakertoimen avulla voitiin arvioida naapuruston kokoa ja keskimääräistä dispersaalietäisyyttä. Yhtälöä Nb = (1 F 1 )/b käyttäen laskettiin, että naapuruston keskimääräinen 48

49 koko Suomessa oli 128,9 yksilöä. Yhtälössä esiintyvä F 1 kuvaa ensimmäisen etäisyysluokan yksilöiden keskimääräistä sukulaisuutta, joka oli 0,014. Naapuruston alan ja dispersaalietäisyyden laskemista varten tarvittiin arvio ilveksen yksilötiheydestä Suomessa. Tämä arvioitiin poronhoitoalueen eteläpuolisen Suomen pinta-alan (noin km 2 ) ja vuoden 2005 arvion ilvesten yksilömäärästä (ka. 1150) perusteella (Kojola ym. 2006a). Poronhoitoalue jätettiin arvion ulkopuolelle, koska alue on laaja ja ilves on siellä varsin vähälukuinen, joten sillä olisi ollut huomattava vaikutus ilveksen tiheysestimaattiin kannan varsinaisella levinneisyysalueella Suomessa. Tällä perusteella laskettuna ilvestiheys oli: 1150 yksilöä/ km 2 x1000 6,2 yksilöä/1000 km 2. Tiheyden avulla ratkaistiin, että naapuruston keskimääräinen ala oli km 2. Tiheysestimaattia hyväksikäyttäen oli mahdollista arvioida ilveksen keskimääräistä dispersaalietäisyyttä Suomessa, kun lisäksi oletettiin, että ilvesten dispersaalietäisyydet noudattavat normaalijakaumaa, vaikkakaan tämä ei välttämättä toteudu luonnon oloissa (Rousset 1997, 2001). Aksiaalisen dispersaalietäisyyden keskihajonta σ saadaan ratkaistua yhtälön Nb = 4πDσ 2 avulla, jossa D on keskimääräinen tiheys ja σ 2 on aksiaalisen dispersaalietäisyyden varianssi, josta voidaan ratkaista ilvesten keskimääräiseksi dispersaalietäisyydeksi 115,4 km Skandinavia Odotetusti Skandinavian sisäistä rakennetta selitti Pritchardin ym. (2000) menetelmän mukaan parhaiten malli, jossa K = 3. Suurimman uskottavuusarvon saaneen ajon tulosten tarkempi tarkastelu osoitti, että Skandinavia voitiin jakaa kolmeen alapopulaatioon yhdistämällä jo aiemmin maantieteellisin perustein erotettuja ryhmiä (ks. liite IV). Ensimmäinen alapopulaatio voitiin muodostaa ryhmistä N1, N2, S1, toinen yhdistämällä ryhmät N3, N4, S2, S3, ja kolmas alapopulaatio muodostui pienestä N5 ryhmästä. Ennakkotiedon käytön sallivan mallin mukaan yksilöt kuuluivat suurella todennäköisyydellä siihen alapopulaatioon, johon ne tässä työssä oli luokiteltu. Pohjoisimmassa alapopulaatiossa vain viisi yksilöä kuului siihen alle 80 % todennäköisyydellä. Keskiosan alapopulaatioon kuului kahdeksan yksilöä alle 80 % todennäköisyydellä, ja näistä vain kaksi alle 50 % todennäköisyydellä. Eteläisimmässä alapopulaatiossa neljä yksilöä kuului siihen alle 80 % todennäköisyydellä, ja näistä kolme yksilöä alle 50 % todennäköisyydellä. Jatkotutkimuksessa pohjoisosan alapopulaatioon kuului 68 yksilöä, keskiosaan 198 yksilöä ja eteläosan alapopulaatioon 37 yksilöä (ks. kuva 3.1). 49

50 3.3 Populaatioiden kytkentä- ja Hardy-Weinbergin tasapaino Suomessa esiintyi kytkentäepätasapainoa lokusten Fca001 ja F115 välillä, ja se oli tilastollisesti merkitsevää Bonferronin korjauksen jälkeenkin (χ 2 =, df = 2, p = 0,000). Muiden lokusten väliltä ei löytynyt tilastollisesti merkitsevää kytkentäepätasapainoa. Skandinaviassa pohjois- ja eteläosan alapopulaatiot olivat kytkentätasapainossa. Keskiosan alapopulaatiosta löytyi tilastollisesti merkitsevää kytkentäepätasapainoa (p = 0,000) järjestetyn Bonferronin korjauksen (Holm 1979) mukaan lokusten Fca001 ja F115, Fca008 ja Fca596 sekä Fca045 ja Fca506 väliltä. Suomen ilvekset olivat Fisherin tarkan nelikenttätestin mukaan HW-tasapainossa kaikkien lokusten yli arvioituna (χ 2 = 24.29, df = 20, p = 0,234). Lokuksittain tarkasteltuna genotyyppifrekvenssit esiintyivät HW-tasapainon mukaisissa suhteissa kaikissa muissa, paitsi Fca045-lokuksessa (p = 0,025, SE = 0,002). Fca045-lokuksessa heterotsygootteja esiintyi HW-tasapainon mukaan odotettu määrä (havaittu 81 yksilöä, odotettu 83,1 yksilöä), mutta tiettyä genotyyppiä (139/147) esiintyi paljon vähemmän (14 kpl), kuin mitä alleelifrekvenssien mukaan olisi odotettu (21 kpl), jonka takia lokuksessa esiintyi merkitsevä poikkeama HW-tasapainosta. Skandinaviassa pohjois- ja eteläosan alapopulaatiot olivat HW-tasapainossa (χ 2 = 30,56, df = 20, p = 0,061 ja χ 2 = 9,11, df = 18, p = 0,957), mutta keskiosan alapopulaatio ei ollut (χ 2 = 56,74, df = 20, p = 0,000). Kokonaisuudessaan Skandinavia ei ollut HW-tasapainossa (χ 2 = 96,42, df = 52, p = 0,000). 3.4 Fennoskandian ilvesten populaatiorakenne ja erilaistuminen Molekyylivarianssianalyysin mukaan 18,8 % kokonaisvarianssista johtui Suomesta ja Skandinaviasta muodostettujen ryhmien välisistä alleelifrekvenssieroista (taulukko 3.2). Pienempi osa kokonaisvarianssista oli ryhmien sisällä, tässä tapauksessa Skandinavian alapopulaatioiden välisistä eroista johtuvaa (3,47 %), ja loppuosa selittyi populaatioiden sisäisellä muuntelulla. Kokonaisuudessaan Fennoskandiassa esiintyi huomattavaa (F ST = 0,223), ja tilastollisesti erittäin merkitsevää erilaistumista (p = 0,000). Fiksaatioindeksit osoittivat, että Suomen ja Skandinavian välinen erilaistuminen oli voimakasta (F CT = 0,188). Tämä ei saanut kuitenkaan tilastollisesti merkitsevää arvoa (p = 0,267), koska permutaatiotestissä oli käytettävissä vain neljä populaatiota sekoittamisen suorittamiseksi. Skandinavian alapopulaatioiden välinen erilaistuminen oli kohtalaista (F SC = 0,043), mutta se oli permutaatiotestin perusteella erittäin merkitsevää (p = 0,000). 50

51 Taulukko 3.2 Kokonaisvarianssin jakautuminen Fennoskandiassa molekyylivarianssianalyysin mukaisesti. Varianssin lähde Vapausasteet Varianssi (%) Suomen ja Skandinavian välillä 1 18,8 Skandinavian sisällä alapopulaatioiden välillä 2 3,47 populaatioiden sisällä ,7 Taulukko 3.3 Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välille lasketut, erilaistumista kuvaavat F ST -arvot. Suomi Pohjoisosa Keskiosa Pohjoisosa 0,183 Keskiosa 0,212 0,044 Eteläosa 0,253 0,091 0,058 Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välisen erilaistumisen tarkastelu F-statistiikan avulla osoitti, että erilaistuminen oli huomattavaa jo Suomen ja Skandinavian pohjoisimman alapopulaation välillä (taulukko 3.3), ja erilaistumisen voimakkuus kasvoi Skandinavian niemimaan eteläkärkeä kohti. Skandinaviassa alapopulaatioiden välillä oli kohtalaista geneettistä erilaistumista, joka oli suurempaa pohjois- ja eteläosan, kuin vierekkäisten alapopulaatioiden välillä. 3.5 Geneettinen muuntelu ja sukusiitos Suomi Suomessa alleelien lukumäärät eri lokuksissa vaihtelivat kolmesta (Fca045 ja Fca149) kahteentoista (F115), ja kaikista lokuksista laskettu keskiarvo oli 5,8 alleelia (taulukko 3.4). Lokuskohtaiset tiedot alleelifrekvensseistä löytyvät liitteestä V. Odotettu heterotsygotia vaihteli lokuksittain välillä 0,267 0,835, ja se oli useimmiten samansuuruista havaitun heterotsygotian kanssa. Fca506-lokuksessa havaittiin vähemmän heterotsygootteja kuin HW-tasapainon mukaan olisi odotettu, ja Fca559-lokuksessa enemmän. Kokonaisuudessaan kaikkien lokusten yli arvioituna populaatiossa havaittiin lähes saman verran heterotsygootteja (H o = 0,640), kuin mitä HWtasapainon mukaan odotettiin (H e = 0,645) (taulukko 3.4). 51

52 Suomesta laskettu sukusiitoskerroin oli hieman positiivinen (F IS = 0,011), mutta 1000 uudelleenotanta-toiston mukaan arvo ei ollut tilastollisesti merkitsevä (taulukko 3.4), koska sen 95 % luottamusväli vaihteli nollan molemmin puolin ( 0,022 0,039). Fca506-lokuksen positiivinen ja suuri sukusiitoskerroin (F IS = 0,108), sai tilastollisesti merkitsevän tuloksen (95 %:n luottamusväli: 0,009 0,209), mutta lokuksen homotsygotian ylimäärä johtui luultavasti nolla-alleeleista. Fca149- lokuksessa oli myös suuri sukusiitoskerroin (F IS = 0,098), mutta se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (95 %:n luottamusväli: 0,039 0,231). Sukusiitoksen vaikutuksen pitäisi näkyä homotsygotian ylimääränä kaikissa tutkituissa lokuksissa, joten Suomen populaatiossa ei esiintynyt merkkejä sukusiitoksesta. Taulukko 3.4 Lokusten näytekoko (n), alleelien lukumäärä (A), geenidiversiteetti (H e ), havaittu heterotsygotia (H o ) ja sukusiitoskerroin (F IS ). *-merkki osoittaa sukusiitoskertoimen tilastollisesti merkitsevää arvoa 1000 uudelleenotanta-toiston mukaan. Lokus n A H e H o F IS Fca ,692 0,653 0,060 Fca ,702 0,720 0,022 Fca ,835 0,835 0,002 Fca ,726 0,758 0,042 Fca ,455 0,445 0,025 F ,827 0,827 0,006 Fca ,267 0,242 0,098 Fca ,556 0,560 0,005 Fca ,709 0,634 0,108* Fca ,679 0,725 0,066 ka 5,8 0,645 0,640 0, Suomi ja Skandinavia Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välillä havaittiin tilastollisesti merkitseviä eroja alleelirikkaudessa Friedmanin testin mukaan (Q = 11,97, df = 3, p = 0,007) (taulukko 3.5). Skandinaviassa kokonaisuudessaan näytti esiintyvän vähemmän alleeleja (R s = 4,5) kuin Suomessa (R s = 5,8), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Q = 2,50, df = 1, p = 0,114). Myös odotettu heterotsygotia näytti vähäisemmältä Suomeen verrattuna sekä koko Skandinavian näytteestä laskettuna, että alapopulaatiotasolla (taulukko 3.5). Skandinaviassa kokonaisuudessaan, ja myös sen alapopulaatioissa esiintyneiden alleelien lukumäärä, alleelifrekvenssit ja odotettu heterotsygotia on esitetty liitteessä V lokuksittain. Alleelien lukumäärä oli Suomessa kuuden lokuksen osalta suurempi kuin Skandinaviassa, mutta Skandinaviassa vastaava arvo oli suurempi vain yhdessä lokuksessa (liite V). Skandinavian alapopulaatioissa alleelirikkaus oli vähäinen, erityisesti etelän 52

53 alapopulaatiossa (taulukko 3.5), josta puuttui useita pohjoisemmista alapopulaatioita löytyviä alleeleja (liite V). Skandinavian alapopulaatioiden väliset erot alleelirikkauksissa olivatkin tilastollisesti merkitseviä (Q = 8,15, df = 2, p = 0,017). Skandinavian pohjoisosan geenidiversiteetti (H e = 0,54) oli suurempi kuin koko Skandinaviasta laskettu geenidiversiteetti (H e = 0,52). Sekä geenidiversiteetti että alleelirikkaus laskivat Skandinavian niemimaan eteläkärkeä kohti (taulukko 3.5). Suomessa esiintyi 16 alleelia, joita ei löytynyt Skandinaviasta, kun taas Skandinaviassa esiintyi vain viisi privaattialleelia (liite V). Pelkästään Skandinavian alapopulaatioita tarkasteltaessa pohjoisosan alapopulaatiossa esiintyi kolme ja keskiosassa neljä privaattialleelia (liite V). Taulukko 3.5 Suomen ja Skandinavian, sekä Skandinavian alapopulaatioiden, näytekoko (n), alleelien lukumäärä (A), alleelirikkaus (R s ), geenidiversiteetti (H e ) ja sukusiitoskerroin. Sukusiitoskertoimen tilastollisesti merkitsevä arvo 1000 uudelleenotanta-toiston perusteella on merkitty *-merkillä. n A R s a Suomi 182 5,8 5,8 5,4 0,645 0,011 Skandinavia 303 4,7 4,5 0,516 0,074* Pohjoisosa 68 4,1 3,9 0,538 0,047 Keskiosa 198 4,4 3,7 0,503 0,063* Eteläosa 37 3,1 3,1 0,427 0,048 a Suhteutettu Suomen näytekokoon (n = 164) b Suhteutettu Skandinavian eteläosan alapopulaation näytekokoon (n = 36) R s b H e F IS Koko Skandinavian sekä keskiosan alapopulaation sukusiitoskertoimet olivat tilastollisesti merkitsevät (taulukko 3.5). Koko Skandinavian positiivinen sukusiitoskerroin voi johtua Wahlundin ilmiöstä (Wahlund 1928), jossa erillisten alapopulaatioiden yhdistäminen yhdeksi populaatioksi saa aikaan homotsygoottien ylimäärän verrattuna HW-tasapainon odotuksiin (Hedrick 2005, s ). Skandinavian pohjois- ja eteläosan alapopulaatioille lasketut sukusiitoskertoimet eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. 3.6 Migraatio Suomen ja Skandinavian välinen historiallinen geenivirta vaikutti privaattialleelimenetelmän mukaan olleen vähäistä. Privaattialleelien keskimääräinen frekvenssi oli 0,056, ja efektiivisten migranttien määrä sukupolvessa (Nm) oli vain noin 0,243 yksilöä näytekoolla korjatun estimaatin mukaan. 53

54 Suomesta ei löytynyt bayesilaisen itseluokittelumenetelmän mukaan todennäköisiä immigrantteja, sillä yhdenkään yksilön todennäköisyys kuulua Suomen populaatioon ei ollut pienempi, kuin asetettu 1 % hylkäämisraja. Tämä oli kuitenkin heikompi testi, kuin mitä käytettiin Suomen ja Skandinavian välisen migraation tutkimiseen (Piry ym. 2004). Kun migrantin mahdollinen lähdepopulaatio oli edustettuna näytteissä, havaittiin yksi todennäköinen ensimmäisen sukupolven immigrantti. Tämän naarasyksilön todennäköisyys kuulua Suomen populaatioon oli olematon (p = 0,000). Yksilön näyte oli peräisin Lapin Tervolasta (kuva 3.1), mutta geneettisesti yksilö vaikutti olevan peräisin Skandinavian keskiosan alapopulaatiosta, koska yksilön itseluokittelukriteerin arvo oli suurin kyseisessä populaatiossa. Skandinaviassa ei havaittu yhtään Suomesta peräisin olevaan immigranttia. Skandinavian alapopulaatioita tarkasteltaessa havaittiin kahdeksan todennäköistä immigranttia, jotka kuuluivat alapopulaatioihinsa alle 1 % todennäköisyydellä. Migraatio näytti tapahtuvan yleensä vierekkäisten alapopulaatioiden välillä. Pohjoisosan alapopulaatiossa havaittiin neljä keskiosasta peräisin olevaa immigranttia, ja keskiosan immigranteista yksi oli geneettisesti peräisin pohjoisesta ja kaksi eteläosasta. Eteläosasta löytynyt yksi migrantti oli geneettisin perustein saapunut sinne pohjoisosan alapopulaatiosta. 54

55 Kuva 3.1 Suomessa havaittu, geneettisesti Skandinavian keskiosan alapopulaatiosta peräisin oleva immigrantti punaisella nuolella osoitettuna. Skandinavian ilvesnäytteistä muodostetut alapopulaatiot on esitetty siten, että pohjoisosan näytteet on merkitty punaisella, keskiosan sinisellä ja eteläosan keltaisella. Suomen ilvesnäytteet on merkitty vihreällä. 3.7 Efektiivinen populaatiokoko Suomi Molemmat käytetyt menetelmät antoivat samankaltaiset arviot Suomen ilveksen efektiivisestä populaatiokoosta (taulukko 3.6). Likimääräisellä bayesilaisella laskentamenetelmällä saatu arvio oli hieman suurempi (N e = 155,0), kuin kytkentäepätasapainoon perustuvan menetelmän arvio (N e = 135,5). Myös bayesilaispohjaisen menetelmän laskema luottamusväli oli huomattavasti leveämpi kuin LD-menetelmän linkkuveitsi-luottamusväli. Estimaateista laskettu N e :n aritmeettinen keskiarvo oli 145,3 yksilöä. Taulukko 3.6 Suomen ilveksen efektiivisen populaatiokoon estimaatit ja 95 % luottamusvälit. Menetelmä Ohjelma Ne 95 % luottamusväli LD-menetelmä LDNe 135,5 99,4 196,7 Likimääräinen bayesilainen menetelmä OneSamp 155,0 80,6 460,0 Vuonna 2005 Suomessa arvioitiin olevan noin 1150 ilvestä (Kojola ym. 2006a), joten N e :n ja N:n suhteeksi saatiin 145/1150 = 0,126. Karkeasti esittäen Suomen ilveksen efektiivinen koko oli siis noin 13 % koko kannan yksilömäärästä. Lisääntyvien aikuisten lukumäärästä ei ole tarkkaa tietoa, mutta samana vuonna ilveskantaan arvioitiin syntyneen noin 185 pentuetta (Kojola ym. 2006a). Tämä antaa kuvaa lisääntyvien naaraiden määrästä Suomessa ja osoittaa, että Suomen ilvesten efektiivinen koko oli pienempi kuin lisääntyvien aikuisten määrä Skandinavia Menetelmät antoivat varsin erilaiset arviot kunkin Skandinavian alapopulaation efektiiviseksi kooksi. Bayesilaispohjaisen menetelmän mukaan N e laski etelää kohti, kun taas LD-menetelmän mukaan N e oli suurin keskiosan alapopulaatiossa (taulukko 3.7). Kummankin menetelmän mukaan eteläosan alapopulaation efektiivinen koko oli pienin, mutta bayesilaispohjaisen menetelmän 55

56 estimaatti (N e = 38,8) oli kaksi kertaa suurempi kuin LD-menetelmän estimaatti (N e = 14,6). Myös pohjoisosan alapopulaation N e -estimaatti oli suurempi bayesilaispohjaisella menetelmällä laskettuna (N e = 100,7) kuin LD-menetelmällä (N e = 67,1), jonka estimaatti on samaa luokkaa kuin alapopulaatiosta käytettävissä ollut näytekoko (n = 68). Keskiosan alapopulaation Ne-estimaatit erosivat eniten käytettyjen menetelmien välillä, ja toisin kuin kahdessa muussa alapopulaatiossa, LD-menetelmä arvioi keskiosan alapopulaation efektiivisen koon huomattavasti suuremmaksi (N e = 178,5), kuin bayesilaispohjainen menetelmä (N e = 86,1). Taulukko 3.7 Skandinavian alapopulaatioiden efektiivisen populaatiokoon estimaatit ja 95 % luottamusvälit. Menetelmä LD-menetelmä Likimääräinen bayesilainen menetelmä Alapopulaatio Ne 95 % luottamusväli Ne 95 % luottamusväli Pohjoisosa 67,1 37,4 169,2 100,7 70,7 314,8 Keskiosa 178,5 94,1 520,2 86,1 49,4 258,1 Eteläosa 14,6 7,0 31,4 38,8 31,6 63,0 3.8 Fennoskandian ilvespopulaatioiden pullonkaulat Suomesta ei Bottleneck-ohjelman Wilcoxonin testillä havaittu merkkejä geneettisestä pullonkaulasta käyttäen yksisuuntaista kysymyksenasettelua (p = 0,188). Myös alleelifrekvenssiluokkien frekvenssit noudattivat normaalia L-jakaumaa (kuvaaja 3.3), joka on odotettavissa kun populaatiokoko on ollut vakaa (Luikart ym. 1998). Myöskään Skandinavian pohjoisosan (p = 0,138), keskiosan (p = 0,500) tai eteläosan (p = 0,545) alapopulaatioissa ei havaittu merkkejä pullonkaulasta Wilcoxonin testillä, tai alleelifrekvenssijakaumaan perustuvalla tarkastelulla (kuvaaja 3.3). 56

57 Kuvaaja 3.3 Suomessa ja Skandinavian alapopulaatioissa esiintyneiden alleelien frekvenssit on esitetty jaoteltuna eri alleelifrekvenssiluokkiin. 4 POHDINTA 4.1 Aineiston luotettavuus Näytteet antoivat kattavan kuvan Suomessa vuosina kuolleista ilveksissä, ja noudattivat sijaintinsa perusteella melko hyvin ilveksen tunnettua levinneisyysaluetta Suomessa. Aineistossa oli vain neljä näytettä lajin pohjoisimmilta elinalueilta Lapista, mutta toisaalta ilves on siellä varsin harvalukuinen. Ilves on nykyisin jakautunut melko tasaisesti Lapin eteläpuoliseen Suomeen, joten läntinen osa ilveksen levinneisyysalueesta ei ehkä ollut otoksessa niin hyvin katettuna, kuin keskija itäosat. Kokonaisuutena näytteet muodostivat kattavan otoksen Suomen ilveksistä. DNA:n eristys kudosnäytteistä onnistui hyvin, mutta mikrosatelliittilokusten monistaminen DNAnäytteistä vaati tiettyjen lokusten kohdalla PCR-olojen optimointia. Negatiivisten kontrollien mukaan aineistossa ei esiintynyt kontaminaatioita. Fca506-lokuksessa esiintyi todennäköisesti nolla-alleeli, ja se ilmeisesti saikin aikaan lokuksen positiivisen sukusiitoskertoimen (F IS = 0,108) tilastollisesti merkitsevän arvon. Kuitenkin nolla-alleelin esiintymisfrekvenssi oli niin pieni, ettei sen uskottu merkitsevästi vaikuttavan tutkimustuloksiin kaikkien lokusten ollessa mukana tutkimuksessa. Myöskään yhden lokusparin välillä esiintyneen kytkentäepätasapainon ei uskottu 57

58 vääristävän tuloksia, sillä lokusten välinen korrelaatiokerroin ei ollut kovin suuri (tietoja ei esitetty), joten ne antoivat myös toisistaan riippumatonta tietoa. Skandinavian aineiston osalta luotettiin genotyyppiaineiston hankkineen tahon riittävään huolellisuuteen. Skandinavian genotyyppiaineiston alleelikokojen vastaavuuksien määrityksen uskottiin onnistuneen Suomen genotyyppiaineiston kanssa. Jos alleelikokojen vastaavuuksien määrityksessä on kuitenkin mennyt jotain vikaan, voi populaatioiden välille lasketut F ST -arvot olla liian suuret, ja populaatioiden välisten migranttien tunnistus ei välttämättä ole onnistunut vaaditulla hylkäämisrajalla. Skandinavian ilvesten suuri näytemäärä antoi kattavaa kuvaa ilveksen geneettisestä muuntelusta kaikkialta Skandinavian niemimaalta. 4.2 Geneettinen muuntelu Suomen ilveksen geneettinen muuntelu oli mikrosatelliiteille kohtalaisella tasolla, ja havaittu heterotsygotia (H o = 0,640) oli samansuuruista odotetun heterotsygotian kanssa (H e = 0,645). Suomen ilveksen geneettisen muuntelun määrää koskevat aiemmat tutkimustulokset ovat perustuneet huomattavasti pienempiin näytekokoihin (Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003, Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a), mutta tulokset ovat olleet samansuuntaisia. Breitenmoser- Wursten ja Obexer-Ruff (2003) vertailivat eri ilvespopulaatioiden geneettisen muuntelun määrää Euroopassa, ja heidän tutkimuksensa mukaan Suomen ilveksen heterotsygotia oli noin 0,68. He tutkivat 15 mikrosatelliittilokusta 30 suomalaisesta ilveksestä, mutta julkaisussa ei mainittu tutkittujen lokusten nimiä, näytteiden keräyspaikkaa tai ajankohtaa. Rueness ym. (2003a) tutkimuksessa käytettiin 48 ilvesnäytettä Suomesta vuosilta , ja niiden perusteella laskettu geenidiversiteetti (H e = 0,63) oli samaa tasoa, kuin tässä työssä saavutetut tulokset. Kuitenkin tämän työn suurempi näytekoko, ja mahdollisesti myös otoksen kattavuus paljastivat Suomesta neljä aiemmissa tutkimuksissa havaitsematta jäänyttä alleelia (Hellborg ym. 2002). Tässä työssä Suomessa esiintyi keskimäärin 5,8 alleelia, kun aiemmissa töissä oli ilmoitettu keskimäärin 5,4 alleelia (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). Skandinavian ilvesten jakaminen geneettisin perustein vain kolmeen alapopulaatioon Rueness ym. (2003a) käyttämän kahdeksan ryhmän sijaan, antoi mahdollisesti todellisempaa kuvaa niemimaalla esiintyvästä muuntelun määrästä ja jakautumisesta. Tässä työssä havaittiin, että Skandinavian alapopulaatioiden välillä oli tilastollisesti merkitseviä eroja alleelirikkauden suhteen. Pohjoisosan alapopulaation geneettinen muuntelu oli Skandinavialle runsainta (H e = 0,538, R s = 3,9), mutta muuntelun määrä laski niemimaan eteläkärkeä kohti. Keskiosan alapopulaatiossa muuntelu oli vielä 58

59 kohtalaisella tasolla (H e = 0,503, R s = 3,7), mutta eteläosan alapopulaatiossa muuntelu oli erityisen vähäistä (H e = 0,427, R s = 3,1), ja sieltä puuttui useita pohjoisempana esiintyviä alleeleja. Myös Skandinavian ahmoilla eteläosan alapopulaatiossa on ollut vähemmän muuntelua, ja sieltä on puuttunut useita alleeleja verrattuna niemimaan pohjoisempiin osiin (Walker ym. 2001). Skandinavian niemimaan pohjois- ja keskiosan alapopulaatiossa esiintyi muutamia privaattialleeleja, mutta niitä ei havaittu eteläosan alapopulaatiossa. Muihin Euroopan alkuperäispopulaatioihin verrattuna Skandinavian ilveksen muuntelun määrä oli vähäisempää (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a, Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003). Myös Skandinavian sudella ja ahmalla on havaittu samanlainen muuntelun vähäisyys verrattuna lajien manner-populaatioihin (Walker ym. 2001, Vila ym. 2003). Suomen ilvesten geenidiversiteetti ja alleelirikkaus (H e = 0,645, R s = 5,8) näyttivät olevan suurempia kuin koko Skandinaviassa (H e = 0,0516, R s = 4,5), vaikka alleelirikkauden osalta havaittiin, etteivät erot olleet tilastollisesti merkitseviä. Kuitenkin tarkasteltaessa Suomea ja Skandinavian alapopulaatioita havaittiin tilastollisesti merkitseviä eroja alleelirikkaudessa (p = 0,007), sillä Skandinavian alapopulaatioiden alleelirikkaus oli huomattavan vähäistä. Suomen ilvesten suuremmasta muuntelun määrästä kertoi myös privaattialleelien runsaampi esiintyminen Suomessa verrattuna Skandinaviaan. Skandinavian eteläosan geneettisen muuntelun vähäisyys oli huolestuttavaa, koska se oli samaa luokkaa, tai jopa pienempi, kuin Keski-Eurooppaan siirtoistuttamalla palautettujen pienten ilvespopulaatioiden muuntelu. Näistä Juravuoriston ilveskannan koko on noin yksilöä ja Sveitsin Alppien yksilöä. Niissä esiintyvä heterotsygotia on ollut 0,52 ja 0,42, sekä vastaavasti alleelien lukumäärä 3,47 ja 2,87, (Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003, Ryser-Degiorgis ym. 2004), ja sukusiitosheikkouden esiintymistä on pidetty mahdollisena (Ryser-Degiorgis ym. 2004). Suomen ilveksen geneettinen muuntelu oli suunnilleen samaa tasoa Baltian ja Karpaattien alkuperäispopulaatioiden kanssa (Breitenmoser-Wursten & Obexer-Ruff 2003, Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). Venäjän ilvesten geneettinen muuntelu vaikuttaisi olevan runsainta, koska vain 11 yksilöstä laskettuna populaation geenidiversiteetti (H e = 0,70) oli suurempi kuin muualla Euroopassa, ja niissä esiintyi kuusi privaattialleelia (Rueness ym. 2003a). Suurissa yhtenäisissä populaatioissa esiintyy yleensä paljon muuntelua (Frankham ym. 2002, s ), ja laajan euraasialaisen esiintymisvyöhykkeen ilveksistä suurin osa elää Venäjällä (Kojola 2003). Suomen ilvekset esiintyvät lajin levinneisyysalueen länsireunalla, jossa muuntelun määrä voi olla 59

60 vähäisempää kuin levinneisyysalueen ydinalueilla esiintyvillä populaatioilla (Schwartz ym. 2003, Gaines ym. 1997). Suomen ilveksen geneettinen muuntelu ei ollut suurempaa, kuin muiden suomalaisten suurpetojen, vaikka suurempi populaatiokoko antaisi sellaista olettaa. Suteen verrattuna ilveksen muuntelu oli samaa luokkaa (Aspi ym. 2006), mutta jäi huomattavasti pienemmäksi karhulla havaitusta muuntelun määrästä: karhun geenidiversiteetti oli Pohjois-Suomen populaatiossa 0,84 ja Etelä- Suomen populaatiossa 0,77 (A. Kopatz, julkaisematon tieto). Erilaiset tulokset voivat selittyä käytettyjen lokusten eriasteisesta muuntelevuudesta, mutta toisaalta työssä käytetyt lokukset ovat paljastaneet muilla kissaeläimillä huomattavaa muuntelua (Hellborg ym. 2002). Onkin esitetty, että Pohjois-Euroopan ilvesten kohtalainen muuntelu voisi johtua sen levittäytymisestä yhdestä jääkauden aikaisesta refugiasta välimeren seudulta (ks. lisätietoja Hellborg ym. 2002, Gugolz ym. 2008), tai suurpetojen voimakkaan metsästyksen aiheuttamasta kannan romahduksesta (Hellborg ym. 2002). 4.3 Populaatiorakenne Fennoskandiassa Suomi Vilkasliikenteiset tiet voivat estää ilveksen geenivirtaa (Kramer-Schadt ym. 2004), mutta tällaisia esteitä tuskin esiintyy suuressa mittakaavassa Suomessa. Maantieteellisten ja historiallisten tekijöiden lisäksi myös ekologiset tekijät, kuten ravinto tai ympäristöolot, voivat rajoittaa geenivirtaa, ja saada aikaan populaation sisäistä alueellista erilaistumista (Pilot ym. 2006, Stenseth ym. 2004, Charmichael ym. 2001). Erityisesti suuren dispersaalikyvyn omaavilla suurilla ja keskisuurilla petonisäkkäillä, joilla maantieteelliset etäisyydet eivät välttämättä rajoita geenivirtaa, voivat ekologiset tekijät olla vaikuttamassa paikallisen geneettisen rakenteen syntymiseen (Pilot ym. 2006). Suomen ilveksenkin populaatiorakenteen tutkimiseen käytettyjen bayesilaisten ryhmittelymenetelmien pitäisi suoriutua kohtalaisen hyvin populaatiorakenteen selvityksestä, kun ryhmien välinen erilaistuminen on vähintään kohtalaista (F ST = 0,03 0,05), ja ryhmien välisen erilaistumisen kasvaessa yksilöiden ryhmittelyn tarkkuus lisääntyy (Latch ym. 2006). Simulaatioihin perustuvissa tutkimuksissa satunnaistettua optimointia käyttäneen menetelmän on havaittu tunnistavan todellisen populaatiorakenteen varsin hyvin (Latch ym. 2006, Waples & Gaggiotti 2006), mutta luonnon populaatioita koskevissa tutkimuksissa menetelmän muodostamat 60

61 ryhmät eivät ole vastanneet todellisia alapopulaatioita (Aspi ym. 2006, Rowe & Beebee 2007). Myöskään tässä työssä optimaaliset ryhmät eivät vastanneet maantieteellisiä alueita, joten luultavasti mallipohjaisen ryhmittelymenetelmän tulos kuvaa paremmin ilvesten geneettistä rakennetta Suomessa. Suomen ilvespopulaatio oli myös kokonaisuudessaan HW-tasapainossa, eikä Monmonierin algoritmia käyttävän menetelmän mukaan Suomessa esiintynyt geneettisiä rajoja merkittävässä mittakaavassa. Erillisten alapopulaatioiden sijaan Suomen ilvesten geneettisessä rakenteessa oli havaittavissa ainakin jonkin asteista erilaistumista maantieteellisten etäisyyksien takia. Sekä regressioanalyysissä, että spatiaalisessa autokorrelaatioanalyysissä havaittiin maantieteellisen etäisyyden kasvaessa yksilöiden välisen sukulaisuuden laskevan. Koska Suomen populaatiorakenne näytti seuraavan etäisyysisolaation mallia, aineistosta voitiin laskea naapuruston koko ja ala. Naapuruston ala oli pieni, noin km 2, eli vajaa puolet Itä-Suomen läänin koosta, ja naapuruston koko oli 128,9 yksilöä. Tämä oli hieman pienempi, mutta kuitenkin samaa suuruusluokkaa, kuin Suomen ilvesten efektiiviseksi populaatiokooksi arvioitu 145,3 yksilöä. Naapuruston koon biologista merkitystä on epäilty (Rousset 1997), mutta arvioiden samankaltaisuus tukee edelleen ajatusta, ettei Suomessa esiinny populaation sisäistä rakennetta, vaan ilvekset muodostavat yhtenäisen kokonaisuuden. Naapuruston koon perusteella arvioitu keskimääräinen dispersaalietäisyys oli 115,4 km. Suomen ilveksien dispersaalietäisyyksiä ei ole arvioitu radioseurannan avulla, mutta saatu arvio oli muualla Euroopassa raportoitujen keskimääräisiä dispersaalietäisyyksiä suurempi. Esimerkiksi Sveitsissä ilveksen keskimääräinen dispersaalietäisyys on ollut juravuorissa 63,1 km ja Alpeilla 29,5 km (Zimmermann ym. 2005), ja Norjassa 42 km (Sunde ym. 2000a). Suomalaisen suden dispersaalietäisyyksiä on arvioitu radioseurannan avulla (Kojola ym. 2006b), ja myös geneettisestä aineistosta regression avulla etäisyysisolaatioon perustuen (Aspi ym. 2006). Näiden tutkimusten arviot suden keskimääräisestä dispersaalietäisyydestä olivat hyvin samanlaiset: 98,5 km ja vastaavasti 97,3 km. Tämän perusteella näyttäisi siltä, että normaalijakaumaoletusta hyväksi käyttäen voidaan arvioida keskimääräistä dispersaalietäisyyttä. Ilveksen dispersaalikyky Suomessa näyttäisi olevan riittävä säilyttämään yhtenäisen populaatiorakenteen, eikä Suomessa esiinny esimerkiksi ekologisia geenivirtaa rajoittavia tekijöitä. Kuitenkin rajallisten dispersaalietäisyyksien, ja Suomen suuren maantieteellisen koon takia, on syntynyt etäisyydestä johtuvaa erilaistumista. 61

62 4.3.2 Skandinavia Skandinavian niemimaan ilvesten geneettinen rakenne seuraa etäisyysisolaation mallia (Hellborg ym. 2002), mutta niemimaan eri alueiden välinen erilaistuminen (Rueness ym. 2003a) on huomattavaa ottaen huomioon alueen pienen mittakaavan (Rueness ym. 2003b). Skandinaviasta voitiinkin geneettisin perustein muodostaa kolme alapopulaatiota, joihin yksilöt kuuluivat suurella todennäköisyydellä. Tässä työssä mallipohjaisen bayesilaisen ryhmittelymenetelmän (Pritchard ym. 2000) yleisen mallin tulosten perustella muodostettiin geneettisesti perusteltu ryhmittely kolmeen alapopulaatioon. Kun tätä ryhmittelyä käytettiin ennakkotiedon käytön sallivassa mallissa, havaittiin, että yksilöt kuuluivat niistä muodostettuihin alapopulaatioihin suurella todennäköisyydellä. Mallipohjaisen menetelmän ennakkotiedon käytön salliva malli kylläkin olettaa, että aineistosta muodostettu ryhmittely vastaa hyvin todellista tilannetta (Pritchard ym. 2007), joten alapopulaatioiden rajat tuskin todellisuudessa ovat niin jyrkkärajaisia, kuin tässä työssä käytetty jako varsinkaan pohjoisempien alapopulaatioiden osalta. Todennäköisemmin alapopulaatiot sulautuvat toisiinsa ydinalueidensa ulkopuolella (Rueness ym. 2003a). Tällöin keskiosan alapopulaation rajaamisen vaikeus voi aiheuttaa sen, ettei se ollut HW-tasapainossa, ja kytkentäepätasapainoa esiintyi useamman lokuksen välillä. Keskiosan positiivinen sukusiitoskerroin osoitti myös, että alueella esiintyi puutetta heterotsygooteista, ja tämä voi johtua Wahlundin ilmiöstä. Esimerkiksi Rueness ym. (2003a) havaitsivat positiivisen sukusiitoskertoimen keskiosan alapopulaatioon lukeutuvassa N3 ryhmässä, jonka arveltiin johtuvan paikallisesta populaatiorakenteesta. Skandinavian alapopulaatioiden välille lasketut F ST -arvot osoittivat alapopulaatioiden erilaistumisen olevan huomattavaa. Pohjois- ja eteläosan alapopulaatioiden välinen erilaistuminen (F ST = 0,091) oli suurempaa kuin esimerkiksi Skandinavian ja Venäjän naalipopulaatioiden välinen erilaistuminen (F ST = 0,082) (Nyström ym. 2006). Skandinavian niemimaalla esiintyvän alueellisen erilaistumisen on esitetty johtuvan ilvesten kotipaikkauskollisuudesta (Rueness ym. 2003a), mutta myös monet ekologiset tekijät, maantieteellisiä ja historiallisia tekijöitä unohtamatta, rajoittavat geenivirtaa (Pilot ym. 2006, Stenseth ym. 2004, Carmichael ym. 2001). Myöskään ihmisen vaikutusta ei täysin voida unohtaa, sillä Skandinaviassa suurin osa nuorten ja aikuisten ilvesten kuolemista aiheutuu ihmisen toiminnasta (Andren ym. 2006). Yhden selittävän tekijän etsiminen ei välttämättä ole tarkoituksenmukaista, sillä useiden tekijöiden yhteisvaikutus voi lopulta johtaa rajoittuneeseen 62

63 geenivirtaan, saaden aikaan populaatiossa havaittavan geneettisen erilaistumisen (Pilot ym.2006, Hillborn & Stearns 1982) Fennoskandian populaatiorakenne ja geneettinen erilaistuminen Tämän työn tulokset vahvistivat jo aiemmin havaitun huomattavan erilaistumisen Suomen ja Skandinavian välillä (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a), mutta toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa, tässä työssä geneettisen erilaistumisen havaittiin kasvavan Suomen ja Skandinavian alapopulaatioiden välillä Skandinavian niemimaan eteläkärkeä kohti. Suomen ja Skandinavian välinen voimakas erilaistuminen tuskin kuitenkaan selittyy kokonaan etäisyysisolaatiolla, ottaen huomioon erilaistumisen voimakkuuden jo Suomen ja Skandinavian pohjoisosan välillä, vaan luultavasti myös muut tekijät ovat geneettisten erojen taustalla. 4.4 Sukusiitos Suomessa ja Skandinaviassa Pienessä populaatiossa sukusiitos on väistämätöntä ja menneisyydessä tapahtunut sukusiitos ei katoa, vaikka populaatiokoko kasvaisikin (Frankham ym. 2002, s ). Suomen ilvekset eivät vaikuttaneet sukusiittoisilta niille lasketun sukusiitoskertoimen perusteella (F IS = 0,011). Lisäksi Suomen ilvekset olivat myös Hardy-Weinberg-tasapainossa, joten tämänkään testin mukaan populaatiossa ei esiintynyt sukusiitoksesta aiheutuvaa homotsygoottien ylimäärää. Suomen ilveksen populaatiokoko on kasvanut tasaisesti 1990-luvun puolivälistä lähtien, ja kannan kasvu on edelleen jatkunut vakaana (Kojola ym. 2005). Myös pentueiden lukumäärä on lisääntynyt lähes joka vuosi (I. Kojola, joten lajin ekologiseen tietoon perustuen ei olekaan todennäköistä, että Suomessa esiintyy sukusiitosta. Skandinavian koko populaatiolle laskettu sukusiitoskerroin oli positiivinen (F IS = 0,074) ja tilastollisesti merkitsevä, samoin keskiosan alapopulaation (F IS = 0,063). Kuitenkin sukusiitoksen sijaan, nämä tulokset johtuvat luultavammin Wahlundin ilmiöstä, joten päätös jakaa Skandinavia kolmeen erilliseen alapopulaatioon vaikuttaa perustellulta. Pohjois- ja eteläosan alapopulaatioille lasketut sukusiitoskertoimet (F IS = 0,048 ja F IS = 0,047) olivat samaa suuruusluokkaa, mutta merkiltään vastakkaiset. Ne eivät kuitenkaan olleet tilastollisesti merkitsevät eli ovat voineet syntyä vain sattuman vaikutuksesta. Skandinavian alapopulaatiot eivät näyttäneet tässä tarkastelussa sukusiittoisilta, vaan poikkeamat selittynevät mahdollisella alapopulaation sisäisellä rakenteella, sekä alapopulaation rajaamisen vaikeudella. 63

64 4.5 Fennoskandian ilvesten mahdolliset pullonkaulat Geneettisen pullonkaulan aikana populaation efektiivinen koko pienenee huomattavasti, ja sattuma pääsee vaikuttamaan populaatiossa esiintyvän muuntelun määrään. Silloin harvinaiset alleelit karsiutuvat suurella todennäköisyydellä, ja populaatio menettää geneettistä muuntelua samalla kun se erilaistuu geneettisesti muista populaatioista. Esimerkiksi Skandinavian susipopulaation on havaittu hyvin lyhyessä ajassa erilaistuneen itäisestä lähdepopulaatiostaan perustajan vaikutuksen takia (Vila ym. 2003). Myös pullonkaulan kokenut Skandinavian naali on tänä päivänä huomattavasti erilaistuneempi Venäjän naalipopulaatiosta, kuin sen historiallinen populaatio (Nyström ym. 2006). Toisin kuin historialliset tiedot antaisivat olettaa, Suomen populaation alleelifrekvenssien jakauma noudatti vakaassa populaatiossa esiintyvää L-muotoista jakaumaa, eikä tilastollinen testaus havainnut heterotsygotian ylimäärää. Tulosten perustella näyttäisi siltä, ettei Suomen ilvespopulaatio ole kokenut pullonkaulaa, tai ainakaan pullonkaula ei ole ollut vakava. Cornuet & Luikart (1996) ovat arvioineet, että jos efektiivinen populaatiokoko laskee 50 yksilöön, pullonkaulan tulisi näkyä heterotsygotian ylimääränä vielä sukupolven kuluttua. Jos ilveksen sukupolven pituus on 4,1 vuotta (Boman 1995), niin 1950-luvun alkuun sijoittuneen pullonkaulan pitäisi vielä olla nähtävissä. Myös alleelifrekvenssijakauman muutos pitäisi olla nähtävissä muutaman kymmenen sukupolven ajan (Luikart ym. 1998). Skandinavian alapopulaatioista ei löytynyt merkkejä populaation pullonkauloista, vaikka ilveskanta on käynyt pienenä myös Skandinaviassa, ja esimerkiksi Skandinavian ahman alapopulaatioissa on havaittu pullonkaulan vaikutus (Walker ym. 2001). Hellborg ym. (2002) havaitsivat Skandinavian ilveksiä tutkiessaan merkkejä pullonkaulasta koko niemimaan käsittäneessä tarkastelussa, vaikka sitä ei ole saatu vahvistettua kaikilla pullonkaulan testaamiseen käytettävissä olevilla menetelmillä (Spong & Hellborg 2002). Pullonkaulan havaitsematta jääminen voi johtua käytetyistä geneettisistä menetelmistä (Spong & Hellborg 2002), sillä pullonkaulan havaitseminen geneettisestä aineistosta ei ole ongelmatonta testaukseen liittyvien lukuisten oletusten takia. Molemmat käytetyt menetelmät olettavat, että tutkittava populaatio on muista populaatioista erillinen, eikä siihen saavu immigrantteja tai esiinny alapopulaatiorakennetta (Cornuet & Luikart 1996, Luikart ym. 1998). Suomen ilvespopulaatio tuskin täyttää näitä oletuksia ainakaan migraation osalta (MMM 1996), ja esimerkiksi Suomen sudella juuri migraation on todennäköisesti peittänyt geneettiset merkit kannan kokemasta pullonkaulasta (Aspi ym. 2006). Myös Skandinavian alapopulaatioiden tapauksessa niiden välinen 64

65 migraatio, sekä myös alapopulaatioiden rajaamisen vaikeus vioittivat ohjelmien oletuksia varsinkin pohjoisemmissa alapopulaatioissa. Toisaalta pullonkaula saattoi jäädä havaitsematta aineistosta testin riittämättömän voimakkuuden takia, sillä Spong & Hellborg (2002) havaitsivat, että 10 lokusta ei välttämättä riitä tilastollisesti merkitsevän tuloksen saavuttamiseen suurellakaan näytemäärällä, vaikka se täyttääkin käytettyjen menetelmien vähimmäissuosituksen (Piry ym. 1999). 4.6 Suomen ja Skandinavian ilvesten efektiivinen populaatiokoko Suomen ilvespopulaation lähiajan efektiivistä kokoa arvioitiin kahdella erilaisella menetelmällä, joiden keskiarvona saatiin estimaatti N e = 145,3. Tämä on huomattavasti pienempi kuin ilvesyksilöiden lukumäärä Suomessa, vain noin 13 % koko kannan yksilömäärästä. Toisaalta Nunney ja Elam (1994) ovat esittäneet, että kyseisen suhteen laskemisessa olisi parempi käyttää aikuisten yksilöiden lukumäärää kannan kokonaismäärän sijaan, koska aikuisten yksilömäärä pysyy populaatiossa vakaampana kuin nuorten, ja nuoret yksilöt eivät ole vaikuttamassa evolutiivisesti tärkeään populaatiokokoon. Tätä suhdetta olisi mahdollista käyttää eri populaatioiden efektiivisten populaatiokokojen vertailuun (Nunney & Elam 1994), mutta Suomen ilveksistä ei ollut saatavilla kyseistä tietoa. Jo lisääntyvien naaraiden lukumäärän perusteella nähtiin, että Suomen ilvesten efektiivinen populaatiokoko oli pienempi kuin lisääntyvien yksilöiden määrä. Suomessa ei esiintynyt sukusiitosta tai alapopulaatiojakoa, ja Suomessa on suunnilleen saman verran uroksia ja naaraita (kojola 2003), joten todennäköisesti muut tekijät laskevat populaation efektiivistä kokoa. Esimerkiksi ilveksen polygyninen pariutumisjärjestelmä voi johtaa efektiivisen populaatiokoon laskuun demografisten tekijöiden lisäksi (Caballero 1994). Toisaalta käytetyt menetelmät olettavat, ettei populaatioon saavu immigraatiota (Waples 2006, Tallmon ym. 2008), ja tämän oletuksen vioittuessa estimaatit ovat aliarvioita todellisesta efektiivisestä populaatiokoosta. Myös kasvavassa populaatiossa kytkentäepätasapainoon perustuva menetelmä voi aliarvioida efektiivistä populaatiokokoa muutaman sukupolven verran (Waples 2006), ja Suomen ilveskannan kehitys on ollut nousujohteista 1990-luvun alkupuolelta lähtien (Kojola ym. 2005). Skandinavian niemimaalla alapopulaatiot eivät ole jyrkkärajaisia, joten erityisesti keskiosan alapopulaation N e -estimaattia voidaan pitää pikemmin suuntaa antavana. Molempien menetelmien antamien estimaattien perusteella Skandinavian eteläosan alapopulaation efektiivinen koko oli pienin, keskimäärin 26,7 yksilöä. Bayesilaispohjaisen menetelmän N e -estimaateissa suuntaus oli 65

66 sama kuin geneettisessä muuntelussa, eli efektiivinen populaatiokoko laski niemimaan eteläkärkeä kohti. Sen sijaan keskimääräiseen kytkentäepätasapainoon perustuvan menetelmän mukaan keskiosan N e oli suurin. Pohjoisosasta laskettu kytkentäepätasapainon mukainen N e -estimaatti oli lähes samansuuruinen kuin alueelta käytettävissä ollut näytekoko. England ym. (2006) ovat arvioineet, että kytkentäepätasapainoon perustuvan menetelmän arvioita voidaan pitää luotettavina silloin, kun estimaatti on samaa luokkaa tai pienempi kuin näytekoko. Tässä työssä käytettiin Waplesin (2006) LD-menetelmään kehittämää korjausta harhattomien estimaattien saavuttamiseksi. Menetelmä on kuitenkin uusi, eikä sen toimivuutta luonnon oloissa ole toistaiseksi arvioitu, joten ei voida olla varmoja olisiko suuremmalla näytekoolla saavutettu suurempi arvio Skandinavian pohjoisosan efektiivisestä populaatiokoosta. Pidettäessä mielessä efektiivisen populaatiokoon ja geneettisen muuntelun määrän läheinen yhteys (Reed & Frankham 2003), vaikuttaisi luotettavammalta seurata bayesilaisen menetelmän osoittamaa suuntaa, jolloin Skandinavian pohjoisosan alapopulaatio olisi efektiiviseltä kooltaan suurin. Suomen ja Skandinavian välisiä efektiivisiä populaatiokokoja ei ehkä ole mielekästä vertailla, koska Skandinaviassa laskettiin efektiivinen populaatiokoko niemimaan alapopulaatioille, kun taas Suomessa arvioitiin koko maan ilvesten efektiivistä kokoa. Vaikka Suomessa ei havaittu populaation sisäistä rakennetta, oli kuitenkin havaittavissa etäisyydestä johtuvaa geneettistä erilaistumista, joka voi laskea Suomen N e -estimaattia (Caballero 1994). Tämän lisäksi migraatio voi vaikuttaa efektiivisen populaatiokoon arvioihin sekä Suomessa että Skandinaviassa. Efektiivinen populaatiokoko kuvaa sattuman vaikutuksen voimakkuutta populaatiossa esiintyvään muunteluun, ja se vaikuttaa populaation lyhyen ja pitkän ajan selviämiseen (Lynch ym. 1995), joten efektiivisen populaatiokoon selvittäminen on tärkeää populaation uhanalaisuuden arvioimiseksi. Lisääntymiskelpoisuuden säilyttämiseksi efektiivisen populaatiokoon tulisi olla vähintään 50 yksilöä, mutta evolutiivisen potentiaalin säilyttämiseksi ja haitallisten mutaatioiden kertymisen ehkäisemiseksi tarvittavan efektiivisen populaatiokoon arviot vaihtelevat yksilöön (ks. Frankham ym. 2002, s ). Koska efektiivinen populaatiokoko on pääsääntöisesti huomattavasti pienempi, kuin populaation yksilömäärä (N e /N 0,4) (Hedrick ym. 2005, s. 333), tulisi kannan koon olla useita tuhansia yksilöitä populaation tulevaisuuden turvaamiseksi. Tässä työssä saavutettuja tuloksia voidaan pitää suuntaa antavina ja näyttäisikin siltä, että lyhyellä aikavälillä Fennoskandian ilvesten tulevaisuus ei ole uhattuna muualla kuin Skandinavian eteläosan alapopulaatiossa. Sen sijaan pitkällä aikavälillä ilvesten lukumäärä ei näyttäisi olevan riittävä. Erityisesti Skandinavian niemimaan ilvesten tulevaisuus riippuu alueen sisäisen, ja muualta 66

67 saapuvan migraation vaikutuksesta, sillä Skandinaviassa harjoitettavien elinkeinojen takia ilveskannan koko on säätelyn alaisena (Liberg & Andren 2004, Linnell & Brøseth 2004). 4.7 Migraatio Perinteisten geneettisten menetelmien käyttöä migraation tutkimiseen on arvosteltu niiden epätodellisten oletusten takia (Whitlock & McCauley 1999), mutta tarpeeksi kattavalla aineistolla niiden arvioita voidaan pitää suuntaa-antavina (Neigel 1997). Suomen ja Skandinavian välinen geenivirta oli privaattialleelien perusteella vielä vähäisempää, kuin mitä aiemmin on havaittu (Hellborg ym. 2002). Mahdollisesti tämä kuvaa Suomen ja Skandinavian kantojen romahdusta edeltävällä ajalla esiintynyttä geenivirtaa (Hellborg ym. 2002), mutta voi myös johtua kantojen pienestä koosta 1900-luvulla. Jos privaattialleelien perusteella havaittu Suomen ja Skandinavian välinen vähäinen geenivirta johtui kantojen romahduksesta ja pienestä koosta 1900-luvulla, ei nykyisin tapahtunut kantojen toipuminen ja levittäytyminen takaisin entisille elinalueille näyttäisi lisänneen geenivirtaa. Suomen ja Skandinavian välillä havaittiin luokittelumenetelmällä vain yksi migrantti. Kun otetaan huomioon ilveksen hyvä dispersaalikyky, voisi ajatella geenivirran jo toipuneen Suomen ja Skandinavian välillä, jos se muinoin olisi ollut runsasta, joten mahdollisesti geenivirta ei ole koskaan ollut runsasta Suomen ja Skandinavian välillä (Hellborg ym. 2002). Skandinavian pohjoisosa oli huomattavan erilaistunut Suomesta (F ST = 0,183), joten migranttien pitäisi olla tunnistettavissa geneettisesti, sillä luokittelumenetelmän on havaittu suoriutuvan migranttien tunnistuksesta hyvin jo silloin, kun F ST ~ 0,070 (Berry ym. 2004). Skandinavian sisällä alapopulaatioiden välillä esiintyi geenivirtaa, mutta se oli korostunutta vierekkäisten alapopulaatioiden välillä. Migraatio näytti runsaammalta pohjoisempien alapopulaatioiden välillä, ja eteläosan alapopulaatioon oli saapunut vain yksi immigrantti, joka oli todennäköisesti peräisin niemimaan pohjoisosasta. Myös privaattialleelimenetelmällä alapopulaatioiden välille lasketut geenivirran estimaatit (tietoja ei esitetty) osoittivat, että geenivirta oli vähäistä eteläosan ja kahden muun alapopulaation välillä, ja runsaampaa pohjoisempien alapopulaatioiden välillä. Ilveksellä nuoret naaraat voivat jäädä aikuistuessaan synnyinpaikkansa läheisyyteen, mutta molempien sukupuolten on myös havaittu dispersoivan (mm. Zimmermann ym. 2005). Nisäkkäillä urokset ovat yleensä dispersoiva sukupuoli (Greenwood 1980), ja ilveksellä urosten dispersaalietäisyydet ovat yleensä pidempiä (Zimmermann ym. 2005, Schmidt 1998). Tässä työssä havaittu migrantti oli naaras, mutta tämän perusteella ei kuitenkaan voida arvioida eroja 67

68 sukupuolten välisessä dispersaalikäyttäytymisessä, koska yksittäinen havainto voi johtua vain sattumasta. Myöskään yksilön ikää ei tiedetty, joten ei voi arvioida oliko kyseessä lähiaikoina saapunut nuori yksilö vai mahdollisesti jo lisääntynyt naaras. Suomeen mahdollisesti idästä ja kaakosta saapuvaa migraatiota ei voitu tutkia samalla menetelmällä kuin Suomen ja Skandinavian väliltä, koska tutkimuksessa ei ollut käytettävissä näytteitä Venäjän tai Baltian ilvespopulaatiosta. Tällaisia immigrantteja pyrittiin tunnistamaan itseluokittelumenetelmällä, jonka tulisi paljastaa populaatioon kuulumaton yksilö tämän monilokusgenotyypin perusteella. Yllättävää kyllä, aineistosta ei löytynyt yhtäkään todennäköistä immigranttia, vaikka liikehdintää Suomen ja Venäjän rajojen molemmin puolin on tapahtunut luvulta vuosittain, ainakin vielä 1990-luvulle tultaessa (MMM 1996). Geenivirta Suomeen kauempaa Venäjältä on mahdollista kolmen kannaksen kautta, mutta Karjalan ja Leningradin alueen ilveskannat ovat jonkin verran taantuneet (Kojola 2003). Migraatio Suomeen voi tämän takia olla vähäisempää, sillä juuri näillä alueilla Suomen ja Venäjän väliset rajanylitykset ovat olleet vilkkaimpia (MMM 1996). Toisaalta ilveskanta alkoi runsastua Suomessa voimakkaasti 1970-luvun lopulla (MMM 1996), ja muuttovoitto idästä voi osin selittää kannan toipumista. Tällöin idästä saapuneiden ilvesten perimä voi olla Suomessa niin voimakkaana, ettei käytetyllä menetelmällä voitu tunnistaa Venäjältä tai Baltiasta mahdollisesti saapuneita immigrantteja. Käytetty itseluokittelumenetelmä oli heikompi testi, kuin Skandinavian ja Suomen välillä suoritettu luokittelu (Piry ym. 2004), eikä se tunnistanut edes Suomen ja Skandinavian välistä immigranttia. Tämä todennäköinen immigrantti sai kyllä pienimmän todennäköisyyden kuulua populaatioon (8,7 %), mutta se ei ollut testille asetetun tiukkuusrajan mukaan tilastollisesti merkitsevä. Suomen ja Skandinavian populaatioiden välillä oli huomattavaa erilaistumista, mutta Suomen ja itäisten ilvesten välinen erilaistuminen on vähäisempää (Hellborg ym. 2002, Rueness ym. 2003a). Luokittelumenetelmän tarkkuus paranee kun populaatioiden välinen erilaistuminen kasvaa (Berry ym. 2004), ja koska itseluokittelutesti ei pystynyt tunnistamaan edes Skandinaviasta saapunutta migranttia, ei ilmeisesti ollut mahdollista tunnistaa itärajan ylittäviä migrantteja ilman näytteitä mahdollisista lähdepopulaatioista. Toisaalta, itseluokittelumenetelmällä Suomesta löytyi Skandinavian immigrantin lisäksi kahdeksan yksilöä, joiden todennäköisyys kuulua Suomen ilvespopulaatioon oli alle 20 %. Nämä eivät täyttäneet testille asetettua hylkäämisrajaa, mutta ottaen huomioon, että edes Skandinaviasta saapunut todennäköinen immigrantti ei saanut tilastollisesti merkitsevää arvoa, sitä tuskin saavutettiin idästäkään saapuville immigranteille. Näiden kahdeksan 68

69 yksilön maantieteellisen sijainnin tarkastelu osoitti, että ne sijaitsivat itärajan läheisyydessä akselilla Uusimaa-Kainuu. Yksi yksilö oli peräisin aivan itärajan tuntumasta Sallasta. 4.8 Migraation vaikutus Fennoskandiassa ja tulevan tutkimuksen tarve Suomen ilveskannan kohtalosta 1900-luvun puolivälissä ei ole varmaa tietoa, ja historialliset tiedot sekä tämän työn geneettiset tulokset ovat osin ristiriitaisia. Voidaan esittää kolme vaihtoehtoa: 1) kanta ei ole käynyt niin pienenä, että sillä olisi ollut vaikutusta populaatiossa havaittavaan muuntelun määrään, 2) kanta on käynyt pienenä, mutta migraatio on palauttanut populaatioon sen menettämää muuntelua, 3) kanta on lähtöisin naapurimaista saapuneista immigranteista. Historiallisten tietojen ja useiden asiantuntijamielipiteiden perusteella voidaan pitää lähes varmana, että ilveskanta on käynyt Suomessa pienenä (Pulliainen 1974, s , Ermala 2003, MMM 2007). Pullonkaulan havaitsematta jääminen geneettisestä aineistosta, samoin kuin myös sukusiitoksen, voi johtua immigraatiosta, joka on palauttanut populaatioon sen menettämää muuntelua. Tätä tukee myös Suomen ilveksen Euroopan mittakaavassa runsas muuntelu, sekä runsaana esiintyneet harvinaiset alleelit (kuvaaja 3.3). Suomen ilveksen alkuperän selvittämiseksi tarvittaisiin tietoa pullonkaulaa edeltäneiden ilvesten geneettisestä muuntelusta, joten ilman historiallisia näytteitä ei voida arvioida suomalaisen ilveksen alkuperää. Työssä saatiin alustavaa kuvaa Suomeen saapuvasta geenivirrasta itärajan kautta, mutta tarkempi tutkimus vaatisi näytteitä immigranttien mahdollisista lähdepopulaatioista. Suomessa geenivirta näytti olevan riittävää alueellisen erilaistumisen estämiseksi, eikä maan eri osien ilvesten erilaisen ravinnon havaittu johtaneen geneettiseen erilaistumiseen. Skandinaviassa sen sijaan geenivirta on todennäköisesti rajoittunutta, koska havaittiin rakentumista erillisiin alapopulaatioihin. Erityisesti eteläosan alapopulaatio vaikutti eristyneemmältä pohjoisemmista alapopulaatioista vähäisemmän migraation vuoksi. Tämä on voinut johtaa muuntelun menetykseen pienessä populaatiossa sattuman vaikutuksesta, sillä eteläosassa oli huomattavan vähän geneettistä muuntelua. Skandinavian pohjoisosan alapopulaatio oli geneettisesti monimuotoisin, ja siellä esiintyi Skandinavian niemimaan ilveksiä tarkasteltaessa kolme privaattialleelia. Pohjoisosan suurempi muuntelun määrä ja privaattialleelien esiintyminen voisivat johtua siitä, että 1900-luvulla ilveskannan romahduksen aikaan ilveksiä säilyi myös niemimaan pohjoisosassa (Rueness ym. 2003a), mutta toisaalta pohjoisosassa esiintyneet, Skandinavian ilveksille privaatit alleelit, löytyivät myös Suomen ilveksiltä. Näin ollen pohjoisosan suurempi muuntelun määrä voisi johtua siitä, että pohjoisosaan saapuu jonkun verran migraatiota idästä, vaikka sitä ei havaittukaan tässä työssä, mutta sen edulliset vaikutukset eivät ulotu niemimaan eteläkärkeen saakka. Rueness ym. (2003) havaitsivatkin 69

70 Skandinavian pohjoisosassa kaksi todennäköistä immigranttia, jotka olivat mahdollisesti peräisin Venäjältä tai Suomesta. Eteläosan muuntelun menetys, ja Skandinavian pohjoisosaan vähäisen migraation myötä saapuva muuntelu, joka ei kuitenkaan levittäydy eteläosaan saakka, voisivat osaltaan olla selittämässä Skandinavian pohjois- ja eteläosan välisen huomattavan erilaistumisen. Riittävän migraation määrä populaatioiden välisen geneettisen erilaistumisen ehkäisemiseksi on saanut erilaisia suosituksia (Lacy 1987, Vucetich & Waite 2000), joten on vaikea arvioida, onko Skandinavian alapopulaatioiden välinen geenivirta riittävää estämään voimakkaamman erilaistumisen tulevaisuudessa. Skandinavian ilvesten geneettisen muuntelun määrä oli vähäistä Euroopan alkuperäispopulaatioksi, ja se voi johtua kahdesta tekijästä. Todennäköisesti 1900-luvulle ajoittunut pullonkaula on vähentänyt populaation muuntelun määrää (Hellborg ym. 2002), eikä myöhemmin vähäinen migraatio ole suuressa mittakaavassa palauttanut populaatioon sen menettämää muuntelua. Suomen ja Skandinavian välinen geenivirta on aina voinut olla vähäistä, mutta tässäkin työssä havaittu voimakas erilaistuminen varmasti osaltaa selittyy kantojen voimakkaalla laskulla 1900-luvun alkupuoliskolla. Tällöin sattuma on saanut aikaan geneettistä erilaistumista (Hellborg ym. 2002), eikä myöhemmin vähäinen migraatio ole lievittänyt sitä. Suomen ja Skandinavian välinen eteläkärkeä kohti kasvava voimakas geneettinen erilaistuminen voi osoittaa, että migraatiota tapahtuu vähän ja sen vaikutus vähenee etelää kohti. Jostain syystä Suomen Lappi näyttäisi rajoittavan geenivirtaa Skandinaviaan. Syyt voivat liittyä alueen ilvekselle sopimattomampaan elinympäristöön, mutta toisaalta alueella harjoitetaan myös poronhoitoelinkeinoa (Hellborg ym. 2002). Tämän lisäksi Suomen ja Ruotsin rajalla kulkee Torniojoki, ja esimerkiksi Kanadan susilla MacKenzie-joen on havaittu jonkin verran rajoittavan geenivirtaa (Carmichael ym. 2001). Työssä tutkittiin Skandinavian geneettistä muuntelua erillisissä alapopulaatioissa, ja tulokset antoivat varmasti yleiskuvaa muuntelun määrästä ja populaatiorakenteesta Skandinaviassa. Näyttäisi kuitenkin siltä, että Skandinavian rakenne voi olla monimutkaisempi, ja hierarkkisesti ajateltuna käsittää useampia tasoja. Tarkemman kuvan saamiseksi tulisi varmaankin käyttää erilaisia menetelmiä, kuin millä toistaiseksi on tutkittu niemimaan populaatiorakennetta. Koska Skandinavian ilveksistä on vuosittaisen metsästyksen ansiosta saatavilla tutkimusaineistoa, voisi esimerkiksi kattavaan otantaan ja liikkuvaan ikkunaan perustuva uusi luokittelumenetelmä (Manel ym. 2007) tuoda lisätietoa Skandinavian ilvesten populaatiorakenteesta. 70

71 4.9 Suositukset Suomessa ilveskanta on suurpedoista suurin, mutta sen geneettinen muuntelu oli kuitenkin samaa tasoa, tai jopa vähäisempää kuin muiden suomalaisten suurpetojen. Lisäksi ilveksen huomattavan pieni efektiivinen populaatiokoko osoitti, ettei riistakannan kokoa tule arvioida pelkästään yksilömäärän perusteella. Toisaalta työn arviota efektiivisestä populaatiokoosta voidaan pitää vasta suuntaa-antavana, koska mahdollisesti idästä saapuva migraatio voi kasvattaa populaation todellista efektiivistä kokoa. Nykyinen populaatiorakenne näytti seuraavan etäisyysisolaation mallia, mutta esimerkiksi Sveitsissä on havaittu, että populaatiotiheyden kasvaessa yksilöiden dispersaalietäisyydet lyhenevät (Zimmermann ym. 2005). Itä-Suomessa ilveskanta alkaa olla paikoittain tiheä (Pöri 2008), jolloin keskimääräisen dispersaalietäisyyden lyheneminen voisi mahdollisesti johtaa alueelliseen erilaistumiseen ja sukusiitoksen kasvuun. Itä-Suomen paikallisten asukkaiden sosiaalisen sietokyvyn lisäämiseksi, ja tasaisemman kannan saavuttamiseksi metsästystä on suunniteltu kohdistettavaksi näille tihentymäalueille (Pöri 2008), ja tämä on myös lajin geneettisen hyvinvoinnin kannalta paras ratkaisu. Metsästyksen keskittäminen itärajaan myös luultavasti parantaa maahan saapuvien immigranttien mahdollisuutta perustaa pysyviä elinpiirejä vapautuvien elinalueiden ansiosta. Sudella on havaittu geenivirran nykyisin vähetyneen Suomen ja Venäjän välillä, ja tämän on esitetty osittain johtuvan susikannan kasvun myötä Suomen itärajalla täyttyneistä reviireistä. Sudet eivät siedä vieraita lajitovereita reviirillään, vaan voivat jopa tappaa tunkeilijan, jolloin geenivirta Venäjältä Suomeen estyy reviirin puolustamisen takia (Aspi ym. 2008). Metsästyksen avulla vapautuvien elinpiirien myötä Suomen ilvesten tärkeä yhteys suurempaan mannerpopulaatioon pysyy voimakkaampana, ja laji säilyy elinvoimaisena metsissämme (kuva 4.1). Skandinavian populaatiorakenteen tarkempi selvitys voisi tuoda lisätietoa suojelun kannalta tärkeistä yksiköistä Skandinavian niemimaalla. Skandinavian eteläosan alapopulaatio vaikutti olevan jonkin verran eristynyt pohjoisemmista alapopulaatioista, ja myös sen geneettinen muuntelu oli vähäistä. Kun otetaan vielä huomioon alapopulaation pieni efektiivinen koko, ei sukusiitosheikkouden mahdollista esiintymistä tulevaisuudessa voida sulkea pois. Tämän takia migraatiolla voi olla merkittävä vaikutus jo alapopulaation lyhytaikaisen tulevaisuuden kannalta, joten erilaistumisen voimakkuuden kehitystä tulisi seurata. Skandinavian ilveskannan koon säätelyn takia kannan yksilömäärä tuskin tulee kasvamaan huomattavasti, joten migraatio on tärkeä tekijä myös kannan pitkän ajan selviämisen kannalta. Todennäköisesti geenivirta Skandinaviaan tapahtuu pääasiassa Suomen Lapin kautta. Esimerkiksi vuodelle on Lapin riistanhoitopiirille 71

72 myönnetty viisi ilveksen pyyntilupaa (Anttila & Niemi 2007), joten laillinen metsästyksen ei pitäisi uhata Skandinaviaan mahdollisesti suuntautuvaa geenivirtaa ja säilymistä tulevaisuudessa. Kuva 4.1 Ilves elementissään jäljet kevätlumessa Kuhmon Vuosangassa (kuva Satu Pääkkönen ). 5 YHTEENVETO Fennoskandian ilveskanta on 1900-luvun alkupuoliskolla vähentynyt voimakkaasti sekä Suomessa että Skandinaviassa. Nykyisin kannat ovat toipuneet, ja ilves on levittäytynyt takaisin entisille elinalueilleen. Suomen ja Skandinavian ilveksen geneettisen muuntelun määrää ja populaatiorakennetta tutkittiin kymmenen mikrosatelliittilokuksen avulla kattavasta geneettisestä aineistosta. Työssä käytettiin hyväksi Skandinavian ilveksistä saatavissa olleita tutkimustuloksia, ja Suomen ilvesten osalta suuri aineisto paljasti hieman enemmän muuntelua, kuin mitä aiemmin oli havaittu. Suomen ilvekset muodostivat yhtenäisen kokonaisuuden, josta ei löytynyt merkkejä alapopulaatiorakenteesta tai geneettisistä rajoista. Sen sijaan geneettinen rakenne seurasi 72

73 etäisyysisolaation mallia. Suomessa ilvesten geneettinen muuntelu oli samaa tasoa muiden Euroopan alkuperäispopulaatioiden kanssa, mutta Skandinavian ilvesten geneettinen muuntelu oli vähäisempää. Skandinavian niemimaalla voitiin tunnistaa ainakin kolme alapopulaatiota, jotka eivät olleet jyrkkärajaisia, vaan sulautuivat toisiinsa ydinalueiden ulkopuolella varsinkin niemimaan pohjoisosassa. Suomessa ilveksen dispersaalietäisyydet olivat riittävät säilyttämään yhtenäisen, vaikkakin etäisyysisolaation mallia seuraavan populaatiorakenteen, kun taas Skandinaviassa dispersaalietäisyydet voivat olla rajoittuneita useiden tekijöiden yhteisvaikutuksen takia. Suomesta tai Skandinavian alapopulaatioista ei löytynyt geneettisiä merkkejä pullonkaulasta tai sukusiitoksesta, ja tämä voi selittyä migraation vaikutuksella. Mahdollisesti idästä on saapunut immigrantteja Suomeen, ja ne ovat palauttaneet kannan romahduksen aikaan todennäköisesti menettämää geneettistä muuntelua. Skandinaviassa alapopulaatioiden välillä näytti esiintyvän migraatiota, mutta se oli kuitenkin yleisempää pohjois- ja keskiosan alapopulaatioiden välillä. Alapopulaatioiden välillä oli huomattavia eroja geneettisen muuntelun määrässä. Skandinavian pohjoisosa oli geneettisesti monimuotoisin, ja muuntelun määrä laski niemimaan eteläkärkeä kohti. Skandinavian eteläosan geneettinen muuntelu oli vähäistä, ja koska alapopulaation efektiivinen koko oli pieni ja sinne saapuva migraatiota näytti vähäiseltä, voi sukusiitoksesta koitua haittaa pienen alapopulaation tulevaisuudelle. Suomen ja Skandinavian välinen migraatio oli vähäistä, vaikka ilveskanta on molemmilla alueilla toipunut ja levittäytynyt takaisin entisille elinalueilleen. Suomen ja Skandinavian ilvekset olivat huomattavan erilaistuneita toisistaan. Tämä johtui luultavasti vähäisestä migraatiosta, sekä kantojen romahduksesta molemmilla alueilla, koska jo Suomen ja Skandinavian pohjoisosan ilvekset olivat huomattavan erilaistuneet, ja erilaistumisen voimakkuus alueiden välillä kasvoi Skandinavian niemimaalla etelää kohti. Myös Skandinavian ilvesten vähäisen muuntelun määrän Euroopan alkuperäispopulaatioksi voi johtua kannan romahduksesta, ja sinne saapuvan geenivirran vähäisyydestä. Skandinavian pohjois- ja eteläosan huomattava geneettinen erilaistuminen voi osittain selittyä eteläosan alapopulaation geneettisen muuntelun menetyksen ja pohjoisosaan saapuvan geenivirran avulla, sillä geenivirran suotuisa vaikutus geneettisen muuntelun määrää ei näyttäisi ulottuvan niemimaan eteläosaan saakka. Suomessa ilveksen efektiivinen populaatiokoko oli vain 13 % koko kannan yksilömäärästä, mutta mahdollisesti idästä saapuva migraatio voi kasvattaa ilveksen efektiivistä populaatiokokoa. Skandinaviassa populaation efektiivinen koko ei näyttänyt olevan riittävä pitkän aikavälin 73

74 selviämisen kannalta, ja koska metsästyksellä säädelty kanta tuskin tulee huomattavasti kasvamaan, on Skandinavian tulevaisuuden kannalta geenivirran saapuminen idästä tärkeää. Toistaiseksi tunnistamattomat tekijät näyttyäisivät kuitenkin rajoittavan geenivirtaa Skandinaviaan Suomen Lapin kautta. 6 KIITOKSET Haluan esittää lämpimät kiitokset ohjaajilleni yli-intendentti Jouni Aspille ja FT Minna Ruokoselle suuresta avusta ja tuesta, jonka tarjositte kaikkien vaikeuksien keskellä gradua tehdessäni. Suuri kiitos myös Katja Holmalalle ilvekseen liittyvistä asiantuntevista kommenteista, ja Manuela von Arxille avusta ja selvennyksistä koskien Euroopan ilveksiä. Erityiskiitokset Alexander Kopatzille, jolta sain käyttööni vielä julkaisemattomia tuloksia Suomen karhuista, sekä Krzysztof Schmidtille julkaisua odottavien tutkimustulosten lähettämisestä. Haluan kiittää myös Jukka Kiiskelää, joka määritti Skandinavian ilvesnäytteiden genotyypit ja edisti näin gradunani huomattavasti, sekä Eeva Roinista, joka ystävällisesti neuvoi minua ja lainasi luettavaksi kirjallisuutta susista ja mikrosatelliiteista. Tämän lisäksi haluan mainita miten kiitollinen olen perheelleni ja ystävilleni kaikesta tuesta ja kannustuksesta, sillä se on todella auttanut minua. Suuri kiitos kuuluu kaksoissiskolleni Sannalle, joka on lukenut tekstiäni ja auttanut minua monin tavoin. Akille, kiitos että olet ollut tukenani joka päivä. Lopuksi. Kiitos isä esimerkistä, jonka annoit kiinnostuksellasi luontoa kohtaa se säilyy ja kevään muuttolinnut muistuttavat aina sinusta. 74

75 7 LÄHTEET Andren, H., Linnell, J.D.C., Liberg, O., Andersen, R., Danell, A., Karlsson, J., Odden, J., Moa, P.F., Ahlqvist, P., Kvam, T., Franzen, R., Segerström, P. (2006) Survival rates and causes of mortality in Eurasian lynx (Lynx lynx) in multi-use landscapes. Biological Conservation 131: Anttila, S-L. & Niemi, S. (2007) Pyyntiluvan nojalla tai alueellisen kiintiön puitteissa sallittava suden, ilveksen ja saukon metsästys. Metsästäjä 6: 44. von Arx, M., Breitenmoser-Wursten, C., Zimmermann, F., Breitenmoser, U. (2004) Status and conservation of the eurasian lynx (Lynx lynx) in Europe in KORA Bericht No Ashley, C.T. & Warren, S.T. (1995) Trinucleotide repeat expansion and human disease. Annual Reviews of Genetics 29: Aspi, J., Roininen, E., Kiiskilä, J., Ruokonen, M., Kojola, I., Bljudnik, L., Danilov, P., Heikkinen, S., Pulliainen, E. (2008) Genetic structure of the northwestern Russian wolf populations and gene flow between Russia and Finland. Käsikirjoitus. Aspi, J., Roininen, E., Ruokonen, M., Kojola, I., Vila, C. (2006) Genetic diversity,population structure, effective population size and demographic history of the finnish wolf population. Molecular Ecology 15: Balloux, F. & Lugon-Moulin, N. (2002) The estimation of population differentiation with microsatelliten markers. Molecular Ecology 11: Berry, O., Tocher, M., D., Sarre, S., D. (2004) Can assignment tests measure dispersal? Molecular Ecology 13: Barton, N.H., & Slatkin, M. (1986) A quasi-equilibrium theory of the distribution of rare alleles in a subdivided population. Heredity 56: Beaumont, M.A., Zhang, W., Balding, D.J. (2002) Appriximate Bayesin computation in population genetics. Genetics 162: Beckman, J.S. & Weber, J.L. (1992) Survey of human and rat microsatellites. Genomics 12: Belkhir, K., Borsa, P.,Chikhi, L., Raufaste, N., Catch, F. (2004) GENETIX , software under WindowsTM for genetics of the populations. Laboratory Genome, Population, Interactions, CNRS UMR 5000, University of Montpellier, France. Berry, O., Tocher, M., D., Sarre, S., D. (2004) Can assignment tests measure dispersal? Molecular Ecology 13:

76 Bijlsma, R., Bundgaard, J., Boerema, A.C. (2000) Does inbreeding affect the extinction risk of small populations?: predictions from Drosophila. Journal of evolutionary biology 13: Boman, M. (1995) Estimating costs and genetic benefits of various sizes of predator populations: The case of bear, wolf, wolverine and lynx in Sweden. Journal of Environmental Management 43: Breitenmoser, U., Breitenmoser-Würsten, C., Okarma, H., Kaphegyi, T., Kaphygyi, U., Wallmann, U.M.M. (2000) Action plan for the conservation of the Eurasian Lynx (Lynx lynx) in Europe. Convention on the conservation of European Wildlife and Natural Habitats (Bern Convention). Nature and environment, No Breitenmoser, U., Kaczensky, P., Doetterer, M., Breitenmoser-Würsten, C., Capt, S., Bernhart, F., and Liberek, M. (1993). Spatial organization and recruitment of lynx (Lynx lynx) in a reintroduced population in the Swiss Jura Mountains. Journal of Zoology, London 231: Breitenmoser-Würsten, C., & Obexer-Ruff, G. (2003) Population and conservation genetics of two reintroduced lynx (Lynx lynx) populations in Switzerland a molecular evaluation 30 years after translocation. Environmental Encounters 58: Brookfield, J.F.Y. (1996) A simple new method for estimating null allele frequency from heterotsygote deficiency. Molecular Ecology 5: Brown, T.A. (2006) Genomes 3. Garland Sciense publishing, New York and London. 713s. Caballero, A. (1994) Developments in the prediction of effective population size. Heredity 73: Callen, D.F., Thompson, A.D., Shen, Y., Phillips, H.A., Richards, R.I., Mulley, J.C., Sutherland, G.R. (1993) Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers. American Journal of Human Genetics 52: Carmichael, L.E., Nagy, J.A., Larter, N.C., Strobeck, C. (2001) Pray specialization may influence patterns of gene flow in wolves of the Canadian Northwest. Molecular Ecology 10: Chackraborty, R., De Andrade, M., Daiger, S.P., Budowle, B. (1992) Apparent heterotsygote deficiencies observed in DNA typing data and treir implications in forensic applications. Annals of Human Genetics 56: Chakrabry, R., Kimmel, M., Stivers, D.N., Davison, L.J. Deka, R.(1997) Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide microsatellite loci. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 94:

77 Charlesworth, D. & Charlesworth, B. (1987) Inbreeding debression and its evolutionary consequences. Annual review of Ecology and Systematics 18: Corander, J., Waldman, P., Sillanpää, M. J. (2003) Bayesian analysis of genetic differentiation between populations. Genetics 163: Corander, M., Marttinen, P., Mäntyniemi, S. (2006) A Bayesian method for identification of stock mixtures from molecular marker data. Fishery Bulletin of the Fish and Wildlife Service 104: Cornuet, J-M. & Luikart, G. (1996) Description and power analysis of two tests fo detecting recent population bottlenecks from allele frequence data. Genetics 144: Cornuet, J-M., Piry, S., Luikart, G., Estoup, A., Solignac, M. (1999) New methods employing multilocus genotypes to select or exclude populations as origins of individuals. Genetics 153: Crnokrak, P. & Roff, D.A. (1999) Inbreeding depression in the wild. Heredity 83: Crow, J.F. & Denniston, C. (1988) Inbreeding and variance effective population numbers. Evolution 42: Crow, J.F. & Kimura, M (1970) An introduction to population genetics theory. Harper & Row, New York. 591s. Cummings, C.J., & Zoghbi, H.Y (2000) Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics 9: Dakin, E.E. & Avise, J.C. (2004) Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity 93: Di Rienzo, A., Peterson, A.C., Garza, J.C., Valdes, A.M., Slatkin, M., Freimer, N.B. (1994) Mutational processes of simple-sequence repeat loci in human populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91: DNAeasy TM tissue handbook. july Qiagen. Dopson, F.S. & Jones, W.T. (1985) Multiple causes of dispersal. The American Naturalist 126: Driscoll, D.A. (1999) Genetic neighborhood and effective population size for two endangered frogs. Biologisal Conservation 88: Ellegren, H. (2000) Microsatellite mutations in the germline: implications for the evolutionary inference. Trends in Genetics 16: England, P.R, Cornuet, J-M., Berthier, P., Tallmon, D.A., Luikart, G. (2006) Estimating effective population size from linkage disequilibrium: severe bias in small samples. Conservation Genetics 7:

78 Ermala, A. (2003) A survey of large predators in Finland during the 19 TH -20 TH centuries. Acta Zoologica Lituanica 13: Estoup, A., Jarne, P., Cornuet, J-M. (2002) Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and their consequences for population genetics analysis. Molecular Ecology 11: Excoffier, L. & Heckel, G. (2006) Computer programs for population genetics data analysis: a survival guide. Nature Reviews 7: Excoffier, L., Laval, G., Schneider S. (2005) Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: Excoffier, L., Smoude, P., Quattro, J. (1992) Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: Falkoner, D.S. & Macay, T.F.C (1996) Introduction to quantitative genetics, 4. painos. Longman, Lontoo. 464 s. Ferreras, P., Delibes, M., Palomares, F., Fedriani, J.M., Calzada, J., Revilla, E. (2004) Proximate and ultimate causes of dispersal in the Iberian lynx lynx pardinus. Behavioral Ecology 15: Field, D. & Wills, C. (1998) Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae, and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S. cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of selective forces. Proceedings of the National Fisher, R.A. (1930) The genetical theory of natural selection. Dover Publications, New York. 291 s. Frankham, R., Ballou, J.D., Briscoe, D.A. (2002) Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press, Cambridge. 617 s. Frankham, R. (1995) Inbreeding and extinction: a threshold effect. Conservation Biology 9: Gaggiotti, O.E., Lange, O., Rassmann, K., Gliddons, C. (1999) A comparison of two indirect methods for estimating average levels of gene flow using microsatellite data. Molecular Ecology 8: Gaines, M.S., Diffendorfer, J.E., Tamarin, R.H., Whitman, T.S. (1997) The effect of habitat fragmentation on the genetic structure of small mammal populations. Journal of Heredity 88: Glaubitz, J., C (2004) CONVERT: A user friendly program to reformat diploid genotypic data for commonly used population genetic software packages. Molecular Ecology Notes 4: Goudet, J. (2001) FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version ). Saatavilla 78

79 Greenwood, P.J Mating systems. Philopatry and dispersal in birds and mammals. Animal Behaviour 28: Grigione, M.M., Beier, P., Hopkins, R.A., Neal, D., Padley, W.D., Schonewald C.M., Johnson, M.L. (2002) Ecological and allometric determinants of home-range size for mountain lions (Puma concolor). Animal Conservation 5: Gugolz, D., Bernasconi, M.V., Breitenmoser-Wursten, C., Wandeler, P. (2008) Historical DNA reveals the phylogenetic position of the extinct Alpine lynx. Journal of Zoology 1-8. Guo, S.W. & Thompson, E.A. (1992) Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48: Hancock, J.M. (1995) The contribution of slippage-like processes to genome evolution. Journal of Molecular Evolution 41: Hancock, J.M. (1996) Simple sequences in a minimal genome. Nature Genetics 14: Harding, R.M., Boyce, A.J., Clegg, J.B. (1992) The evolution of tandemly repetitive DNA: recombination rules. Genetics 132: Hardy, O.J. (2003) Estimation of pairwise relatedness between individuals and characterization of isolation-by-distance precesses using dominant markers. Molecular Ecology 12: Hardy, O.J. & Vekemans, X. (1999) Isolation by distance in a continuous population: reconciliation between spatial autocorrelation analysis and population genetic models. Heredity 83: Hardy, O.J. & Vekemans, X. (2002) SPAGeDi: a versatile computer program to analyze spatial genetic structure at individual or population levels. Molecular Ecology Notes 2: Hedrick, P.W. (2005) Genetics of populations (3. painos). Jones and Bartlett publishers, Massachusetts. 737 s. Hellborg, L., Walker, C.H., Rueness, E.K., Stacy, J.E., Kojola, I., Valdmann, H., Zimmermann, Z., Jakobsen, K.S., Ellegren, H. (2002) Differentiation and levels of genetic variation in northern European lynx (Lynx lynx) populations revealed by microsatellites and mitochondrial DNA analysis. Conservation Genetics 3: Hellborg, L. & Ellegren, H. (2004) Low levels of nucleotide diversity in mammalian Y chromosomes. Molecular Biology and Evolution 21: Henderson, S.T. & Petes, T.D. (1992) Instability of Simple Sequence DNA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology 12: Henriksen, H.B., Andersen, R., Hewison, A.J.M., Gaillard, J-M., Bronndal, M., Jonsson, S., Linnell, J.D.C., Odden, J. (2005) Reproductive biology of captive female Eurasian lynx, Lynx lynx. European Journal of Wildlife Research 51:

80 Herfindal, I., Linnell, J.D.C., Odden, J., Birkeland Nilsen, E., Andersen, R. (2005) Prey density, environmental productivity and home-range size in the Eurasian lynx (Lynx lynx). Journal of Zoology 265: Hill, W.G. (1981) Estimation of effective population size from data on linkage disquilibrium. Genetical Research 38: Hillborn, R. & Stearns, S.C. (1982) On inference in ecology and evolutionary biology: the problem of multiple causes. Acta Biotheoretica 31: Holm, S A simple sequential rejective multiple test procedure. Scandinavian Journal of Statistics 6: Holmala, K. & Kojola,I. (2007) Ilveksille lähettimiä. Metsästäjä 6: 69 Huelsenbeck, J.P. & Bollback, J.P. (2001) Application of the likelihood function in phylogenetic analysis. Kirjassa: Balding, D.J., Bishop, M., Cannings, C. (toim.) Handbook of statistical genetics, John Wiley & Sons, Chichester, UK, s Hughes, L. (2000) Biological consequences of global warming: is the signal already apparent?. Trends in Ecology and Evolution 15: Ibrahim, K.M., Nichols, R.A, Hewitt, G.M. (1996) Spatial patterns of genetic variation generated by different forms of dispersal during range expansion. Heredity 77: Jarne, P. & Lagoda, P.J.L.(1996) Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology and Evolution 11: Jedrzejewski, W., Jedrzejewska, B., Okarma, H., Schmidt, K., Bunevich A. N., Milkowski, L. (1996) Population dynamics ( ), demography, and home ranges of the lynx in Bialowieza Primeval Forest (Poland and Belarus). Ecography 19: Jedrzejewski, W., Schmidt, K., Milkowski, L., Jedrzejewska, B., Okarma, H.(1993) Foraging by lynx and its role in ungulate mortality: the local (Biolowieze Forest) and the palearctic viewpoints. Acta Theriologica 38: Jedrzejewski, W., Schmidt, K., Okarma, H., Kowalczyk, R. (2002) Movement pattern and home range use by the Eurasian lynx in Białowieza Primeval Forest (Poland). Annales Zoologici Fennici 39: Johnson, W.E., Godoy, J.A., Palomeres, F., Delibes, M., Fernandes, M., Revilla, E., O Brien, S.J. (2004) Phylogenetic and phylogeographic analysis of Iberian lynx populations. Journal of Heredity 95: Jones, A.G., Stockwell, C.A., Walker, D., Avice, J.C. (1998) The molecular basis of a microsatellite null allele from white sands pupfish. Journal of Heredity 89:

81 Jorde, P.E., Rueness, E.K., Stenseth, N.C, Jakobsen, K.S. (2006) Cryptic population structuring in Scandinavian lynx: reply to Pamilo. Molecular Ecology 15: Kaeuffer, R. Pontier, D., Devillard, S., Perrin, N. (2004) Effective size of two domestic cat populations (Felis cattus L.): effect of the mating system. Molecular ecology 13: Kashi, Y. & King, D.G. (2006) Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolution. Trends in Genetics 22: Katti, M., Ranjekar, P.K., Gupta, V.S.(2001) Differential Distribution of Simple Sequence Repeats in Eukaryotic Genome Sequences. Molecular Biology and Evolution 18: Kauhala, K. & Helle, P. (2000) The interactions of predator and hare populations in Finland a study based on wildlife monitoring counts. Annales Zoologici Fennici 37: Kimura, M. & Crow, J.F. (1964) The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics 49: Kimura, M. & Ohta, T. (1987) Stepwise mutation model and distribution of allelic frequencies in a finite population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75: Koenig, W.D., Van Vuren, D., Hooge, P.N. (1996) Detectbility, philopatry and the distribution of dispersal distances in vertebrates. Trends in Ecology and Evolution 11: Kojola, I. (2003) Ilveskanta, elinvoimaisin suurpetokanta. Metsästäjä 52: Kojola, I., Aspi, J., Hakala, A., Heikkinen, S., Ilmoni, C., Ronkainen, S. (2006) Dispersal in an expanding wolf population in Finland. Journal of Mammalogy 87: Kojola,I., Määttä, E., Hiltunen, H. (2005) Suurpetojen lukumäärä ja lisääntyminen vuonna Riistantutkimuksen tiedote 203: 1-7. Kojola,I., Määttä, E., Hiltunen, H. (2006a) Suurpetojen lukumäärä ja lisääntyminen vuonna Riistantutkimuksen tiedote 208: 1-5. Kojola, I., Aspi, J., Hakala, A., Heikkinen, A., Ilmoni, C., Ronkainen, S. (2006b) Dispersal in an expanding wolf population in Finland. Journal of Mammalogy 87: Kong, A., Gudbjartsson, D.F., Saintz, J., Jonsdottir, G.M., Gudjonsson, S.A., Richardsson, B., Sigurdardottir, S., Rarnard, J., Hallbeck, B., Masson, G., Shlien, A., Palsson, S.T., Frigge, M.L., Thorgeirsson, T.E., Gulcher, J.R., Stefansson, K. (2002) A high-resolution recombination map of the human genome. Nature Genetics 31: Koreth, J., O.Leary, J.J., McGee, J.O D. (1996) Microsatellite and PCR genomic analysis. Journal of Pathology 178:

82 Kramer-Schadt, S., Revilla, E., Wiegand, T., Breitenmoser, U. (2004) Fragmented landscapes, road mortality and patch connectivity: modeling influences on the dispersal of Eurasian lynx. Journal of Applied Ecology 41: Kratochvil, J. ym. (1968) History of the distribution of lynx in Europe. Acta Scientarium Naturalia Academia Scientarium Bohemoslovacae-Brno 2: 1-50 Kumar, S. & Subramanian, S. (2002) Mutation rates in mammalian genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences 99: Lacy, R.C. (1987) Loss of genetic diversity from managed populations: interacting effects of drift, mutation, immigration, selection and population subdivision. Conservation Biology 1: Lai, Y. & Sun, F. (2003) The relationship between microsatellite slippage mutation rate and the number of repeats units. Molecular Biology and Evolution 20: Latch, E.K., Dharmarajan, G., Glaubitz, J.G., Rhodes, O.E. Jr. (2006) relative perfonmance of Bayesian clustering software for inferring population substructure and individual assignment at low levels of population differentiation. Conservation Genetics 7: Leberg,P.L. (2002) Estimating allelic richness:effects of sample size and bottlenecks. Molecular Ecology 11: Leeflang, E.P., Tavare, S., Marjoram, P., Neal, C.O.S., Srinidhi, J., MacFarlane, H., MacDonald, M.E., Gusella, J.F., De Young, M., Wexler, N.S., Arnheim, N. (1999) Analysis of germline mutation spectra at the Huntington s disease locus supports a mitotic mutation mechanism. Human Molecular Genetics 8: Levinson, G. & Gutman, G.A. (1987a) Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology Evolution 4: Levinson, G. & Gutman, G.A. (1987b) High frequencies of short fameshifts in poly-ca/tg tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Research 15: Li, Y-C., Korol, A.B., Fahima, T., Beiles, A., Nevo, E. (2002) Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational machanisms: a review. Molecular Ecology 11: Liberg, O. (1998) Lodjuret viltet, ekologin och människan. Svenska Jägareförbundet, Uppsala. 95 s. Liberg, O. & Andren, H. (2004) Sweden. Teoksessa: von Arx, M., Breitenmoser-Wursten, C., Zimmermann, F., Breitenmoser, U. (2004) Status and conservation of the eurasian lynx (Lynx lynx) in Europe in KORA Bericht No

83 Liberg, O. & Andren, H. (2006) The lynx population in Sweden An evaluation of census data and methods. Report Wildlife Damage Center / Grimsö Wildlife Research Station, Swedish University of Agricultural Sciences SLU. 39 s. Linnell, J.D.C., Andersen, R., Kvam, T., Andrén, H., Liberg, O., Odden, J., Moa, P.F. (2001) Home range size and choice of management strategy for lynx in Scandinavia. Environmental Management 27: Linnell, J. & Brøseth, H. (2004) Norway. Teoksessa: von Arx, M., Breitenmoser-Wursten, C., Zimmermann, F., Breitenmoser, U. (2004) Status and conservation of the eurasian lynx (Lynx lynx) in Europe in KORA Bericht No Litt, M. & Luty, J.A. (1989) A hypervariable microsatellite revealed y in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics 44: Loiselle, B.A., Sork, V.L., Nason, J., Graham, C. (1995) Spatial genetic structure of a tropical understory shrub, Phycgotria officianalis (Rubiaceae). American Journal of Botany 82: Luikart,G. & Cornuet, J-M. (1999) Estimating the effective number of breeders from heterotsygote excess in progeny. Genetics 151: Luikart, G:, Allendorf, F.W., Cornuet, J-M., Sherwin, W.B. (1998) Distortion of allele frequency distributions provides a test for recent population bottlenecks. The Journal of Heredity 89: Luikart, G. & England, P.R. (1999) Statistical analysis of microsatellite DNA data. Trends in Ecology and Evolution 14: Lynch, M., Conery, J., Burger, R. (1995) Mutation accumulation and the extinction of small populations. The American Naturalist 146: Lyytikäinen, V., Luotonen, H., Uotila, I., Kotanen, J., Hokkanen, T. J. (2004) Pohjois-Karjalan suurpedot - Erämaisen luonnon ja ihmisen rinnakkaiseloa itäisimmässä Suomessa. Pohjois- Karjalan ympäristökeskus. Kainuun Sanomat Oy, Kajaani. Manchester, K.H. (1995) Value of A 260 /A 280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. Biotechniques 19: Manel, S., Berthoud, F., Bellemain, E., Gaudeul, M., Luikart, G., Swenson, J.E., Waits, L.P., Taberlet, P., Intrabiodiv Consortium (2007) A new individual based spatial approach for identifying genetic discontinuities in natural populations. Molecular Ecology 16: Manel, S., Gaggiotti, O.E., Waples, R.S. (2005) Assignment methods: matching biological questions with appropriate techniques. Trends in Ecology and Evolution 20:

84 Manel, S., Schwartz, M., K., Luikart, G., Taberlet, P. (2003) Landscape genetics: combining landscape ecology and population genetics. Trends in Ecology and Evolution 18: Manni, F., Guerard, E., Heyer, E. (2004) Geographic patterns of (genetic, morphologic, linguistic) variation: How barriers can be detected by using Monmonier`s algorithm. Human Biology 76: Mattern, M.Y. & McLennan, D.A Phylogeny and speciation of Felids. Cladistics 16: McNeely, J.A., Miller, K.R., Reid, W.V., Mittermeier, R.A., Werner, T.B. (1990) Conserving the world s biological diversity. IUCN, world resources institute, conservation international, WWF-US and the world bank, Washington DC Menotti-Raymond, M.A., David, V.A., Lyons, L.A., Schäffer,A.A., Tomlin, J.F., Hutton, M.K., O Brien, S.J (1999) A genetic linkage map of microsatellites in the domestic cat (Felis cattus). Menotti-Raymond, M.A. & O Brien, S.J (1995) Evolutionary conservation of ten microsatellite loci in four species of Felidae. The Journal of Heredity 86: Miller, M.P. (2005) Alleles In Space (AIS): Computer software for the joint analysis of interindividual spatial and genetic information. Journal Of heredity 96: Genomics 57: Miller,C.R. & Waits, L.P. (2003) The history of effective population size and genetic diversity in the Yellowstone grizzly (Ursus arctos): Implications for conservation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: Moniz de Sa, M. & Drouin, G. (1996) Phylogeny and substitution rates of angiosperm actin genes. Molecular Biology Evolution 13: Monmonier,M. (1973) Maximum difference barriers: an alternative numerical regionalization method. Geographical Analysis 3: Morgante, M., Hanafey, M., Powell, W. (2002) Microsatellites are preferentially associated with nonrepetetive DNA in plant genomes. Nature Genetics 30: MMM (1996) Suomen maasuurpetokannat ja niiden hoito. Suurpetotyöryhmän raportti. M Maa- ja metsätalousministeriön julkaisu 6, 46 s. MMM (2007) Suomen ilveskannan hoitosuunnitelma. Maa- ja metsätalousministeriön julkaisu 1, 64 s. Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R. (1975) The bottleneck effect and genetic variability in populations. Evolution 29: Nei, M., Tajima, F., Tateno, Y. (1983) Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution 19:

85 Nei, M. (1987) Molecular evolutionary genetics. Columbia university press, New York. 512 s. Neigel, J.E. (1997) A comparison of alternative strategies for estimating gene flow from genetic markers. Annual Review of Ecology and Systematic 28: Nunney, L. & Elam, D.R. (1994) Estimating the effective population size of conserved populations. Conservation biology 8: Nyholm, E.S. (1995) Petosiirrot riistantutkimuksen vaatimaton kokeilu. Metsästäjä 1: Nyholm, E. S. (1996) Ilves. Kirjassa Riistan jäljille (Toim. Lindén, H., Hario, M., Wikman, M.) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos. Edita, Helsinki. 201s. Nyström, V., Angerbjörn, A., Dalen, L. (2006) Genetic consequences of a demographic bottleneck in the Scandinavian arctic fox. Oikos 114: Odden, J., Linnell, J.D.C., Andersen, R. (2006) Diet of Eurasian lynx, Lynx lynx, in the boreal forest of southeastern Norway: the relative importance of livestock and hares at low roe deer density. European Journal of Wildlife Research 52: Ohta, T. & Kimura, M. (1973) A model of mutation appropriate to estimate the number of electrophoretically detectable alleles in finite population. Genetical Research 22: Okarma, H., Jedrzejewska, B., Jedrzejewski, W., Krasinski, Z.A., Milkowski, L. (1995) The roles of predation, snow cover, acorn crop, and man-related factors on ungulate mortality in Bialowieza Primeval Forest, Poland. Acta Theriologica 40: van Oosterhout, C., Hutchinson, W.,F., Wills, D., P., M., Shipley, P. (2004) MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4: Paetkau, D., Calvert, W., Stirling, I., Strobeck, C. (1995) Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar Bears. Molecular Ecology 4: Paetkau, D., Slade, R., Burden, M., Estoup, A. (2004) Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulation-based exploration of accuracy and power. Molecular Ecology 13: Paetkau,D., Waits, L.P., Clarkson, P.L., Craighead, L., Strobeck, C. (1997) An empirical evaluation of genetic distance statistics using microsatellite data from bear (Ursidae) populations. Genetics 147: Pamilo, P. (2004) How cryptic is Scandinavian lynx? Molecular Ecology 13: Petit, R.J., El Mousadik, A., Pons, O. (1998) Identifying populations for conservation on the basis of genetic markers. Conservation Biology 12:

86 Pilot, M., Jedrzejewski, W., Branicki, W., Sidorovich, V.E., Jedrzejevska, B., Stachura, K., Funk, S.M. (2006) Ecological factors influence population genetic structure of European grey wolves. Molecular Ecology 15: Piry, S., Alapetite, A., Cornuet J-M., Paetkau, D., Baudouin, L., Estoup, A. (2004) GENECLASS2: A software for genetic assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity 95: Piry, S., Luikart, G., Cornuet, J-M. (1999) BOTTLENECK: A computer program for detecting recent reductions in the effective population size using allele frequency data. Journal of Heredity 90: Pritchard, J., K., Stephens, M., Donnelly, P. (2000) Inference of population structure using multilokus genotype data. Genetics 155: Pritchard, J.K., Wen, X., Falush, D. (2007) Documentation for structure software: Version 2.2. Käyttäjän opas. Primmer, C.R., Ellegren, H., Saino, N., Moller, A.P. (1996) Directional evolution in germline microsatellite mutations. Nature Genetics 13: Primmer, G.R. & Ellegren, H. (1998) Patterns of molecular evolution in avian microsatellites. Molecular Biology Evolution 15: Pudovkin, A.I.,Zaykin, D.V., Hedgecock, D. (1996) On the potential for estimating the effective number from heterozygote-excess in progeny. Genetics 144: Pulliainen, E. (1974) Suomen suurpedot. KK:n kirjapaino, Helsinki. 263 s. Pulliainen, E. (1981) Winter diet of Felis lynx L. in SE Finland as compared with the nutrition of other northern lynxes. Zeitschrift fur Säugetierkunde 46: Pullianinen, E. & Hyypiä, V. (1975) Ilvesten talviravinnosta Kaakkois-Suomessa. Suomen Riista 26: Pulliainen, E., Lindgren, E., Tunkkari, P.S. (1995) Influence of food availability and reproductive status on the diet and body condition of the European lynx in Finland. Acta Theriologica 40: Pulliainen, E & Rautiainen (1999) Suurpetomme: karhu, susi, ahma, ilves. Articmedia, Kajaani. Pusay, A. & Wolf, M. (1996) Inbreeding avoidance in animals. Trends in Ecology and Evolution 11: Pöri, K. (2008) Itä-Suomen ilvesesiintymät haaste riistanhoidolle. Metsästäjä 2: Ralls, K., Ballou, J.D., Templeton, A. (1988) Estimates of lethal equivalents and the cost of inbreeding in mammals. Conservation Biology 2:

87 Randi, E., Lucchini, V., Christensen, M.F., Mucci, N., Funk, S.M., Dolf, G., Loeschcke, V. (2000) Mitochondrial DNA variability in Italian and east European wolves: detecting the consequences of small population sizeand hybridization. Conservation Biology 14: Rannala, B. & Mountain, J. (1997) Detecting immigration by using multilocus genotypes. Proceedings of the National Academy of Sciance of the United States of America 94: Ranta, E., Rita, H., Kouki, J. (2002) Biometria. Tilastotiedettä ekologeille (8. painos) Yliopistopaino, Helsinki. 569 s. Rassi, P., Alanen, A., Kanerva, T., Mannerkoski (toim.) (2001) Suomen lajien uhanalaisuus Ympäristöministeriö & Suomen ympäristökeskus, Helsinki. 432 s. Raymond, M. & Rousset, F. (1995) Population genetics software for exact test and ecumenicism. Journal of Heredity 86: Reed, D.H. & Frankham, R. (2003) Correlation between fitness and genetic diversity. Conservation Biology 17: Richards, G-F. & Paques, F. (2000) Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection. EMBO raports 1: Rohrer, G.A., Alexander, L.J., Keele, J.W., Smith, T.P., Beattie, G.W. (1994) A microsatellite linkage map of the porcine genome. Genetics 136: Rousset, F. (1997) Genetic Differentiation and estimation of gene flow from F-statistics under isolation by distance. Genetics 145: Rousset, F. (2001) Inferences from spatial population genetics. Kirjassa: Balding, D.J., Bishop, M., Cannings, C. (toim.) Handbook of statistical genetics, John Wiley & Sons, Chichester, UK, s Rousset, F. & Raymond, M. (1995) Testing Heterozygote Excess and Deficiency. Genetics 140: Rowe, G. & Beebee, J.C. (2007) Defining population boundaries: use of three Bayesian approaches with microsatellite data from British natterjack toads (Bufo calamita). Molecular ecology 16: Rubinsztein, D.C., Amos, M., Leggo, J., Goodburn, S., Jain, S., Li, S.H., Morgolis, R.L., Ross, C.A., Ferguson-Smith, M.A. (1995) Microsatellite evolution- evidence for directionality and variation in rate between species. Nature Genetics 10: Rueness, E.K., Jorde, P.E., Hellborg, L., Stenseth, N.C., Ellegren, H., Jakobsen, K.S. (2003a) Cryptic population structure in a large, mobile mammalian predator: the Scandinavian lynx. Molecular ecology 12:

88 Rueness, E.K., Stenseth, N.C., O Donoghue, M., Boutin, S., Ellegren, H., Jakobsen, K.S. (2003b) Ecological and genetic spatial structuring in the Canadian lynx. Nature 425: Ryser-Degiorgis,? M-P., Ryser, A., Oxeber-Ruf, G., Breitenmoser-Wursten, C., Breitenmoser, U., Lang, J. (2004) Emergence of congenital malformations in free ranging Lynx from Switzerland: first evidence of inbreeding depression? European association of zoo- and wildlife veterinarians (EAZVY), Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J, Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988) Primer-directed entsymatic amplification on DNA with a thermostable DNA polymerace. Science 239: Salo, P. (2007) Ilveksen biologia. Julkaisussa: Suomen ilveskannan hoitosuunnitelma, Maa- ja metsätalousministeriön julkaisu 1: Schlötterer, C. (2000) Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma 109: Schlötterer, C., Ritter, R., Harr, B., Brem, G. (1998) High mutation rate of a long microsatellite allele in Drosophila melanogaster provides evidence for allele-specific mutation rates. Molecular Biology and Evolution 15: Schmidt, K. (1998) Maternal behaviour and juvenile dispersal in the Eurasian lynx. Acta Theriologica 43: Schmidt, K. (1999) Variation in daily activity of the free-living Eurasian lynx (Lynx lynx) in Bialowieza Primeval Forest, Poland. Journal of Zoology 249: Schmidt, K., Jedrzejewski, W., karma, H. (1997) Spatial organization and social relations in the Eurasian lynx population in Bioalowieza Primeval Forest, Poland. Acta Treriologica 42: Schmidt, K., Kowalczyk, R., Ozolins, J., Männil, P., Fickel, J. (2008) Genetic structure of the European lynx population in north-eastern Poland and the Baltic states. Conservation genetics. Painossa. Schwartz, M.K., Mills, L.S., Ortega, Y., Ruggiero, L.F., Allendorf, F.W. (2003) Landscape location affects genetic variation of Canada lynx (Lynx Canadensis). Molecular Ecology 12: Schmidt-Posthaus, H., Breitenmoser-Würsten, Ch., Posthaus, H., Bacciarini, L. N., and Breitenmoser, U. (2002) Causes of mortality in reintroduced Eurasian lynx in Switzerland. Journal of Wildlife Diseases 38: Shaw, P.W., Pierce, G.J., Boule, P.R. (1999) Subtle population structuring within a highly vagile marine invertebrate, the veined squid Loligo forbesi, demonstrated with microsatellite DNA markers. Molecular Ecology 8:

89 Shinde, D., Lai, Y., Sun, F., Arnheim, N. (2003) Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis: (CA/GT)n and (A/T)n microsatellites 974±980 Nucleic Acids Research 31: Slatkin, M. (1981) Estimating levels of gene flow in natural population. Genetics 99: Slatkin, M. (1985a) Gene flow in natural populations. Annual Reviews in Evolution and Systematics 16: Slatkin, M. (1985b) Rare alleles as indicators of gene flow. Evolution 39: Slatkin, M. (1995) A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics 139: Spong, G. & Hellborg, L. (2002) A near extinction event in lynx: Do microsatellite data tell the tale? Conservation ecology 6. Osoitteesta: Stenseth, N.C., Shabbar, A., Chan, K-S., Boutin, S., Rueness, E.K., Ehrich, D., Hurrell, J.W., Lingærde, O.C., Jakobsen, K.S. (2004) Snow conditions may create an invisible barrier for lynx. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 101: Stahl, P. & Vandel, J.-M. (1999). Mortalité et captures de lynx Lynx lynx en France ( ). Mammalia 63: Strand, M., Prolla, T.A., Liskay, R.M., Petes, T.D. (1993) Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature 365: Sturzeneker, R., Bevilacqua, R.A.U., Haddad, L.A., Simpson, A.J.G., Pena, A.D.J. (2000) Microsatellite instability in tumors as a model to study the process of microsatellite mutations. Human Molecular Genetics 9: Sunde, P., Kvam, T., Moa, P., Negård, A., Overskaug, K. (2000a). Space use by Eurasian lynxes Lynx lynx in central Norway. Acta Theriologica 45: Sunde, P., Kvam, T., Bolstad, J.P., Bronndal, M. (2000b). Foraging of lynxes in a managed borealalpine environment. Ecography 23: Sunnocks, P. (2000) Efficient genetic markers for population biology. Trends in Ecology and Evolution 15: Tachida, H. & Iizuka, M. (1992) Persistence of repeated sequences that evolve by replication slippage. Genetics 131: Tallmon, T.A., Koyuk, A., Luikart, L., Beaumont, M.A. (2008) ONESAMP: a program to estimate population size using appriximate Bayesian computation. Molecular Ecology 8:

90 Tenzer, I., Ivanissevich, S.D., Morgante, M., Gessler, C. (1999) Identification of microsatellite merkers and their application to population genetics of Venturia inaqualis. Phytopathology 89: Toth, G., Gaspari, Z., Jurka, J. (2000) Microsatellites in Different Eukaryotic Genomes: Survey and Analysis. Genome Research 10: Tumlison, R. (1987) Mammalian species, Felis lynx. The American Society of Mammalogists 269: 1-8. Vekemans, X. & Hardy O.J. (2004) New insights from fine-scale spatial genetic structure analyses in plant populations. Molecular Ecology 13: Vila, C., Sundqvist, A-K., Flagstad, Ø, Seddon, J., Björnefeldt, S., Kojola, I., Casulli, A., Sand, H., Wabakken, P., Ellegren, H. (2003) Rescue of a severely bottlenecked wolf (Canis lupus) population by a single immigrant. Proceedings of the Royal Society of London, series B: Biological Sciences 270: Vucetich, J.A. & Waite, T.A. (2000) is one migrant per generation sufficient for the genetic management of fluctuating populations? Animal Conservation 3: Wahlund, S. (1928) Zusammensetzung von population und korrelationserscheinungen vom standpunkt der vererbungslehre aus betrachtet. Hereditas 11: Wang, J. (2005) Estimation of effective population sizes from data on genetic markers. Philosophical Transactions of the Royal Society B 360: Wang, J. & Caballero, A. (1999) Developments in predicting the effective size of subdivided populations. Heredity 82: Walker, C.W., Vila, C., Landa, A., Linden, M., Ellegren, H. (2001) Genetic variation and population structure in Scandinavian wolverine (Gulo gulo) populations. molecular Ecology 10: Waples, R.S. (1989) A Generalized Approach for Estimating Effective Population Size From Temporal Changes in Allele Frequency. Genetics 121: Waples, R.S. (2006) A bias correction for estimates of effective population size based on linkage disequilibrium at unlinked gene loci. Conservation genetics 7: Waples, R.S. & Do, C. (2007) LDNE: a program for estimating effective population size from data on linkage disequilibrium. Molecular Ecology Resources. Waples, R.S. & Gaggiotti, O. (2006) What is a population? An empirical evaluation of some genetic methods for identifying the number of gene pools and their degree of connectivity. Molecular Ecology 15:

91 Wattier, R., Engel, C.R., Saumitou-Laprade, P., Valero, M. (1998) Short allele dominance as a sourse of heterotsygote deficiency at microsatellite loci: experimental evidence at the dinucleotide locusgvl in Gracilaria gracilis (Rhodophyta). Molecular Ecology 7: Weber, J.L. (1990) Informativeness of human (dc-da)n (dg-dt)n polymorphisms. Genomics 7: Weber, J.L. & May, P.E. (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerace chain reaction. American Journal of Human Genetics 44: Weir, B.S. (1979) inferences about linkage disequilibrium. Biometrics 35: Weir, B.S. & Cocherham, C.C. (1984) Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: Werdelin, L. (1981) The evolution of lynxes. Annales Zoologici Fennici 18: Whitlock, M.C. & McCauley, D.E. (1999) Indirect measures of gene flow and migration: F ST 1/(4Nm + 1). Heredity 82: Wikberg, S. (toim.) (2007) Suomen laki III. Talentum, Lakimiesliiton kustannus, Helsinki. Wright, S. (1922) Coefficients of inbreeding and relationships. The American Naturalist 56: Wright, S. (1931) Evolution in mendelian populations. Genetics 16: Wright, S. (1943) Isolation by distance. Genetics 38: Wright, S. (1977) Evolution and the genetics of the populations. Experinmental results and evolutionary deductions, volume s. Xu, X., Peng, M., Fang, Z., Xu, X. (2000) The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length. Nature Genetics 24: Zimmermann, F., Breitenmoser-Wursten, C., Breitenmoser, U. (2005) Natal dispersal of Eurasian lynx (Lynx lynx) in Switzerland. Journal of Zoology 267: Käytetyt internet-lähteet: Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitoksen sivut Maa- ja metsätalousministeriön verkkosivut Metsähallituksen ylläpitämät verkkosivut Suomen suurpedoista 91

92 8 LIITTEET Liite I Liite II Liite III Liite IV Liite V Euraasian ilveksen (Lynx lynx) levinneisyysalue Euroopassa vuonna 2001 von Arx ym. (2004) mukaan, muokattu Manuela von Arxin toimesta Suomessa metsästettyjen ilvesyksilöiden lukumäärä vuosina kymmenen vuoden jaksoissa, Ermala (2003) mukaan muokattuna Työssä käytetyt liuokset Skandinavian kahdeksan maantieteellisin perustein muodostettua ryhmää Rueness ym. (2003) mukaan Suomen ja Skandinavian lokuskohtaiset tiedot alleelifrekvensseistä ja geenidiversiteeteistä 92

93 Liite I Euraasian ilveksen (Lynx lynx) levinneisyysalue Euroopassa vuonna 2001 von Arx ym. (2004) mukaan, muokattu Manuela von Arxin toimesta 93

94 Liite II Suomessa metsästettyjen ilvesyksilöiden määrä vuosina kymmenen vuoden jaksoissa, Ermala (2003) mukaan muokattuna 94

95 Liite III Työssä käytetyt liuokset Latauspuskuri: 4 ml glyserolia 4,5 ml 0,5 M Na 2 EDTA 20 mg bromofenolin sinistä 5 x TBE-puskuri: 54 g Tris-emästä 27,5 g Boori-happoa 20 ml 0,5 M EDTA (etyleenidiamiinitetra-asetaattihappo), ph 8 Aineet liuotetaan litraan steriiliä vettä. Geelielektroforeesin käyttökonsentraatio oli 0,5 x, joka saatiin liuottamalla 200 ml 5 x TBE-puskuria 1800 ml steriiliä vettä. 95

96 Liite IV Skandinavian kahdeksan maantieteellisin perustein muodostettua ryhmää Rueness ym. (2003) mukaan A. 96