LOPPURAPORTTI Dnro 109/304/2007

Transkriptio

1 Dnro 109/304/2007 LOPPURAPORTTI Molekyylibiologinen selvitys harmaahylkeen geneettisestä monimuotoisuudesta metsästyssaaliin perusteella Jouni Aspi, Sauli Härkönen ja Mervi Kunnasranta Tiivistelmä Tutkimuksessa selvitettiin Itämeren harmaahylkeen (Halichoerus grypus) geneettisen monimuotoisuuden määrää sekä mahdollisten populaation pullonkaulojen vaikutusta siihen. Lisäksi tutkittiin harmaahylkeen populaatiogeneettistä rakennetta Suomessa. Tulosten mukaan harmaahylkeen geneettinen monimuotoisuus on vastaavalla tasolla kuin aikaisemmissa muilla alueilla harmaahylkeillä tehdyissä tutkimuksissa. Harmaahylkeellä ei ole meillä havaittavissa merkkejä sukusiittoisuudesta. Kanta ei ole jakautunut geneettisesti maantieteellisiin lisääntymisyksiköihin, vaan harmaahylkeet Suomen vesialueella näyttäisivät muodostavan yhtenäisen panmiktisen populaation. Harmaahylkeen ja 1980-luvun vaihteen populaatiokoon pullonkaula ei näy harvinaisten alleelien puuttumisena eikä heterotsygoottisuuden määrä suhteessa alleelimäärään poikkea merkitsevästi tasapainopopulaatiolle ominaisesta. Bayesiläisten MCMC-simulaatioiden mukaan harmaahylkeen kannan koko olisi alentunut pitkän ajan kuluessa ja lajin teholliset populaatiokoot olisivat aikaisemmin olleet huomattavasti nykyisiä suurempia. Simulaatioiden perusteella kannan aleneminen olisi alkanut jo hyvin kauan sitten. Geneettisillä menetelmillä arvioidut estimaatit harmaahylkeen teholliselle populaatiokoolle olivat kohtuullisen suuria. Kokonaisuutena harmaahyljekannasamme ei ole havaittavissa merkkejä geneettisen monimuotoisuuden alenemisesta ja sitä voidaan käsitellä yhtenä kannanhoitoyksikkönä. 1. Tutkimuksen taustaa Harmaahyljettä (Halichoerus grypus) tavataan pohjoisella Atlantilla, jossa kanta on jakautunut Länsi- ja Itä-Atlantin osapopulaatioihin, ja Itämeressä. Vaikka Itämeren hallia on joissain yhteyksissä esitetty omaksi alalajikseen (H. g. balticus) (Schwartz ym. 2003), kaikki kolme maantieteellisesti erillistä osakantaa luetaan edelleen yhdeksi lajiksi. Itämeren harmaahyljekanta on voinut käydä läpi suhteellisen voimakkaan populaation pullonkaulan. Tapporahatilastoihin perustuvien tilastomallien mukaan on arvioitu, että 1900-luvun alussa harmaahylkeitä olisi ollut (Harding & Härkönen 1999) tai (Kokko ym. 1999). Sen sijaan lukujen vaihteessa kanta oli arvioiden mukaan pudonnut vain yksilöön (Helle & Stenman 1990). Pääsyynä Itämeren hyljekantojen vähenemiseen on ollut liikapyynti sekä todennäköisesti ympäristömyrkkyjen aiheuttamat lisääntymishäiriöt (Helle ym. 1976a, Helle ym. 1976b, Helle & Stenman 1990, Hårding & Härkönen 1999, Kokko ym. 1999, Bergman 1999, Harding ym. 2007). Rauhoituksen ja lisääntymisterveyden parantumisen myötä hallikanta on kääntynyt kasvuun vaihteen pullonkaulan jälkeen. Hallinaaraiden lisääntymisterveys on nykyisin normaali (Helle ym. 1

2 2005) ja laskentakanta on ajoittain kasvanut Suomen merialueilla jopa noin 10 % vuodessa. Itämeressä havaittiin keväällä 2007 lähemmäs hallia, joista noin 42 % oli laskentahetkellä Suomen merialueilla (RKTL 2007). Hallikannan kasvu on mahdollistanut hallinmetsästyksen uudelleen aloittamisen Hallien runsastumisen myötä myös niiden aiheuttamat vahingot kalataloudelle ovat voimakkaasti lisääntyneet. Tämä on luonut yhteiskunnallisen konfliktitilanteen, joka osaltaan on siirtämässä harmaahyljekannanhoidon painopistettä tiukasta suojelusta kohti riistaeläinpainotteista kannanhoitoa ( Kannanhoitotoimenpiteiden suunnittelu ja toteuttaminen tarvitsevat yhä enemmän biologista pohjatietoa hallikannan tilasta. Hallikannan kestävän käytön ja elinvoimaisuuden ylläpitämiseksi tarvitaan myös entistä parempaa tietoa hylkeiden geneettisestä ja populaatiorakenteesta. Itämeren hallin nykyiset pääesiintymisalueet ovat Itämeren pääaltaan pohjoisosassa, mutta meillä ei ole tietoa missä määrin eri päälevinneisyysalueen kannat ovat eriytyneet toisistaan geneettisesti. Tosin Karlssonin julkaisemattoman tutkimuksen (2004) mukaan ei Ruotsin merialueella Pohjanlahden ja Tukholman saariston harmaahylkeiden välillä ole selvää erilaistumista. Itämeren harmaahylkeille on tyypillistä suuri liikkuvuus ja pitkät vuodenaikaiset vaellukset. Hallien elinpiirit ovat varsin laajoja ja yksilöt voivat helposti liikkua koko Itämeren alueella (Sjöberg 1999, Dietz ym. 2003, Karlsson 2003). Suuresta liikkumispotentiaalista huolimatta on Brittein saarilla tehdyissä tutkimuksissa todettu, että hallin eri osakantojen välillä on merkitseviä geneettisiä eroja (Allen ym. 1995; Gaggiotti ym. 2002), ja sen vuoksi niitä täytyy käsitellä omina erillisinä kannanhoitoyksikköinään. Brittein saarilla hallit pesivät paikkauskollisesti samoilla luodoilla, mikä toimii kantoja geneettisesti eristävänä tekijänä. Erilaistumisen määrää lisää todennäköisesti myös se, että uudet koloniat saavat tulokkaansa epätasaisesti jo olemassa olevista populaatioista (Gaggiotti ym. 2002) sekä myös saarikolonioissa vallalla oleva haaremijärjestelmä (e.g. Pomeroy ym. 2000), joka pienentää populaatioiden tehollista populaatiokokoa. Itämeren alueella tilanne voi olla olennaisesti toinen kuin Itä-Atlantin kannoissa. Itämerellä halli synnyttää pääasiallisesti ajojäälle, vaikkakin erityisesti Länsi- Viron rannikolla, Ruotsin rannikolla ja Saaristomeren ulkoluodoilla halli voi synnyttää myös maalle. Luodoilla poikiminen tapahtuu yleensä laumoissa, mutta jäällä naaraat synnyttävät pääasiallisesti yksittäin. Naaras tulee kiimaan imetyksen lopulla ja pariutuminen tapahtuu myös jäillä. Poikiminen jäille vähentää halliurosten moninaaraisuutta, ja Itämeren hallilla ei olekaan varsinaisia haaremeita (Helle & Stenman 1990, Jüssi 1999, Karlsson 2003). Pariutumisjärjestelmän erilaisuus ja kiinteiden pesimäluotojen ja -saarten puutuminen voi osaltaan johtaa siihen, että hallikantojen erilaistuminen on Itämerellä vähäisempää kuin Itä-Atlantin kannoissa. Aikaisemmissa harmaahylkeen geneettistä monimuotoisuutta selvittävissä tutkimuksien mukaan Itä-Atlantin kannoissa on runsaasti geneettistä muuntelua (Allen ym. 1995). Meillä geneettisen monimuotoisuuden määrää ei ole selvitetty. Periaatteessa hallin Itämerellä läpikäymä populaation pullonkaula on voinut vähentää sen geneettistä monimuotoisuutta. Populaation pullonkaulat voivat näkyä myös harvinaisten alleelien puuttumisena tai heterotsygotian liiallisena määränä suhteessa alleelimäärään (Cornuet & Luikart 1996). 2

3 Tässä työssä oli tavoitteena arvioida DNA:n mikrosatelliittimuuntelun avulla harmaahyljekannan geneettistä monimuotoisuutta sekä sen mahdollista jakaantumista useampiin lisääntymisyksiköihin. Lisäksi pyrittiin geneettisillä menetelmillä arvioimaan kannan demografista historiaa ja arvioimaan populaation tehollista populaatiokokoa (effective population size). Tehollinen populaatiokoko on teoreettinen käsite, jolla tarkoitetaan sitä ideaalipopulaation kokoa, jossa geneettiset muutokset ovat samansuuruisia kuin tutkittavassa luonnonpopulaatiossa. Ideaalipopulaatiossa kaikki yksilöt lisääntyvät ja jokaisen yksilön tuottamien jälkeläisten määrä ja varianssi on yksi. Tehollista populaatiokokoa voivat alentaa monet tekijät ja tyypillisesti se on vain kymmenesosa populaation yksilöiden arvoidusta kokonaismäärästä (esim. Frankham 1995). Tehollisen populaatiokoon alenemisen varhainen tunnistaminen on tärkeää populaatioiden hoidon kannalta. 2. Aineisto ja menetelmät Suomen harmaahylkeen geneettisestä rakenteesta tehtävän hankkeen rahoitti Maa- ja metsätalousministeriö (rahoituspäätös Dnro: 898/721/2007). Tutkimus toteutettiin Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitoksen (RKTL) ja Oulun yliopiston Biologian laitoksen yhteistyönä. RKTL huolehti näytteiden keruusta ja laboratoriotyöt sekä geneettinen analyysi tehtiin Biologian laitoksella Tutkitut näytteet Tutkimusmateriaalin muodostivat hallinmetsästyksen yhteydessä kerätyt kudosnäytteet vuosilta Näytteet edustivat 168 harmaahyljeyksilöä eri puolilta merialuettamme. Yksilöt oli pyydetty pääosin kevättalvella lisääntymisaikana, ja pyyntipaikkansa mukaan ne oli jaettu kuuden merialueen: (Perämeren, Merenkurkun, Selkämeren, Ahvenanmeren, Saaristomeren ja Suomenlahden) yksilöihin. Tarkat pyyntikoordinaatit oli saatavilla vain muutamalle yksilölle DNA:n eristys DNA-eristettiin kudoksista DNeasy -menetelmällä (Qiagen) tai fenolikloroformi -uutolla (Sambrook & Russell 2001). Eristysreagenssien puhtaus varmistettiin negatiivisilla kontrolleilla, joihin ei lisätty lainkaan kudosnäytettä Mikrosatelliitilokusten genotyypitys Tutkimuksessa käytettiin aiemmin erityisesti harmaahylkeelle (Allan ym. 1995) tai norpalle (Phoca hispida) (Goodman 1997) kehitettyjä mikrosatelliittialukkeita. Samoja lokuksia on käytetty myös Itämeren norppien (P. h. botnica) geneettisissä tutkimuksissa (esim. Palo ym ) Koko aineiston analyysit perustuvat 10 mikrosatelliittilokukseen (Taulukko 1). Eristetyt DNA-näytteet monistettiin Peltier Thermal Cycler-200-koneella (MJ Research) käyttäen kullekin lokukselle spesifisiä alukkeita. Genotyypit eroteltiin ABI Prism 3730 kapillaarielektroforeesilaitteella ja GENEMAPPER 3.7 (Applied Biosystems) ohjelmalla. 3

4 Taulukko 1. Tutkitut mikrosatelliittilokukset ja niiden muuntelua kuvaavia tunnuslukuja (A = alleelien lukumäärä; H EXP odotettu heterotsygotia; H OBS = havaittu heterotsygotia; F IS = sukusiitoskerroin) Lokus Kokoalue A H EXP H OBS FIS Hg ,66 0,66 0,002 Hg ,82 0,82-0,051 Hg ,76 0,77-0,019 Hg ,76 0,76 0,010 SGPv ,76 0,76-0,001 Hg ,81 0,81-0,050 Hgdii ,71 0,72 0,082 Hg ,78 0,78 0,008 HI ,90 0,90 0,163 SGPv ,21 0,21-0,021 Keskiarvo 7,7 0,72 0,72 0, Aineiston analyysi Mikrosatelliittien PCR-prosessissa mahdollisesti syntyneitä monistusvirheitä ja nolla-alleelien esiintymistä tutkittiin MICROCHECKER-ohjelmalla (van Oosterhout 2004). Hallikannan geneettistä monimuotoisuutta havainnollistettiin havaitun (H OBS ) ja odotetun heterotsygotian määrällä (H EXP ) sekä alleelien keskimääräisellä lukumäärällä (A) kussakin lokuksessa ja alueella. Nämä tunnusluvut laskettiin GENETIX-ohjelmalla (Belkhir ym. 2004). Merialueet jaettiin myös pohjoisiin (Perämeri, Merenkurkku, Selkämeri) ja eteläisiin (Ahvenanmeri, Saaristomeri, Suomenlahti) alueisiin, ja muuntelun määrää näillä maantieteellisillä alueilla verrattiin FSTAT-ohjelman (Goudet 2001) permutaatiotestillä. Kytkentäepätasapainoa eri mikrosatelliittilokusten alleelien välillä arvioitiin GENETIX-ohjelmaan (Belkhir ym. 2004) sisälletyllä Black & Krafsurin (2004) menetelmällä. Hallikantamme lisääntymisyksiköiden määrää analysoitiin bayesilaisella Monte Carlo Markovin ketju simulaatioilla, jolla pyritään estimoimaan aineistossa olevien lisääntymisyksiköiden määrää ilman tietoa siitä miltä alueelta tai ryhmästä tutkittavat yksilöt ovat peräisin (Pritchard 1999, Falush ym. 2004). Simulaatiot tehtiin STRUCTURE-ohjelmalla (ver. 2.1; Falush ym. 2004), ja lisääntymisyksiköiden (k) määränä käytettiin 1-8, ja jokaisella k:n arvolla tehtiin viisi erillistä simulaatiota. Jokaisessa simulaatiossa käytetty iteraatioiden määrä oli Näitä edelsi alustavaa iteraatiota (burn in), joita ei sisällytetty lopullisiin tuloksiin. Yksilötasolla eri merialueiden hallien geneettisiä sukulaisuussuhteita tutkittiin myös faktoriaalisella korrespondenssianalyysillä (esim. Benzécri 1973). Tässä analyysissä alleelifrekvenssiaineisto muunnetaan kontingenssitaulukoksi, jolla mitataan eri yksilöiden välistä sukulaisuutta k-dimensionaalisessa (k = alleeleiden määrä) avaruudessa. Tästä taulukosta analyysin tuottamat faktoriaaliakselit järjestään niiden ominaisarvojen mukaan, ja kunkin yksilö saamat faktoripisteet esitetään koordinaatistossa yksilöiden geneettisen samankaltaisuuden kuvaamiseksi. FCA-analyysi toteutettiin GENETIX-ohjelmalla (Belkhir ym. 2004). 4

5 Eri merialueiden harmaahylkeiden erilaistumista ja muuntelun jakautumista merialueiden sisälle ja välille mitattiin Wrightin F-statistiikalla ja molekulaarisella varianssianalyysillä (AMOVA). F-statistiikassa sukusiitoskerroin (F IS ) kuvaa poikkeamaa Hardy-Weinbergin tasapainosta tietyn harmaahyljejoukon sisällä. Se voi vaihdella -1 ja 1:sen välillä; positiiviset arvot ilmentävät (esimerkiksi sukusiitoksen aiheuttamasta) homotsygoottien ja negatiiviset heterotsygoottien yksilöiden ylimäärää. F ST arvot puolestaan kuvaavat populaatioiden (merialueiden) välistä erilaistumista. F ST voidaan tulkita populaatioiden välisen muuntelun osuudeksi kokonaismuuntelusta, joka on vertailukelpoinen erilaistumismitta eri lokusten ja eri tutkimusten välillä (esim. Hedrick 2000). Eri merialueiden välille pareittan laskettujen F ST - ja merialueiden maantieteellisten etäisyysmatriisien korrelaation merkitsevyys testattiin Mantelin testillä. F-statistiikka eri hierarkkisten maantieteellisten alueiden välillä laskettiin ARLEQUIN (ver 3.1.) - ohjelmalla (Escoffier 2006). Molekulaarisella varianssianalyysillä (Excoffier ym. 1992) estimoidaan varianssianalyysille analogisesti geneettisen muuntelun määrän jakautumista eri hierarkiatasoille ja eri varianssikomponenttien merkitsevyyttä. AMOVA-analyysit toteutettiin ARLEQUIN (ver 3.1.) - ohjelmalla (Escoffier 2006). Populaatiokoon pullonkaulojen aikana niistä katoavat harvinaiset alleelit. Lisäksi niissä on suhteessa havaittuun alleelimäärään liikaa heterotsygoottisyyttä, koska pullonkaulat vaikuttavat heterotsygoottisuuteen määrään suhteellisesti alleelimääriä vähemmän (Cornuet & Luikart, 1996). Pullonkaulojen vaikutuksia alleelifrekvenssijakaumaan ja heterotsygootisyyden määrään arvioitiin BOTTLENECK-ohjelmalla (Cornuet & Luikart, 1996). Teoreettinen alleelien ja heterotsygotian suhde tasapainopopulaatioissa riippuu käytetystä mutaatiomallista, ja analyysissä käytettiin harmaahylkeiden mikrosatellittilokuksille TPM-mallia, jossa 95 % mutaatioista lokuksessa oletettiin tapahtuvan peräkkäisten toistojaksojen määrän välillä ja 5 % kaikkien mahdollisten toistojaksojen määrän välillä. Teoreettista ja havaittua heterotsygoottisuuden määrää verrattiin BOTTLENECK-ohjelman Wilcoxonin testillä. Populaation demografista historiaa tutkittiin koalesenssiteoriaan pohjautuvilla bayesilaisilla Monte Carlo Markovin ketju-simulaatioilla (Beaumont 1999). Näissä simulaatioissa lähdetään liikkeelle nykyisestä alleelifrekvenssijakaumasta ja pyritään siitä taaksepäin koalesenssimallin mukaisesti simuloimalla arvioimaan kannan aikaisempaa demografista historiaa ja populaatioparametrejä. Simulaatioisssa käytettiin MSVAR-ohjelmaa ver. 1.3 (Beaumont 1999), jolla arvioidaan nykyisen ja ennen kannan alenemista vallinneen tehollisen populaatiokoon sekä kannan alenemisen ajankohdan posterior todennäköisyysjakaumia. Eri lähtöarvoilla tehtiin viisi erillistä simulaatiota. Simulaatioissa käytetty kannan alenemisen malli oli lineaarinen (eksponentiaalisen vaihtoehdon sijaan), ja sukupolvien välinen aika seitsemää vuotta. Kussakin simulaatiossa käytettiin ohennetun Markovin ketjun tilaa, joissa ohennettu ketju sisälsi ketjun joka tilan (yhteensä 10 8 tilaa). Ohennetun ketjun alusta jätettiin pois 10 % tiloista (burn in), joita ei sisällytetty lopullisiin tuloksiin. Populaation tehollista populaatiokokoa pyrittiin arvioimaan myös kytkentäepätasapainon määrään perustuvalla menetelmällä (Hill 1977, Waples 1998, 2006). Äärellisissä populaatioissa sattuma luo kytkentäepätasapainoa eri lokus- 5

6 ten alleeleiden välille, ja kytkentäepätasapainon määrä on riippuvainen tehollisesta populaatiokoosta. Tutkimalla populaation kytkentäepätasapainon määrä neutraaleissa markkereissa voidaan myös tehollinen populaatiokoko arvioida. Tehollisen populaatiokoon estimointiin käytettiin LDNE-ohjelmaa (Waples & Doi 2008), jossa joitakin menetelmän aikaisempia systemaattisia virheitä on korjattu (Waples 2006). Tehollisen populaatiokoon 95 % luottamusvälit arvioitiin eri lokusten yli tehdyllä jacknife-menetelmällä, joka antaa välille tarkemman estimaatin kuin aikaisemmin yleisesti käytetty parametrinen menetelmä (Waples 2006). 3. Tulokset ja johtopäätökset 3.1. Geneettinen monimuotoisuus Harmaahyljekantamme geneettisen muuntelun määrä oli kohtuullisen suurta (Liite 1, Taulukko 2) kaikilla merialueilla ja yhdistetyssä aineistossa. Merialueet jaettiin myös pohjoisiin (Perämeri, Merenkurkku, Selkämeri) ja eteläisiin (Ahvenanmeri, Saaristomeri, Suomenlahti) alueisiin, mutta niiden välillä ei havaittu permutaatiotestillä merkitsevää eroa missään geneettisen muuntelun tunnusluvussa (H EXP, H OBS, A, F IS ). Havaitun ja odotetun heterotsogotian määrä näyttivät hieman alhaisemmalta kuin muilla alueilla harmaahylkeillä havaitut (taulukko 1). Pääosin se johtuu yhdestä lokuksesta (SPGv10), joka on kehitetty alunperin norpalle (Goodman 1997), ja jota ei ole käytetty vertailtavissa harmaahyljetutkimuksissa. Siitä löydettiin vain kaksi alleelia ja hyvin vähän heterotsygotiaa (Taulukko 1, Liite 1). Jos tämä lokus jätetään pois tuloksista keskimääräinen odotettu (0.77) ja havaittu heterotsygotia (0.76) ovat hyvin samalla tasolla kuin muilla alueilla tehdyissä tutkimuksissa. Taulukko 2. Keskimääräinen odotettu (H exp ) ja havaittu (H obs ) heterotsygotia, sekä sukusiitoskerroin (F IS ) harmaahylkeellä tässä ja aikaisemmin tehdyissä tutkimuksissa. Alue H exp H obs A F IS Viite Suomi Ruotsi Kaikki 0,72 0,71 7,7 0,02 Tämä tutkimus Pohjoiset alueet 0,72 0,71 7,5 0,01 Tämä tutkimus Eteläiset alueet 0,71 0,73 6,5 0,05 Tämä tutkimus Pohjanlahti 0,77 0,76 Karlsson, 2003 Tukholman 0,79 0,76 Karlsson, 2003 saaristo Viro 0,77 0,67 Karlsson, 2003 Brittein saaret Isle of May 0,74 Allen at al., 1995 North Rona 0,75 Allen at al,

7 Harmaahylkeen mikrosatelliittilokukset olivat Hardy-Weinbergin tasapainossa lukuun ottamatta lokusta Hii15, joka poikkesi tasapainosta erittäin merkitsevästi (p < 0.001). MICROCHECKER-ohjelmalla (van Oosterhout ym. 2004) tehdyn analyysin mukaan poikkeaman syynä olisi todennäköisesti lokuksessa oleva nolla-alleeli (jolloin tunnistuskohdan sekvenssi on muuttunut siten ettei lokus monistu ollenkaan PCR-reaktiossa), ja tämän vuoksi osa heterotsygooteista tulkitaan homotsygooteiksi. MICROCHECKER-ohjelmalla nolla-alleelin frekvenssin arvioitiin olevan vain (Brookfield I menetelmä; ks. van Oosterhout ym. 2004), joten lokus pidettiin mukana jatkoanalyyseissä. Sukusiitoskertointen (F IS ) estimaatit olivat yhdistetyssä aineistossa, sekä pohjoisella että eteläisellä merialueella hyvin lähellä nollaa (Taulukko 2), mikä viittaa siihen että pariutuminen kannassa on jokseenkin satunnaista. Tutkimuksessa ei löydetty merkitsevää (χ 2 =27.99; df = 30; p = 0.571) kytkentäepätasapainoa eri lokusten alleelien välille Geneettinen rakenne STRUCTURE-ohjelmalla tehdyn analyysin mukaan mallin selittävyyttä kuvaava log-likelihood arvo pienenee aina lisääntymisyksiköiden (k) lukumäärään viisi ja alkaa kasvaa uudelleen sen jälkeen. Suurin log-likelihood arvo saavutettiin kuitenkin k:n arvolla yksi, ja se on ainoa malli johon selittää aineiston tyydyttävästi (p 1). Analyysin perusteella hyljekanta näyttäisi siis muodostavan ainoastaan yhden panmiktisen populaation, eikä siinä ole havaittavissa kryptistä populaatiorakennetta , ,00 Lnlikelihood k.a SE -5600, , , , , k Kuva 1. STRUCTURE analyysin log-likelihood arvot eri k:n arvoilla 7

8 Halliyksilöiden sijoittuminen FCA-analyysin kahden ensimmäisen faktoriakselin suhteen on esitetty kuvassa 2. Eri merialueiden yksilöt eivät näyttäsi ryhmittyvän pyyntipaikkansa mukaisiin ryhmiin vaan eri alueiden välillä oli hyvin paljon päällekkäisyyttä. 1,00 Alue Perämeri Merenkurkku Saaristomeri Selkämeri Ahvenanamaa Suomenlahti 0,50 FCA-akseli 2 0,00-0,50-1,00-0,75-0,50-0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 FCA-akseli 1 Kuva 2. Kaksidimensionaalinen FCA-analyysi, joka kuvaa eri halliyksilöiden multilokusgenotyyppien keskinäistä sukulaisuutta. AMOVA-analyysissa ei eri merialueiden välille löydetty merkitsevää eroa alleelifrekvensseissä kaksitasoisessa (yksilö ja merialue) hierarkkisessa mallissa (Taulukko 3). Mallissa muuntelusta merialueiden välistä oli ainoastaan 0.3 % ja alueiden välistä geneettistä erilaistumista kuvaava F ST -arvo oli hyvin alhainen (0.003). Kolmen tason hierarkkisessa mallissa (yksilö, merialue ja maantieteellinen alue), jossa merialueet oli ryhmitelty pohjoisiin ja eteläisiin ryhmiin, ei eri ryhmien välillä myöskään löydetty eroa alleelifrekvensseissä (Taulukko 2), joten AMOVA-analyysi ei viitannut merkitsevään erilaistumiseen eri maantieteellisten alueiden välillä. 8

9 Taulukko 3. AMOVA-analyysi geneettisen muuntelun jakautumisesta eri hierarkkisille tasoille kahdella eri populaatiorakenteen mallilla. Ei-maantieteellistä ryhmittelyä Muuntelukomponentti d.f. Neliösumma Varianssi komponetti Merialueiden välillä Yksilöiden välillä Yhteensä Ryhmittely pohjoiseen ja eteläiseen Muuntelukomponentti d.f. Neliösumma Varianssi komponetti Ryhmien välillä Merialueiden välillä Yksilöiden välillä Yhteensä Yksilöiden geneettistä erilaistumista eri merialueiden välillä mitattiin myös parittaisilla F ST -arvolla (Taulukko 4). Alueiden välisen erilaistumisen estimaatit olivat erittäin alhaisia. Perämeren ja Selkämeren välillä oli merkitsevä ero (0,025), joka ei kuitenkaan ollut enää merkitsevä käytettäessä Bonferronikorjausta. Taulukko 4. Merialueiden väliset F ST -arvot. Ennen Bonferroni korjausta merkitsevät arvot on lihavoitu. Perämeri Merenkurkku Selkämeri Ahvenanmeri Saaristomeri Merenkurkku Selkämeri Ahvenanmeri Saaristomeri Suomenlahti % % Eri merialueiden väliset F ST -arvot eivät näyttäneet olevan riippuvaisia niiden välisestä maantieteellisestä etäisyydestä. Korrelaatio F ST -estimaattien ja maantieteellisten etäisyyksien välillä (Kuva 3) näytti olevan jopa negatiivinen, mutta ei merkitsevä (r M = -0.21; p < 0.05). 9

10 0,040 0,020 Fst 0,000-0,020-0, Etäisyys (km) Kuva 3. Eri merialueiden parittaisten geneettisten (F ST ) ja maantieteellisten etäisyyksien suhde Tulosten perusteella hyljekannassamme ei näyttäisi olevan geneettistä populaatiorakennetta, ja sitä voidaan hyvin käsitellä yhtenä hoitoyksikkönä. 3.3.Hallikannan demografia Hallikannan lukujen populaation pullonkaula ei näy harvinaisten alleelien puuttumisena populaation alleelifrekvenssijakaumassa. Frekvenssijakauma on tyypillinen tasapainopopulaatiolle (Kuva 4), jossa harvinaisten alleelien luokka on kaikista yleisin. Heterotsygoottisuuden määrä suhteessa alleelimäärään oli teoreettista hiukan suurempi, mutta ei kuitenkaan merkitsevä (Wilcoxonin testi; p = 0.065). Harmaahylkeen lukujen populaation pullonkaula ei ehkä kuitenkaan ole ollut geneettisesti niin alhainen, että se näkyisi harvinaisten alleelien puuttumisena. Toisaalta on myös mahdollista, että hallikantaamme on voinut tulla pullonkaulan jälkeen migranttien myötä harvinaisia alleeleita Itä-Atlantin kannasta. Geenivirran määrää Itämeren populaation ja Itä-Atlantin ei kuitenkaan tunneta ja sen määrä olisi myös aiheellista tutkia. 10

11 0,60 0,50 0,40 Frekvenssi 0,30 0,20 0,10 0, Alleelifrekvenssiluokka Kuva 4. Alleelifrekvenssijakauma Itämeren harmaahyljekannassa. Bayesilaisten MCMC-simulaatioiden (Beuamont 1999) mukaan harmaahyljekantamme olisi pienentynyt pitkän ajan kuluessa. Kaikissa simulaatioissa nykyinen tehollinen populaatiokoko oli selkeästi pienempi kuin aikaisemmin vallinnut. Simulaatioiden perusteella nykyinen efektiivinen populaatiokoko olisi keskimäärin 1289 (viidessä simulaatiossa vaihteluväli ) ja populaation alenemisen aikaista edeltänyt koko olisi ollut lähes sata kertaa suurempi (Ne = ; vaihteluväli ). Käytetyllä seitsemän vuoden sukupolven välillä populaation aleneminen olisi alkanut jo viimeisen jääkauden aikana (17896 vuotta; vaihteluväli ). Todennäköisesti populaation taantumisen ajankohdan arvio kuvaakin Itämeren populaation erkaantumista aikaisemman yhtenäisestä Atlantin populaatiosta. Hallikannan efektiivistä kokoa arvioitiin myös kytkentäepätasapainoon perustuvalla menetelmällä (Hill 1981, Waples 1989, 2006). Tällä menetelmällä saatu tehollinen populaatiokoko oli 736 yksilöä (95 % luottamusväli 260 ). Menetelmällä saatua estimaattia tulee pitää vain suuntaa-antavana, ja hallikannan läpikäymän pullonkaulan vuoksi se on todennäköisesti liian pieni. Pullonkaulan äskettäin läpi käyneelle populaatiolle menetelmä antaa teholliselle populaatiokoolle muutaman sukupolven ajan liian pienen estimaatin (Waples 2006). Merialueittemme harmaahylkeen tehollinen populaatiokoko näyttäisi kohtuullisen suurelta. Tosin Etelä-Amerikan turkishylkeelle (Arctocephalus australis) suurempaakin estimoitua efektiivistä populaatiokokoa (2153) on pidetty lajin säilymisen kannalta liian pienenä elinvoimaiselle populaatiolle (de Oliveira ym. 2005). 11

12 4. Tulosten hyödyntäminen ja jatkotutkimustarpeet Hankkeen tuloksille on nähtävissä suoria hyödyntämismahdollisuuksia hallikannan hoidon suunnittelussa. Hankkeen tulokset sisällytetään Oulun yliopistossa valmisteilla olevaan väitöskirjatyöhön (Paula Moisio), jota ohjaavat Jouni Aspi, Minna Ruokonen ja Mervi Kunnasranta. Hankkeen tuloksia hyödynnetään myös HELCOM Seal Expert Group in populaatiokokotyöryhmän toiminnassa (Suomen edustajana ryhmässä Sauli Härkönen, METLA). Tutkimusta jatketaan edelleen, jolloin selvitetään hallien populaatiogeneettistä monimuotoisuutta laajemminkin Itämerellä ja lähialueilla. Tulokset tullaan myöhemmin julkaisemaan kansainvälisessä vertaisarviointikäytännön omaavassa julkaisusarjassa. 5. Kirjallisuus Allen PJ, Amos W, Pomeroy PP, Twiss SD Microsatellite variation in grey seals (Halichoerus grypus) shows evidence of genetic differentiation between two British breeding colonies. Molecular Ecology 4: Beaumont MA Detecting population expansion and decline using microsatellites. Genetics, 153, Belkhir K ym GENETIX, logiciel sous WindowsTM pour la génétique analysis des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier. Benzécri JP L analyse des données, tome II: l analyse des correspondances. Dunod: Paris. Bergman A Health condition of the Baltic grey seal (Halichoerus grypus) during two decades. APMIS 107: Black WC, Krafsur ES A FORTRAN program for the calculation and analysis of two-locus linkage disequilibrium coefficients. Theoretical and Applied Genetics Cornuet JM. & Luikart G Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data. Genetics 144: de Oliveira LR, Arias-Schreiberd M, Meyera D, Morgantea JS Effective population size in a bottlenecked fur seal population. Biological Conservation 131: Dietz R, Teilmann J, Henriksen OD & Laidre K Movements of seals from Rødsand seal sanctuary monitored by satellite telemetry. Relative importance of the Nysted Offshore wind farm area to the seals. National Environmental Research Institute, NERI technical Report No 429. Excoffier, L., Smouse, P., and Quattro, J Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: Excoffier L Arlequin. An Integrated Software Package for Population Genetics Analysis. Ver Falush D, Stephens M, Pritchard JK Inference of population structure from multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies. Genetics 164:

13 Frankham, R Effective population size/adult population size ratios in wildlife: A review. Genetical Research 66: Gaggiotti OE. Jones, F, Lee WM, Amos W, Harwood J & Nicholsk RA Nature 416: Goudet J FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). fstat.html. Goodman SJ Development of PCR primers derived from the European harbour seal (Phoca vitulina vitulina) which amplify microsatellite loci in diverse pinniped species. Animal Genetics 28: Goodman SJ Patterns of Extensive Genetic Differentiation and Variation Among European Harbor Seals (Phoca vitulina vitulina) Revealed Using Microsatellite DNA Polymorphisms. Molecular Biology and Evolution 15: Harding KC. & Härkönen T Development in the Baltic grey seal (Halichoerus grypus) and ringed seal (Phoca hispida) populations during the 20th century. Ambio 28: Harding KC, Härkönen T, Helander B & Karlsson O Population assessment and extinction risk. In: Haugh, T., Hammill, M. & Olafsdottir, D. (eds.): Grey seals in the North Atlantic and the Baltic s Hedrick PW Genetics of Populations. 2nd. ed. Jones & Bartlett, Sudbyry MA. 553 s. Helle E. 1980a Reproduction, size and structure of the Baltic ringed seal population of the Bothnian Bay. PhD thesis, University of Oulu. Helle E. 1980b. Aerial census of ringed seals Pusa hispida basking on the ice of the Bothnian Bay, Baltic. Holoarctic Ecology 3: Helle, E Reproductive trends and occurrence of organochlorines and heavy metals in the Baltic seal populations. International Council for the Exploration of the Sea (CM papers and reports) E: 37. Helle E. & Stenman, O Itämeren hyljekannat Maailman Luonnon Säätiön Suomen Rahaston raportteja 1, 76 s. Helle E., Olsson, M. & Jenssen, S. 1976a. DDT and PCB levels and reproduction in ringed seal from the Bothnian Bay. Ambio 5: Helle E., Olsson, M. & Jenssen, S. 1976b. PCB levels correlated with pathological changes in seal uteri. Ambio 5: Helle E., Nyman, M & Stenman, O Reproductive capacity of grey and inged seal females in Finland. International conference on Baltic seals, February Helsinki, Finland. Hill WG Estimation of effective population size from data on linkage disequilibrium. Genetical Research 38: Jüssi M Breeding habitat preference and reproduction success of Baltic grey seal (Halichoerus grypus). Master thesis, University of Tartu. Karlsson O Population structure, movements and site fidelity of grey seals in the Baltic Sea. Ph.D thesis, University of Stockholm. Kokko H, Lindström J. & Ranta, E Risk analysis of hunting of seal populations in the Baltic. Conservation Biology 11: Kokko H.Helle E, Lindström J, Ranta E, Sipilä T. & Courchamp F Backcasting population sizes of ringed and grey seals in the Baltic and Lake Saimaa during the 20th century: Annales Zoologici Fennici 36:

14 Palo JU, Mäkinen HS, Helle E, Stenman O & Väinölä R Microsatellite variation in ringed seals (Phoca hispida): genetic structure and history of the Baltic Sea population. Heredity 86: Pomeroy PP, Twiss SD & Duck CD Expansion of a grey seal breeding colony change of pupping site use at the Isle of May, Scotland. Journal of Zoology, London 250: Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 155, Sambrook J. & Russell DW Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York Schwarz J, Harde K., von Nordheim H. & Dinter W. (toim.) Wiederansiedlung der Ostseekegelrobbe (Halichoerus grypus balticus) an der deutchen Ostseekuste. Bundesamt fur naturschutz, 206 s. Sjöberg, M Behaviour and movements of the Baltic grey seal. PhD Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences. van Oosterhout C, Hutchinson WF, Wills DPM, Shipley P MICROCHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4: Waples RS A generalized approach for estimating effective population size from temporal changes in allele frequency. Genetics 121: Waples, RS A bias correction for estimates of effective population size based on linkage disequilibrium at unlinked gene loci. Conservation Genetics 7: Waples RS & Doi, C Ldne: a program for estimating effective population size from data on linkage disequilibrium. Molecular Ecology Notes (painossa). 14

15 Liite 1. Odotettu (H exp ) ja havaittu (H obs ) heterotsygotia, alleelien lukumäärä (A) and sukusiitoskerroin (F IS ) tutkituissa mikrosatelliittilokuksissakuudella eri merialueilla Perämeri (N = 92) Merenkurkku (N = 41) Selkämeri (N = 7) Ahvenanmeri (N = 6) Saaristomeri (N = 10) Suomenlahti (N = 12) Locus H exp H obs A F IS H exp H obs A F IS H exp H obs A F IS H exp H obs A F IS H exp H obs A F IS H exp H obs A F IS Hg4.2 0,66 0,65 6-0,02 0,65 0,63 5 0,03 0,44 0,57 3-0,23 0,65 0,50 4 0,32 0,65 0,60 4 0,14 0,68 0,83 4-0,17 Hg6.3 0,83 0,81 7-0,07 0,82 0,81 7 0,03 0,77 0,86 5-0,04 0,69 0,83 4-0,11 0,80 0,90 6-0,07 0,78 0,92 6-0,13 Hg3.6 0,77 0,74 5-0,10 0,74 0,73 6 0,03 0,57 0,43 3 0,32 0,69 0,83 4-0,11 0,66 0,60 5 0,14 0,77 0,75 6 0,06 Hg6.1 0,77 0,73 6 0,06 0,71 0,78 5-0,08 0,72 0,57 5 0,28 0,74 0,67 5 0,18 0,81 1,00 6-0,18 0,71 0,83 5-0,13 SGPv9 0,76 0,76 7 0,02 0,74 0,73 7 0,04 0,78 0,86 6-0,03 0,67 1,00 5-0,43 0,72 0,80 5-0,07 0,74 0,75 6 0,05 Hg8.9 0,79 0, ,07 0,81 0, ,10 0,82 1,00 7-0,15 0,76 0,83 7 0,00 0,81 0,89 7-0,03 0,70 0,50 4 0,33 Hgdii 0,72 0,70 6 0,04 0,67 0,61 5 0,10 0,73 0,86 5-0,15 0,71 0,33 4 0,59 0,69 0,50 5 0,32 0,81 0,70 4-0,09 Hg8.10 0,77 0,80 8-0,03 0,76 0,70 8 0,09 0,64 0,86 3-0,26 0,76 0,83 5 0,00 0,69 0,80 4-0,11 0,81 0,75 7 0,13 HI15 0,89 0, ,21 0,91 0, ,40 0,88 0,57 9 0,42 0,88 0,57 7 0,09 0,83 0,80 9 0,09 0,89 0, ,19 SGPv10 0,22 0,26 2-0,14 0,15 0,17 2-0,08 0,24 0,28 2-0,09 0,15 0,17 2 0,00 0,40 0,11 2 0,75 0,15 0,17 2-0,05 Kaikki 0,72 0,72 7,2 0,00 0,70 0,69 7,0 0,02 0,63 0,69 4,9 0,04 0,67 0,68 4,7 0,07 0,71 0,70 5,3 0,06 0,69 0,70 5,6 0,03 15