(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT (45) Patettl. p3.tozit zsz.14clw 20 C4 10. (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6

Transkriptio

1 S U O M I F I N L A N D II (B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT (45) Patettl. p3.tozit zsz.14clw 20 C4 10 (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6 C 12N 9/18, A 61K 39/02, C 12P 19/44 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (1:1) (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (71) Hakija - Sökande (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US88/01244 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P 1. Board of Regents, The University of Texas System, 201 West Seventh Street, Austin, TX 78701, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Munford, Robert S., 5504 Greenbrier, Dallas, TX 75209, USA, (US) 2. Hall, Catherine L., 6338 Vickery Boulevard, Dallas, TX 75214, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Asyylioksiasyylihydrolaasi ja sen käyttö Acyloxiacylhydrolas och dess användning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, marraskuu 1983, Hall, C.L. ja/och Munford, R.S., p , Science, vol. 234, , Munford, R.S. ja/och Hall, C.L., p ; Biological Abstracts, vol. 80, 1985, Munford, R.S. ja/och Hall, C.L., tiivistelmä nro 41027; Biological Abstracts/RRM, Munford, R.S., tiivistelmä nro ; Chemical Abstracts, vol. 72, 1970, Gimber, P. ja/och Rafter, G.W., nro 40641c; Chemical Abstracts, vol. 100, 1984, Galanos, C. et al., nro f; Chemical Abstracts, vol. 101, 1984, Kotani, S. et al., nro w, SE B (A 61K 39/02) (57) Tiivistelmä Sammandrag Ihmisen promyelosyyttisolulinjasta HL-60 saadun asyloksiasyylihydrolaasin on havaittu spesifisesti hydrolysoivan rasvahappoja niiden esterisidoksista 3-hydroksirasvahappgjen hydroksiryhmiin, joista viimeksi mainitut rasvahapot puolestaan ovat sitoutuneet LPS:n giukosaminyylitähteisiin. Hydrolysoidut rasvahapot voivat olla dodekaanihappo, tetradekaanihappo ja heksadekaanihappo. Tämän entsyymin molekyylipaino määritettynä kromatografisesti geelisuodatusta käyttäen oli daltonia. Tuotetaan muunnettuja bakteeri-lps:ja, jotka oleellisesti eivät sisällä LPS:N lipidi A:n glukosaminyyliryhmään kovalenttisesti sitoutuneiden 3-hydroksirasvahappojen hydroksyyliryhmään sitoutuneita rasvahappoja. Koska lipidi A -osan rakenne on erittäin hyvin säilynyt, asyloksiasyylihydrolaasi voi vaikuttaa monien erilaisten patogeenisten bakteerien (esimerkiksi Salmonella, Escherichia, Hemophilus ja Neisseria) LPS:ihin. Tällaiset muunnetut LPS:t, joiden myrkyllisyys on vähentynyt enemmän kuin immunostimulatoorinen aktiivisuus, voivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia: (1) rokotteina estämään gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia sairauksia indusoimalla vasta-aineita LPS:n 0-polysakkaridia tai R-ydin-antigeeneja vastaan, (2) vastamyrkkyinä gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman verenmyrkytyksen (septinen shokki) hoitamiseksi tai estämiseksi tai (3) adjuvantteina lisäämään vasta-aineiden muodostumista muita antigeeneja vastaan. Asyloksiasyylihydrolaasi voi itse olla ennalta ehkäisevästi tai terapeuttisesti käyttökelpoinen endogeenisen LPS:n toksisuuden neutraloimiseksi potilaissa, joilla on gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia sairauksia. Entsyymiä voidaan käyttää myös myrkyllisen LPS:n poistamiseksi terapeuttisista injektoitavista aineista.

2 95599 Ett acyloxiacyl-hydrolas från den mänskliga pn~locytcellinjen HL-60 har befunnits hydrolysera fettsyror specifikt från deras esterbindningar till hydroxigrupper i 3-hydroxifettsyror, vilka fettsyror i sin tur är bundna vid LPS-glukosaminylrester. De hydrolyserade fettsyrorna kan inkludera dodekansyra, tetradekansyra och hexadekansyra. Detta enzym uppvisade en molekylvikt, beräknad genom gelexklusionskromatografi, mellan ca och ca dalton. Förändrat, bakteriellt LPS, vilket väsentligen saknar fettsyror som via esterbindningar är bundna vid hydroxigrupper 1 3-hydroxifettsyror, vilka i sin tur är kovalent bundna vid en glukosaminyldet av LPS-lipid A, produceras. Till följd av att strukturen hos lipid A-delen är i hög grad bevarad, kan acyloxiacylhydrolaset inverka på LPS av flera olika, patogeniska bakterier (t.ex. Salmonella, Escherichia, Hemophilus och Neisseria). Dylikt förändrat, bakteriellt LPS, vilket har toxiteten reducerad i högre grad än den immunostimulatoriska aktiviteten, kan vara terapeutiskt användbart: (1) som vaccin för förhindrande av gramnegativa, bakteriella sjukdomar genom inducering av antikroppar mot 0-polysackarid eller R-kärn-antigener hos LPS, (2) som motgift för behandling eller förhindrande av förgiftningar 1 kroppen (septisk chock), vilka förorsakats av gram-negativa bakterier, eller (3) som hjälpmedel för ökande av antikroppbildningen mot andra antigener. Acyloxiacylhydrolaset som sådant kan vara profylaktiskt eller terapeutiskt användbart vid avgiftningen av endogent LPS hos patienter med gram-negativa, bakteriella sjukdomar. Enzymet kan även användas för avlägsning av toxiskt LPS från terapeutiska injektionsmedel.

3 Asyylioksiasyylihydrolaasi ja sen käyttö Tämä keksintö koskee asyylioksiasyylihydrolaasia ja menetelmä, joissa sitä käytetään bakteeriendotoksiinin 5 (lipopolysakkaridin) toksisuuden neutraloimiseksi sen lipidi A -osaa entsymaattisesti modifioimalla ja muunnettujen bakteeriperäisten lipopolysakkaridien valmistamiseksi. Eläimillä on monimutkainen tulehdusvastejärjestelmä gram-negatiivisten bakteerien kudokseen tunkeutumista 10 vastaan. Monet näistä vasteista näyttävät olevan bakteerin ulommaisessa kalvossa esiintyvien lipopolysakkaridien (LPS) aiheuttamia. On paljon näyttöä siitä, että LPS:n lipidi A -alue stimuloi suoraan isäntäsoluja, kuten makrofageja, neutrofiilejä ja endoteelisoluja, jotka sitten 15 välittävät tulehdukselliset muutokset. Vasteet LPS:lle voivat olla toksisia (verenpaineen aleneminen, hyytymishäiriöt, kuolema) tai infektoidulla isännälle hyödyllisiä (vasta-aineiden muodostumisen lisääntyminen, fagosyyttien mobilisaatio, akuutin faasin proteiinin synteesi ym.). 20 Tyypillisissä gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkarideissa (LPS) on kolme tärkeää rakenteellista aluetta: 0-polysakkaridi, R-ydinoligosakkaridi sekä lipidi A (kuvio 1 ja kuvio 2). 0-polysakkaridin rakenne eroaa suuresti eri organismeissa, jopa saman lajin sisällä, ja 25 sen antigeenisyyteen perustuu bakteerien serologinen tyypitys. R-alue muodostaa sillan 0-antigeenin ja lipidi A:n välille; sen rakenne on samanlainen useimmissa gram-negatiivisissa bakteereissa. LPS:ia vastaan muodostetut vasta-aineet (tyypillisesti 0- tai R-ydin -antigeenisia koh- 30 tia vastaan) saattavat edistää fagosytoosia tai bakteerien tappamista, tai ne voivat lisätä LPS:ien poistamista verenkierrosta paikkoihin (maksa, perna), joissa LPS:t hajoitetaan. 0-antigeeni on LPS:ien antigeenisin komponentti, jonka toksisuus on kuitenkin vähäinen. Lipidi A 35 sitä vastoin on heikosti antigeeninen mutta sisältää myr-

4 kyllisen molekyylin ytimen. Lipidi A -osan rakenne on silmiinpistävän samanlainen suurella joukolla eri bakteerisukuj a. Enteeristen bakteerien (esim. Salmonella, E. coli) 5 lipidi A on glukoosiamiinidisakkaridi, joka on fosforyloitu asemissa 1 ja 4' ja jossa on kuusi tai seitsemän kovalenttisesti kiinnittynyttä rasvahappoa (kuvio 1). Neljä 3- hydroksitetradekanoaatti (3-0H-14:0) -molekyyliä on kiinnittynyt glukoosiamiinidisakkaridiin asemissa 2, 3, 2' ja 10 3'; 3-0H14:0-tähteiden hydroksyyliryhmät asemissa 2' ja 3' (ja joskus asemassa 2) on substituoitu tavallisilla rasvahapoilla (dodekanoaatti, tetradekanoaatti, heksadekanoaatti), jolloin muodostuu asyylioksiasyyliryhmiä. Vuonna 1983 raportoitiin uuden entsymaattisen aktiivisuuden löytymi- 15 nen. Tämä entsyymi oli asyylioksiasyylihydrolaasi, joka löytyi ihmisen perifeerisen veren neutrofiilien granulafraktiosta ja joka selektiivisesti poisti hydroksyloimattomia asyyliketjuja Salmonella typhimuriumin LPS:sta (Hall ja Munford, Proc. Nat. Acad. Sci. 80 (1983) ). Tiedettiin, että Dictyostelium discoideum (limasieni), joka käyttää gram-negatiivisia bakteereja tärkeimpänä ravintoaineenaan, sisältää entsyymejä, jotka poistavat hydroksyloimattomia ja hydroksyloituja asyyliketjuja LPS:sta [Rosner et al., J. Biol. Chem. 254 (1979) ]. Gimberin ja Rafterin kokeet [Arch. Biochem. Biophys. 135 (1969) 14-20] olivat myös viitanneet siihen, että koskemattomat neutrofiilit suorittavat LPS:n deasylaation. Viimeaikaiset tutkimukset kemiallisesti syntetisoi- 30 tujen lipidi A -analogien ja lipidi A:n biosynteettisten esiasteiden biologisista vaikutuksista ovat tuottaneet arvokasta tietoa rakenteen ja aktiivisuuden välisistä suhteista [Galanos et al., Eur. J. Biochem. 140 (1984) 221; Takada et al., Infect. & Immun. 48 (1985) 219; Kotani et 35 al., Infect. Immun. 49 (1985) 225 ja Homma et al., J.

5 Biochem. 98 (1985) 395]. Lipidi A -analogit, joista puuttuu hydroksyloimattomat asyyliketjut, eivät reagoi dermaalisessa Shwartzmanin kokeessa, ja niiden pyrogeenisuus on vähäisempi, vaikka ne ovat lähes yhtä tehokkaita kuin täy- 5 dellinen lipidi A erilaisissa määritysmenetelmissä, joissa mitataan immunologista stimulaatiota, kuten B-solumitogeenisyyttä, adjuvanttiominaisuutta ja makrofagien stimulaatiota vapauttamaan PGE 2 :ta. Asyylioksiasyylihydrolaasin vaikutukset LPS:n biologisiin aktiivisuuksiin pitävät 10 yleisesti yhtä näiden aikaisempien havaintojen kanssa: asyylioksiasyylihydrolaasi neutraloi LPS:n toksisuuden tuhoamatta immunostimulatorista aktiivisuutta. Esillä oleva keksintö koskee asyylioksiasyylihydrolaasia, jolle on tunnusomaista, että se on puhdistettu vä- 15 hintään kertaisesti ja se pystyy hydrolysoimaan rasvahappojen ja lipopolysakkaridin glukoosiaminyylitähteeseen sitoutuneen 3-hydroksirasvahapon hydroksyyliryhmän välisiä esterisidoksia hydrolysoimatta 3-hydroksirasvahapon ja lipopolysakkaridin glukoosiaminyylitähteiden väli- 20 siä esteri- tai amidisidoksia, sen molekyylipaino määritettynä kromatografisesti geelisuodatusta käyttäen on noin daltonia ja määritettynä elektroforeettisesti 11-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä natriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa välillä noin ja daltonia, siitä oleellisesti puuttuu hydrolyyttinen aktiivisuus kolesteroliestereitä, glyserolitrioleaattia ja lipopolysakkaridin fosforyyliryhmiä kohtaan, sillä on sitoutumisaffiniteettia lipopolysakkaridia kohtaan ja se voidaan saada menetelmällä, joka käsittää vaiheet, joissa 30 otetaan ihmisen promyelosyyttisolulinjan HL-60 -soluja tai ihmisen perifeerisen veren neutrofiilejä, solut rikotaan entsyymiä sisältävän lysaatin saamiseksi, lysaatti tehdään liukoiseksi ja 35 entsyymi erotetaan johtamalla lysaatti kromatografisten puhdistusvaiheiden läpi, jotka käsittävät affini-

6 teettikromatografian, hydrofobinen interaktio -kromatografian, hydroksiapatiittikromatografian ja ioninvaihtokromatografian. Hydrolysoituja rasvahappoja voivat olla esimerkiksi dodekaanihappo, tetradekaanihappo ja heksadekaani- 5 happo. Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää muunnetun bakteeriperäisen lipopolysakkaridin valmistamiseksi, jossa on 3-hydroksirasvahappoja kovalenttisesti sitoutuneena lipopolysakkaridin lipidi A:n glukoosiaminyyliryh- 10 miin, jolloin 3-hydroksirasvahapoista puuttuvat esteröidyt 3-hydroksiryhmät, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että hydrolysoidaan rasvahappojen ja lipopolysakkaridin glukoosiaminyylitähteeseen sitoutuneen 3-hydroksirasvahapon hydroksyyliryhmän välisiä esterisidoksia hydrolysoi- 15 matta 3-hydroksirasvahapon ja lipopolysakkaridin glukoosiaminyylitähteiden välisiä esteri- tai amidisidoksia käyttäen edellä mainittua asyylioksiasyylihydrolaasia. Mainituissa muunnetuissa bakteeri-lps:issa on luon- teenomaisesti sidottuja 3-hydroksirasvahappoja, joiden 20 hydroksiryhmät ainakin oleellisesti ovat esteröitymättömiä. Koska lipidi A -osan rakenne säilyy suurelta osin, asyylioksiasyylihydrolaasi voi vaikuttaa monien erilaisten patogeenisten bakteerien (joista tutkittuja ovat Salmonella, Escherichia, Hemophilus ja Neisseria) LPS:ihin. 25 Nämä muunnetut bakteeri-lps:t, joiden toksisuus on vähentynyt enemmän kuin immunostimulatorinen aktiivisuus, voivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia. Tämä terapeuttinen käyttökelpoisuus sisältää muunnettujen LPS:ien käytön (1) rokotteina gram-negatiivisten bakteerien ai- 30 heuttamien sairauksien estämiseksi indusoimalla vasta-ai- neita 0-polysakkarideja tai R-ydin-antigeeneja vastaan, (2) vastamyrkkyinä gram-negatiivisten bakteerien aiheutta- mien verenmyrkytysten ("septinen shokki") hoidossa tai ennalta ehkäisyssä tai (3) adjuvantteina muita antigeene- 35 ja vastaan nostettujen vasta-aineiden muodostumisen lisää- miseksi.

7 Lisäksi keksintö koskee menetelmää lipopolysakkaridin myrkyllisyyden vähentämiseksi tai lipopolysakkaridia sisältävän terapeuttisen nestemäisen injektantin myrkyllisyyden poistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomais- 5 ta että rasvahappojen ja lipopolysakkaridin glukoosiaminyylitähteisiin esteri- tai amidisidoksella sitoutuneiden 3-hydroksirasvahappojen hydroksyyliryhmien väliset esterisidokset hydrolysoidaan entsymaattisesti, jolloin entsymaattinen hydrolyysi saadaan aikaan edellä mainitulla puh- 10 distetulla asyylioksiasyylihydrolaasilla. Kuvio 1 esittää Salmonella-LPS:n yleistä rakennetta. 0-polysakkaridi on liittynyt lipidi A:han R-ydinalueen avulla. n = Useiden R-ydin-LPS:ien rakenteet on merkitty. 15 Kuvio 2 esittää endobakteriaalisen lipidi A:n ehdotettua yleistä rakennetta. R = polysakkaridiketjun kiinnittymispaikka. Nuolet osoittavat asyylioksiasyylihydrolaasin vaikutuspaikan. Kuvio 3 esittää puhdistetun entsyymin SDS-polyak- 20 ryyliamidigeelianalyysiä. Kaista A sisältää entsyymipreparaatin, joka on puhdistettu yli kertaisesti solulysaatista. Kaista B sisältää molekyylipainomerkkiaineet. Geeli värjättiin hopeavärjäyksellä. Nuoli osoittaa nauhaa, joka sisältää entsyymin, joka tässä 11-$:isessa poly- 25 akryyliamidigeelissä on kooltaan noin daltonia. Mikään muista nauhoista ei esiinny entsyymin kanssa yhdessä tai useammassa muussa analyysissä (geelisuodatus, butyyli-sepharose-kromatografia). Yksi ainoa monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa kaistan A kaksi ylintä vahvaa 30 nauhaa, ja ne edustavat todennäköisesti saman kontaminoivan proteiinin erilaisia muotoja; tämä vasta-aine absorboi nämä proteiinit muttei entsymaattista aktiivisuutta. Kuvio 4 esittää varsinaisen entsyymin sitoutumista LPS:iin. Osittain puhdistettu entsyymipreparaatti leimat- 35 tiin radioaktiivisella 125 I:11a. Sitten radioaktiivisella isotoopilla leimattuja proteiineja inkuboitiin LPS:n kans-

8 sa tai ilman LPS:a yhden tunnin ajan 22 C:ssa. Stafylokokkeja, jotka oli päällystetty LPS:a vastaan muodostetuilla IgG-vasta-aineilla, lisättiin tämän jälkeen, ja kun seosta oli inkuboitu vielä 4 C:ssa, stafylokokit pestiin 5 perusteellisesti ja tehtiin sitten liuokseksi SDS-hajoituspuskuriin (2 % SDS, 20 % glyseroli) ja 125 I:llä leimatut proteiinit, jotka sitoutuivat stafylokokkeihin, analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografialla. Kaista, joka on merkitty *:11a, sisälsi lei- 10 mattujen proteiinien seoksen. Kaistat 1-4 sisälsivät stafylokokkeja, joita inkuboitiin leimattujen proteiinien kanssa; inkubointiseos sisälsi LPS:n ja anti-lps-vastaaineen osoitetulla tavalla. Yksi ainoa radioaktiivisella isotoopilla leimattu proteiini sitoutui spesifisesti sta- 15 fylokokkeihin silloin, kun sekä LPS ja anti-lps olivat mukana (kaista 3). Geeli sisälsi ei-radioaktiiviset molekyylipainomerkkiaineet; LPS:a sitovan proteiinin arvioitu koko on osoitettu. Tämä on sama nauha, joka liittyy entsymaattiseen aktiivisuuteen kaikissa muissa puhdistusvai- 20 heissa. Kuvio 5 esittää 3H-rasvahapon, "C-glukoosiamiinin ja 32P-fosfaatin vapautumisen aikataulun leimatusta LPS:sta asyylioksiasyylihydrolaasin läsnäollessa. Kuvio 6 esittää deasylaation vaikutuksia leimattui- 25 hin LPS-näytteisiin, joista on ajettu elektroforeesi polyakryyliamidigeelissänatriumdodekyylisulfaatinläsnäollessa. Kukin kaista sisälsi 0,5 pg LPS:a. Geeli käsiteltiin En 3Hance'lla (New England Nuclear) ja autografoitiin Kodak X-Omat XAR-5 -filmiä käyttäen -70 C:sSa. Kaista 1 sisälsi 30 S-LPS:a (noin 1-%:isesti) deasyloitu); kaista 2, S-LPS (25-%:isesti deasyloitu); kaista 3, SR-LPS (0,6-%:isesti deasyloitu); kaista 4; SR-LPS (15-%:isesti); kaista 5, SR-LPS (28-%:isesti); kaista 6, SR-LPS (65-%:isesti deasyloitu NaOH:lla); kaista 7, Rc-LPS (1-%:isesti); kaista 8, 35 Rc-LPS (20-%:isesti); kaista 9, Rc-LPS (32-%:isesti), kaista 10, Rc-LPS (65-%:isesti deasyloitu [NaOH:lla) sekä

9 kaista 11, S-LPS (1-%:isesti). LPS:t kaistoilla 6 ja 10 deasyloitiin käsittelemällä NaOH:lla, joka hydrolysoi kaikki esterisidokset. Kuvio 7 esittää ei-radioaktiivisen LPS:n kykyä vä- 5 hentää 3 H-rasvahappojen vapautumista radioaktiivisella isotoopilla leimatusta LPS-substraatista. Ei-radioaktiivista LPS:a S. minnesotasta lisättiin (säädettynä 0,27 pmol:ksi) reaktioseoksiin, jotka sisälsivät 0,27 pmol radioaktiivisella isotoopilla leimattua Rc-LPS:a. Kun seosta oli inku- 10 boitu 37 C:ssa yhdeksän tunnin ajan, vapautuneen 3H-rasvahapon määrä määritettiin uuttamalla rasvahapot kloroformiin ja mittaamalla radioaktiivisuus. Ei-radioaktiivisessa LPS:ssä oli noin 6 (Rc), 9 (Rb), 10 (Ra) ja (sileä) sakkaridia lipidi A:han kiinnittyneenä. 15 Keksinnön mukaisella menetelmällä aikaansaatu myrkyllisyyden vähentäminen sisältää hydroksyloimattomien asyyliryhmien ja 3-hydroksimyristoyylin (3-hydroksitetradekanoaatin) tai muiden 3-hydroksirasvahappotähteiden välisten esterisidosten hydrolyysin. Nämä 3-hydroksimyristo- 20 yyliryhmät ovat puolestaan sitoutuneet esteri- tai amidisidoksella D-glukoosiaminyylidisakkaridirakenteeseen LPS:n lipidi A -osassa (katso kuvio 2). Asyylioksiasyylihydrolaasia käytettiin S. typhimuriumin LPS:n deasylointiin. Entsymaattisesti deasyloidusta 25 LPS:sta puuttuivat hydroksyloimattomat rasvahapot, mutta fosfaatti- ja 3-hydroksimyristoyylitähteet sekä polysakkaridiketju olivat jäljellä. Asyylioksiasyylihydrolyysin vaikutusta LPS:n biologisiin aktiivisuuksiin tutkittiin useissa koesysteemeissä. Biologisen aktiivisuuden menetys 30 näissä määrityksissä liittyi suoraan deasylaatioasteeseen. Noin 95 %:n hydroksyloimattomia rasvahappoja poisto LPS:stä vaikutti suhteellisen vähän B-solumitogeenisuuteen (5-12-kertainen aktiivisuuden menetys); keskitasoisesti pyrogeenisuuteen ja Limulus-lysaatin sakkaantumisaktiivi- 35 suuteen ( kertainen aktiivisuuden menetys); sekä erittäin paljon ihon valmistamiseen dermaaliseen

10 Shwartzmanin reaktioon ja ihmisen vaskulaaristen endoteelisolujen stimulaatioon (suurempi kuin 100-kertainen aktiivisuuden menetys). LPS:n kudosmyrkyllisyys mitattuna Shwartzmanin reaktiolla väheni siten vähintään kymmenen 5 kertaa enemmän kuin immunostimulatorinen aktiivisuus mi- tattuna B-solunmitogeenisyys-määritysmenetelmällä. Nämä tulokset ovat yleensä yhdenmukaisia julkaistujen asyylioksiasyyliryhmien roolien kanssa lipidi A -analogien biologisissa aktiivisuuksissa. Hydrofiilisen 10 LPS-polysakkaridin läsnäolo ei näytä muuttavan suuresti vaikutusta, joka asyylioksiasyylitähteillä on lipidi A:n biologisiin aktiivisuuksiin. Tässä keksinnössä kuvataan ensimmäinen LPS:n biologisia vaikutuksia modifioiva entsymaattinen aktiivisuus. 15 Asyylioksiasyylihydrolaasiaktiivisuutta on löydetty ihmi- sen neutrofiileistä ja hiiren makrofageista; viimeksi mainitut solut sisältävät myös mekanismit 3-hydroksimyristaattitähteiden poistamiseksi LPS:stä. Vasta-aineella opsonisoidut LPS:t deasyloituvat sekä neutrofiilien että 20 makrofagien vaikutuksesta, joten asyylioksiasyylihydrolaa- sien pitäisi yhtä hyvin vaikuttaa LPS:iin fagosytoiduissa bakteereissa. Salmonella-LPS:n lisäksi entsyymi deasyloi myös muiden bakteerien (esimerkiksi E. coli, Hemophilus influenzae, Neisseria meningitidis) LPS:ja. Todennäköisim- 25 min asyylioksiasyylihydrolaasit sijaitsevat happamassa, solunsisäisessä osassa (lysosomeissa tai endosomeissa), joissa bakteeri-lps:n deasylointia seuraisi muiden bakteerikomponenttien hajoitus. Neutrofiilit ovat isännän puolustusmekanismien etulinjassa bakteeri-invaasiota vas- 30 taan, mutta ne ovat lyhytikäisiä kudoksessa ja näyttävät myös viskaavan takaisin osan syömästään aineesta; neutrofiileistä vapautunut, osittain deasyloitu LPS voi sitten reagoida muiden isäntäsolujen kanssa. Tulisi korostaa sitä, että LPS:n solunsisäistä kohtaloa ei täydellisesti ym- 35 märretä ja että olemassa olevat tutkimukset ovat kaikki koskeneet puhdistettua LPS:a eikä bakteerien LPS:a sel-

11 laisenaan. Tällä hetkellä tuntemattomat deasylaasit, asyylitransferaasit tai fosfataasit voivat myös prosessoida LPS:a solunsisäisesti, ja näillä saattaa olla erilaisia vaikutuksia LPS:n biologiseen aktiivisuuteen. 5 Tulisi myös mainita, että asyylioksiasyylihydrolaa- siaktiivisuutta on löydetty kanien, hiirien ja ihmisen seerumista (Munford, R.S., julkaisematon tiedonanto). Matalia aktiivisuuspitoisuuksia esiintyy normaalissa hiiren ja kanin seerumissa; näitä pitoisuuksia voidaan lisätä kertaisesti immunisoimalla kanit gram-negatiivisilla bakteereilla. Kanin seerumin asyylioksiasyylihydrolaasiaktiivisuuden ph-optimi on jonkin verran korkeampi (5-6) kuin ihmisen neutrofiilien asyylioksiasyylihydrolaasiak- tiivisuuden ph-optimi (4,5-5,0). Vaikka normaalissa ih- 15 misen seerumissa ei näytä olevan todettavaa asyylioksi- asyylihydrolaasiaktiivisuutta, matalia aktiivisuuspitoisuuksia on löydetty joiltakin gram-negatiivista bakteeriinfektiota veressään kantavilta potilailta. Nämä esitutkimukset viittaavat siihen, että eläimet vastaavat gram-ne- 20 gatiivisten bakteerien immunisaatioon tai infektioon li- säämällä asyylioksiasyylihydrolaasiaktiivisuutta veressään. Oletettavasti veren entsyymi(t) saattaa joko (1) sitoutua kiertävään LPS:iin tunnistaen LPS:n fagosytoivien solujen, joissa asyylioksiasyylihydrolyysi tapahtuisi, 25 kohteiksi tai (2) vaikuttaa LPS:iin paikallisissa kudoksen infektiokohdissa. Asyylioksiasyylihydrolaasien tärkein rooli eläimissä voi olla LPS:n kudosmyrkyllisyyden estäminen. Huomattavaa on, että asyylioksiasyylihydrolyyåin negatiivinen vai- 30 kutus LPS:n immunostimulatoriseen aktiivisuuteen on paljon pienempi ainakin mitattuna sellaisilla määritysmenetelmillä kuin B-solumitogeenisuus. LPS:n immunostimulatoristen aktiivisuuksien säilyminen antaisi eläimille sellaisia hyötyjä kuin immunologinen stimulaatio terveenä ollessa ja 35 vasta-aineiden muodostuksen lisääminen infektioissa. Tässä mielessä on mielenkiintoista miettiä sitä, että asyyliok-

12 siasyylihydrolaaseilla saattaa olla samanlainen rooli kuin lysotsyymillä, joka on toinen fagosytoivien solujen entsyymi, joka pilkkoo toksista bakteerin soluseinän polymeeria (peptidoglykaania) tuotteiksi (muramyylipeptidit), 5 joilla on immunostimulatiivisia vaikutuksia. Tässä keksinnössä kuvataan ihmisen asyylioksiasyylihydrolaasin identifiointia, karakterisointia ja puhdistusta. Asyylioksiasyylihydrolaasivaikutus LPS:ään kohdis- 10 tuu sekä LPS:n myrkyllisyyteen että LPS:n immunostimulatoriseen aktiivisuuteen. Hydroksyloimattomien rasvahappojen hydrolyyttinen vapautuminen vähentää huomattavasti enemmän LPS:n toksisia vaikutuksia kuin LPS:n immunostimulatorisia vaikutuksia. 15 Asyylioksiasyylihydrolyysi ei muuta LPS:n polysakkaridialueiden antigeenirakennetta. Lipidi A:n entsymaattinen toksisuuden neutralointi tuhoamatta immunostimulatorista aktiivisuutta saattaa siten tuottaa ei-myrkyllisiä LPS-rokotteita; toksisuudeltaan neutraloidun lipidi A:n 20 adjuvanttiominaisuus auttaisi vasta-aineiden muodostamisen polysakkaridiantigeen(e)ille edistämistä. Kuten yllä on mainittu, nämä vasta-aineet voivat suojata eläimiä erilaisilta gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamilta sairauksilta. 25 Asyylioksiasyylihydrolaasin toksisuudeltaan neutraloimia LPS:ja voidaan myös käyttää terapeuttisesti vastustamaan infektoivissa bakteereissa olevien (tai niistä vapautuvien) LPS:ien myrkyllisiä vaikutuksia. Entsymaattisesti deasyloitu LPS inhiboi natiivin LPS:n kykyä stimu- 30 loida ihmisen endoteelisolujen neutrofiiliin takertumistekijän (neutrophil-adherence factor) ekspressiota [Pohlman, Munford ja Harlan, J. Exp. Med. 165 (1987) 1 393]. Deasyloidut LPS:t inhiboivat, kun niitä lisättiin niinkin pitkän ajan kuin 60 minuutin kuluttua natiivin 35 LPS:n lisäämisestä. Neutrofiilien takertumisella endoteelisoluihin uskotaan olevan osuutta LPS:n toksisissa vaiku-

13 tuksissa. Lisäksi lipidi A -analogin, joka rakenteellisesti muistuttaa asyylioksiasyylihydrolyysin tuotetta, on osoitettu pystyvän käänteisesti vaikuttamaan endotoksiseen shokkiin hiirillä ja lampailla [Clin. Res. 34 (1986) 5 518A]. Toksisuudeltaan neutraloitu LPS saattaa olla ylivoimaisesti parempi lipidi A -analogeihin verrattuna tähän tarkoitukseen, koska hydrofiilinen LPS:n polysakkaridiketju lisää molekyylien liukoisuutta vesipitoisessa ympäristössä. 10 Entsyymiä voidaan siis käyttää vähentämään toksisuutta terapeuttisissa, nestemäisissä, injektoitavissa aineissa, jotka saattavat olla LPS:n kontaminoimia. Lisäämällä asyylioksiasyylihydrolaasia injektoitavaan aineeseen ja antamalla entsyymin entsymaattisesti hydrolysoida este- 15 risidokset sen sisältämän LPS:n toksisuus neutraloituisi. Seuraavat esimerkit esitetään tämän keksinnön edullisten suoritusmuotojen valaisemiseksi, eikä niiden ole tarkoitettu rajoittavaan keksinnön suoja-alaa, ellei toisin erityisesti mainita tähän liitetyissä patenttivaati- 20 muksissa. Esimerkki 1 Asyylioksiasyylihydrolaasin puhdistus Solujen lähde. HL-60-soluja [American Type Culture Collection, Rockville, MD, (ATCC) kanta CCL-240] kasvatet- 25 tiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 8 % naudan sikiön seerumia (Hyclone), 10 yksikköä/ml penisilliini G:tä ja 50 pg/ml streptomysiiniä. Tyypillisesti 250 ml:n viljelmät 750 ml:n pulloissa (Falcon) kerättiin talteen 4-5 päivää 37 C:ssa 5-%:isessa CO 2 -atmosfäärissä kasvatuksen 30 jälkeen. Kandestakymmenestä pullosta (5 1 väliainetta) saatiin noin 5 x 10 9 solua. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla (500 x g, 10 min., 4 C), pestiin kerran PBS:llä (10 mmo1/1 natriumfosfaatti, 0,15 mo1/1 NaCl, ph 7,1) ja suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan lepopuskuria 35 (100 mmo1/1 KC1, 3 mmo1/1 NaC1, 3,5 mmo1/1 MgC1 2 ja 10 mmo1/1 HEPES, ph 7,4).

14 Sitten solut hajoitettiin käyttäen useita iskuja Dounce-homogenisaattorissa, jonka jälkeen seos sentrifugoitiin (478 x g, 5 min, 4 C) tumien ja rikkoutumattomien solujen saamiseksi solunapiksi. Nappi suspendoitiin uudel- 5 leen 10 ml:aan lepopuskuria, ja homogenointi ja sentrifugointi toistettiin. Tätä sykliä jatkettiin (tavallisesti 4-5 kertaa), kunnes vain noin 5-10 % soluista oli ehjiä napin mikroskooppisen tarkastelun perusteella. Yhdistetyt supernatantit 5 x 10 9 solusta sisälsivät tyypillises- 10 ti mg proteiinia. Entsyymipreparaatti Entsyymiä sisältävät jyväset sedimentoitiin sentrifugoimalla x g:llä 10 min ajan 4 C:ssa. Supernatantti sentrifugoitiin uudelleen, ja yhdistetyt napit sus- 15 pendoitiin 27 ml:aan lepopuskuria. Triton X-100 -deter- genttiä lisättiin (0,5 %, v/v), ja kun suspensio oli seissyt 10 minuutin ajan jäähauteessa, lisättiin tislattua vettä seoksen tilavuuden saattamiseksi 30 ml:ksi (Triton X-100, 0,05 %:n pitoisuus). Fenyylimetyylisulfonyylifluo- 20 ridia (PMSF) ja pepstatiinia (5 mmo1/1 ja 1 nmol/l, vas- taavasti) lisättiin, ja preparaatti sentrifugoitiin kiih- tyvyydellä x g 60 minuutin ajan 4 C:ssa. Nappi heitettiin pois, ja supernatantti jäädytettiin -20 C:ssa. Hydroksiapatiittikromatografiaa ja hydrofobinen interak- 25 tio -kromatografiaa lukuunottamatta kaikki puhdistusvai- heet suoritettiin noin 4 C:ssa. Linssin lektiini -kromatografia. Kun PMSF:ää ja pepstatiinia oli lisätty vielä kerran, x g -supernatantti laimennettiin 2-kertaiseksi lektiinipylväspusku- 30 rilla (25 mmo1/1 NaCl, 10 mmo1/1 MES, ph 6,0, 0,01 % Triton X-100) ja vietiin lentil lectin -Sepharose 4B (Pharmacia) -pylvääseen, jonka koko oli 0,9 cm x 15 cm. Pylväs pestiin peräkkäin 15 ml:n tilavuudella 10 mmo1/1 MES:ä, 0,01-%:ista Triton X-100-purskuria, joka sisälsi 35 (1) 0,025 mo1/1 NaCl:a, (2) 0,15 mmo1/1 NaCl:a ja 0,5 mo1/1 a-metyylimannosidia ja (3) 0,5 mo1/1 NaCl:a ja

15 ,5 mo1/1 a-metyylimannosidia. Pylväästä eluoitunut proteiinipiikki otettiin talteen kokonaan ja jäädytettiin -20 C:ssa. Hydrofobinen interaktio -kromatografia 5 Glykoproteiinieluaatti laimennettiin 0,5 tilavuudella pylväspuskuria (0,2 mo1/1 (NH 4 ) 2SO4, 4 mmo1/1 NaH 2 PO 4, 6 mmo1/1 Na 2HPO4, 0,04 % natriumatsidi, ph 6,8) ja vietiin pylvääseen, joka sisälsi 4-8 ml Phenyl- Sepharose CL-4B -geeliä. Näytteen lisäämisen jälkeen pyl- 10 västä pestiin pylväspuskurilla, kunnes eluaatin A280 saavutti alhaisen tason. Sitten pylvääseen vietiin lineaarinen gradientti käyttäen pylväspuskuria ja eluutiopuskuria (75-%:inen etyleeniglykoli, 1,5 mmo1/1 NaH 2PO 4, 8,5 mmol/1 Na 2HPO 4, 0,04 % natriumatsidi, ph 7,2) suhteessa yksi osa 15 pylväspuskuria kahteen osaan eluutiopuskuria. Fraktiot (3 ml) kerättiin ja monitoroitiin entsyymiaktiivisuuden ja absorbanssin aallonpituudella 280 nm (A 280 ) suhteen. Entsyymi eluoitui A no -absorbanssipiikin ensimmäisessä puoliskossa. Asianmukaiset fraktiot yhdistettiin ja säilytettiin C:ssa. Hydroksiapatiittikromatografia Edellisen vaiheen fraktiot laimennettiin 3-kertaisesti HPT-puskurilla (0,02 mo1/1 natriumfosfaatti, ph 7,0, 0,04 % natriumatsidi, 0,01 % Triton X-100) ja vietiin hyd- 25 roksiapatiittipylvääseen (Biorad HPT), jonka koko oli 1,0 cm x 4,0 cm. Proteiinit euloitiin käyttäen gradienttia, joka muodostui 0,02-0,4 mo1/1 natriumfosfaatista samassa puskurissa. Entsymaattisen aktiivisuuden piikki eluoitui fosfaattipitoisuudella 0,2 mo1/1. Glyserolia 30 (30 %, v/v) lisättiin, ja entsyymin sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin käyttäen Centricon-30 -sentrifugointivälinettä (Amicon). Kationinvaihtokromatografia Konsentroidut HPT-fraktiot laimennettiin kymmen- 35 kertaisesti MonoS-lähtöpuskuriin (0,15 mo1/1 natriumasetaatti, ph 4,5, 0,05 % Triton X-100, 0,04 % natriumatsi-

16 di, 2 % tauriini, 5 % 2-propanoli), sentrifugoitiin sakan poistamiseksi ja puristettiin 0,22 mikrometrin suodattimen läpi MonoS-pylvääseen (Pharmacia). Käyttäen FPLC-systeemiä (Pharmacia) proteiinit eluoitiin pylväästä MonoS-lähtöpus- 5 kurilla, jossa oli NaCl-gradientti 0-1,0 mo1/1. Entsymaattisen aktiivisuuden piikki eluoitui NaCl-pitoisuudella noin 0,27-0,3 mo1/1. Glyserolia (28 % v/v) lisättiin piikkifraktioihin, ennen kuin ne yhdistettiin ja konsentroitiin yllä kuvatulla tavalla. Entsyymi(e)n spesifinen 10 aktiivisuus MonoS-piikkifraktioissa oli vähintään kertaa korkeampi kuin solun hajoituksen jälkeisessä (post-nuclear) homogenaatissa. Lopullisen preparaatin proteiinikoostumus analysoitiin polyakryyliamidigeelielektroforeettisesti käyttäen natriumdodekyylisulfaattia: hopea- 15 värjäyksessä materiaalissa oli ainakin 5 nauhaa mukaan lukien huomattavan suuri nauha molekyylipainoltaan noin daltonia (kuvio 3). Kuten kuviossa 4 on esitetty, molekyylipainoltaan samanlaisen proteiinin osoitettiin sitoutuvan LPS:iin, entsyymin substraattiin. 20 Puhdistusmenetelmän yhteenveto on annettu taulukossa 1.

17 Taulukko 1 Asyylioksiasyylihydrolaasin puhdistus HL-60-soluista Menetelmä Saanto (kumulatiivinen, %) Spesifinen aktiivisuus (suunnittainen) Proteiini Entsyymin aktiivisuus Aktiivisuus/,ig proteiinia Solun hajoituksen jälkeinen lysaatti Jyväsfraktion Triton X-100 -liukoinen, xg-supernatantti 5, Lentil lectin (mannosidilla eluoituva fraktio) 0, Phenyl-Sepharose (etyleeniglykolilla eluoituva fraktio) 0, Hydroksyyliapatiittipiikki 0, MonoS- (FPLC-kationinvaihto) piikki (?) 0,001* 13 (?) 7 500* * Varsinaista proteiinipitoisuutta ei mitattu.

18 Vaihtoehtoinen solujen lähde Yllä olevia menetelmiä on käytetty myös asyylioksi- asyylihydrolaasin puhdistamiseksi ihmisen perifeerisen veren neutrofiileistä. Näistä kandesta lähteestä saadun 5 entsymaattisen aktiivisuuden ominaisuudet ovat oleellisesti identtiset. Koska HL-60-entsyymiä on helpommin saatavissa suurempia pitoisuuksia, sitä on käytetty esimerkeissä 2, 3 ja 4 kuvatuissa tutkimuksissa. Esimerkki 2 10 Asyylioksiasyylihydrolaasiaktiivisuus LPS:aa koh- taan Inkubointiolosuhteet Biosynteettisesti radioaktiivisilla isotoopeilla leimattu LPS valmistettiin Salmonella typhimuriumista, 15 jota kasvatettiin 3H-asetaatin ja N-asetyyli-l- {14 C] -glukoosiamiinin (jotka yhdistyivät lipidi A -alueen rasvahappoihin ja glukoosiamiinirunkoon, vastaavasti) läsnä ollessa. Asyylioksiasyylihydrolyysiä seurattiin mittaamalla 3H-rasvahappojen vapautumista glukoosiamiinilla leimatusta 20 LPS-rungosta. Kaksoisleimattuja (3/1/14-,_ L) LPS-näytteitä (5 pg) in- kuboitiin 37 C:ssa puhdistetun entsyymin (10 p1) kanssa reaktioseoksessa (0,5 ml), joka sisälsi 1 mg/ml rasvahappoja sisältämätöntä naudan seerumin albumiinia (BSA, 25 Sigma, St. Louis, Mo), 5 mmo1/1 CaC1 2 :a, 0,5 % (v/v) Triton X-100:aa ja 20 mmo1/1 Tris-sitraattia, ph 4,8. Reaktio pysäytettiin haluttuina ajankohtina saostamalla LPS ja BSA 1,2 ml:lla 95-%:ista etanolia. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla ( x g, 10 min, 4 C) ja pes- 30 tiin kerran 1,0 ml:lla 80-%:ista etanolia. Sakat suspendoitiin 0,5 ml:aan normaalia fysiologista suolaliuosta ja säilytettiin -20 C:ssa. Pienten sakka- ja supernatanttiosa-annosten radioaktiivisuus laskettiin, ja kunkin supernatantissa olevan radioaktiivisen leiman prosenttisuus 35 laskettiin. 32 P-leimattua S. typhimuriumin Rc-LPS:a, joka oli valmistettu kasvattamalla kantaa PRX20 alhaisen fos-

19 faattipitoisuuden omaavassa väliaineessa, joka sisälsi 32 PO4 :a (ortofosfaatti, New England Nuclear, Boston, MA), inkuboitiin rinnalta ja saostettiin samalla tavalla; 32PO 4 5 täydellisesti talteen etanolisupernatantista. Rasvahappoanalyysi LPS deasyloitiin ja saostettiin etanolilla, ja etanolivesisupernatantti kuivattiin typen alla. 3H-rasvahapot uutettiin kloroformi/metanoli-seokseen (2/1). Inkuboimaton 10 LPS ja deasyloitu LPS etanolisakassa hydrolysoitiin ja va- pautuneet rasvahapot uutettiin kloroformiin. Radioaktiivisuussaanto jokaisessa vaiheessa oli yli 85 %. Näytteet analysoitiin yksisuuntaisella TLC:llä käyttäen Silica Gel G -levyjä (Analtech). Liuotinsysteemi oli petrolieetteri/- 15 dietyylieetteri/etikkahappo (70/30/1). Täplät raaputettiin levyltä, ja radioaktiivisuus mitattiin (84-96 %:n saanto lisätystä radioaktiivisuudesta). Annetut arvot ovat kaksoismääritysten keskiarvoja. LPS:n deasylointi 20 Deasylointireaktion ajankulku on esitetty kuvios- sa 5. 3H-rasvahapot vapautuivat LPS:sta ajan kuluessa, kun taas "C:tä eikä 32P:tä (joita oli 32 P:llä leimatussa S. typhimuriumin LPS:ssa, jota oli käsitelty entsyymillä rin- 3H/ 14C-LPS:n kanssa) ei vapautunut merkittäviä määriä. 25 Reaktio saavutti näennäisen maksimin, kun noin 32 % 3H-rasvahapoista oli uutettu LPS:sta; koska 35 % tämän preparaatin 3H-lukemista oli hydroksyloimattomissa rasvahapoissa (NFA), 32-%:inen deasylaatio oli yhtä pitävä näiden tähteiden lähes täydellisen poistamiseen kanssa. Tätä johto- 30 päätöstä tuki substraatti-lps:n ja reaktiotuotteiden rasvahappokoostumuksen analyysi; 65 % 3H-rasvahappolukemista LPS:ssa oli 3-OH-14:0:ssa ja 35 % NFA:issa, kun taas deasyloimattomat rasvahapot, jotka vapautuivat LPS:sta, olivat lähes kokonaan (94 %) hydroksyloimattomia ja 95 % ras- 35 vahapoista osittain deasyloidussa LPS:ssä oli 3-0H-14:0:ja. inkuboituna rinnalla ja identtisesti käsiteltynä saatiin

20 Kuten kuviossa 6 on esitetty, asyloidut ja deasy- loidut LPS-näytteet liuotettiin näytepuskuriin ja niistä ajettiin elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi natriumdodekyylisulfaattia (SDS-PAGE). 5 Entsymaattinen deasylointi lisäsi LPS:n liikkumis- ta SDS-PAGE:ssa, mikä on yhtä pitävä molekyylien koon pienenemisen kanssa (kuvio 6). Tämä lisäys liikkumisessa oli pienempi kuin sellaisella LPS:lla, joka oli käsitelty alkaalisella aineella, joka poistaa kaikki neljä esterisi- 10 doksella liittynyttä rasvahappoa lipidi A:sta (vertaa kaistat 5 ja 6, 9 ja 10). Alkuperäisen tikapuukuvion säilyminen [mikä kuvastaa sellaisten molekyylien läsnäoloa, joilla on erilaiset lukumäärät 0-toistuvia yksikköjä deasyloidussa sileässä LPS:ssa (kaistat 1 ja 2)] osoitti, 15 ettei entsymaattinen käsittely poistanut polysakkaridi- ketjua. Yhdistettynä nämä todisteet osoittavat, että ainoa modifikaatio entsymaattisesti käsitellyissä molekyyleissä oli NFA:n menetys. 20 Esimerkki 3 ominaisuudet Ihmisen neutrofiilien asyylioksiasyylihydrolaasin Entsymaattinen aktiivisuus oli lisääntynyt noin kertaisesti MonoS-piikkifraktiossa verrattuna solun 25 hajoituksen jälkeiseen homogenaattiin. Entsymaattinen aktiivisuus tuhoutui kuumennettaessa 10 minuutin ajan 80 C:ssa, muttei inhiboitunut EDTA:lla (10 mmo1/1), PMSF:lla (5 mmo1/1), pepstatiinilla (1 mmo1/1), para-hydroksimerkuribentsoaatilla (0,2 mmo1/1), natriumfluoridil- 30 la (50 mmol/1), TPCK:lla (0,1 mmo1/1), TLCK:lla (0,1 mo1/1) eikä soijapavun trypsiini-inhibiittorilla (10 ug/ml). Kalsiumkloridia (5-10 mmo1/1) ja Triton X-100:aa (0,5 % v/v) vaadittiin maksimiaktiivisuuden saa- miseksi. Natriumdeoksikolaatti inhiboi reaktion. Geeli- 35 suodatuskromatografiassa entsymaattinen aktiivisuus eluoi- tui yhtenä ainoana piikkinä, jonka molekyylikoko oli noin

21 daltonia. Preparaatin Triton X-100 -käsittely ennen kromatografiaa saattaa aiheuttaa virheen tähän molekyylipainoarvioon. Entsyymin molekyylipainon määrittämiseksi tarkemmin maksimaalisesti puhtaat preparaatit 5 (jotka sisälsivät noin 5 proteiininauhaa hopeavärjätyissä SDS-polyakryyliamidielektroforeesigeeleissä, kuten kuviossa 3 on esitetty) leimattiin radioaktiivisella jodilla ja analysoitiin uudelleen. Kun radioaktiivisella jodilla leimattua seosta inkuboitiin LPS:n kanssa ja LPS adsorboitiin 10 sitten liuoksesta käyttäen kiinteään faasiin sidottuja anti-lps-vasta-aineita, vain yhden radioaktiivisen proteiinin havaittiin sitoutuvan LPS:än. Tämän nauhan näennäinen molekyylipaino SDS-PAGE:ssa (11-%:inen polyakryyliamidi) oli noin daltonia (kuvio 4); sama 15 radioaktiivinen nauha eluoitui yhdessä entsymaattisen aktiivisuuden kanssa, ja sen näennäinen molekyylipaino oli geelisuodatuskromatografiassa (Superose 12, Pharmacia Labs., Inc., Piscataway, New Jersey). Ristiriita näennäisessä molekyylipainossa saattaa kuvastaa ent- 20 syymin glykosylaatioastetta ja sen pidättäytymistä tiettyihin pylväsmateriaaleihin. Proteiinin näennäinen molekyylipaino todellakin kasvaa, kun polyakryyliamidin prosenttisuutta elektroforeesigeelissä lisätään, mikä taaskin pitää yhtä glykoproteiinin käyttäytymisen kanssa. 25 Ei-radioaktiivinen LPS kilpailee radioaktiivisella isotoopilla leimatun LPS-substraatin kanssa. Mitä pitempi polysakkaridiketju ei-radioaktiivisessa LPS:ssä on, sitä parempi kilpailu (kuvio 7). Kun LPS:ia, joissa polysakkaridiketjujen pituudet vaihtelevat, leimattiin radioaktii- 30 visella isotoopilla ja niitä käytettiin entsyymin substraatteina, lyhytketjuisin LPS (Re) hydrolysoitui merkittävästi vähemmän kuin pitempiketjuinen LPS (sileä, Rc). Siten asyylioksiasyylihydrolaasi oli aktiivisempi in vitro pitkiä polysakkaridiketjuja sisältäviä LPS-substraatteja 35 kohtaan.

22 Puhdistetun entsyymin kyvyn deasyloida LPS:ja muista kuin negatiivisista bakteereista testaamiseksi, radioaktiivisella isotoopilla leimattuja LPS:ja valmistettiin S. typhimuriumista ja E. colista (kaksi Entero- 5 bacteriaceae-heimon jäsentä) sekä kandesta kaukaista sukua olevasta lajista, Neisseria meningitidisista (Neisseriaceae-heimo) ja Hemophilus influenzaesta (Brucellaceae-heimo). Jokaisessa tapauksessa entsyymi ensisijaisesti poisti hydroksyloimattomia rasvahappoja 10 LPS:sta. Koska asyylioksiasyyliasyylioksi-sidoksia on löydetty kaikkien tutkittujen, lääketieteellisesti tärkeiden bakteerien LPS:stä, on todennäköistä, että LPS:n herkkyys asyylioksiasyylihydrolaasille on yleinen ilmiö. Puhdistettu entsyymi ei sisältänyt mitattavia mää- 15 riä fosfataaseja, jotka poistavat fosfaattiryhmiä joko S. typhimuriumin RcLPS:ssä tai "deep-rough" E. colin LPS:ssä. Tällaisen fosfataasiaktiivisuuden puuttuminen on edullista tämän keksinnön mukaisiin käytännön sovellutuksiin. 20 Sarjan näytteitä, jotka sisälsivät kasvavia määriä asyylioksiasyylihydrolaasiaktiivisuutta, havaittiin sisältävän väheneviä pitoisuuksia hydrolyyttistä aktiivisuutta metyyliumbiliferyylioleaattia, hapan lipaasi -entsyymin substraattia, kohtaan. Lisäksi havaittiin, ettei asyyliok- 25 siasyylihydrolaasilla ollut hydrolyyttistä aktiivisuutta kolesteroliestereitä, glyserolitrioleaattia tai dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia kohtaan, mikä edelleen erottaa asyylioksiasyylihydrolaasin yleisimmistä hydrolyyttisistä entsyymeistä. 30 Esimerkki 4 LPS:n biologisten aktiivisuuksien muuttaminen asyylioksiasyylihydrolaasin avulla R-LPS:a (karkea LPS, jossa on lyhyt polysakkaridiketju) S. typhimuriumista käsiteltiin tässä kuvatulla ta- 35 valla puhdistetulla asyylioksiasyylihydrolaasilla.

23 LPS:n deasylointi suoritettiin inkuboimalla vakiomääriä R-LPS:a ja asyylioksiasyylihydrolaasia eri aikoja, jotta saataisiin eriasteisia deasylaatioita. 0,5-2,2 %:n taustadeasylaatio (LPS:a inkuboitiin ilman entsyymiä) vä- 5 hennettiin jokaisesta arvosta. Kontrollit jokaisessa biologisen aktiivisuuden määrityksessä olivat reaktioseos ja reaktioseos, joka sisälsi entsyymin muttei LPS:a; nämä kontrollit olivat aina negatiivisia. Asyylioksiasyylihydrolyysin vaikutukset LPS:n bio- 10 logisiin aktiivisuuksiin tutkittiin kuudella määritysmenetelmällä. Dermaalista Shwartzmanin reaktiota ja kanin pyrogeenitestiä käytettiin toksisuuden in vivo mittaamiseksi. Hiiren pernasolu- (B-lymfosyytti-) mitogeenisyysmääritystä, hiiren makrofagien stimulointia vapauttamaan pros- 15 taglandiineja sekä ihmisen vaskulaaristen endoteelisolujen stimulaatiota ekspressoimaan neutrofiileihin tarttumistekijää käytettiin LPS:n biologisten aktiivisuuksien mittaamiseksi in vitro. Dermaalinen Shwartzmanin reaktio suoritettiin in- 20 jektoimalla ihoon 2,5 pg LPS,:a tai entsymaattisesti deasyloitua LPS:a New Zealand White -kaneihin. Kaksikymmentäkaksi tuntia myöhemmin eläimille annettiin suonensisäinen annos R-LPS:ää (2-4 pg/kg). Kaksi henkilöä, jotka eivät tunteneet näytteiden sisältöä, arvioivat ihon leesiot tunnin kuluttua. Kanden kanin keskiarvotulokset on esitetty taulukon 1 toisessa ja kolmannessa sarakkeessa. Lämpövasteindeksi (TRI) LPS-valmisteille määritettiin injektoimalla 3-4 kg:n painoiseen New Zealand White -kaniin suonensisäinen 50 ng:n annos LPS:a. Lämpötilaa 30 monitoroitiin peräsuolianturilla, ja tulos pantiin muistiin joka 10. minuutti. Lämpövasteindeksi on perustason ( C:ina) ylittävän lämpötilan ja ajan (astetunteina) integroitu tulo. [Zimmer et al., Peptides 2 (1981) 413]. Jokainen annos testattiin 3 tai 4 kanissa. 35 B-solujen lisääntyminen mitattiin inkuboimalla ensin LPS-valmisteita hiiren pernasolujen kanssa 98-kuop-

24 paisissa mikrotiitterilevyissä, kuten Wannemuehler et al., J. Immunol. 133 (1984) 299, ovat kuvanneet. 24 tunnin kuluttua jokaiseen kuppaan lisättiin metyyli[ 3H]tymidiiniä (0,5 ici). Kuhunkin soluviljelmään inkorporoituneen radio- 5 aktiivisuuden määrä mitattiin 18 tunnin kuluttua. Jokainen LPS testattiin neljänä 5-kertaisena laimennoksena; tulos- ten probit-analyysi osoitti kunkin preparaatin määrän, joka tuotti puoliksi maksimaalisen B-solujen lisääntymisen stimulaation. Maksimaalisen stimulaation indeksi ( 3H-radio- 10 aktiivisuus stimuloiduissa soluissa/ 3H-radioaktiivisuus stimuloimattomissa soluissa) kandessa taulukossa 1 esitetyssä kokeessa oli 30 ja 29, vastaavasti. Neljäs määritysmenetelmä oli Limulus-lysaattitesti, in vitro sakkaantumismääritys LPS:lle. Limulus-lysaatin 15 sakkaantuminen mitattiin käyttäen 50 pl lysaattia (Cape Cod Associates, Woods Hole, MA), joka sisälsi 0,8 mg/ml n-bentsoyyli-l-valyyliglysyyli-l-arginiini-pna:ta (Vega Biochemicals, Tuscon, AZ) ja 50 pl testinäytettä. Kun seosta oli inkuboitu 55 minuutin ajan 37 C:ssa, 0,7 ml %:ista etikkahappoa lisättiin jokaiseen putkeen, ja absorbanssi aallonpituudella 405 nm mitattiin. Esitetyt arvot saatiin vertaamalla testinäytteiden 10-kertaisten laimen-nosten tuloksia vakiokuvaajaan, jokaoli muodostettu Rc-LPS:stä ja joka oli normalisoitu aloituspitoisuuteen pg/ml. Laimennokset tehtiin pyrogeenivapaaseen veteen. Jokainen arvo on kaksoismääritysten, jotka poikkesivat toisistaan alle 10 %, keskiarvo. Samanlaisia tuloksia saatiin kandessa muussa kokeessa. Hiiren makrofagien stimulointia vapauttamaan pros- 30 taglandiini E 2 :ta käytettiin myös immunostimulatorisen aktiivisuuden indeksinä. Tioglykolaatilla aiheutettuja C3H/HeN-hiiren makrofageja inkuboitiin asyloidun ja 29-%:isesti deasyloidun LPS:n kanssa 40 tunnin ajan 37 C:ssa, kuten Munford ja Hall, Infection and Immunity (1985) , ovat kuvanneet. PGE 2 -pitoisuudet solusupernatantissa mitattiin radioimmunologisella mää-

25 ritysmenetelmällä [Campbell et al., Hypertension 2 (1980) ]. LPS stimuloi vaskulaarisia endoteelisoluja ekspressoimaan solun pintatekijää/tekijöitä, jotka edistävät 5 neutrofiilien tarttumista endoteelisolun pintaan. Tällä aktiivisuudella ajatellaan olevan osuutta LPS:n toksisuudessa samoin kuin neutrofiilien houkuttelemisessa bakteeri-infektion kudospaikkoihin. Yhteistyötutkimuksissa testattiin LPS:n ja deasyloidun LPS:n kyky stimuloida 51Cr- 10 leimattujen ihmisen neutrofiilien tarttumista ihmisen napasuonen yksikerroksisiin endoteelisoluihin [Pohlman et al., 3. Exp. Med. 165 (1987) 1 393]. Asyylioksiasyylihydrolyysin vaikutukset LPS:n biologisiin aktiivisuuksiin näissä määrityksissä tutkittiin 15 kandella tavalla. Ensiksi maksimaalisen LPS:n deasyloinnin (30-32-%:inen 3H-rasvahappojen menetys) määritettiin jokaisella biologisella määritysmenetelmällä. Toiseksi annos-vastesuhde (deasylaatioaste vs. biologisen aktiivisuuden menetys) tutkittiin kolmella määritysmene- 20 telmällä. Maksimaalisen deasyloinnin vaikutus Ihonsisäinen LPS-injektio, kun sitä seuraa tuntia myöhemmin suonensisäinen LPS-injektio, tuottaa verta vuotavan ihon kuolion ihonsisäisen injektion kohdal- 25 le (dermaalinen Shwartzmanin reaktio). Maksimaalisesti deasyloitu LPS (32-$:inen 3H-rasvahappojen menetys) ei valmistanut ihoa reaktioon niinkään suurilla annoksilla kuin 10 pg, kun taas LPS, jota oli inkuboitu reaktioseoksessa ilman entsyymiä, tuotti veren vuodon (4-5 mm:n 30 halkaisija) ja kovettuman 0,1 pg:n annoksilla; toksisuuden väheneminen oli siten 100-kertainen tai suurempi. Varsinaisen loppupisteen määrityksen esti se, ettei entsyymiä ollut riittävästi tarvittavien suurten LPS-määrien deasyloimiseksi. Deasyloitu LPS oli myös oleellisesti vä- 35 hemmän pyrogeeninen kaneissa kuin täysin asyloitu LPS. 62 ng/kg:n suonensisäiset annokset asyloitua ja

26 %:isesti deasyloitua LPS:a tuottivat keskimääräisen lämpövasteindeksin 12,0 ± 2,5 (S.D.) ja 5,0 ± 1,0, vastaavasti, kun taas indeksit 25 ng/kg:n annoksilla olivat 8,5 ± 1,9 ja 2,8 ± 1,1, vastaavasti. 32 $:n 3H-rasvahappoja 5 deasylointiin liittyi noin kertainen stimulatorisen vaikutuksen menetys ihmisen napasuonen endoteelisoluja kohtaan, 20-kertainen aktiivisuuden menetys Limulustestissä, kertainen lasku B-solumitogeenisyydessä ja kertainen lasku PGE 2 :n vapautumisessa tioglyko- 10 laatilla aiheutetuilla hiiren makrofageilla. Yhdistettynä 15 lä). nämä tulokset osoittivat, että maksimaalisesti deasyloidut LPS:t olivat ainakin 10-kertaa vähemmän toksisia (mitattu- na dermaaliselle Shwartzmanin testillä) kuin ne olivat immunostimulatorisia (mitattuna B-solumitogeenisyystestil- Annosvaste Taulukko 2 esittää deasylaatioasteen ja biologisen aktiivisuuden menetyksen välistä suhdetta kolmessa määritysmenetelmässä. Jokaisessa määrityksessä aktiivisuuden 20 menetys liittyi suoraan deasylaatioasteeseen. Yhteenvetona esitettynä asyylioksiasyylihydrolaasi vähensi suuresti LPS:n kudostoksisuutta mutta säilytti suhteellisesti enemmän immunostimulatorista aktiivisuutta. Tämä johtopäätös on yhtä pitävä Tausta-osassa käsiteltyjen 25 koetulosten kanssa, joissa käytettiin lipidi A -analogeja asyylioksiasyyliryhmien stimulatorisen roolin arvioimiseksi. Asyylioksiasyylihydrolyysi mandollistaa monien eri bakteerien LPS:ien toksisuuden neutraloimisen mukaan lukien LPS:t, joissa on pitkiä polysakkaridiketjuja. Biolo- 30 gisen aktiivisuuden väheneminen liittyi suoraan deasylaa- tioasteeseen (taulukko 1). Muunnoksia tässä kuvattujen eri elementtien, vaiheiden ja menetelmien suunnitteluun, toteutukseen ja järjestelyyn voidaan suorittaa poikkeamatta seuraavissa 35 patenttivaatimuksissa määritellyn keksinnön aiheesta ja suoja-alasta.

27 Taulukko 2 Deasyloinnin vaikutus LPS:n biologisiin aktiivisuuksiin LPS:n deasylaatio 1 ( % ) Dermaalinen Puoliksi maksimaaliseen Shwartzmanin reak- B-solujen lisääntymiseen tio 2 tarvittava annos 3 (0-4+) (jug/m1) Kani 1 Kani 2 Koe 1 Koe 2 Limulus-lysaattiaktiivisuus 4 (pg/ml) ,024 0,016 6, ,055 0,08 4, ,087 NT* 3, ,100 NT* 1, ,14 0,18 0,4 1 (vapautuneet 3 H-rasvahapot/kaikki LPS:n 3 H-rasvahapot) x Vakiomäärät (2,5)ug) R-LPS:ja, jotka oli deasyloitu eriasteisesti, injektoitiin ihon- sisäisesti New Zealand White -kaneihin. 0 = ei reaktiota; 1+ = yhtä suuri kuin tai alle 4 mm:n verenvuoto; 2+ = 5-9 mm:n verenvuoto; 3+= mm:n verenvuoto. mm:n verenvuoto; 4+ = yli 3 C3H/HeN-hiiren pernan yksisolususpensioita inkuboitiin LPS:n kanssa 96-kuoppaisissa mikrotiitterilevyissä ja 3 H-metyylitymidiinin inkorporaatio mitattiin. 4 Limulus-lysaatin sakkaantuminen mitattiin käyttäen 50 pl lysaattia, joka sisälsi 0,8 mg/ml n-bentsoyyli-l-valyyliglysyyli-l-arginiini-pna:ta ja 50 pl testinäytettä. *NT = ei testattu