Matkakertomus yhteisön E. coli vertailulaboratorion, EU-RL VTEC, vuosittainen workshop (10. -11.10.2013, Rooma, ISS) Sisällysluettelo, jossa linkit aiheisiin: Role of phages in the evolution of VTEC and their presence in food and the environment / Mate Muniesa (University of Barcelona, Spain) Acquisition of vtx-phages by E. coli other than VTEC: can we expect new mosaic pathotypes? / Laura Grande (NRL Italy) Genome sequencing and VTEC genomics and typing: an overview of the 100,000 Genomes Project / Eelco Franz (NRL Netherlands) Sequencing results of the VTEC O157 typing phages / Lauren Cowley (NRL UK) Update on the annual reporting of VTEC in the EU and on EFSA activities for molecular typing data collection for food and animal isolates / Valentina Rizzi, EFSA Development of a European molecular typing database for food, environmental and veterinary strains of Listeria monocytogenes / Benjamin Felix Detection methods for VTEC and other pathogenic E.coli: the state of play / Stefano Morabito Joint ECDC-FWD (4th EQA) EU-RL (PT10) PT on the identification and typing of VTEC: The FWD network results / Flemming Scheutz Joint ECDC-FWD (4th EQA) EU-RL (PT10) PT on the identification and typing of VTEC: The EU- RL network results / Rosangela Tozzoli Results of the 11th inter-laboratory study (PT11) on the identification of pathogenic E. coli / EU-RL VTEC Management of the risk posed by VTEC in food: Results of an inventory of Member States approach to beef control / Kris De Smet Public health action and management of patients with VTEC infection: the Danish approach / Flemming Scheutz Argentinian meat: progress to prevent STEC contamination in beef production / Gerardo Leotta (Universidad de la Plata, Argentina) Role of wildlife as a reservoir of STEC./ Gabriella Conedera (IZS Venezie, Pordenone, Italy) IMS performed in microplates: comparison with the classical method / Estelle Loukiadis (NRL France) Standardisation of VTEC detection & typing in the UK / Lesley Allison (Scottish VTEC reference laboratory, Edinburgh, UK) Outbreak of VTEC O26-associated HUS in southern Italy / Alfredo Caprioli STEC O104:H4 in Turkey / Belkis Levent (National Public Health Agency, Ankara, Turkey) Quality assessment of PFGE typing / EU-RL VTEC PTs on VTEC detection and typing: results of a 6-years experience and management of the underperformance / EU-RL VTEC Yhteenveto workshopista / Alfredo Caprioli Tänä vuonna kokoukseen otti osaa 29 laboratoriota, jotka edustivat 24 jäsenmaata sekä Norjan ja Turkin laboratorioiden edustajat. Kokouksen ohjelmassa oli perinteiseen tapaan esityksiä kutsutuilta puhujilta, kansallisista referenssilaboratorioista, EFSA:sta, sekä vertailututkimuskierrosten raportointia. Lisäksi tänä vuonna pohdittiin molekyylityypitystietovarannon perustamiseen liittyviä käytännön järjestelykysymyksiä. Linkki esityksiin: http://www.iss.it/vtec/index.php?lang=2&id=169&tipo=12 Role of phages in the evolution of VTEC and their presence in food and the environment / Mate Muniesa (University of Barcelona, Spain) Esityksessä saatiin perustietoa faagien elinkierrosta ja yhteenveto faagitutkimusten tärkeimmistä havainnoista viime vuosilta. Koska tärkeimmät stx virulenssigeenit sijaitsevat liikkuvissa faageis-
2 (9) sa, on faagin elinkierron ymmärtäminen ja tutkiminen tärkeää VTEC bakteerien virulenssin ja sen muutosten ymmärtämisessä. Esimerkkinä vuorovaikutuksesta on ilmiö, jossa faagin lyyttiseen sykliin siirtyminen aktivoi stx-geenit tuottamaan toksiineja. Lyyttisen syklin käynnistää puolestaan bakteerin reagoiminen tiettyihin ympäristöolosuhteiden muutokseen (esim. UV säteily) SOSvasteellaan. Tutkimusryhmä on tutkinut faagitransduktiota (horisontaalista geenien siirtymistä) ja havainnut sitä tapahtuvan mm. ruoassa, mutta ei silti kovin kylmissä (<4 C) eikä happamissa (<ph 4) olosuhteissa. Ryhmä on tutkinut stx-faagien pitoisuuksia ympäristössä, elintarvikkeissa ja ihmisten ulosteissa. Ympäristössä (jätevesi) stx-faagien pitoisuus oli korkea, vaikka Barcelonan seudulla VTEC esiintyvyys ihmisissä on pieni. Myös elintarvikkeissa stx-faageja esiintyi runsaasti. Kaikki tutkitut jauhelihanäytteet ja noin puolet salaattinäytteistä olivat positiivisia stx-faagien suhteen vaikka näytteissä ei ollut todettavissa VTEC-bakteereita tai bakteeri-dna:ta. Faageilla myös esiintyi useampien eri alatyyppien stx-geenejä. Tutkimuksissa oli havaittu että laboratorioissa yleisesti käytössä olevat elintarvikkeiden/bakteerisolujen DNA:n eristysmenetelmät voivat eristää myös faagi-dna:ta (viruspartikkelit vaativat yleensä oman menettelynsä), vaikka bakteeri-dna:ta ei olisikaan näytteessä läsnä. Ympäristöstä ja elintarvikkeista tehtävään PCR-analytiikkaan liittyy siis irrallisista stxfaageista peräisin oleva väärien positiivisten mahdollisuus. Virhemahdollisuus voi olla merkittävä, jos pelkän faagi-stx-dna:n osuus näissä matriiseissa on niin korkea kuin tutkimustulokset antavat aihetta olettaa. Faagi-DNA on myös hyvin kestävää ympäristöolosuhteille ja säilyy pitkään (kestävämpää kuin VTEC bakteerit). Johtopäätöksenä ympäristöoloja simuloivista kokeista todettiin että ympäristössä esiintyvät stx-faagit (sekä muut virulenssiolminaisuuksia kantavat faagit) toimivat lähteenä uusille ominaisuusyhdistelmille ja uudentyyppisille VTEC kannoille. Acquisition of vtx-phages by E. coli other than VTEC: can we expect new mosaic pathotypes? / Laura Grande (NRL Italy) Työssä tutkittiin E. coli-bakteerien infektoitumista stx-faageilla etenkin enteroaggregatiivisten E. coli bakteerikantojen osalta. Tutkimus tuotti osin uutta tietoa ja vahvisti osin aikaisempia käsityksiä siitä että muut E. coli patotyypit kuin VTEC voivat infektoitua ja lysogenisoitua stx-faageilla. Tutkimus etenee vielä EIEC ja ExPEC kolien osalta. Genome sequencing and VTEC genomics and typing: an overview of the 100,000 Genomes Project / Eelco Franz (NRL Netherlands) Esityksessä kerrottiin elintarvikevälitteisten patogeenien laajasta kokogenomien sekvensointiprojektista. Projektissa tutkimusryhmä USA:ssa (University California Davis) sekvensoi ilmaiseksi valtavan määrän elintarvikepatogeenikantoja tutkijoiden pyynnöstä. Tutkija saa vuoden yksinoikeuden saatuihin tuloksiin julkaisua varten, jonka jälkeen saadut sekvenssit ja lähetetyt mikrobikannat säilötään julkiseen tietopankkiin. Hollannin NRL on yhdessä EU-RL:n kanssa lähettänyt projektiin yli 100 kantaa. Hollantilaisten tutkimus suuntautuu geno- ja fenotyyppisten erojen selvittämiseen kannoilla, jotka on eristetty sekä reservoaarista että sairastuneista ihmisistä. Heidän erityinen kiinnostuksensa kohdistuu stx2f tyypin kantoihin (etenkin stx2f/o63), jotka ovat nousseet yleisimmäksi ihmisten infektioiden aiheuttajaksi Hollannissa. Tyyppi on aiheuttanut yleensä lievempiä oireita, jopa tavallista ripulia, joskin hiljattain on tehty HUS-löydös Italiassa (Alfredo Capriolin kommentti).
3 (9) Sequencing results of the VTEC O157 typing phages / Lauren Cowley (NRL UK) Projektissa tyypitykseen käytettävät faagit haluttiin sekvensoida ja selvittää mm. muutoksia joita on tapahtunut O157 VTEC kantojen faagityypeissä viime vuosina. Sekvenssien perusteella faagit ryhmittyivät pääosin tyypityksessä saatavien tulosten ja ryhmien kanssa yhdenmukaisesti. Samankaltaisuus perimässä vertautuu samankaltaisuuteen lyyttisyydessä. UK pohtii sekvenssitiedon julkistamista ja etsii sopivaa (kuratoitua) tietokantaa. Update on the annual reporting of VTEC in the EU and on EFSA activities for molecular typing data collection for food and animal isolates / Valentina Rizzi, EFSA Ihmisten elintarvikevälitteisten infektioiden tilastoissa vuodelta 2011 oli ensimäistä kertaa enemmän VTEC infektioita (9485 kpl) kuin yersiniainfektioita (7017 kpl). Tämä johtui Saksan ituepidemiasta. Ihmisten infektioiden tilaston johdossa olivat kampylobakteerit (220 209) ja salmonellat (95 548). Listeriat (1476) seurasivat VTEC:n ja yersinioiden jälkeen. VTEC trendi on nouseva pidemmällä ajanjaksolla tarkasteltuna (vaikka Saksan ituepidemia jätettäisiin huomioimatta). EFSA:n raporteissa 22 jäsenvaltiota raportoi VTEC-tutkimuksia elintarvikkeista ja 13 eläimistä. Suurin osa tutkimuksista tehtiin edelleen ISO 16654:2001 menetelmällä, joka toteaa ainoastaan O157 serotyypin. Tämä johtaa muiden tyyppien vakavaan aliarviointiin. Tuoreessa naudanlihassa (8 maata raportoi) VTEC:iä esiintyi 1,4% näytteistä (näyteyksiköitä 4347). Näistä 0,3% oli VTEC O157 positiivisia. Suomi oli 4 maan joukossa, jotka raportoivat tutkimuksista siemenissä tai iduissa (näytemäärä yli 25 kpl). Eläimistä tehtävissä tutkimuksissa Suomi oli runsaalla näytemäärällään (1501 kpl) tilastojen kärjessä ja ohitti mm. Saksan (878 kpl) vuonna 2011 melkein kaksinkertaisella näytemäärällä. Painopiste Suomessa on siis vahvasti eläinnäytteissä, kun muissa maissa se näytemäärien perusteella näyttää olevan elintarviketutkimuksissa tai yhtä paljon molemmissa näytetyypeissä. EFSA toivoi jäsenvaltioilta toksiinityyppien tarkempaa raportoimista, esim. vaikka vain vapaakenttämuodossa. EFSA kertoi että kokogenomisekvenssien datapankista on tehty suunnitelmia ja tyypitystietopankin suunnittelu etenee jo konkreettisemmin (pilotti vuonna 2014). Asiantuntijatapaamista suunnitellaan molemmista aiheista. Development of a European molecular typing database for food, environmental and veterinary strains of Listeria monocytogenes / Benjamin Felix Puhuja oli tullut VTEC workshoppiin kertomaan kokemuksista L. monocytogenes tyypityskirjaston ja tietovarannon luomisessa. Listerian osalta vertailututkimuskierroksia (PT-trials) on järjestetty vuosina 2009, 2010 ja 2012 (viimeisin yhteistyössä ECDC:n kanssa) ja SOP-ohje PFGE-profiilien tulkinnasta on laadittu. Tietovarannon jäseniksi on hyväksytty laboratoriot, jotka ovat suoriutuneet hyväksyttävästi PT-kierroksista ja sitoutuvat memorandum of understanding yhteenvedon periaatteisiin. Tietovarannon kehittämisessä on viimeaikoina pyritty vastaamaan jäsenlaboratorioiden tarpeeseen paremmasta keskinäisestä tiedonvaihdosta. Jäsenlaboratoriot voivat käyttää EU-RL:n tietokantaa oman PFGE-profiilinsa tulkintaan, joka kannustaa laboratorioita järjestelmän käyttöön ja harmonisoi tulkintaa eri maiden välillä. Järjestelmä parantaa myös NRL:n keskinäisen tiedonvaihdon mahdollisuuksia. Eristettyjen bakteerikantojen taustalla olevien näytteiden tiedonkeruu noudattelee EFSA:n standard sample description kuvauksia (jako Food> Food product/food product environment >process applied). VTEC tietovarantoa tullaan kehittämään yhteistyössä EU-RL Listerian kanssa.
4 (9) Detection methods for VTEC and other pathogenic E.coli: the state of play / Stefano Morabito Esityksessä tehtiin yhteenveto vuoden aikana tapahtuneesta kehityksestä VTEC-asioiden ympärillä. Yksi huolenaiheista oli se että ISO/TS 13136 reaaliaikainen PCR-menetelmä on akkreditoimatta suurimmassa osassa eurooppalaisia laboratorioita (myös EU-RL:ssa). Esiteltiin tulokset EU-RL:n tekemästä kyselystä (toukokuu 2013) koskien laboratorioiden akkreditointitilannetta menetelmälle ISO/TS 13136. Selvisi, että yksikään laboratorio ei ollut toukokuussa 2013 akkreditoinut menetelmää. Neljä NRL:ää oli aikeissa akkreditoida menetelmän vuonna 2013, 7 vuonna 2014, 7 vuonna 2015, 1 vuonna 2016, 1 niin nopeasti kuin mahdollista ja 2 ei aio akkreditoida ollenkaan. Loput vastaajat ovat akkreditoineet tai aikovat akkreditoida oman sisäisen menetelmän vastaavalla sovellusalueella, joko samoilla tai eri reagensseilla. Toinen kysymys, jonka EU-RL (vihdoin) nosti esityskalvojen tasolle, oli mitä tehdään positiivisilla PCR-tuloksilla jotka eivät varmistu bakteerin eristysyrityksillä (esityksen lopussa esitettiin kehotus keskusteluun asiasta, mutta keskustelulle ei jätetty kuitenkaan aikaa eikä asiaan palattu workshopin aikana joten asiasta käytiin lähinnä käytäväkeskusteluja). Käytännön analytiikan ongelmana ituasetuksen voimaantulon jälkeen on esiintynyt idätyksessä käytetyn kasteluveden tutkiminen. Kasteluvesi voi olla liian sakeaa suodatusmenettelylle ja tietynlaiset esisuodattimet voivat tarjota ratkaisun ongelmaan. EU-RL lupasi vuonna 2014 käynnistää tutkimuksen parhaista esisuodatusvaihtoehdoista. Nouseva trendi näyttää olevan VTEC RASFF-ilmoitukset elintarvikkeista, jotka eivät ole lainsäädännön piirissä VTEC:n osalta. Lihassa ja lihatuotteissa RASFF-ilmoitusten määrä on lyhyessä ajassa ponnahtanut Listerian tasolle. EU-RL kysyykin olisiko tarvetta uudelle lainsäädännölle. Lainsäädännön laatiminen ei kuitenkaan olisi helppoa, sillä se pitäisi tehdä EFSA:n asiantuntijamielipiteen perusteella (raportti julkaistu 2013), jossa konsensus yksittäisten alaryhmien nimeämiseksi merkittävimmiksi VTEC -riskiryhmiksi jäi saavuttamatta. Sama ongelma heijastuu kysymykseen mitä valvonnallisia toimenpiteitä tulisi tehdä pelkän PCR-positiivisen tuloksen perusteella. Joint ECDC-FWD (4th EQA) EU-RL (PT10) PT on the identification and typing of VTEC: The FWD network results / Flemming Scheutz Saatiin raportti ECDC:n verkoston eli humaanipuolen (referenssi)laboratorioiden menestymisestä PT 10 kierroksella (kierros järjestettiin vuodenvaihteessa 2012-2013). Humaaninäytteitä tutkivat laboratoriot menestyivät kohtuullisen hyvin, tosin vtx-alatyypityksessä esiintyi samanlaisia ongelmia kuin EU-RL:n laboratorioverkoston laboratorioissa. Parannusta edelliseen kierrokseen on kuitenkin tapahtunut järjestävien tahojen tekemien menetelmien parannuksien myötä. Laboratorioverkoston kyky vtx- ja eae- tyypityksiin oli kattavin, mutta muihinkin parametreihin oli osallistuttu kiitettävästi. PFGE-analytiikan osalta verkostossa on päätetty käyttää ainoastaan O157 ajoparametreja vertailtavuuden takaamiseksi. SSI:ssä oli tunnistettu tärkeimpiä virhelähteitä PFGE-kuvien laadussa, joista esiin nostettiin mm. epäselvät ajo-olosuhteet ja bändit. Epäselvien bändien helpoin korjauskeino oli varmistaa laboratoriossa, että tarkennusta käytetään oikein (ja ylipäätään käytetään!) kuvanottohetkellä. Epäselviin bändeihin pystytään vaikuttamaan myös riittävillä ja huolellisilla pesuilla (sekä plugien pesuvaihe että geelin pesu värjäyksen jälkeen).
5 (9) Joint ECDC-FWD (4th EQA) EU-RL (PT10) PT on the identification and typing of VTEC: The EU-RL network results / Rosangela Tozzoli Vertailututkimuskierroksella tutkittiin VTEC kantoja ja muita patogeenisia E. coli- kantoja (15 kpl). Kannat valmisti SSI Tanskassa (yhteistyö Flemming Hansenin kanssa). Kierros järjestettiin yhtäaikaisesti edellä mainitun humaaninäytteitä tutkivien referenssilaboratorioiden kierroksen kanssa. Kierrokselle osallistui 31 NRL:ää 26:sta eri EU-maasta, sekä lisäksi joitakin EU:n ulkopuolisia maita. Laboratorioista 53 % tunnisti oikein vtx-kohdegeenit näytekannoista. Eviran elintarvike- ja rehumikribiologian tutkimusyksikön elintarvikemikrobiologian jaosto ELMI osallistui kierrokselle. Myös Eviran Kuopion Eläintautibakteriologian tutkimusyksikkö osallistui kierrokselle. Kaikki saadut tulokset (vtx1, vtx2, eae ja top-5 molekyyliserotyypitys), sekä Eviran Kuopion Eläintautibakteriologian tutkimusyksikön ELMI:n kannoille tekemät tutkimukset (aggr, aaic, sekä osa serotyypitystutkimuksista) oli vastattu oikein. Kuusi laboratoriota sai liikaa virhepisteitä O-serotyypitysosuudessa, mutta heidän suorituksensa kuitenkin hyväksyttiin koska virheet eivät eivät tapahtuneet tärkeimpien top-5 serotyyppien tunnistamisessa. Tärkeimpien VTEC-virulenssigeenien (vtx1, vtx2 ja eae) tunnistamisessa laboratoriot onnistuivat hyvin, ja vtx-alatyypitysten tulokset olivat parantuneet (menetelmäparannuksen seurauksena) huomattavasti edellisestä kierroksesta vuonna 2010. Results of the 11th inter-laboratory study (PT11) on the identification of pathogenic E. coli / EU-RL VTEC Kierrokselle osallistui 36 NRL:ää ja 91% laboratorioista tunnisti VTEC virulenssigeenit oikein lähetetyistä bakteerikannoista. Virallista raporttia kierroksesta ei ole vielä päivitettu EU-RL nettisivuille. Eviran elintarvike- ja rehumikribiologian tutkimusyksikön elintarvikemikrobiologian jaosto ELMI ei osallistunut kierrokselle. Eri serotyyppien osalta oikein tunnistaneita laboratorioita oli 97% (O26 ja O121) ja 91% (O113) ja EU-RL totesi laboratorioiden olevan hyvin varautuneita myös muiden patogeenisten E. colien toteamiseen. Management of the risk posed by VTEC in food: Results of an inventory of Member States approach to beef control / Kris De Smet Komission edustaja otti esiin tuontinaudanlihan lisääntyneet RASFF-ilmoitukset, joiden määrä on noussut huomattavasti vuodesta 2009 (5 kpl) tähän vuoteen (52 kpl). Lainsäädännössä ei ole yksityiskohtaisia kriteereja VTEC:ille naudanlihassa, mutta prosessihygieniakriteerit enterobakteereille ja salmonellalle ovat voimassa. Samoin noudatetaan artiklaa 14, asetuksesta 178/2004. Komissio teki tilanteen johdosta kyselyn jäsenvaltioille viime keväänä (vastausprosentti 72%). Kyselyssä kartoitettiin mm. jäsenvaltioiden suhtautumista VTEC löydöksiin naudanlihassa ja sellaisenaan syötävissä tuotteissa. Kyselyn vastausten perusteella jäsenvaltioiden menettelyt ruhon ja jauhelihan osalta ovat yhdenmukaisempia kuin sellaisenaan syötävien ruokien (RTE) osalta, joiden kohdalla useampi jäsenvaltio (=10) vastasi hylkäävänsä tuotteet tiettyjen serotyyppien perusteella. Suurin osa käytti menetelmää ISO/TS 13136, mutta tarkemmassa erittelyssä paljastui, että 4 maata tekee menetelmästä vain vtx-pcr osuuden, 12 maata vain vtx- ja sero-pcr osuuden ja 10 maata tekee menetelmän loppuun asti eli edellä mainittujen osuuksien lisäksi bakteerin eristysyrityksen eli viljelytutkimuksen. Luennon jälkeen kysyttäessä komission edustaja vielä vahvisti että kyselyn tuloksia voidaan tulkita niin että noin puolet jäsenmaista hylkää tällä hetkellä liha-ja RTEtuotteita pelkän PCR-tuloksen perusteella. PCR-standardin lisäksi käytössä oli lisäksi ISO 16654:2001 eli perinteinen viljelymenetelmä, joten komissio totesi että menetelmissä on kirjoa ja harmonisoinnille olisi tarvetta. Kyselyn perusteella 13 maata halusi käyttöön mikrobiologiset kriteerit lihalle, 5 maata halusi harmonisoida monitorointia ja 10 maata halusi tarkemman ohjeistuksen
6 (9) komissiolta nykyisen lain 178/2004 soveltamisesta tälle alueelle. Jäsenvaltioiden välillä oli selviä eroja riskinarvioinnissa ja toimenpiteissa, mutta myös halukkuutta harmonisointiin. Komission aikeissa onkin työstää seuraavaksi ohjeistus 2013 julkaistuun EFSA Opinion -raporttiin perustuen. Komission esitti toiveen että jäsenvaltiot olisivat myös tarvittaessa valmiita joustamaan näkemyksistään yhteisen, harmonoidun mallin luomiseksi. Public health action and management of patients with VTEC infection: the Danish approach / Flemming Scheutz Esityksessä kerrottiin toimintamalleista, jotka ovat käytössä VTEC-bakteerien diagnostiikassa Tanskassa. Kaikki veriripulia sairastavat potilaat on tutkittava VTEC:in varalta ja löydöksistä on ilmoitettava. Potilasohje hyödyntää HUSEC:in käsitettä (VTEC tapaukset, joiden seurauksena HUS), ja rajoittavat toimet keskittyvät ainoastaan näihin infektioihin ja tiettyihin ryhmiin (esim. lapsi laitoshoidossa, sairaalan tai elintarvikealan työntekijät). Paikallisia lääkäreitä informoidaan infektioista ja sairastuneiden elintarviketyöntekijöiden tapauksessa myös elintarvikepuolen viranomaisia informoidaan. SSI (Statens Serum Institut, Tanskan kansanterveyslaitos ) on tehnyt infektio- ja kantojen virulenssitilastojen perusteella luokituksen HUSEC statuksen tunnistamisen kannalta oleellisista virulenssitekijöistä (http://www.ssi.dk/service/sygdomsleksikon/h/haemolytisk%20uraemisk%20syndrom.aspx). Listaan kuuluu tällä hetkellä 5 eri virulenssigeenien esiintymisen perusteella jaettua luokkaa, jotka ovat nähtävissä SSI:n nettisivuilla ja joita päivitetään aina jos tilanteen muuttuminen luo tarvetta sille. Tanskassa on havaittu, että kontrollitoimien kohteeksi joutuvaa ihmisryhmää voidaan vielä nykyisestä pudottaa (n. 11%:iin) jos vtx-alatyypitys tehtäisiin nykyistä useammin. Lisäksi Tanskalaiset olivat saaneet konkreettista tietoa VTEC:in alidiagnosoinnista. Insidenssi oli noussut Fynin saarella muutamasta tapauksesta 10,5:een kun käytännöksi otettiin kaikkien ulostenäytteiden seulonta VTEC:in varalta. Vastaavan tasoinen alidiagnosointi koko Tanskan väestötasolla tarkoittaisi lähes 400 tapauksen huomiotta jättämistä vuosittain. Argentinian meat: progress to prevent STEC contamination in beef production / Gerardo Leotta (Universidad de la Plata, Argentina) Puhuja kertoi edistysaskelista joita Argentiinan lihantuotannossa on otettu VTEC:in eliminoimiseksi. Argentiinalaiset olivat ryhtyneet mittaviin toimenpiteisiin 5 isoimman vientiteurastamonsa hygienian parantamiseksi hiljattain. Tilannetta oli edeltänyt joidenkin EU-maiden äkillinen siirtyminen nollatoleranssilinjalle VTEC-bakteerin suhteen tuoreen naudanlihan ja jauhelihan osalta. Hylkäykset tehtiin pelkkien stx-geenien esiintymisen perusteella ilman että bakteeria oli kyetty eristämään viljelymenetelmällä (sama ilmiö näkynyt myös Euroopan RASFF-tilastoissa äkillisenä nousuna). Argentiinalaisissa teurastamoissa käyttöönotettuja toimenpiteitä olivat mm. ruhon hännän käsittely, peräsuolen pussitus, höyrykäsittelyt ruhon käsittelyn eri vaiheissa, sekä laitteiden ja pintojen tehostettu desinfiointi. Toimenpiteet siis vaikuttavat hygieniaa edistävästi patogeeniin katsomatta, eli lopputulos kuluttajan kannalta on positiivinen. Role of wildlife as a reservoir of STEC./ Gabriella Conedera (IZS Venezie, Pordenone, Italy) Esityksessä raportoitiin STEC O157:n esiintymistä peuranlihassa ja siitä valmistetuissa tuotteissa Italiassa. Peuroilla esiintyy paljon STEC:iä erittäviä yksilöitä ja niistä on eristetty eri sero- ja virulenssityyppien kantoja. Osa eristetyistä kannoista on potentiaalisesti virulentteja ihmiselle. Riistali-
7 (9) han tutkimusprojektissa 13/16 (81%) tutkituista näytteistä oli stx-positiivisia (mm. peuran ja villisian lihaa). Tutkituista näytteistä 14 oli positiivisia top-5 seroryhmien geenien suhteen. Tutkituista näytteistä 8/15 (53%) pystyttiin eristämään STEC-bakteeri. Todettiin että riistaliha on tärkeä lähde ihmisen STEC-infektioille. Esiin nostettiin etenkin paikalliset RTE perinnetuotteet tietyissä osissa Italiaa (salamityyppiset makkarat). Merkillepantavaa oli että STEC O103 (stx1, eae) eristettiin kuivasta makkarasta (aw 0,92, ph 5,35). IMS performed in microplates: comparison with the classical method / Estelle Loukiadis (NRL France) Esiteltiin uutta bakteerien selektiivistä eristämistapaa, joka perustuu immunomagneettiseen separaatioon (IMS) mikrotiitterilevyillä. Kyseinen Nexidian menetelmä nopeuttaa eristystä, koska se tehdään 96-kuoppalevyillä monikanavapipettejä apuna käyttäen. Menettelytapa soveltuu myös serotyypeille joille nykyisellään ei ole IMS kuulia saatavilla. Alustavat ymppäyskokeet elintarvikematriisin kanssa ovat antaneet lupaavia tuloksia. Tällä hetkellä on meneillään luonnollisesti kontaminoituneiden näytteiden tutkimukset. Standardisation of VTEC detection & typing in the UK / Lesley Allison (Scottish VTEC reference laboratory, Edinburgh, UK) Puhuja esitteli Skotlannin ja Englannin välistä harmonointia erityisesti tyypitysmenetelmissä. O157 infektioiden runsas esiintyminen on tuonut esiin puutteet PFGE tyypityksessä (niistä esitelmä aiemmilta vuosilta), jonka johdosta on siirrytty MLVA-tyypitykseen. Tästä puhuja sai yleisöstä kriittistä palautetta, sillä tämä päätös vaikeuttaa harmonointia Euroopassa, jos UK käyttää eri menetelmää (MLVA) kuin mitä muut NRL:t ovat sopimassa käytettäväksi (PFGE). Outbreak of VTEC O26-associated HUS in southern Italy / Alfredo Caprioli Epidemian aikana kesällä 2013 todettiin 23 hemolyyttis-ureemista sydrooma (HUS) tapausta Apulian maakunnassa Etelä-Italiassa. Suurimmalla osalla potilaista (19 kpl) todettiin EHEC tyyppiä O26, vtx2a, eae. Merkillepantavaa epidemiassa oli että eri perheissä vain pienimmät lapset sairastuivat. Potilaat yhdistettiin epidemiologisesti PFGE-tyypitystulosten perusteella (esitettiin erittäin huonolaatuinen tyypityskuva!). Epidemiologisen kuvaajan perusteella epidemialla oli jatkuva lähde. Jos kyseessä oli ruoka, oli kysymys pitkästä säilyvyysajasta. Epäiltiin paikallisia tuotteita, mm. mozzarellaa ja vesimeloneja. Tutkituista elintarvikenäytteistä ei kuitenkaan löydetty STECbakteereita. Tietyistä juuston valmistuseristä todettiin vtx2, eae ja O26 geenit PCR-tutkimuksilla, mutta kannat jotka saatiin eristettyä erosivat potilaskannoista. Epidemialle ei löytynyt selvää lähdettä. Yleisesti ottaen O26 serotyyppiin liittyvät HUS-tapaukset ovat yleistyneet Italiassa vuosien varrella. STEC O104:H4 in Turkey / Belkis Levent (National Public Health Agency, Ankara, Turkey) Ennen Saksan ituepidemiaa vuonna 2011 Turkissa (etsittiin ja) eristettiin vain EHEC -tyyppiä O157:H7. Ripulipotilailta eristyksiä tehtiin 0,2 1,2 % näytteistä eri tutkimuksissa. Turkkilaisissa laboratorioissa EHEC:iä ersitetään sekä suoraan että IMS käsittelyn avulla. Nykyään myös TSBviljelmästä tehdään verotoksiini ELISA- ja PCR tutkimukset. Jatkotutkimuksissa huomioidaan sekä O157 sekä non-o157 kannat. Turkissa on löytynyt EHEC tapauksia (5 eristettyä kantaa 10:stä),
8 (9) jotka edustavat tyyppiä O104:H4. Eristetyt kannat ovat lähinnä pohjoisosista Turkkia, yksikään ei ollut eteläisiltä turistialueilta peräisin. Turkin tavoitteena on lisätä paikallisten mikrobiologien ja kliinikkojen tietoisuutta STEC:istä ja HUS:istä. Quality assessment of PFGE typing / EU-RL VTEC Raportoitiin tuloksia ensimmäiseltä EU-RL:n järjestämältä PFGE tyypityskierrokselta. Mukana oli 19 NRL:ää, joista 16 EU-referenssilaboratorioverkostosta. Vastaustapana oli lähettää kuva PFGEgeelistä tiff-muodossa sähköpostissa. Eviran Elintarvikemikrobiologian jaosto osallistui kierrokselle ja olimme kokonaistuloksissa 8 parhaimman menestyneen laboratorion joukossa. Arviointi koostui eri osatekijöistä joita olivat 1) ajo-olosuhteet ja kuvan otto/tarkennus, 2) solususpension laatu, 3) bändit eli restriktoidut DNA-juosteet (juosteiden erottuminen) 4) lanet eli juosteiden kulkureitit (esim. niiden asettuminen mahdollisimman suoraan), 5) restriktio (entsyymin pilkkomisreaktion onnistuminen), 6) geelin tausta (taustan puhtaus roskista, jotka häiritsevät juosteiden erottumista) ja 7) DNA:n hajoaminen (ei esiinny merkittävästi ei-toivottua hajoamista). Kaikkien osanottajien keskiarvoina laboratoriot menestyivät huonoimmin bands osuudessa, eli DNA-juosteiden erottumisessa oli eniten puutteita. Parhaiten oli onnistunut restriction eli DNA oli saatu pilkottua onnistuneesti restriktioentsyymillä suurimmassa osassa laboratorioista. Kaikilla parametreilla ei ehkä ole yhtäläinen painoarvo onnistuneen geelikuvan kannalta, joten arviointia kehitetään suuntaan jossa painotetaan esim. bändejä ja geelin taustaa. Listeria -referenssilaboratoriosta kommentoitiin vielä arviointia siten että järjestäjän ei olisi hyvä esittää suoraviivaisia kommentteja että ongelmat geelikuvassa johtuvat esim. restriktiosta, sillä ne voivat olla monen asian yhteisvaikutuksesta johtuvia (esim. DNA:n eristys, restriktioentsyymin laatu, ym. monet tekijät). PTs on VTEC detection and typing: results of a 6-years experience and management of the underperformance / EU-RL VTEC EU-referenssilaboratorio kertoi 6 vuoden kokemuksiaan vertailututkimuskierroksista. 41 NRL:ää on ottanut osaa kierroksille, 28 EU-maista ja 7 muusta Euroopan tai Euroopan ulkopuolisesta laboratoriosta. Virheet eri serotyyppien toteamisessa ovat vähentyneet. Viimeisimmällä elintarviketutkimuskierroksella (9th PT), johon osallistui 32 NRL:ää 26:sta EU-maasta (+NO, SW, RU, EG) menestyminen oli hyvää. EU-RL totesi EU-maiden valmiuksien todeta merkittävimmät STEC:it elintarvikkeista olevan hyvät. Nyt kierrokset etenevät myös muiden patogeenisten E. colien havaitsemiseen ja tunnistamiseen. Joulukuussa päättyvällä kierroksella mukana ovat STEC, EAggEC, ETEC ja EIEC ja tutkittavina näytteinä idut. Yhteenveto workshopista / Alfredo Caprioli EU-referenssilaboratorio mainosti vielä tulevan vuoden harjoitteluohjelmiaan. ISS:n tiloihin on mahdollista tulla opettelemaan BioNumericsin käyttöä PFGE-geelien analysoinnissa. Vuonna 2014 tullaan järjestemään kaksi PT kierrosta, toinen itunäytteillä ja toinen kantojen tunnistamisessa. Yhteenvetona workshopin ohjelmasta todettiin että muille RTE ruuille kuin iduille on tehtävä tapauskohtaisesti riskinarviointi asetuksen 178/2002 mukaan, jos STEC todetaan. Esiin tulleita epäkohtia tulisi tarkastella esim. jos top6 serotyyppejä (tai mitä tahansa STEC serotyyppejä) esiintyy iduissa tai STEC esiintyy raa assa naudanlihassa. Ongelmaksi ISO/TS 13136 osalta on noussut vtx2falatyypin puuttuminen menetelmän sovellusalueesta, sillä vtx2f-tyypin merkitys ihmisten infektioissa on kasvanut huomattavasti. Myös menetelmän esikäsittelyn ongelmat (puutteet esirikastuksen ja DNA:n eristyksen kuvauksissa) tulisi ottaa käsittelyyn. Irtofaagien (stx-faagit) vaikutus elintarvikkeiden tutkimustuloksiin nousi myös esiin merkittävänä asiana tässä workshopissa. Todettiin lo-
9 (9) puksi, että menetelmät ja valmius niiden käyttämiseen ovat parantuneet myös muiden patogeenisten E. colien kuin STEC osalta viime aikoina.