RAVINNON N-3-RASVAHAPPOJEN JA KALAN SYÖNNIN VAIKUTUS LIPIDIMETABOLIAAN HEIKENTYNEESSÄ GLUKOOSIAINEENVAIHDUNNASSA

RAVINNON N-3-RASVAHAPPOJEN JA KALAN SYÖNNIN VAIKUTUS LIPIDIMETABOLIAAN HEIKENTYNEESSÄ GLUKOOSIAINEENVAIHDUNNASSA Sanna Leinonen Pro gradu tutkielma Ravitsemustiede Lääketieteen laitos Terveystieteiden tiedekunta Itä-Suomen yliopisto Huhtikuu 2016

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta, ravitsemustiede LEINONEN SANNA T.: Ravinnon n-3-rasvahappojen ja kalan syönnin vaikutus lipidimetaboliaan heikentyneessä glukoosiaineenvaihdunnassa Pro gradu -tutkielma, 70 s. ja 1 liite (5 s.) Ohjaajat: FT, apulaisprofessori Ursula Schwab ja FT, dosentti Arja Erkkilä Huhtikuu 2016 Avainsanat: n-3-rasvahapot, alfalinoleenihappo, rasvainen kala, vähärasvainen kala, ruokavalio, lipidimetabolia RAVINNON N-3-RASVAHAPPOJEN JA KALAN SYÖNNIN VAIKUTUS LIPIDIMETABOLIAAN HEIKENTYNEESSÄ GLUKOOSIAINEENVAIHDUNNASSA Dyslipidemia on ateroskleroosin riskitekijä. Ateroskleroosi puolestaan on useiden sydän- ja verisuonisairauksien taustalla. Dyslipidemian ja ateroskleroosin kehittymiseen voidaan vaikuttaa elintavoilla. Tutkimuksissa kalan käytöllä on useimmiten havaittu joko positiivisia tai ei lainkaan vaikutuksia lipidimetaboliaan. Kalan käyttö voi suurentaa HDL-partikkeleita ja suurentaa HDL-kolesterolipitoisuutta. Toisin kuin kalaöljykapseleiden, kalan käytön ei ole havaittu suurentavan LDL-kolesterolipitoisuutta. Vaikutuksia lipidimetaboliaan on havaittu myös vähärasvaisella kalalla, joten vaikutukset eivät näyttäisi olevan yksinomaan n-3- rasvahappojen ansiota. On havaittu viitteitä siitä, että alfalinoleenihapon (ALA) käyttö vähentäisi aterogeenisempien pienten ja tiheiden LDL-partikkeleiden pitoisuutta ja lisäisi suurempien LDL-partikkeleiden pitoisuutta. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää vähärasvaisen ja rasvaisen kalan sekä ALA:n vaikutuksia lipidimetaboliaan. Tutkittavat (n=79) olivat 40-70-vuotiaita, joilla oli glukoosiaineenvaihdunnan häiriö. Heidät satunnaistettiin sukupuoli ja statiinilääkitys huomioon ottaen neljään ryhmään. Rasvaisen kalan ryhmässä tutkittavat söivät neljä annosta rasvaista kalaa viikossa, jolloin eikosapentaeenihapon (EPA) ja dokosaheksaeenihapon (DHA) saanti olisi keskimäärin 1 g päivässä. Vähärasvaisen kalan ryhmässä tutkittavat söivät myös neljä kala-annosta viikossa. ALA-ryhmä sai syödä enintään yhden kala-aterian viikossa ja lisäksi he käyttivät camelinaöljyä 30 ml vuorokaudessa saadakseen 10 g ALA:a päivässä. Myös kontrolliryhmässä vain yksi kala-annos viikossa oli sallittu. Ruokavaliot olivat isokalorisia, perustuivat tutkittavien aiempaan ruokavalioon ja noudattivat ravitsemussuosituksia lukuun ottamatta kalan käyttöä ja ALA:n saantia. Interventio kesti 12 viikkoa. Tutkittavat pitivät ruokapäiväkirjaa neljän päivän ajan ennen tutkimuksen alkua sekä viikoilla 3, 7 ja 11. Lipoproteiinipartikkelien ja lipidien määritykseen käytettiin NMR-spektroskopiaa (ydinmagneetinen resonanssispektroskopia). Rasvaisen kalan käyttö suurensi seerumin DHA:n ja muiden n-3-rasvahappojen pitoisuuksia sekä näiden osuutta kokonaisrasvahapoista. Rasvaisen kalan ryhmässä HDL-partikkelien koko suureni lähtötilanteeseen verrattuna ja muutos erosi merkitsevästi kontrolliryhmästä. Myös kolesterolipitoisuus HDL- ja HDL2-partikkeleissa sekä lipidien ja fosfolipidien pitoisuus suurissa HDL-partikkeleissa lisääntyi rasvaisen kalan ryhmässä verrattuna vähärasvaisen kalan ryhmään. ALA:n käyttö suurensi n-3-rasvahappojen osuutta seerumin kokonaisrasvahapoista. ALA-ryhmässä IDL-partikkelien (intermediate density lipoprotein) pitoisuus pieneni ja muutos erosi merkitsevästi vähärasvaisen kalan ryhmästä. Vähärasvaisella kalalla ei tässä tutkimuksessa havaittu vaikutusta lipidimetaboliaan. Tämän tutkimuksen perusteella rasvaisen kalan käyttö näkyy niin seerumin DHA-pitoisuuden kuin muidenkin n-3-rasvahappojen pitoisuuden suurenemisena. Rasvaisen kalan käyttö vaikuttaa myös edullisesti HDL-partikkeleihin. ALA:n käyttö suurentaa n-3-rasvahappojen osuutta seerumin kokonaisrasvahapoista, muttei vaikuta seerumin DHA-pitoisuuteen. ALA:n käyttö myös pienentää IDL-partikkelien pitoisuutta. Vähärasvaisen kalan käytöllä ei ollut vaikutusta seerumin lipideihin tai lipoproteiinien pitoisuuksiin ja koostumukseen.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Science, Nutrition Science LEINONEN SANNA T.: The effect of dietary n-3 fatty acids and fish on lipid metabolism in subjects with impaired glucose metabolism Master's thesis, 70 p. and 1 attachment (5 p.) Supervisors: PhD, Associate Professor Ursula Schwab and PhD, Docent Arja Erkkilä April 2016 Keywords: n-3 fatty acids, alpha-linolenic acid, fatty fish, lean fish, diet, lipid metabolism THE EFFECT OF DIETARY N-3 FATTY ACIDS AND FISH ON LIPID METABOLISM IN SUBJECTS WITH IMPAIRED GLUCOSE METABOLISM Dyslipidemia can lead to the development of atherosclerosis. Which in turn is a major phenomenon in several types of cardiovascular diseases. Dyslipidemia could be treated with life style modification. In recent research fish intake has had favorable or no effect on lipid metabolism. Fish intake may increase the size of HDL-particles and concentration of HDLcholesterol. Unlike fish oil capsules, fish intake does not increase LDL-cholesterol concentration. Lean fish has also showed some favorable effects on lipid metabolism, so there might be something else than just n-3- fatty acids in fish that affect lipid metabolism. There has also been some evidence that alpha-linolenic acid (ALA) intake would decrease the amount of small dense LDL-particles and increase the amount of larger LDL-particles. The aim of this study was to examine the effects of fatty and lean fish and ALA intake on lipid metabolism. Study subjects (n=79) were 40-70 years old and had impaired glucose metabolism. They were randomized in four groups (fatty fish, lean fish, ALA and control) according to sex and the use of statins. Fish groups had four meals of fish per week to get 1 g of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) per day. ALA-group was allowed to have one fish meal per week and they ingested 30 ml camelina oil to get 10 g ALA per day. Diets were isocaloric, based on the subject's habitual diet and followed the Finnish dietary recommendations (except for fish and ALA intake). The duration of the study was 12 weeks. Subjects kept 4-day food records before the beginning and during the intervention (at weeks 3,7,11). Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) was used in the analysis of lipoprotein particles and lipids. In this study fatty fish intake increased serum DHA and n-3 fatty acid levels and their proportion of the serum total fatty acids. In the fatty fish group the mean size of HDL-particles increased and the change was statistically significant compared to the control group. The concentration of total cholesterol in HDL- and HDL2-particles and the concentration of lipids and phospholipids in large HDL-particles increased in the fatty fish group compared to the lean fish group. ALA intake increased the proportion of n-3 fatty acids of total fatty acids in serum. The concentration of IDL-particles decreased in the ALA group compared to the lean fish group. The concentration of small LDL-particles and the amount of lipids in the small LDL-particles decreased in the ALA group but the change was not significant compared to the other groups. In this study lean fish consumption had no effect on lipid metabolism. Fatty fish intake increases serum DHA and other n-3 fatty acid levels and their proportion of the total fatty acids in serum. Fatty fish intake also has beneficial effect on HDL-particles. ALA intake increases the proportion of n-3 fatty acids of the serum total fatty acids, except DHA. ALA intake also reduces the amount of IDL-particles. Lean fish intake had no effect on lipid metabolism.

LYHENTEET ALA=alfalinoleenihappo EPA=eikosapentaeenihappo DHA=dokosaheksaeenihappo LDL=low density lipoprotein HDL=high density lipoprotein VLDL=very low density lipoprotein IDL=intermediate density lipoprotein NMR=nuclear magnetic resonance spectroscopy, ydinmagneettinen spektroskopia PUFA=polyunsaturated fatty acids, monityydyttymättömät rasvahapot MUFA=monounsaturated fatty acids, kertatyydyttymättömät rasvahapot SFA=saturated fatty acids, tyydyttyneet rasvahapot

SISÄLTÖ 1 JOHDANTO... 7 2 KIRJALLISUUS... 8 2.1. N-3-rasvahapot... 8 2.1.1 Rasvahappojen luokittelu... 8 2.1.2 N-3-rasvahapot ja niiden konversio... 8 2.1.3 Konversioon vaikuttavia tekijöitä... 10 2.2 N-3-rasvahapot ruokavaliossa... 10 2.2.1 N-3-rasvahappojen suositukset, saanti ja lähteet suomalaisilla... 10 2.2.2 Kasviöljyt n-3-rasvahappojen lähteenä ja vaikutus n-3-rasvahappopitoisuuksiin elimistössä... 12 2.3 Kala... 14 2.3.1 Suositukset kalan käytölle... 14 2.3.2 Suomalaisten kalan käyttö... 14 2.3.3 Kalan käytön ongelmat... 15 2.3.4 Kala n-3-rasvahappojen lähteenä ja vaikutus n-3-rasvahappopitoisuuksiin elimistössä... 16 2.3.5 Muut kalan ominaisuudet... 17 2.4 Lipidimetabolia... 18 2.4.1 Lipidien imeytyminen elimistöön... 18 2.4.2 Lipidien kuljetus elimistössä... 20 2.4.3 Lipidimetabolia ja sydän- ja verisuonisairaudet... 23 2.4.4 Kalan syönnin vaikutus lipoproteiinipartikkeleihin... 26 2.4.5 Alfalinoleenihapon vaikutus lipoproteiinipartikkeleihin... 31 2.5 NMR-spektroskopia... 36 2.5.1 NMR-menetelmä... 36 2.5.2 NMR-spektroskopia ja metabolomiikka... 36 2.5.3 NMR-menetelmän hyödynnettävyys... 38 3 TAVOITTEET... 39

4 AINEISTO, MENETELMÄT JA TULOSTEN KÄSITTELY... 40 4.1 Aineisto... 40 4.2 Tutkimuksen kulku... 43 4.3 Ruokavaliot... 44 4.4 Lipidi- ja lipoproteiinimääritykset... 45 4.5 Tilastolliset analyysit... 45 5 TULOKSET... 46 5.1 Ruokavaliot... 46 5.2. Seerumin lipidit... 49 5.3 Lipoproteiinipartikkelit... 52 5.3.1 Lipoproteiinipartikkelien koko... 52 5.3.2 Kolesterolin ja triglyseridien pitoisuudet lipoproteiinipartikkeleissa... 53 5.3.3 VLDL-, IDL- ja LDL-partikkelit... 55 5.3.4 HDL-partikkelit... 55 6 POHDINTA... 58 6.1 Aineisto... 58 6.2 Menetelmät... 59 6.3 Tulokset... 60 7 JOHTOPÄÄTÖKSET... 63 LÄHTEET... 64 LIITE. VLDL-, IDL- ja LDL-partikkelien pitoisuudet ja koostumus tutkimuksen alussa ja lopussa.... 71

1 JOHDANTO 7 Sydän- ja verisuonitaudit ovat edelleen suomalaisten yleisin kuolinsyy. Sydän- ja verisuonitautien taustalla on usein ateroskleroosi, jonka kehittymiseen vaikuttaa dyslipidemia eli lipidimetabolian häiriintyminen. Dyslipidemiaan voidaan vaikuttaa elintavoilla, kuten liikunnalla, tupakoinnin lopettamisella ja ruokavaliolla (Dyslipidemiat. Käypä hoito -suositus. 2013). Yksittäisistä ravintoaineista n-3-rasvahappojen vaikutuksia lipidimetaboliaan on tutkittu runsaasti. Enimmäkseen on kuitenkin tutkittu pitkäketjuisia n-3-rasvahappoja eikosapentaeenihappoa ja dokosaheksaeenihappoa kalaöljykapseleiden muodossa ja kalaöljyn onkin havaittu laskevan triglyseridejä (Leslie ym. 2015). Kalaöljyistä DHA:n on kuitenkin havaittu myös suurentavan seerumin LDL-kolesterolia (Wei ja Jacobson 2011, Bernstein ym. 2012). Alfalinoleenihapon vaikutuksia lipidimetaboliaan on puolestaan tutkittu melko vähän. Käytännössä ihminen ei kuitenkaan syö yksittäisiä ravintoaineita, vaan ruokavalio on kokonaisuus ruoka-aineita. Ruoka-aineiden lisääminen ruokavalioon muuttaa ruokavaliota syrjäyttämällä sieltä jotakin muuta. Ruoka-aineet myös muodostavat kokonaisuuden, jossa voi tunnettujen ravintoaineiden lisäksi olla jotakin muuta, joka vaikuttaa ravintoaineiden toimintaan elimistössä. Siksi ravitsemustieteellinen tutkimus on enenevässä määrin kiinnostunut ruokavalion kokonaisuudesta ja kokonaisten ruoka-aineiden vaikutuksista metaboliaan. Metabolomiikkatutkimusta on edistänyt myös tutkimusmenetelmien kehittyminen, NMR-menetelmällä pystytään tutkimaan suuri määrä metaboliitteja helposti yhdestä seeruminäytteestä. Tämä tutkimussuuntaus on myös tässä pro gradu -työssä, jossa tutkitaan rasvaisen kalan, vähärasvaisen kalan ja alfalinoleenihapon vaikutuksia lipidimetaboliaan. Tavoitteena on tutkia eroavatko n-3-rasvahappojen vaikutukset lipidimetaboliaan riippuen siitä, saadaanko ne EPA:na ja DHA:na kalasta vai ALA:na kasviöljyistä. Lisäksi tutkitaan onko vähärasvaisella kalalla itsenäistä vaikutusta lipidimetaboliaan.

8 2 KIRJALLISUUS 2.1. N-3-rasvahapot 2.1.1 Rasvahappojen luokittelu Ruokavaliossa rasvat ovat pääasiassa triglyseridejä (myös pieniä määriä fosfolipidejä, monoja diglyseridejä sekä steroleja ja steroliestereitä) ja niitä saadaan sekä eläin- että kasvikunnan lähteistä (FAO 2010). Triglyseridit muodostuvat glyseroliosasta sekä kolmesta rasvahaposta, jotka toimivat elimistössä energianlähteenä sekä metaboliassa ja rakenneosina. Rasvahappoja kutsutaan tyydyttyneiksi (saturated fatty acid, SFA), jos niissä ei ole kaksoissidoksia (FAO 2010). Kertatyydyttymättömissä rasvahapoissa (monounsaturated fatty acid, MUFA) on yksi kaksoissidos ja monityydyttymättömissä rasvahapoissa (polyunsaturated fatty acid, PUFA) useampi kaksoissidos. Kaikissa näissä rasvahapoissa on parillinen määrä hiiliatomeja. Luonnossa rasvahapot ovat yleensä cis-muodossa, mikä tarkoittaa, että kaksoissidoksen vetyatomit ovat samalla puolella. Trans-muodossa kaksoissidoksen vetyatomit ovat eri puolilla. Rasvahappoja voidaan jakaa luokkiin myös sen mukaan kuinka monta hiiliatomia niissä on. Tyydyttyneet rasvahapot, joissa on 3-7 hiiliatomia, ovat lyhyitä (short chain, SC-) ja 8-13 hiiliatomia sisältävät rasvahapot ovat keskipitkiä (medium chain, MC-). Tyydyttyneitä rasvahappoja kutsutaan pitkäketjuisiksi (long-chain, LC-) jos niissä on 14 20 hiiliatomia ja erittäin pitkäketjuisiksi (very-long-chain, VLC-) kun niissä on kaksikymmentä tai useampi hiiliatomi. Monityydyttymättömiä rasvahappoja kutsutaan pitkäketjuisiksi kun niissä on 20 24 hiiliatomia ja erittäin pitkäketjuisiksi kun hiiliatomeja on vähintään 25 (FAO 2010). 2.1.2 N-3-rasvahapot ja niiden konversio Monityydyttymättömien rasvahappojen n- -merkintä kertoo kaksoissidoksen paikan laskettuna rasvahapon metyylipäästä (FAO 2010). Monityydyttymättömistä rasvahapoista tärkeimmät ryhmät ovat n-3- ja n-6-rasvahapot. Alfalinoleenihappo (ALA, 18:3n-3) ja linolihappo (LA 18:2n-6) ovat välttämättömiä rasvahappoja, sillä ne ovat pidempiketjuisten n- 3- ja n-6-rasvahappojen esiasteita, eikä ALA:a ja LA:ta pystytä valmistamaan elimistössä. Pitkäketjuisia n-3-rasvahappoja (LC-n-3-PUFA) ovat eikosapentaeenihappo (EPA, 20:5n-3) ja dokosaheksaeenihappo (DHA, 22:6 n-3) sekä dokosapentaeenihappo (DPA 22:5 n-3). Konversio ALA:sta ja LA:sta edelleen pidempiketjuisiksi rasvahapoiksi tapahtuu solulimakalvostolla (Burdge ja Calder 2005). Konversio on esitetty kuvassa 1. Erityisesti ensimmäinen, delta-6-desaturaasin katalysoima reaktio on konversiota rajoittava reaktio (Burdge ja Calder 2005). ALA:lla on suurempi affiniteetti delta-6-desaturaasiin, mutta LA:ta on enemmän tarjolla, joten yleensä muodostuu enemmän pitkiä n-6-rasvahappoja (FAO 2010).

9 ALA ja LA kilpailevat myös muista konversioon osallistuvista entsyymeistä (Burdge ja Calder 2005). Kuva 1. N-6- ja n-3-rasvahappojen konversio (Muokattu: Arterburn ym. 2006). LA=linoleenihappo; GLA=gammalinoleenihappo; DGLA=dihomo-gammalinoleenihappo; ARA=arakidonihappo; ALA=alfalinoleenihappo; EPA=eikosapentaeenihappo; DPA=dokosapentaeenihappo; DHA=dokosaheksaeenihappo Desaturaatiossa ALA:sta syntyy stearidonihappoa (SDA, 18:4n-3). Tämän jälkeen elongaasi pidentää ketjua ja delta-5-desaturaasi lisää ketjuun kaksoissidoksen, jolloin SDA:sta syntyy EPA. EPA:sta muodostuu elongaatioreaktiossa edelleen DPA. DPA:sta syntyy elongaation ja delta-6-desaturaation kautta 24:6n3, joka siirtyy solulimakalvostolta peroksisomiin. Peroksisomissa rasvahappo lyhenee beetaoksidaatiossa ja syntyy DHA (FAO 2010). Peroksisomeissa tapahtuu myös vähäisessä määrin retrokonversiota, jossa DHA:sta tehdään EPA:a (Brossard ym. 1996). DHA-lisä ei kuitenkaan juuri lisää muiden n-3-rasvahappojen määrää elimistössä, koska retrokonversio on melko tehotonta. Burdge (2004) toteaakin artikkelissaan, että retrokonversio on mahdollista, mutta DHA:n saannin vähäisyyden takia

10 (noin 0,1g/vrk) epätodennäköistä. DHA-lisällä on kuitenkin havaittu annosvaste EPA:n pitoisuuteen plasmassa (Burdge 2004). Myös ALA:n konversio edelleen EPA:ksi ja etenkin DHA:ksi on heikkoa, ALA:sta DHA:ksi on havaittu konvergoituvan alle 1 % (Brenna ym. 2009). 2.1.3 Konversioon vaikuttavia tekijöitä Konversion tehokkuuteen vaikuttavat useat eri tekijät. Miehillä suurempi osa ALA:sta päätyy beetaoksidaatioon, kun taas naisilla konversio on tehokkaampaa, todennäköisesti estrogeenin vaikutuksesta (Burdge 2004). Koska ALA ja LA käyttävät metaboliassaan samoja entsyymejä, voivat runsaasti LA:ta sisältävät ruokavaliot estää ALA:n metaboloitumista edelleen EPA:ksi ja DHA:ksi (Arterburn ym. 2006). Ruokavalion suurta LA:ALA -suhdetta pidetäänkin yhtenä konversiota heikentävänä tekijänä (Brenna ym. 2009). ALA:n on kuitenkin havaittu tehokkaammin estävän LA:n metaboliaa, LA:ta tarvitaan kymmenen kertaa enemmän estämään ALA:n metaboliaa (Barceló-Coblijn ja Murphy 2009). Toisaalta LA:n saanti onkin yleensä suurempaa, jopa 5-20-kertaista ALA:n saantiin verrattuna (Calder 2012). Goyens ja muut (2006) totesivat kuitenkin tutkimuksessaan, ettei LA:ALA -suhteella olisi vaikutusta konversioon, vaan ennemminkin LA:n ja ALA:n absoluuttisilla määrillä. Tämä osoitettiin tutkimalla konversiota kahdella eri ruokavaliolla, joissa LA:ALA -suhde oli sama, mutta absoluuttiset määrät vaihtuivat. Johtopäätöksenä kuitenkin oli, että konversion kannalta parasta olisi lisätä n-3-rasvahappojen ja vähentää n-6-rasvahappojen saantia (Goyens ym. 2006). Myös fysiologisella tilalla ja n-3-rasvahappojen tarpeella uskotaan olevan vaikutusta konversion tehokkuuteen (Burdge ja Calder 2005). Raskauden aikana suurempi estrogeenimäärä elimistössä voisi tehostaa konversiota (Burdge 2004). Samoin esimerkiksi DHA:n puute voi parantaa konversion tehokkuutta (Plourde ja Cunnane 2007). Myös muut tekijät, kuten ikä, stressi, krooniset sairaudet ja infektiot voivat vaikuttaa konversiossa toimivan delta-6-desaturaasientsyymin toimintaan (Lane ym. 2014). Konversioon vaikuttavat myös siinä toimivia entsyymejä koodaavien geenien polymorfiat, esimerkiksi SNP:t (single nuclear polymorphism) FADS1- ja FADS2-geeneissä vaikuttavat delta-5- ja delta-6-desaturaasien toimintaan (Gillingham ym. 2013). 2.2 N-3-rasvahapot ruokavaliossa 2.2.1 N-3-rasvahappojen suositukset, saanti ja lähteet suomalaisilla Valtion ravitsemusneuvottelukunnan vuonna 2014 julkaisemissa Suomalaisissa ravitsemussuosituksissa suositellaan tyydyttymättömän rasvan käytön lisäämistä (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). Kokonaisrasvan osuudeksi aikuisille ja yli 2-vuotiaille lapsille suositellaan 25 40 E %. Suositukset ja suomalaisten rasvahappojen saanti on esitetty

11 taulukossa 1. Pehmeää rasvaa eli tyydyttymättömiä rasvahappoja tulisi olla vähintään 2/3 rasvasta. Tyydyttymättömästä rasvasta MUFA:a (kertatyydyttymättömiä rasvahappoja) suositellaan 10 20 E % ja PUFA:a (monityydyttymättömiä rasvahappoja) 5-10 E %. N-3- rasvahappoja tulisi olla PUFA:sta vähintään 1 E %. Välttämättömiä rasvahappoja (LA ja ALA) suositellaan vähintään 3 E %, josta ALA:a tulisi olla 0,5 E % (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). ALA:a on erityisesti kasviöljyissä, kuten pellavaöljyssä, rypsiöljyssä ja soijaöljyssä sekä siemenissä (erityisesti pellavan ja chian siemenissä) ja saksanpähkinöissä (Rajaram 2014). EPA:a, DPA:ta ja DHA:ta on erityisesti rasvaisessa kalassa, kuten lohessa, makrillissa, silakassa (FAO 2010). Ruoka-ainetasolla suomalaisissa ravitsemussuosituksissa (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014) suositellaan monityydyttymättömien rasvahappojen saannin varmistamiseksi kasviöljyjä ja kalaa. Suositeltavaa on kasviöljyjen ja kasviöljypohjaisten levitteiden (vähintään 60 % rasvaa) käyttö ruoanvalmistuksessa ja levitteenä sekä kasviöljyjen tai kasviöljypohjaisten salaatinkastikkeiden käyttö salaatissa. Kalaa suositellaan syömään 2-3 kertaa viikossa (kypsä annos on noin 100-150g eli 200-450g kalaa viikossa). Ravitsemussuosituksissa suositellaan myös syömään pähkinöitä, siemeniä ja manteleita 30g eli noin kaksi ruokalusikallista päivittäin. Taulukko 1. Kokonaisrasvan ja rasvahappojen saanti ja suositukset osuuksina kokonaisenergiasta (Muokattu Helldán ym. 2013) Miehet Naiset Suositus 25-64v. 65-74v. 25-64v. 65-74v. Kokonaisrasva, E % 36,1 34,6 35,5 33,5 25-40 SFA, E% 13,9 13,0 13,7 12,7 5-10 MUFA, E%* 13,0 12,4 12,6 11,6 10-15 PUFA, E%* 6,2 6,2 6,3 6,2 5-10 n-3-rasvahapot, E% 1,4 1,5 1,5 1,5 1 n-6-rasvahapot, E % 4,5 4,4 4,6 4,5 Alfalinoleenihappo, E % 1,2 1,2 1,2 1,2 vähintään 0,5 Linolihappo, E % 4,4 4,3 4,5 4,4 Trans-rasvahapot, E % 0,4 0,4 0,4 0,4 Mahdollisimman vähän *MUFA:n ja PUFA:n yhteismäärä vähintään 2/3 kokonaisrasvasta Finravinto 2012-tutkimuksen mukaan 25 64-vuotiaat suomalaiset saavat ruokavaliostaan rasvaa suositusten mukaisesti, noin 36 E % (Helldán ym. 2013). Tyydyttynyttä rasvaa suomalaiset saavat liikaa suositukseen nähden. MUFA:a ja PUFA:a saadaan suosituksiin nähden riittävästi, mutta etenkin PUFA:n saanti on suosituksen alarajoilla ja tyydyttymättömien

12 rasvahappojen osuus kokonaisrasvasta on huomattavasti suositeltua pienempi. Suomalaiset saavat suurimman osan välttämättömistä rasvahapoistaan margariineista (Helldán ym. 2013). Myös n-3-rasvahapoista valtaosa saadaan levitteinä ja ruoanvalmistuksessa käytetystä rasvasta ja kalasta. Naiset saavat n-3-rasvahappoja myös palkokasvit ja pähkinät -ryhmästä ja miehet liharuoista. Pitkäketjuisten n-3-rasvahappojen lähteenä on kala. 2.2.2 Kasviöljyt n-3-rasvahappojen lähteenä ja vaikutus n-3-rasvahappopitoisuuksiin elimistössä LC-n-3-rasvahappoja, EPA:a ja DHA:ta, voidaan saada vain merenelävistä, sillä levät ovat DHA:n ja EPA:n primaarituottajia ja kalat syövät leviä, jolloin niihin päätyy paljon DHA:ta ja EPA:aa (Arterburn ym. 2006, Kim ym. 2014). Kala onkin suurin EPA:n ja DHA:n lähde (FAO 2010, Helldán ym. 2013). Kalaa ei kuitenkaan ole joka puolella saatavissa ja liikakalastuksen myötä kalakannat ovat vaarassa, etenkin jos kalan syöntiä pyritään lisäämään suosituksia vastaavalle tasolle (Kim ym. 2014, Domenichiello ym. 2015). Kalan syöntiin liittyy myös rajoituksia niiden sisältämien dioksiinien, metyylielohopean, PCB-yhdisteiden (polyklooratut bifenyyliyhdisteet) ja POP-yhdisteiden (persistent organic pollutants) takia (Kim ym. 2014). Siksi on pyritty löytämään uusia, ympäristöystävällisiä ja helpommin saatavilla olevia vaihtoehtoja LC-n-3-rasvahappojen lähteiksi. N-3-rasvahapoista ALA on kasviperäinen (Kim ym. 2014). Sitä on erityisesti pellavansiemenöljyssä (flaxseed oil, 53 %), camelinaöljyssä (camelina oil, 38 %) sekä saksanpähkinäöljyssä (walnut oil, 10 %), mutta näiden käyttö on vähäistä (Kim ym. 2014). Rypsiöljyn (rapeseed oil/canola oil, englanninkielisiä termejä käytetään myös rapsiöljystä, joka vastaa koostumukseltaan rypsiöljyä) käyttö on yleistä, koska se on halpaa ja se on myös soijaja palmuöljyn jälkeen viljellyin öljykasvi (Kim ym. 2014, Hoffman ja Gerber 2014). Lajike, kasvupaikka ja ilmasto ja vuodenaika vaikuttavat rypsin ja rypsiöljyn ALA-pitoisuuteen ja se vaihtelee 8-12% välillä (Kris-Etherton ym. 2000, Lin ym. 2013, Gladine ym. 2013, Kim ym. 2014, Rajaram 2014). Myös soijaöljyssä on kohtalaisesti ALA:a (7 %), mutta eniten käytetyissä maissi-, auringonkukka- ja oliiviöljyissä ALA:a on vain noin 1 % (Kim ym. 2014). Myös SDA:ta on tutkittu entistä enemmän EPA:n ja DHA:n lähteenä. Sitä muodostuu konversiossa ALA:sta, mutta sitä saadaan myös ruokavaliosta (Walker ym. 2013). Se ohittaa konversion ensimmäisen delta-6-desaturaasin katalysoiman reaktion ja sitä on siksi pidetty mahdollisesti parempana lähteenä EPA:lle ja DHA:lle kuin ALA:aa (Walker ym. 2013). SDA:ta on kalassa, mutta myös esimerkiksi hamppuöljyssä, echium-kasvin siemenissä sekä mustaherukkaöljyssä (Plourde ja Cunnane 2007, Walker ym. 2013).

13 Kasviöljyjen ja ALA:n vaikutusta plasman ja punasolujen EPA- ja DHA- pitoisuuksiin on tutkittu paljon, vaikka kuten aiemmin jo todettiin, ALA:n konversio elimistössä pidemmiksi n- 3-rasvahapoiksi ei ole kovin tehokasta (Brenna ym. 2009). Meta-analyysissä ALA:n havaittiin vaikuttavan vain vähän plasman ALA ja EPA pitoisuuksiin, eikä se vaikuttanut lainkaan DHApitoisuuksiin (Arterburn ym. 2006). Camelinaöljyn on havaittu olevan tehokkaampi suurentamaan plasman ALA-pitoisuutta kuin rypsi- ja oliiviöljyn (30 g/vrk annoksella) (Karvonen ym. 2002). Camelinaöljyssä onkin enemmän ALA:a ja tutkimuksessa eri öljyjen rasvahappopitoisuudet heijastuivat myös plasman rasvahappopitoisuuksissa. Camelinaöljy suurensi myös EPA- ja DPA-pitoisuuksia plasmassa verrattuna rypsi- ja oliiviöljyyn, muttei vaikuttanut DHA-pitoisuuteen. Arterburn ja kumppanit (2006) päätyivät kuitenkin katsauksessaan siihen, että ruokavalion ALA ei riittävästi korvaa EPA:aa ja DHA:ta, vaan parasta olisi lisätä sitä rasvahappoa, jota tarvitaan. He kuitenkin toteavat, että ALA:n vaikutus LC-n-3-PUFA pitoisuuksiin plasmassa voi olla parempi, jos elimistössä on n-3-rasvahappojen puutetta ja ruokavaliossa vähän n-6-rasvahappoja (Arterburn ym. 2006). Samaan päätyi Burdge (2004) katsauksessaan: tutkimusten mukaan ALA nostaa EPA:a ja DPA:ta, muttei riittävästi DHA:ta, joten LC-n3-PUFA:a tarvitaan myös ruokavaliosta. Barceló-Coblijn ja Murphy (2009) huomauttavat kuitenkin, että ALA:n poistaminen ruokavaliosta aiheuttaa DHA:n ja EPA:n puutetta, joten ruokavalion ALA on tärkeä lähde myös kudosten riittäville LC-n-3-rasvahappopitoisuuksille. Heidän mukaansa ALA:n konversion tehokkuus on kudoksesta riippuvaista ja kudoksesta riippuen syntyisi myös DHA:ta. Tämä konversio olisi myös riittävää täyttämään DHA:n tarpeen, mikäli ALA:aa saadaan yli 1200 mg vuorokaudessa (Barceló-Coblijn ja Murphy 2009). Ainakin aivojen DHA-tarpeeseen konversion uskotaan riittävän (Domenichiello ym. 2015). On myös näyttöä eläimillä siitä, että ALA:lla voi olla myös DHA:ta muistuttavia vaikutuksia, jolloin vain osa ALA:n vaikutuksista välittyy DHA:ksi konvergoitumisen kautta (Barceló-Coblijn ja Murphy 2009). Lisäksi on mahdollista, että ALA:n pieni vaikutus DHA:han ei näy niin nopeasti tai pienillä annoksilla kuin vaikutus EPA:aan, koska DHA-varannot plasmassa ovat paljon suuremmat (Brenna ym. 2009). Kasviöljyillä tehdyt tutkimukset antavat samansuuntaisia tuloksia. Vuonna 2014 julkaistu systemaattinen katsaus (Lane ym. 2014) selvitti kasviperäisten lähteiden hyödyllisyyttä LC-n- 3-rasvahappojen lähteenä. He löysivät kymmenen tutkimusta, joissa oli käytetty echium-öljyä (Echium plantagineum, piankieli-kasvin siemenistä), pellavansiemenöljyä, saksanpähkinäöljyä tai leväöljyä. Useimmissa tutkimuksissa kasviöljyt suurensivat ALA-pitoisuutta ja hieman EPA-pitoisuutta, mutta eivät vaikuttaneet DHA:han. Sen sijaan leväöljyt, jotka sisältävät

14 DHA:ta, suurensivat DHA-pitoisuutta plasmassa ja punasolujen solukalvoilla (Lane ym. 2014). Kuitenkin vaihdettaessa LA-pitoisia öljyjä enemmän ALA:aa ja vähemmän LA:ta sisältäviin öljyihin, on saatu näkyviin myös DHA-pitoisuuden suurentumista (Brenna ym. 2009). Myöskään vegaaneilla ei ole havaittu DHA:n puutetta, vaikka he eivät saakaan DHA:ta ruokavaliostaan (Plourde ja Cunnane 2007). 2.3 Kala Kaloja luokitellaan rasvaisuutensa perusteella vähärasvaisiin ja rasvaisempiin (Nordic Council of Ministers 2014). Vähärasvaisia ovat kalat, joissa rasvaa on alle 2 %, kuten turska seiti, kolja, punakampela ja hauki. Keskirasvaisia (2-8 %) ovat esimerkiksi talvimakrilli, ruijanpallas, monnikalat ja tonnikala. Rasvaisia kaloja (yli 8 % rasvaa) ovat silli, kesämakrilli, taimen, lohi ja ankerias (Nordic Council of Ministers 2014). Rasvaiset kalat varastoivat rasvan lihaan ja vähärasvaisemmat kalalajit varastoivat rasvaa maksaan (Calder 2012). Kala ja äyriäiset sisältävät myös 20 35 % proteiinia ja rasvainen kala ja jotkin vähärasvaisemmatkin kalalajit (kuten kuha) sisältävät myös D-vitamiinia (Nordic Council of Ministers 2014). Kalan rasvahappopitoisuuksia käsitellään kohdassa 2.4.4 ja muita ominaisuuksia kohdassa 2.4.5. 2.3.1 Suositukset kalan käytölle Kalan käyttöä, erityisesti rasvaisen kalan, suositellaan suomalaisissa ravitsemussuosituksissa tyydyttymättömien ja pitkäketjuisten n-3-rasvahappojen saannin turvaamiseksi (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). Ravitsemussuosituksissa kehotetaan myös suosimaan luonnonkaloja ja välttämään uhanalaisten kalojen käyttöä, sillä ne ovat suositeltavia kestävän kehityksen näkökulmasta. Elintarviketurvallisuusvirasto Evira on kuitenkin asettanut myös rajoituksia kalan käytölle niiden sisältämien dioksiinien, PCB-yhdisteiden ja raskasmetallien takia (Evira 2015). Jos sisävesikaloja syö päivittäin, on syytä rajoittaa isojen petokalojen (hauki, ahven, kuha, made) syöntiä. Lasten, nuorten ja hedelmällisessä iässä olevien suositellaan syövän yli 17 cm kokoista silakkaa, Itämeren lohta tai taimenta vain 1-2 kertaa kuukaudessa, samoin haukea vain yhdestä kahteen kertaa kuukaudessa. Raskaana oleville ja imettäville haukea ei suositella lainkaan. 2.3.2 Suomalaisten kalan käyttö Suomalaisista työikäisistä neljä kymmenestä syö kalaa, samoin 65-74-vuotiaista naisista, mutta ikääntyvistä miehistä puolet syö kalaa (Helldán ym. 2013). Kalaruoat ovat suomalaisille yksi tärkeimmistä D-vitamiinin lähteistä. Finravinto 2012 -tutkimuksen mukaan (Helldán ym. 2013) suomalaiset työikäiset miehet syövät kalaa ja äyriäisiä noin 240 g viikossa ja 65 74 -vuotiaat miehet 300 g viikossa. Työikäiset naiset syövät vastaavasti noin 190 g/vko ja 65 74 -vuotiaat

15 naiset 225 g/vko. Suositukseen (200 450 g/vko) verrattuna suomalaiset näyttäisivät työikäisiä naisia lukuun ottamatta syövän riittävästi kalaa (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). Kalan käyttö on kuitenkin jakautunutta ja osa suomalaisista syö suositukseen nähden riittämättömästi (Helldán ym. 2013). 2.3.3 Kalan käytön ongelmat Kalan käyttöön vaikuttavat monet tekijät (Oken ym. 2012). Kalan syömiseen liittyy positiivisten ravitsemuksellisten tekijöiden lisäksi muitakin näkökulmia, kuten ekologiset ja ekonomiset tekijät, kalan sisältämät raskasmetallit, POP- yhdisteet ja kalan tai sitä korvaavien muiden ruoka-aineiden saatavuus. Joidenkin kalalajien kantojen on jo todettu pienentyneen ja edelleen uusien kalakantojen odotetaan pienenevän ihmisen toimien seurauksena, ilmaston ja elinympäristöjen muutoksen sekä ylikalastuksen takia. Lisäksi kalan syöntiin vaikuttavat myös makumieltymykset ja kulttuuriperinteet. Tavallisen kuluttajan voi olla vaikea muodostaa mielipidettä siitä mitä kalaa pitäisi syödä, sillä ohjeet ympäristömyrkkyjen välttämiseksi, ekologisten ja terveyttä edistävien valintojen tekemiseksi ovat usein osittain vastakkaisia (Oken ym. 2012). Raskasmetalleista metyylielohopeaa on erityisesti vanhoissa petokaloissa ja merinisäkkäissä, sillä se kertyy ravintoketjussa (Oken ym. 2012). Metyylielohopealla on haitallisia vaikutuksia hermostoon ja verisuonistoon ja sikiön altistuminen sille haittaa lapsen kognitiivistä ja neuromuskulaarista kehitystä (Mozaffarian ja Rimm 2006, Oken ym. 2012). Kroonisen matalan altistuksen vaikutuksista ei ole varmuutta (Mozaffarian ja Rimm 2006). Metyylielohopean on havaittu myös lisäävän sydän- ja verisuonitautien riskiä, mutta se ei poista kalan positiivista vaikutusta kokonaisuutena (Mozaffarian ja Rimm 2006). PCB:t eli polyklooratut bifenyylit ja dioksiinit ovat aiemmin teollisuudessa käytettyjä ympäristömyrkkyjä, joita edelleen löytyy kaloista (Mozaffarian ja Rimm 2006). PCB:tä ja dioksiineja on kuitenkin lähes yhtä paljon myös muissa ruoka-aineissa, kuten lihassa ja kananmunissa (Mozaffarian ja Rimm 2006). Suomessa Evira on kuitenkin asettanut rajoituksia Itämeren silakan ja taimenen syömiselle suurten PCB- ja dioksiinipitoisuuksien vuoksi sekä päivittäin sisävesien kaloja syöville raskasmetallien takia (Evira 2015). Mozaffarianin ja Rimmin (2006) mukaan aikuisilla, jotka syövät kalaa yhdestä kahteen kertaan viikossa hyödyt voittavat haitat. Myös raskaana olevat hyötyvät kalan syönnistä, kun kiinnitetään huomiota kalalajien käyttöön eli vältetään runsaasti metyylielohopeaa sisältäviä kaloja.

16 2.3.4 Kala n-3-rasvahappojen lähteenä ja vaikutus n-3-rasvahappopitoisuuksiin elimistössä Kala on paras pitkäketjuisten n-3-rasvahappojen lähde (Calder 2012). Muihin eläinproteiinilähteisiin verrattuna kalassa on paljon pitkäketjuisia tyydyttymättömiä rasvahappoja, jopa 40 % lipideistä ja lisäksi kalassa on vain vähän kolesterolia (Raatz ym. 2013b). Kalojen rasvapitoisuus ja eri rasvahappojen suhteelliset osuudet vaihtelevat kalalajeittain, mutta myös kasvupaikkojen ja vuoden aikojen mukaan (Calder 2012). Vähärasvaisesta kalasta saa 0,2 0,3 g LC-n-3-PUFA:a, kun taas rasvaisesta kala-annoksesta saa jopa 1,5 3,5 g LC-3-PUFA:a (Calder 2012). Erityisesti makrilli, lohi, silli, sardiini ja kuore ovat hyviä EPA:n ja DHA:n lähteitä (FAO 2010). Joidenkin kalojen rasva- ja EPA- ja DHA - pitoisuuksia on esitetty taulukossa 2. Taulukko 2. Kalojen rasvapitoisuuksia ja EPA- ja DHA-pitoisuuksia (USDA 2014) Kalalaji Kokonaisrasva g/100g EPA g/100g DHA g/100g Atlantin lohi, kasvatettu 13,42 0,862 1,104 Atlantin lohi 6,34 0,321 1,115 Atlantin silakka 9,04 0,709 0,862 Atlantin makrilli 13,89 0,898 1,401 Amerikan kuore 2,42 0,275 0,418 Kirjolohi 3,46 0,167 0,420 Kirjolohi, kasvatettu 6,18 0,217 0,516 Atlantin turska 0,67 0,064 0,120 Tyynenmeren turska 0,41 0,034 0,096 Ruijanpallas ja tyynen meren pallas 1,33 0,066 0,128 Grönlannin pallas eli sinipallas 13,84 0,526 0,393 Kolja 0,45 0,042 0,089 Tonnikala 4,90 0,283 0,890 Tonnikala vedessä 0,96 0,028 0,196 Tyynenmeren sardiini tomaattikastikkeessa 10,45 0,523 0,864 Kalan käytön vaikutusta plasman EPA:n ja DHA:n pitoisuuksiin on tutkittu paljon. Bonaa ja muut (1992) havaitsivat, että säännöllinen kalan käyttö, jopa vain kerran viikossa, näkyi plasman PUFA-pitoisuuksissa. Selvimmin kalan syönti näkyi EPA-pitoisuudessa, DHA:han se vaikutti vähemmän. Myös Vazquez kollegoineen (2014) havaitsivat satunnaistetussa vaihtovuorokokeessa kalajakson nostavan seerumin EPA- ja DHA-pitoisuuksia. Tutkittavilla (n=257) oli metabolinen oireyhtymä ja he söivät kalajaksolla seitsemänä päivänä viikossa 100 g kummeliturskaa kahdeksan viikon ajan ja noudattivat muuten omaa ruokavaliotaan. Kontrollijaksolla ruokavalio oli muuten sama, mutta mereneläviä ei saanut käyttää lainkaan.

17 Kalan syönnin on havaittu vaikuttavan annosvasteisesti EPA:n ja n-3-rasvahappojen pitoisuuksiin satunnaistetussa vaihtovuorotutkimuksessa (n=19), jossa tutkittavat söivät viljeltyä atlantin lohta 90, 180 tai 270 g kaksi kertaa viikossa neljän viikon ajan (Raatz ym. 2013a). Myös DHA suureni tutkimuksessa kaikilla annoksilla, mutta ei suurentunut isommilla annoksilla enempää kuin pienimmällä eli vaikutti siis saturoituvan jo pienimmällä annoksella. 2.3.5 Muut kalan ominaisuudet Tutkimuksissa nähtävät kalan käytön positiiviset vaikutukset eivät johdu välttämättä pelkästään LC-n-3-rasvahapoista, sillä kala sisältää myös monia muita terveydelle edullisia ravintoaineita kuten seleeniä, D-vitamiinia ja jodia (Lund 2013). Kalan käyttö voi myös olla yhteydessä ylipäänsä terveellisempiin elämäntapoihin (He ym. 2004). Kalaa käyttävien on havaittu olevan harvemmin ylipainoisia, tupakoivan vähemmän ja liikkuvan enemmän kuin niiden, jotka eivät syö kalaa. Useimmat tutkimukset toki pyrkivät ottamaan nämä sekoittavat tekijät huomioon. Proteiini Kalaproteiinia pidetään yleisesti laadultaan hyvänä ja jopa parempana kuin esimerkiksi naudan proteiinia (tutkimuksissa mitattu proteiinien hyötysuhteella, biologiselta laadulla tai aminohappokoostumuksella) (He 2009). Kalan käyttö myös syrjäyttää ruokavaliosta aina muita ruoka-aineita, usein tyydyttynyttä rasvaa sisältäviä proteiininlähteitä kuten punaista lihaa (Oken ym. 2012, Raatz ym. 2013b, Nordic Council of Ministers 2014). Yksittäisistä aminohapoista kalassa on tauriinia, jota on käytetty tutkimuksissa kalan syönnin biomarkkerina (He 2009). Tauriinin määrä virtsassa korreloi kalan syönnin kanssa ja ainakin joillakin populaatioilla se toimii hyvänä kalan syönnin biomarkkerina (Lund 2013). Tauriinilla on esitetty olevan positiivisia vaikutuksia sydän- ja verisuonitautien riskiin (He 2009). Kalassa on lisäksi arginiinia ja glutamaattia, jotka vaikuttavat positiivisesti verisuonten toimintaan (He 2009). Eläinkokeissa kalaproteiinilla onkin havaittu kolesterolia laskeva vaikutus (Chen ym. 2014). Mekanismiksi on esitetty sappihappojen ja kolesterolin suurentunut erittyminen ulosteisiin ja lisäksi mahdollisesti vähentynyt sapen reabsorptio (Chen ym. 2014). Kalaproteiinin hajoamistuotteet edistäisivät kolesterolin poistumista vähentämällä kolesterolin liukoisuutta miselleihin ja lisäämällä sen kiinnittymistä sappihappoihin. Vitamiinit ja kivennäisaineet Kala sisältää LC-n-3-PUFA:n ja hyvänlaatuisen proteiinin lisäksi erilaisia vitamiineja ja kivennäisaineita (He 2009, Lund 2013, Nordic Council of Ministers 2014).

18 Kalassa seleeniä on paljon ja se on bioaktiivisessa muodossa selenometioniinina ja selenokysteiininä (Lund 2013). Käytettävyydessä on kuitenkin eroja riippuen kalalajista, mutta ainakin silakasta ja kirjolohesta voi saada seleeniä (Nordic Council of Ministers 2014). Seleeni osallistuu immuunipuolustuksen toimintaan, aktiivisen kilpirauhashormonin tuotantoon ja sen puute on yhdistetty myös oksidatiiviseen stressiin ja inflammaatioon (Rayman 2000). Sydänja verisuonitautien osalta tutkimukset seleenitason vaikutuksista ovat epäyhtenäisiä. Kalaa on tärkeä D-vitamiinin lähde (Lund 2013). D-vitamiinipitoisuus vaihtelee kaloissa kolmesta kahteenkymmeneen mikrogrammaan sadassa grammassa (Lund 2013). D-vitamiini ja sen puute on liitetty erityisesti havainnointitutkimuksissa muun muassa sydän- ja verisuonisairauksiin sekä infektioihin ja autoimmuunisairauksiin (Theodoratou ym. 2014). Erityisesti merikala on myös hyvä jodin lähde (Nordic Council of Ministers 2014). Jodia tarvitaan kilpirauhasen trijodityroniinin ja tyroksiinin tuotantoon. Jodia, kuten B12-vitamiinia, aminohappoja ja koliinia saadaan myös muista ruoka-ainesta, mutta ne voivat silti osaltaan olla vaikuttamassa kalan syönnin terveyttä edistäviin vaikutuksiin (Lund 2013). Muusta ruokavaliosta ja kalan syöntimäärästä riippuen kalasta voi saada myös A-vitamiinia, rautaa ja sinkkiä merkittäviä määriä (Lund 2013). Kalan sisältämät ainesosat eivät välttämättä yksinään vaikuta esimerkiksi sydän- ja verisuonitautien riskiin, vaan yksittäisten ravintoaineiden vaikutukset voivat olla synergistisiä (Lund 2013). Esimerkiksi seleeni, kalsium ja D-vitamiini voivat vaikuttaa yksin tai yhdessä LC-n-3-PUFA:n kanssa (He 2009). Tämä voi näkyä myös ristiriitaisina tuloksina yksittäisiä aineita tutkittaessa (Lund 2013). Kokonaisen kalan syöminen voi siksi olla parempi terveydelle kuin kalaöljyjen käyttäminen, sillä kalaöljyillä näitä synergistisiä vaikutuksia ei saa (He 2009). 2.4 Lipidimetabolia 2.4.1 Lipidien imeytyminen elimistöön Ravinnossa rasvat ovat pääasiassa triglyserideinä sekä pieni osa fosfolipideinä ja kolesteroliestereinä (Iqbal ja Hussain 2009). Ravinnon rasvojen imeytyminen on esitetty kuvassa 2. Triglyseridit ovat rasvaliukoisia, joten ne eivät imeydy sellaisinaan enterosyytteihin, vaan lipaasit hajottavat ne ennen imeytymistä rasvahapoiksi ja monoglyserideiksi (Ratnayake ja Galli 2009). Mahan lipaasi pilkkoo vain noin 15 20 % triglyseridien rasvahapoista ja pilkkoo enimmäkseen lyhyitä ja keskipitkiä rasvahappoja triglyseridien kolmannesta hiilestä (Ratnayake ja Galli 2009, Goodman 2010). Kielen lipaasi toimii mahalaukussa yhdessä mahan lipaasin kanssa (Iqbal ja Hussain 2009). Lyhyet ja keskipitkät rasvahapot imeytyvät mahalaukun ja suolen seinämän läpi suoraan verenkiertoon ja kulkevat porttilaskimon kautta maksaan albumiiniin sitoutuneena (Ratnayake ja Galli 2009, Goodman 2010).

19 Kuva 2. Ravinnon rasvojen imeytyminen (Muokattu Wang ym. 2014). NPC1L1=Niemann-Pick C1-like1-kolesterolin soluunottaja; KOL=kolesteroli, KOL- E=kolesteroliesteri; HMGCR=3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-KoA reduktaasi; ACAT2=Asyyli-CoAkolesteroli-asyylitransferaasi; MTTP= mikrosomaalinen triglyseridien siirtäjäproteiini; ABCG5/G8= ATP:tä sitova kasettikuljettaja G5 ja G8, poistavat kolesterolia enterosyytistä lumeniin; FABPpm/c=rasvahappoja sitova proteiini solukalvolla (pm) tai solun sisällä (c); CD36=rasvahappotranslokaasi; KoA=Koentsyymi-A; DG=diglyseridi; TG=triglyseridi; PL=fosfolipidi; αgp= α-glyserofosfaatti; FATP4= rasvahappojen siirtäjäproteiini Pureskelun ja mahalaukun peristalttisten liikkeiden ansiosta rasvapisarat pienenevät ja sekoittuvat veden ja fosfolipidien kanssa emulsioksi (Ratnayake ja Galli 2009, Iqbal ja Hussain 2009, Goodman 2010). Emulsion muodostumisen ansiosta rasvapisaroiden pinta-ala kasvaa ja mahdollistaa lipaasin paremman toiminnan (Ratnayake ja Galli 2009). Rasvan kulkeutuminen mahalaukusta ohutsuoleen stimuloi sappi- ja haimanesteen erittymistä (Goodman 2010). Sappihapot estävät emulsiopisaroiden kasaantumista isommiksi pisaroiksi ja haimalipaasi jatkaa triglyseridien pilkkomista yhdessä kolipaasin kanssa (Goodman 2010). Ravinnon fosfolipidejä pilkkoo fosfolipaasi A2 synnyttäen lysofosfolipidejä ja vapaita rasvahappoja (Ratnayake ja Galli 2009, Goodman 2010). Ravinnon kolesteroli esiintyy enimmäkseen vapaana, mutta myös kolesteroliestereinä, jotka kolesteroliesteraasi pilkkoo kolesteroliksi ja vapaiksi rasvahapoiksi (Iqbal ja Hussain 2009).

20 Sappihapot muodostavat lipidien hajoamistuotteina syntyvien monoglyseridien, rasvahappojen, fosfolipidien ja kolesterolin kanssa seosmisellejä, joissa hydrofobiset osat ovat sisällä ja hydrofiiliset osat pinnalla (Ratnayake ja Galli 2009). Misellit pääsevät kulkeutumaan mikrovillusten väliin ja helpottavat siten hajoamistuotteiden diffuusiota enterosyytteihin (Ratnayake ja Galli 2009). Rasvahapot kulkevat enterosyytteihin yksinkertaisella diffuusiolla, mutta myös proteiineihin sitoutuneena (Goodman 2010). Rasvojen kulkeutumista enterosyyttiin on esitetty kuvassa 2. Kolesterolin soluun otosta vastaa luultavasti Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1)-kuljettajaproteiini ja ABC (ATP Binding Cassette)-proteiinit puolestaan erittävät kolesterolia takaisin suolistoon (Iqbal ja Hussain 2009). Yhdessä ne säätelevät kolesterolin imeytymistä (Iqbal ja Hussain 2009). Enterosyytissä rasvahapot ja monoglyseridit kuljetetaan sileälle solulimakalvostolle, jossa asyylitransferaasit muodostavat koentsyymia:n aktivoimista rasvahapoista ja monoglyserideistä uudelleen triglyseridejä (Iqbal ja Hussain 2009). Triglyseridejä voidaan tehdä myös glysero-3-fosfaatista karkealla solulimakalvostolla, mutta tätä tapahtuu vähemmän (monoglyseridireitin kautta syntyy 75 85% triglyserideistä) (Ratnayake ja Galli 2009). Enterosyyteissä myös kolesterolia esteröidään jälleen kolesteroliestereiksi ja lysofosfolipideistä muodostetaan fosfatidyylikoliinia (Ratnayake ja Galli 2009). Triglyseridit, kolesteroliesterit ja fosfolipidit pakataan kylomikroneihin (Ratnayake ja Galli 2009). Solulimakalvostolta MTTP (microsomal triglyseride transport protein) kuljettaa triglyseridin rasvapisaraan, joka yhdistyy proteiinipartikkelin kanssa muodostaen prekylomikronin (Mansbach ja Gorelick 2007). Sitä edelleen muokataan Golgin laitteessa, jonka jälkeen kylomikroni eritetään basolateraalisella membraanilla (Mansbach ja Gorelick 2007). 2.4.2 Lipidien kuljetus elimistössä Elimistössä lipidit kulkeutuvat lipoproteiinipartikkeleissa (German ym. 2006). Lipoproteiinit koostuvat triglyserideistä, kolesterolista, fosfolipideistä ja muista rasvaliukoisista yhdisteistä ja apolipoproteiineista. Lipoproteiineja valmistetaan soluissa, mutta niiden osat (apolipoproteiinit ja lipidit) siirtyvät myös verenkierossa lipoproteiineilta toisille ja siksi selkeitä luokkia on vaikea muodostaa. Lipoproteiinit ikään kuin liukuvat ryhmästä toiseen (German ym. 2006). Lipoproteiineja on kuitenkin luokiteltu niiden tiheyden, koon ja niiden sisältämien apolipoproteiinien mukaan (German ym. 2006). Uudella NMR (nuclear magnetic resonance) - menetelmällä lipoproteiinipartikkeleita voidaan tutkia tarkemmin (Soininen ym. 2015). Lipoproteiinipartikkeleista saadaan menetelmällä 14 alaluokkaa ja lisäksi saadaan tietoa niiden sisältämistä kolesterolin, triglyseridien ja fosfolipidien määristä (Soininen ym. 2015).

21 Kuvassa 3 on esitetty lipoproteiinimetabolian endogeeninen ja eksogeeninen reitti sekä käänteinen kolesterolin kuljetus. Eksogeeniseen metaboliareittiin kuuluu lipidien kuljetus suolistosta kudoksille ja maksaan. Endogeeninen metaboliareitti käsittää maksan kolesterolin kuljetuksen kudoksille ja ylimääräisen kolesterolin takaisin kuljetuksen. Kuva 3. Lipoproteiinien endogeeninen ja eksogeeninen reitti sekä käänteinen kolesterolin kuljetus. (Muokattu Kwan ym. 2007). ABCA1 = ATP:tä sitova kasettikuljettaja 1 (ATP binding cassette transporter 1). KOL- E=kolesteroliesteri; CETP (cholesteryl ester transfer protein)=kolesterolin kuljettajaproteiini; HTGL (hepatic triglyceride lipase)=maksan triglyseridilipaasi; IDL=intermediate-density lipoprotein; LCAT=lesitiini-kolesteroli-asyylitransferaasi; LDL-R= LDL-reseptori; Lp(a)=lipoproteiini(a); LPL=lipoproteiinilipaasi; LRP (LDL-R related protein) = LDL-reseptorin kaltainen proteiini; SR B1=scavenger receptor B1; TG= triglyseridi. Alkuperäinen kuva: Josh Gramling Gramling Medical Illustration. Kylomikronit Kylomikroneita muodostuu vain suoliston enterosyyteissä, joista ne eritetään imusuonistoon ja ne kuljettavat ravinnon lipidejä kudoksille (Iqbal ja Hussain 2009, Goodman 2010). Kylomikronit muodostuvat triglyserideistä, kolesterolista ja fosfolipideistä sekä rasvaliukoisista vitamiineista. Pääasiallinen apolipoproteiini kylomikroneissa on ApoB48 (Iqbal ja Hussain 2009). Muita apolipoproteiineja ovat apoai, apoaii ja apoaiv (Ratnayake ja Galli 2009). Verenkierrossa ja imunesteessä kylomikroneihin kertyy myös apoci, apocii ja III

22 sekä apoe (Ramasamy 2014). Kudoksissa apocii aktivoi endoteelien lipoproteiinilipaasia (Ramasamy 2014). Lipoproteiinilipaasi hydrolysoi kylomikronin triglyseridejä ja hajoamistuotteet siirtyvät soluihin, jossa ne käytetään energiaksi tai varastoidaan (Ratnayake ja Galli 2009). Hydrolyysin seurauksena myös apolipoproteiineja CII ja CIII, fosfolipidejä sekä kolesterolia siirtyy HDL-partikkeleihin, jolloin jäljelle jää kolesteroliestereitä ja syntyy kylomikronijäännepartikkeli (Ratnayake ja Galli 2009). Kylomikronijäänteiden poistuminen verenkierrosta tapahtuu noin 12 24 tunnin kuluessa ruokailusta, luultavasti useampien reseptoreiden avulla, mahdollisesti LDL- tai LRP (LDL-receptor related protein) -reseptorien kautta (Ratnayake ja Galli 2009, Ramasamy 2014). VLDL VLDL (very low density lipoprotein) on myös paljon triglyseridejä sisältävä lipoproteiinipartikkeli, mutta se kuljettaa endogeenisiä, maksan tuottamia triglyseridejä perifeerisille kudoksille (German ym. 2006, Ratnayake ja Galli 2009). VLDL valmistetaan maksassa solulimakalvoston muodostamien apob -partikkeleiden yhtyessä lipidipartikkeleihin (German ym. 2006). Triglyseridien lisäksi se sisältää kolesterolia ja fosfolipidejä sekä muita rasvaliukoisia molekyylejä ja koostumus vaihtelee hieman elimistön metabolisesta tilasta riippuen (German ym. 2006, Ratnayake ja Galli 2009). VLDL:n pinnalla on pysyvästi apob- 100, mutta muita apolipoproteiineja ja myös lipidejä vaihdellaan verenkierrossa (German ym. 2006). Kapillaareissa VLDL-partikkeli luovuttaa triglyseridejä soluille lipoproteiinilipaasin hydrolysoidessa rasvahappoja ja samalla siihen siirtyy HDL:stä apolipoproteiini E (Ramasamy 2014). Triglyseridien vähentyessä VLDL:ään jää kolesteroliestereitä ja fosfolipidejä ja se muuttuu IDL:ksi (intermediate density lipoprotein) (Ramasamy 2014). LDL LDL-partikkeleja (low density lipoprotein) muodostuu VLDL:n jäänteestä IDL:stä, kun maksan lipaasi poistaa triglyseridejä ja jäljelle jää kolesteroliestereitä ja apob-100:a sisältävä partikkeli (German ym. 2006). LDL:n painosta lähes puolet on kolesterolia ja sen tehtävänä onkin kolesteroliestereiden kuljetus sitä tarvitseviin kudoksiin (German ym. 2006, Ratnayake ja Galli 2009, Hirayama ja Miida 2012). Kolesterolia tarvitaan muun muassa kasvuun, hormonien tuotantoon ja sappihappojen metaboliaan (German ym. 2006, Ratnayake ja Galli 2009). LDL-partikkelit otetaan soluihin LDL-reseptorien välityksellä, mutta rakenteeltaan muuntuneet (esimerkiksi hapettuneet) LDL-partikkelit eivät poistu verenkierrosta LDLreseptoreiden kautta vaan syöjäsoluihin (German ym. 2006). LDL-partikkeleita voidaan jakaa useisiin alaluokkiin riippuen koosta, tiheydestä ja koostumuksesta, mutta luokittelut eivät välttämättä ole yhteneviä eri tutkimuksissa (Hirayama

23 ja Miida 2012). Yleisesti käytetään jakoa isoihin, vähemmän tiheisiin (large buoyant, lb) ja pieniin, tiheisiin (small dense, sd) partikkeleihin. LDL:n alaluokista LDL III ja LDL IV lasketaan pieniin tiheisiin sdldl-partikkeleihin. LDL:n aterogeenisuus riippuu LDL:n alaluokista, pieniä tiheitä partikkeleita pidetään aterogeenisempina kuin suuria partikkeleita (Hirayama ja Miida 2012). NMR:llä LDL-partikkelit voidaan jakaa kolmeen luokkaan, joissa partikkelien keskimääräiset halkaisijat ovat noin 25,5; 23 ja 18,7 nm (Soininen ym. 2015). HDL HDL-partikkelit (high density lipoprotein) ovat hyvin heterogeeninen ryhmä lipoproteiinipartikkeleita, jotka eroavat toisistaan niin apolipoproteiinien, lipidien kuin entsyymienkin osalta. Myös niitä luokitellaan eri HDL-alaluokkiin, joilla on mahdollisesti myös erilaisia vaikutuksia elimistössä (Pirillo ym. 2013, Ramasamy 2014). HDL2 on iso, kun taas HDL3 on pieni ja tiivis partikkeli (Pirillo ym. 2013). Nämä voidaan jakaa vielä viiteen eri alaluokkaan 2 a ja b sekä 3 a, b ja c. HDL-partikkelien luokittelua voidaan tehdä myös elektroforeesin tai apolipoproteiinien perusteella (Pirillo ym. 2013). Elektroforeettisella liikkuvuudella mitattuna saadaan pre-β-partikkeleita, α-partikkeleita ja pre-α-partikkeleita (Pirillo ym. 2013). HDL-partikkeleissa on paljon erilaisia apolipoproteiineja, mutta osa niistä esiintyy vain tietyissä HDL-partikkeleissa mikä edelleen vahvistaa käsitystä siitä, että HDLpartikkeleilla voisi olla erilaisia tehtäviä (Ramasamy 2014). HDL-partikkelien tehtävänä on kolesterolin takaisin kuljetus eli kolesterolin kuljetus kudoksista maksaan (Ramasamy 2014). Se on tärkeä tekijä kolesterolin homeostaasin säätelyssä. Myös kolesterolin takaisin kuljetus on esitetty kuvassa 3. ApoAI on HDL:n pääasiallinen apolipoproteiini ja sen tehtävänä on aktivoida LCAT-entsyymiä ja edistää kolesterolin siirtymistä soluista HDL-partikkeliin ja siten kypsän HDL:n muodostamista (Ramasamy 2014). 2.4.3 Lipidimetabolia ja sydän- ja verisuonisairaudet Lipoproteiinimetabolian häiriintyminen eli dyslipidemia on keskeistä ateroskleroosin kehittymiselle. Ateroskleroosi puolestaan on usein taustalla sydän- ja verisuonisairauksissa (mm. sepelvaltimotauti, aivoinfarkti ja sydäninfarkti), jotka ovat suomalaisten yleisin kuolinsyy (Aro 2012, Suomen virallinen tilasto 2012). Dyslipidemialla tarkoitetaan lipidien normaalista poikkeavia konsentraatioita ja se on ateroskleroottisten valtimosairauksien riskitekijä (Dyslipidemiat. Käypä hoito -suositus. 2013). Dyslipidemiassa seerumin HDLkolesterolipitoisuus on pienentynyt (<1), triglyseridipitoisuus suurentunut (>1,7), LDL-kolesterolipitoisuus suurentunut (>3) tai voi esiintyä näiden erilaisia

24 yhdistelmiä. Vaikeaan hypertriglyseridemiaan liittyy myös haimatulehdus. Lisäksi alentunut HDL-kolesterolipitoisuus ja hypertriglyseridemia liittyvät myös metaboliseen oireyhtymään (MBO) (Dyslipidemiat. Käypä hoito -suositus. 2013). Aterogeneesi käynnistyy verisuonten seinämien endoteelisolujen alkaessa tuottaa adheesiomolekyylejä houkutellakseen valkosoluja jouduttuaan ärsytetyksi esimerkiksi korkean verenpaineen, dyslipidemian tai tulehdusta edistävien tekijöiden seurauksena (Libby ym. 2011). Houkutellut monosyytit kypsyvät makrofageiksi ja pyrkivät poistamaan kolesterolia fagosytoimalla oksidaatiossa muuntuneet LDL-partikkelit (Daniels ym. 2009, Libby ym. 2011, Dallmeier ja Koenig 2014). Niihin kertyy kolesterolia ja ne muuttuvat samalla vaahtosoluiksi (Daniels ym. 2009, Dallmeier ja Koenig 2014). Normaalisti makrofagit pystyvät poistamaan kolesterolia edelleen HDL-partikkeleille ABC-transporttereiden kautta, jolloin HDL kuljettaa kolesterolin takaisin maksaan (Libby ym. 2011). Aterooman muodostuessa takaisinkuljetus ei kuitenkaan ole riittävän tehokasta estämään kolesterolin kertymistä intimaan. Paikalle kertyy tilanteen edetessä myös sileälihassoluja ja kollageenia, jotka muodostavat sidekudosteisen ateroomaplakin katon. Vaahtosolut ja kuolleista soluista vapautuneet lipidit muodostavat plakin lipidiytimen. Plakit voivat ahtauttaa verisuonia ja heikentää verenkiertoa ja revetessään synnyttää trombin, joka voi aiheuttaa esimerkiksi sydäninfarktin päätyessään pieniin sepelvaltimoihin (Libby ym. 2011). Kuva 4. Aterooman muodostuminen (Muokattu Libby ym. 2004). SLS=sileät lihassolut. Aterogeeniseen dyslipidemiaan liittyy geneettisiä tekijöitä, mutta usein taustalla on vyötärölihavuutta ja insuliiniresistenssiä (Daniels ym. 2009, Chan ym. 2014). Vyötärölihavuus

25 ja sisäelinten ympärille kertyvä rasva lisää vapaiden rasvahappojen määrää ja kulkeutumista maksaan, mikä puolestaan lisää maksan triglyseridien ja kolesterolin tuotantoa ja triglyseridipitoisten VLDL-partikkelien eritystä. Rasvoittuminen heikentää maksan toimintaa ja seurauksena on myös insuliiniresistenssi, jolloin insuliini ei pysty estämään maksan glukoneogeneesiä tai de novo lipogeneesiä. Täten maksasta erittyy enemmän triglyseridejä sisältäviä VLDL-partikkeleita. Insuliiniresistenssissä myös maksan lipaasi on yliaktiivinen ja saa aikaan LDL-partikkelien muuntumisen sdldl-partikkeleiksi. VLDL:n ja kylomikronien tuotannon lisääntyessä ja niiden hajoamisen vähentyessä plasman triglyseridipitoisten lipoproteiinien ja niiden jäänteiden määrä kasvaa. Tämä lisää CETP:n (cholesterol esterase transfer protein) katalysoimaa lipoproteiinien osien vaihtelua neutraalien lipidien ja LDL:n kanssa ja muuttaa LDL- ja HDL-partikkeleita pienempään ja tiheämpään suuntaan. Normaali ja aterogeeninen lipidiprofiili on esitetty kuvassa 5. Insuliiniresistenssi vaikuttaa myös luustolihaksissa ja rasvakudoksessa heikentäen lipoproteiinilipaasin aktiivisuutta, mikä vähentää triglyseridipitoisten lipoproteiinien hajoamista. Myös LDL-reseptorin toiminta heikkenee, jolloin LDL- ja apob100-partikkelit eivät poistu normaalisti maksaan (Chan ym. 2014). Kuva 5. Normaali ja aterogeeninen lipidiprofiili (Muokattu: Chan ym. 2014). VLDL=very low density lipoprotein; LDL=low density lipoprotein; HDL=high density lipoprotein; apob=apolipoprotein B; apoai=apolipoprotein A-I

26 Dyslipidemiassa verenkierrossa on siis enemmän LDL-partikkeleita, ja erityisesti pieniä sdldl-partikkeleita (Chan ym. 2014). sdldl -partikkelien aterogeenisuus johtuu muun muassa suuremmasta oksidaatioalttiudesta ja heikosta kiinnittymisestä LDL-reseptoriin, jolloin ne ovat alttiita hapettumiselle ja poistuvat heikommin verenkierrosta (Chan ym. 2014). Paljon triglyseridejä sisältävät lipoproteiinipartikkeleiden jäänteet myös kulkeutuvat helposti verisuonten endoteelin alaisiin kerroksiin ja osallistuvat ateroskleroosin syntyprosessiin makrofagien fagosytoidessa ne (Chan ym. 2014). sdldl pääsee helpommin verisuonten endoteelin alaisiin kerroksiin verrattuna isompiin LDL-partikkeleihin (Nikolic ym. 2013). HDL-partikkelien vähäisyys on myös itsenäinen sydän- ja verisuonitautien riskitekijä (Chan ym. 2014). HDL-partikkelien suojaava vaikutus perustunee lähinnä käänteiseen kolesterolin kuljetukseen, mutta HDL-partikkeleilla on mahdollisesti vaikutuksia myös endoteelifunktioon, oksidatiiviseen stressiin ja inflammaatioon (Chan ym. 2014, Dallmeier ja Koenig 2014). Myös HDL-partikkeleista pienet ja tiheät HDL-partikkelit on yhdistetty sydän-ja verisuonitautien riskiin, sillä pieni tiheä HDL3 ja pre B1-HDL lisääntyvät dyslipidemioissa (Pirillo ym. 2013). HDL2-partikkelien on havaittu vähentyneen tyypin 2 diabeteksessa sekä lihavuuteen ja metaboliseen oireyhtymään liittyen (Pirillo ym. 2013). 2.4.4 Kalan syönnin vaikutus lipoproteiinipartikkeleihin Kalan syönnin vaikutusta lipidimetaboliaan, erityisesti lipoproteiinipartikkeleiden luokkiin on tutkittu vähän (Erkkilä ym. 2014). Kalan käytön vaikutuksia lipoproteiinipartikkeleiden kokoon käsitteleviä tutkimuksia on koottu taulukkoon 3. HDL-kolesteroliin ja HDL-partikkeleihin kalan käytöllä on useimmiten havaittu myönteisiä vaikutuksia. Sysdimet-tutkimuksessa terveellisen ruokavalion ryhmän sisällä kalan käytön lisääminen korreloi suurten HDL-partikkelien konsentraation kasvuun, HDL-partikkelien suurempaan halkaisijaan ja suurempaan lipidien määrään isoissa HDL-partikkeleissa (Lankinen ym. 2014). Myös tutkimuksessa, jossa tutkittiin kalan syöntiä yhdistettynä laihdutukseen, kalan syönti suurensi HDL2-kolesterolipitoisuutta ja vähensi HDL3-kolesterolia (painonpudotuksella ei ollut vaikutusta näihin), mutta kokonais-hdl-kolesteroliin kalan käytöllä ei ollut vaikutusta (Mori ym. 1999). Rasvaisen kalan käytön on myös raportoitu suurentavan HDL-partikkelien keskimääräistä kokoa ja lisäävän kolesterolipitoisuutta kaikissa HDL-partikkeleissa (Erkkilä ym. 2014). Lisäksi kalan käyttö oli yhteydessä kolesterolin, kolesteroliestereiden ja kokonaislipidien suurempaan pitoisuuteen erittäin suurissa HDL-partikkeleissa. Vähärasvaisen kalan käytön on havaittu lisäävän HDL2-kolesterolipitoisuutta (Lacaille ym. 2000, Beauchesne-Rondeau ym. 2003) ja jopa HDL-kolesterolia (Lindqvist ym. 2009). On kuitenkin raportoitu myös tutkimuksia, joissa HDL-alaluokkien konsentraatioissa ei ole

27 tapahtunut muutoksia (Gascon ym. 1996, Li ym. 2004). Myöskään Aadlandin ja kollegoiden (2015) tutkimuksessa HDL-partikkeleiden koko ja pitoisuus ei muuttunut ja Jacquesin ja kollegoiden (1992) tutkimuksessa HDL3-kolesterolin pitoisuus jopa suureni. Kalan käytön yhteys triglyserideihin on vaihdellut tutkimuksissa. Kalan käytön on raportoitu laskevan paastotriglyseridejä (Mori ym. 1999), paasto- ja postprandiaalisia triglyseridejä (Aadland ym. 2015) sekä laskevan postprandiaalisia, muttei paastotriglyseridejä (Li ym. 2004). Lankinen ja muut (2014) eivät havainneet kalan käytöllä yhteyttä triglyseridien konsentraatioon. Aadlandin ym. (2015) tutkimuksessa seerumin kokonaistriglyseridien väheneminen oli yhteydessä paastotriglyseridien pitoisuuden pienenemiseen VLDL- ja kylomikronipartikkeleissa ja pienempään VLDL:n partikkelikokoon paastossa sekä postprandiaalisessa tilassa keskikokoisten VLDL-partikkeleiden konsentraation pienenemiseen. Vähärasvaisen kalan käytöllä ei ole havaittu vaikutusta paasto- ja postprandiaalisen VLDL:n ja LDL:n tai kylomikronien määriin (Aadland ym. 2015). Myöskään rasvaisen kalan käytöllä ei havaittu vaikutuksia LDL- tai VLDL-partikkeleiden kokoon tai alaluokkien konsentraatioihin (Erkkilä ym. 2014). Li ym. (2004) eivät havainneet muutosta LDL- ja IDL-partikkeleiden alaluokissa, mutta havaitsivat kalan käytön vähentävän keskikokoisten ja pienten VLDLpartikkeleiden osuuksia. Kokonais- ja LDL-kolesteroliin kalan käytöllä ei ole juuri raportoitu vaikutuksia (Mori ym. 1999, Lankinen ym. 2014). Muutamissa tutkimuksissa on havaittu LDL-apoB:n määrän lisääntymistä (Jacques ym. 1992, Gascon ym. 1996, Lacaille ym. 2000), mutta Beauchesne- Rondeau kollegoineen (2003) ei havainnut eroa kokonais- ja LDL-apoB:n laskussa vähärasvaisella kalalla verrattuna liha- ja siipikarjaruokavalioihin. Aadland ym. (2015) eivät myöskään havainneet tutkimuksessaan vähärasvaisen kalan vaikuttavan apoai- ja apobpitoisuuksiin. Suuressa osassa tutkimuksia kalan käytön vaikutukset lipidimetaboliaan näyttäisivät siis olevan myönteisiä, kuten HDL-partikkelikoon suureneminen, HDL-kolesterolin lisääntyminen ja triglyseridien konsentraation pieneneminen. Aina näitä edullisia vaikutuksia ei kuitenkaan ole havaittu, mutta haitallisia vaikutuksia lipidimetaboliaan ei ole raportoitu kuin muutamassa yksittäisessä tutkimuksessa.

Taulukko 3. Tutkimuksia kalan käytön vaikutuksista lipoproteiineihin 28 Tutkimus N Interventio Kesto Tulokset Muuta Aadland ym. 2015 Beauchesne-Rondeau ym. 2003 Erkkilä ym. 2014 18-65-vuotiaita Satunnaistettu, terveitä norjalaisia vaihtovuoroasetelma (keski-ikä 50.6 ± 3.4 v.), tupakoimattomia n=20 (13 naista ja 7 miestä) kontrolloitu Verrattiin vähärasvaista kalaa sisältävää ruokavaliota (kalasta 60 % ruokavalion proteiinista) kontrolliruokavalioon, jossa ei lainkaan kalaa ja mereneläviä, tarkoituksena selvittää proteiinilähteiden vaikutusta paasto- ja postprandiaalisiin lipideihin. Tutkimusjaksot 4 vko, puhdistusjakso 5 vko. 13 vko Vähärasvainen kala -ruokavaliolla Seerumin paastotriglyseridit Seerumin postprandiaaliset triglyseridit Tämä oli yhteydessä paastotriglyseridien pitoisuuteen kylomikroneissa ja VLDL:ssä VLDL:n partikkelikoko paastossa pienempään keskikokoisten VLDL-partikkeleiden pitoisuuteen postprandiaalisesti kontrolliin verrattuna 21-73-vuotiaita Satunnaistettu vaihtovuoroasetelma 24 vko Vähärasvainen kala -ruokavaliolla miehiä, joilla hyperkolesterolemia Verrattiin vähärasvaisen kalan, HDL2 kolesteroli vähärasvaisen siipikarjan ja HDL3 kolesterolia n=18 vähärasvaisen naudanlihan vaikutuksia HDL2- ja HDL3-kolesterolin suhde lipoproteiiniprofiiliin AHAruokavaliolla (American Heart Associationin suosittelema ruokavalio, jossa suuri PUFA:n ja SFA:n suhde sekä paljon kuitua). Tutkimusjaksot 26 päivää ja puhdistusjaksot 6 vko. Sepelvaltimotautipotilaita, käyttivät statiineja ja β- salpaajia, 61,0±5,8v., keski-ikä n=33 (6 naista ja 27 miestä) Satunnaistettu, ruokavaliointerventio kontrolloitu Verrattiin rasvaisen kalan ja vähärasvaisen kalan käytön vaikutuksia lipoproteiinien alaluokkiin (Rasvainen kala n=11, vähärasvainen kala n=12, ja kontrolli n=10). Kalaruokavalioissa väh.4 kalaruokaa viikossa. Kontrollissa vähärasvaista nautaa, sikaa ja kanaa. 8 vko Rasvainen kala -ryhmässä N-3-rasvahappojen konsentraatiot Kolesterolin, kolesteroliesterien ja kokonaislipidien konsentraatio erittäin suurissa HDL-partikkeleissa HDL-partikkeleiden keskimääräinen koko Kolesterolin pitoisuus kaikissa HDL-partikkeleissa Vähärasvainen kala- ja kontrolliryhmässä kolesterolin, kolesteroliesterien ja lipidien määrä erittäin suurissa HDL-partikkeleissa Vähärasvaisen kalan vaikutukset lipoproteiineihin eivät eronneet merkitsevästi kontrollista. Paino muuttui intervention aikana -1.4 ± 0,2 ja -1.5 ± 0,2 kg, mutta ruokavalioilla ei vaikutusta. Ruokavaliot eivät vaikuttaneet: Paasto- ja postprandiaalinen VLDL Kylomikronien kokonaismäärä Suurten VLDL- ja kylomikronipartikkelien määrä Pienten VLDL-partikkeleiden määrä Paasto- ja postprandiaalisten LDL- ja HDL- partikkelien koko ja määrä ApoAI ja apob Ryhmien välillä ei eroa muutoksissa Kokonais-, LDL- ja VLDL- kolesterolissa Kokonais- ja VLDL-triglyserideissä Kokonais ja LDL ApoB HDL-ApoAI LDL-kolesteroli:apoB Kokonaiskolesteroli:HDL-kolesteroli VLDL- ja LDL-partikkeleiden koko ja alaluokkien konsentraatiot eivät eronneet eri ryhmissä (jatkuu)

Tutkimus N Interventio Kesto Tulokset Muuta Gascon ym. 1996 Jacques ym. 1995 Lacaille ym. 2000 Terveitä, Satunnaistettu, kontrolloitu, 12 vko Vähärasvainen kala verrattuna liharuokavalioon tupakoimattomia vaihtovuoroasetelma naisia, keski-ikä VLDL-triglyseridien konsentraatio 22,4±0,9 vuotta Verrattiin vähärasvaista lihaa sisältävän LDL-apoB määrä ruokavalion (nauta, sika, vasikka, LDL-triglyseridien konsentraatio n=14 kananmuna, maitotuotteet) ja HDL2 ja HDL3 kolesteroli eivät muuttuneet vähärasvaista kalaa sisältävän kummallakaan ruokavaliolla ruokavalion vaikutuksia plasman lipoproteiineihin. Tutkimusjaksot noin 4 vko (kuukautiskierron ajan) ja puhdistusjakso 4 vko. 53-79-vuotiaita Satunnaistettu vaihtovuoroasetelma 8 vko Vähärasvainen kala verrattuna liharuokavalioon (keski-ikä 62,5v), postmenopausaalisia naisia Verrattiin vähärasvaisen liharuokavalion (nauta, sika, kananmuna ja maito) ja Kolesterolin konsentraatio oli suurempi HDL-kolesteroli vähärasvaista kalaa sisältävän HDL3-kolesteroli n=15 ruokavalion vaikutuksia plasman LDL-apoB lipoproteiineihin SHBG (sex hormon binding globulin) 19-27-vuotiaita (keskiikä 22,6±0,7) terveitä, tupakoimattomia miehiä n=11 Lankinen ym. 2014 40-70 vuotiaita miehiä ja naisia, joilla glukoosimetabolian häiriö + 2 muuta MBO:n piirrettä n=106 Satunnaistettu vaihtovuoroasetelma Verrattiin vähärasvaista kalaa sisältävää ruokavaliota kalattomaan (sisälsi nautaa, sikaa, siipikarjaa, kananmunia ja maitoa) ruokavalioon tarkoituksena tutkia vähärasvaisen kalan vaikutusta plasman lipoproteiineihin. 4 viikon testijaksojen välissä 5 viikon puhdistusjakso. Satunnaistettu, kontrolloitu paralleeli ruokavaliointerventio Tutkittiin täysjyvän, kalan ja mustikoiden yhteisvaikutuksia lipidimetaboliaan. Interventio ryhmät olivat terveellinen ruokavalio (täysjyvä tuotteita, rasvaista kalaa 3 x vko, mustikkaa 3 annosta päivittäin, n= 37) ja täysjyväpitoinen ruokavalio (n=34) ja lisäksi kontrolliryhmä (jossa käytettiin puhdistettuja viljatuotteita, n=35) 29 13vko Vähärasvainen kala verrattuna kalattomaan ruokavalioon HDL2-kolesteroli pitoisuus HDL2:HDL3-kolesterolien suhde apob ja LDL-apoB pitoisuus apob:apoai SHBG VLDL-TG:n ja apob:n sekä VLDL-kolesterolin ja apob:n suhteet HDL-kolesteroli:apoAI-suhde 12 vko Terveellisen ruokavalion ryhmässä plasman rasvahapoissa PUFA ja erityisesti n-3- PUFA Terveellisen ruokavalion ryhmän sisällä kalan käytön lisääminen korreloi isojen HDL-partikkelien konsentraation suurenemiseen HDL-partikkelien suurempaan halkaisijaan suurempaan lipidien pitoisuuteen isoissa HDL partikkeleissa Kokonais-, LDL- ja HDL-kolesterolin, triglyseridien, apoai:n ja apob100:n konsentraatiot Vähärasvainen kala-ruokavaliolla syntyi tiheämpiä ja pienempiä LDL-partikkeleita (!). SHBG (sex hormone binding globulin) määrä ei eronnut eri ryhmissä, joten vaikutus lipoproteiinehin ei SHBG-kautta premenopausaalisilla naisilla. Vaikutus lipidimetaboliaan voisi olla sukupuolihormonien välittämää Suurempi PUFA:MUFA:SFA suhde testiruokavaliolla(1,1:1:1) verrattuna aiempaan ruokavalioihin (0,4:1:1) ja tämä mahdollisesti aiheuttanut plasman kolesterolin muutokset lihaa sisältäneellä ruokavaliolla. LPL ja HTGL ei eroja ruokavalioilla. Kalan syönti oli vain osa tutkimusta, muu ruokavalio oli kuitenkin huomioitu analyyseissä ja havainnot oli tehty kalan käytön mukaan ryhmissä. (jatkuu)

Tutkimus N Interventio Kesto Tulokset Muuta Li ym. 2004 Terveitä, yli 40- vuotiaita Lindqvist ym. 2009 Mori ym. 1999 n=22 (11 miestä ja 11 postmenopausaalista naista) 35-60-vuotiaita (keskiikä 48v.) ylipainoisia n=35 (miehiä) 40-70v. Ylipainoisia, joilla verenpainetauti n=63 (miehiä ja naisia) Satunnaistettu, kontrolloitu, paralleeli ruokavaliointerventio Tutkittiin kalan käytön vaikutusta plasman lipoproteiineihin. Aluksi tutkittavat noudattivat AADruokavaliota 6 viikkoa (average american diet keskimääräinen amerikkalainen ruokavalio), jonka noudattivat National Cholesterol Education Program Step2 (NCEP 2) ruokavaliota sisältäen joko paljon tai vähän kalaa 24 viikkoa. Vaihtovuoroasetelma Tutkittiin silli-ruokavalion (sillissä 5-7% rasvaa, 150g 5x vko) vaikutusta sydän- ja verisuonitautien riskitekijöihin. Kontrolliruokavalio sisälsi kanaa ja sikaa yhteensä 150g, 5 x vko. Ruokavaliojaksot 6 viikkoa ja puhdistusjakso 12 viikkoa. Satunnaistettu ruokavaliointerventio kontrolloitu Tutkittiin lisääkö kala painonpudotuksen vaikutuksia seerumin lipideihin, glukoosiin ja insuliiniin. Tutkimusryhmät olivat: kalaa päivittäin syövä ryhmä (n-3- rasvahapppoja 3,65g), laihdutusryhmä, kalaa päivittäin syövä laihdutusryhmä (n-3-rasvahapppoja 3,65g) ja kontrolli. 30 30 vko Paljon kalaa sisältänyt NCEP 2 Postprand. triglyseridit, muutos oli merkitsevästi suurempi kuin NCEP2b:ssä LpAI:AII fraktio Keskikokoisten ja pienten VLDL-partikkeleiden osuus IDL-, LDL- ja HDL -partikkeleiden alaluokat 18 vko Silliruokavaliolla HDL- ja HDL2-kolesterolin konsentraatio AA-, EPA- ja DHA- pitoisuudet veressä 16 vko Kala ruokavaliossa Kokonais-, LDL- ja HDL-kolesteroli HDL2-kolesteroli HDL3-kolesteroli Paastotriglyseridien konsentraatio Paastotriglyseridit myös laihdutusryhmässä ja suurin lasku tapahtui kalaa päivittäin syövässä laihdutusryhmässä. Vähän kalaa sisältänyt NCEP 2 LpAI fraktio IDL partikkelien pitoisuus Isojen HDL-partikkelien (4 ja 5) konsentraatio HDL-partikkelien keskimääräinen koko Ei vaikutusta verenhyytymiseen, verenpaineeseen ja inflammaatioon. Paino laski keskimäärin 5.6 ± 0.8 kg Kala laihdutusruokavaliossa saa aikaan positiivisia vaikutuksia myös glukoosi- ja insuliinimetaboliaan. VLDL=very low density protein; LDL=low density protein; IDL=intermediate density protein; HDL=high density protein; HDL 2=isoja, vähemmän tiheitä HDL-partikkeleita; HDL 3=pieniä ja tiheitä, aterogeenisempia HDL-partikkeleita; TG=triglyseridit; apoai= HDL- ja kylomikroni partikkeleissa esiintyvä apolipoproteiini; apob=vldl-,ldl- ja IDL-partikkeleissa (apob100) sekä kylomikroneissa (apob48) esiintyvä apolipoproteiinien ryhmä; AA=arakidonihappo; EPA=eikosapentaeenihappo; DHA=dokosaheksaeenihappo; SHBG=sukupuolihormoneja sitova globuliini; PUFA=monityydyttymättömät rasvahapot; MUFA=kertatyydyttymättömät rasvahapot; SFA=tyydyttyneet rasvahapot

31 2.4.5 Alfalinoleenihapon vaikutus lipoproteiinipartikkeleihin ALA:n vaikutuksia lipidimetaboliaan, erityisesti vaikutuksia lipoproteiinipartikkeleiden kokoon, on tutkittu vielä varsin vähän (Harper ym. 2006). Tutkimuksia ALA:n vaikutuksista lipoproteiinipartikkeleiden kokoon on esitetty taulukossa 4. Tutkimuksissa ALA:n lähteenä on käytetty pellavansiemenöljyä (Pang ym. 1998, Wilkinson ym. 2005, Harper ym. 2006, Kawakami ym. 2015) ja saksanpähkinöitä (Almario ym. 2001). Tutkimusten kesto vaihtelee kuudesta viikosta viiteen ja puoleen kuukauteen, mutta pisin tutkimus (Almario ym. 2001) ei ollut satunnaistettu eikä sokkoutettu. Tutkimusten otokset ovat myös varsin pieniä, tutkittavia on 18-57 tutkimuksesta riippuen. Tutkimuksissa ALA-lisällä oli pientä vaikutusta LDL-partikkeleiden kokoon. Kawakamin ja kollegoiden (2015) tutkimuksessa ALA:a syötiin 5,49 g vuorokaudessa kahdentoista viikon ajan. Lähtötilanteeseen verrattuna sdldl-pitoisuus oli pienempi sekä neljän että kahdentoista viikon kohdalla ja neljän viikon kohdalla ero maissiöljyjaksoon oli merkitsevä. sdldlpitoisuus pieneni merkitsevästi (sekä 4 että 12 viikon kohdalla) niillä, joilla seerumin triglyseridit olivat yli 100 mg/dl (= 1,129 ). Muutokset erosivat myös merkitsevästi kontrollina toimineen maissiöljyn vaikutuksista. Harperin ja muiden (2006) tutkimuksessa ALA ei vaikuttanut LDL-, HDL- ja IDL- partikkelien kokoon verrattuna oliiviöljyyn, mutta trendinä havaittiin kuitenkin suurempien LDL-partikkelien lisääntymistä. Myös Wilkinson tutkijaryhmineen (2005) havaitsi sdldl -partikkeleiden (LDL3-partikkeleiden) osuuden vähenemistä ja LDL1- ja LDL2-partikkeleiden lisääntymistä, mutta muutos tapahtui kaikissa interventioryhmissä ja oli pienin ALA-ryhmässä. Almarion ja kollegoiden (2001) tutkimuksessa ALA:n vaikutuksia tutkittiin sekä tavanomaisella, että vähärasvaisella ruokavaliolla. Saksanpähkinän lisääminen tavanomaiseen ruokavalioon lisäsi apoa-i:n määrää ja pienensi kolesterolipitoisuutta pienissä ja tiheissä sdldl-partikkeleissa. Kun vähärasvaiseen ruokavalioon lisättiin pähkinää, IDL-kolesterolin pitoisuus pieneni. Pangin ja kollegoiden (1998) tutkimus poikkeaa muista tässä esitetyistä tutkimuksista, sillä he tutkivat n-6-rasvahappojen korvaamista n-3-rasvahapoilla ruokavalioissa, joissa ALA:n ja LA:n suhde oli erilainen (ALA-ryhmässä ALA:a 1,01 g/vrk). He eivät havainneet minkäänlaisia muutoksia kokonais-, LDL-, HDL-, HDL2- ja HDL3- kolesterolipitoisuuksissa, LDL:HDL -suhteessa tai plasman triglyserideissä tutkimuksen aikana. Kolme viidestä tutkimuksesta (Almario ym. 2001, Wilkinson ym. 2005, Kawakami ym. 2015) havaitsivat myös HDL-kolesterolipitoisuuden pienenemistä ALA-supplementaatiolla. Almarion ja kumppaneiden tutkimuksessa (2001) havaittiin HDL-kolesterolin vähenemisen

32 tapahtuneen enimmäkseen suurissa HDL-partikkeleissa, mutta Wilkinsonin ja muiden (2005) tutkimuksessa HDL-kolesterolin lasku oli yhteydessä HDL3-partikkeleiden osuuden pienenemiseen. Kawakami kollegoineen (2015) eivät analysoineet HDL2- ja HDL3- partikkeleita lainkaan. Sen sijaan Pangin ja muiden (1998) tukimuksessa ei havaittu ALAsupplementaatiolla vaikutusta HDL-kolesteroliin eikä myöskään HDL2- ja HDL3-kolesteroli pitoisuuksin.

33 Taulukko 4. ALA:n vaikutuksia lipoproteiinipartikkelien alaluokkiin tutkineita tutkimuksia Tutkimus Tutkittavat (n) Interventio Kesto Tulokset Muuta Almario ym. 2001 Keski-iältään 60 ±8v vuotiaita, joilla FCH familiar combined hyperlipidemia, geneettinen hyperlipidemia n=18 (13 naista ja 5 miestä) Ei satunnaistettu eikä sokkoutettu. Vaihtovuoroasetelma, jossa tutkittiin saksanpähkinän vaikutusta plasman lipideihin ja lipoproteiinipartikkeleihin tavanomaisella ja vähärasvaisella ruokavaliolla. Ruokavalioiden järjestystä ei satunnaistettu, vaan ne toteutettiin tässä järjestyksessä: Tavanomainen ruokavalio 4vko Tavanomainen ruokavalio + saksanpähkinä (48g/vrk =3,3g ALA) 6vko Vähärasvainen ruokavalio (20% rasvaa) 6vko Vähärasvainen ruokavalio (20%)+ saksanpähkinä (48g/vrk =3,3g ALA) 6vko 5,5 kk Saksanpähkinöiden lisäys ruokavalioon Plasman lipidien ALA ja LA, EPA apob Saksanpähkinän lisäys tavanomaiseen ruokavalioon apoai kolesteroli sdldl-partikkeleissa HDL-kolesteroli verrattuna tavanomaiseen ruokavalioon ilman pähkinää, väheneminen tapahtui enimmäkseen suurissa HDL-partikkeleissa. Kokonais- ja LDL-kolesteroli Saksanpähkinän lisäys vähärasvaiseen ruokavalioon IDL-kolesteroli Kokonaiskolesteroli (verrattuna myös tavanomaiseen ruokavalioon ilman pähkinää) LDL-kolesteroli Triglyseridi-pitoisuudet ja VLDL-, HDL- ja LDLpartikkelien koko kaikilla ruokavalioilla Harper ym. 2006a Afroamerikkalaisia, joilla kroonisia sairauksia, kuten verenpainetauti, tyypin 2 diabetes, keski-ikä 51v. n=56 (49 naista ja 7 miestä) Satunnaistettu, kaksoissokkoutettu, rinnakkaisasetelmatutkimus Tutkittavat noudattivat ensin AHAruokavaliota (American Heart Association) 8 viikkoa, jonka jälkeen heidät satunnaistettiin pellavaöljy- (n=27, ALA:a 3g/vrk) ja kontrolli (oliiviöljy) -ryhmiin(n=22). 26 vko Pellavaöljyryhmässä kokonaiskolesteroli Pellavaöljy ei vaikuttanut LDL-, HDL- ja IDLpartikkelien kokoon verrattuna oliiviöljyyn. Trendinä havaittiin kuitenkin suurempien LDL-partikkelien lisääntymistä (LDL 1 p=0,058 ja LDL 2 p=0,083). HDL- ja LDL-kolesteroleissa sekä triglyserideissä ei tapahtunut muutosta kummassakaan ryhmässä eivätkä ryhmät eronneet toisistaan näiden suhteen. (jatkuu)

Tutkimus Tutkittavat (n) Interventio Kesto Tulokset Muuta Kawakami ym. 2015 Terveitä, keski-ikä 44,5 vuotta Pang ym. 1998 n=15 ( miehiä) Terveitä 18-35-vuotiaita n=29 (miehiä) Wilkinson ym. 2005 35-60-vuotiaita, joilla aterogeeninen lipidiprofiili n=57 ( miehiä) Satunnaistettu, kaksoissokkoutettu, vaihtovuorotutkimus Tutkittavat käyttivät päivittäin joko 10g pellavansiemenöljyä (5,49 g ALA:a) tai maissiöljyä (0,09g ALA:a) 12 viikon ajan. Asetelmien välinen puhdistusjakso oli 8 viikkoa. Satunnaistettu, sokkoutettu, rinnakkaisasetelmatutkimus Tutkittiin n-6-rasvahappojen korvaamista n-3-rasvahapoilla ruokavalioissa, joissa ALA:n ja LA:n suhde oli erilainen. ALA-ryhmä käytti pellavansiemenöljyä, ruokavaliossa oli ALA:a 1,01g/vrk ja ALA:LA-suhde oli 1:0,9 (n=15). LA-ryhmässä käytettiin safloriöljyä, ALA:LA-suhde oli 1:66 ja ALA:a 1,0g/vrk (n=14). Tutkittaville tarjottiin kaikki ruoka. Satunnaistettu, sokkoutettu, rinnakkaisasetelmatutkimus Tutkittavat satunnaistettiin korvaamaan 45 g ravinnon rasvoista (muun muassa korvaamalla levitteitä, ruoanvalmistusrasvoja) joko pellavansiemenöljyllä (53%ALA:a), auringonkukkaöljyllä tai auringonkukkaöljy+kalaöljy - yhdistelmällä. 34 32 vko Pellavansiemenöljyjakson jälkeen ALA ja EPA DHA Kokonais-, ei-hdl- ja LDL-kolesteroli HDL-kolesteroli CETP-. apoai- ja apob-pitoisuudet Niillä joilla triglyseridit olivat yli 100mg/l, sdldl pellavansiemenöljyjaksolla merkitsevästi (sekä 4 että 12 viikon kohdalla) verrattuna maissiöljyjaksoon (yleisesti ero merkitsevä vain 4 viikon kohdalla). 6 vko Kokonais- ja LDL-kolesteroli HDL-, HDL 2- ja HDL 3-kolesteroli LDL:HDL-suhde Plasman triglyseridit 12 vko Pellavansiemenöljyryhmässä ALA:n ja EPA:n suhteelliset osuudet punasolujen solukalvoilla Plasman HDL-kolesteroli, tämä oli yhteydessä HDL 3- partikkeleiden osuuden pienenemiseen sdldl (LDL 3)-partikkelien osuus kaikilla ruokavalioilla (p=0,024). Muutos oli pienin pellavansiemenöljyryhmässä. HDL 2 ja HDL 3 ei analysoitu. Maissiöljyjaksolla sdldl ei muuttunut merkitsevästi. Kokonaiskolesteroli kaikissa ryhmissä ALA=alfalinoleenihappo; LA=linolihappo;EPA=eikosapentaeenihappo; DHA=dokosaheksaeenihappo; VLDL=very low density lipoprotein; LDL=low density lipoprotein, vähemmän tiheät lipoproteiinit; IDL=intermediate density lipoprotein; HDL=high density lipoprotein; HDL 2=isoja, vähemmän tiheitä HDL-partikkeleita; HDL 3=pieniä ja tiheitä, aterogeenisempia HDL-partikkeleita; sdldl=tiheät, pienet LDL-partikkelit; apob=vldl-,ldl- ja IDL-partikkeleissa (apob100) sekä kylomikroneissa (apob48)

35 esiintyvä apolipoproteiinien ryhmä; ; apoai= HDL- ja kylomikroni partikkeleissa esiintyvä apolipoproteiini, CETP=cholesterylesther transfer protein, mahdollistaa kolesteroliesterien ja triglyseridien vaihdon lipoproteiinipartikkeleiden välillä.

2.5 NMR-spektroskopia 36 2.5.1 NMR-menetelmä NMR (nuclear magnetic resonance) eli ydinmagneettinen resonanssispektroskopia perustuu sähkömagneettiseen säteilyyn ja atomiydinten (protonien) magneettiseen ominaisuuteen (spin) (Bothwell ja Griffin 2011). Useimmilla atomiytimillä on magneettinen ominaisuus spin, joka voidaan sähkömagneettisella säteilyllä kiihdyttää toiselle, korkeamman energian tasolle. Ytimien palautuessa alkuperäiselle tasolleen, ne vapauttavat sähkömagneettista säteilyä, josta voidaan mitata säteilyn intensiteettiä, frekvenssiä, puoliintumisaikaa ja vaihetta. Tästä saadusta spektristä voidaan edelleen selvittää, mitä molekyylejä seoksessa on ja kuinka paljon (Bothwell ja Griffin 2011). NMR-menetelmällä voidaan analysoida useita erilaisia näytteitä, kuten virtsaa, plasmaa, hikeä, sylkeä ja seerumia (Brennan 2014). NMR-menetelmällä saatavaa spektriä voidaan käsitellä eri tavoin (Rankin ym. 2014). Spektriä voidaan verrata kokonaisuutena esimerkiksi altistetun ryhmän ja kontrolliryhmän välillä (metabolinen sormen jälki, metabolic fingerprinting). Tällöin yksittäisten metaboliittien tunnistaminen ei ole keskeistä. Kvantitatiivinen NMR (myös metabolinen profilointi, metabolic profiling) sen sijaan pyrkii myös tunnistamaan metaboliitit vertaamalla spektriä referenssikirjastoihin. Lisäksi mitataan metaboliittien absoluuttista määrää. Myös lipoproteiinien tunnistaminen on osa kvantitatiivista NMR-menetelmää, vaikka lipoproteiinit ovatkin paljon isompia kuin tavanomaiset metaboliitit. Soinisen ja kumppaneiden (2015) menetelmä yhdistää lipoproteiinien tunnistamisen ja tavallisen kvantitatiivisen NMR:n. Menetelmässä NMR-tulokset esitetään kolmessa eri ikkunassa, LMWM-ikkuna (Low molecular weight molecules) sisältää glykolyysiin ja inflammaatioon liittyviä metaboliitteja sekä aminohappoja ja ketoneja. LIPO-ikkunassa esitetään lipoproteiinipartikkeleita ja LIPID-ikkunassa erilaisten seerumin lipidien määrää ja laatua. Menetelmässä lipoproteiinipartikkelit myös luokitellaan neljääntoista eri luokkaan, määritetään niiden konsentraatiot sekä niiden sisältämien lipidien pitoisuuksia. Lisäksi tietoa saadaan apoa- ja apob-partikkeleista sekä erilaisista kolesteroli-, triglyseridi- ja rasvahappopitoisuuksista (Soininen ym. 2015). 2.5.2 NMR-spektroskopia ja metabolomiikka Metabolomiikalla tarkoitetaan tietyllä hetkellä vallitsevien metaboliittien eli pienten molekyylien tutkimista. Metabolomiikassa tutkitaan yksittäisten pitoisuuksien sijaan kokonaisuuksia, erilaisten metabolisten reittien muutoksia fysiologisissa tilanteissa (Brennan 2014). Metaboliitit heijastavat geenien ja proteiinien tuotoksia. Metaboliitteja voidaan tutkia kohdennetusti tai epäspesifisti (Rankin ym. 2014). Kohdennetussa tutkimuksessa valitaan

37 metaboliitit, joista tietoa halutaan ja valitaan mittaukset sen mukaisesti. Kohdentamattomassa tutkimuksessa sen sijaan tutkitaan epäspesifisti mahdollisimman paljon erilaisia metaboliitteja ja pyritään löytämään sieltä ne, jotka esimerkiksi erottavat kontrolliryhmän tutkimuksen interventioryhmästä (Rankin ym. 2014). Tämä metabolinen profiili on metodologiana parempi tutkittaessa patofysiologisia prosesseja (Soininen ym. 2015). Metabolomiikassa NMR-menetelmällä on useita etuja verrattuna perinteisesti käytettyyn massaspektrometriaan, vaikka sen sensitiivisyys onkin heikompi kuin massaspektrometrian (Rankin ym. 2014). Taulukossa 5 on esitelty menetelmien eroja. NMR:ssä yhdestä seeruminäytteestä saadaan mitattua suuri määrä erilaisia aineenvaihdunnan markkereita, mutta se vastaa silti kustannuksiltaan standardilipidimittauksia (Soininen ym. 2015). Se on siten paremmin soveltuva suurille aineistoille (Soininen ym. 2015). Taulukko 5. 1 H NMR-menetelmän ja massaspektrometrian eroja. (Muokattu Rankin ym. 2014) 1H NMR Näytteen määrä 200 400 µl 10 50 µl Massaspektrometria Näytteen valmistelu Yksinkertaista (puskurin lisääminen) Yksinkertaista, vaihtelee Automaatio Valmistelu ja analysointi mahdollista automaattisesti Valmistelu ja analysointi mahdollista automaattisesti Toistettavuus Erittäin hyvä (kun näytteen valmistelu tehty hyvin) Variaatiota sarjojen välillä ja sisällä täytyy korjata Määritys Absoluuttiset pitoisuudet Suhteelliset pitoisuudet Absoluuttisten pitoisuuksien mittaaminen monimutkaisempaa Tehokkuus Pari sataa näytettä/ päivä Esivalmisteluihin (kaasu- ja nestekromatografiaan) menee aikaa Analyysi Ei tuhoava Tuhoava Edistynyt lipoproteiinien profilointi Kulut Hyvä lipoproteiinien profilointiin Halvempi suureen näytteiden käsittelymäärän takia, mutta pääomakulut suuremmat (laite on kallis) Vaatii työläitä esivalmisteluja Keskinkertaiset, mutta kaupalliset voivat olla kalliita Tunnistaminen Yleisesti hyvä Vaatii erityisosaamista Datan säilyttäminen Helposti käsiteltävä datamäärä Suuri datamäärä vaatii paljon säilytystilaa Herkkyys (metaboliitista riippuvainen) Metabolomista havaittava osuus Heikompi herkkyys (mm) Havaitaan vähemmän metaboliitteja heikomman herkkyyden ja spektrin päällekkäisyyksien takia Parempi herkkyys (nm) Mahdollista havaita suuri määrä metaboliitteja Vaikka näytteiden käsittely on tehtävä huolella, yksi NMR-menetelmän eduista on, että se ei vaadi pitkiä valmisteluja (Brennan 2014). NMR-menetelmällä saadaan mitattua metaboliittien absoluuttisia määriä ja lipoproteiiniluokkien konsentraatioiden määrittely käy nopeasti, minkä

38 lisäksi saadaan tietoa lipoproteiinien sisältämien rasvayhdisteiden määristä (Rankin ym. 2014). NMR-menetelmässä myös toistettavuus on hyvä (Bothwell ja Griffin 2011, Rankin ym. 2014). 2.5.3 NMR-menetelmän hyödynnettävyys NMR-menetelmää ja metabolomiikkaa on jo hyödynnetty erilaisissa tutkimuksissa. Taulukossa 6 on esimerkkejä tutkimuksista, joissa NMR-menetelmää on hyödynnetty lähinnä lipidiprofiilin tutkimisessa. Ravitsemustutkimuksessa sitä on käytetty esimerkiksi interventiotutkimuksissa tutkittaessa interventioiden vaikutuksia metaboliareitteihin eli intervention aiheuttamia aineenvaihdunnallisia muutoksia (Brennan 2014). NMR:llä on etsitty myös biomarkkereita, jotka kuvaisivat tietyn ruoka-aineen käyttöä tai jopa kokonaista ruokavaliotyyppiä (Brennan 2014). Ruokavalioiden ja sairauksien yhteyksiä on tutkittu NMR:n avulla ja pyritty löytämään myös sairauksille uusia biomarkkereita (Brennan 2014). Tutkimukset käsittelevät usein metabolisia riskitekijöitä, sairauksien biomarkkereita ja riskinarviointia sekä metaboliittien ja geenien yhteyksiä (Soininen ym. 2015). Taulukko 6. Esimerkkejä tutkimuksista, joissa on hyödynnetty NMR-spektroskopiaa Tutkimusviite Jelenkovic ym. 2014 Stancakova ym. 2011 Tukiainen ym. 2012 Wang ym. 2012 Mäkinen ym. 2013 Hernandez-Alonso ym. 2015 Erkkilä ym. 2014 Lankinen ym. 2014 Kuvaus Tutkittiin seerumin MUFA:n, PUFA:n ja SFA:n yhteyttä lipideihin ja lipoproteiineihin ja etsittiin geneettisiä tekijöitä ja ympäristötekijöitä, jotka selittäisivät yhteyttä. Tutkittavana oli 269 kaksosta, joista 561 kaksosparia. Hyperglykemian ja tyypin 2 diabeteksen geneettisten riskitekijöiden yhteys lipoproteiinien alaluokkiin ja niiden koostumukseen (n=6580). Tutkimuksessa yhdistettiin genotyyppitestaus ja metabolomiikka, tutkimuksessa testattiin 95 lipidi locuksen yhteyttä 216 erilaiseen metaboliittiin (n=8330). Tutkittiin normaalin glukoosinsiedon ja eri asteisesti heikentyneen glukoosinsiedon omaavien sekä äskettäin tyypin 2 diabetekseen sairastuneiden miesten lipidiprofiileita (n=9399). Tutkittiin elimistön kolesterolin ja triglyseridien vaikutusta diabeettiseen munuaissairauteen tyypin 1 diabeetikoilla (n=3544). Tutkittiin pistaasipähkinöillä (57g/Vrk) täydennetyn ruokavalion vaikutusta lipidiprofiiliin satunnaistetussa vaihtovuoroasetelmassa. Tutkittavilla (n=54) oli diabeteksen esiaste. Tutkittiiin rasvaisen kalan ja vähärasvaisen kalan käytön vaikutuksia lipoproteiinien alaluokkiin satunnaistetussa, kontrolloidussa ruokavaliointerventiossa (n=33). Tutkittiin täysjyvän, kalan ja mustikoiden yhteisvaikutuksia lipidimetaboliaan satunnaistetussa, kontrolloidussa paralleelissa ruokavaliointerventiossa (n=106).

3 TAVOITTEET 39 Tämän pro gradu -työn tarkoituksena oli tutkia ravinnon n-3-rasvahappojen vaikutuksia lipidimetaboliaan. Onko eroa kalasta saatujen n-3-rasvahappojen (EPA ja DHA) ja kasviperäisen, camelinaöljystä saadun n-3-rasvahapon (ALA) vaikutuksissa seerumin rasvahappojen pitoisuuksiin tai lipoproteiinien kokoon ja niiden sisältämien lipidien pitoisuuksiin henkilöillä, joilla on glukoosiaineenvaihdunnan häiriö? Lisäksi tutkittiin, onko vähärasvaisen kalan syönnillä vaikutusta lipidimetaboliaan.

4 AINEISTO, MENETELMÄT JA TULOSTEN KÄSITTELY 4.1 Aineisto 40 Tämä pro gradu -tutkielma on osa Alfa-Kala-tutkimusta. Tutkimukseen rekrytoitiin sanomalehtien ja aiempien Kliinisen ravitsemustieteen yksikössä toteutettujen tutkimusten kautta valkoihoisia, 40 70-vuotiaita miehiä ja naisia, joilla paastoglukoosi oli koholla (5,6 7,0 ). Sisäänottokriteerit on esitetty taulukossa 7 ja poissulkukriteerit taulukossa 8. Tutkimuksen aikana sallittu painonmuutos oli ± 2 3 %. Lääkitys, fyysinen aktiivisuus, alkoholin käyttö ja tupakointi oli pidettävä muuttumattomana tutkimuksen ajan. Taulukko 7. Sisäänottokriteerit 40 70 vuotta BMI 25 32 kg/m 2 Plasman paastoglukoosi 5,6 7,0 2 tunnin plasman glukoosi oraalisessa glukoosirasituskokeessa 11,0 Seerumin LDL-kolesteroli paastossa 5,0 Seerumin kokonaiskolesteroli paastossa 7,0 Seerumin triglyseridit paastossa 4,0 Taulukko 8. Poissulkukriteerit Krooniset sairaudet (maksa-, kilpirauhas-, munuaissairaudet) Alkoholin suurkulutus, >40g/päivä Diabetes 5 %:n painonlasku tutkimuksen aikana tai laihduttaminen viimeisen 6 kk sisällä ennen tutkimuksen alkua Sydäninfarkti viimeisen 6kk sisällä Kortikosteroidilääkitys (hengitettävät kortikosteroidit sallittuja) Lääkitystä vaativa psykiatrinen häiriö Syöpähoidot Kala-allergia ja muut laajat ja vakavat ruoka-allergiat Poikkeuksellinen ruokavalio ennen tutkimusta (kuten Atkinsin dieetti tai vegaaniruokavalio) Tutkimukseen osallistui 79 tutkittavaa, joista 40 oli miehiä ja 39 naisia. Tutkittavien taustatietoja tutkimuksen alussa on esitetty taulukossa 9. Tutkittavien keski-ikä oli 59 vuotta. BMI oli keskimäärin 29 kg/m 2 eli tutkittavat olivat ylipainoisia. Paastoglukoosi oli keskimäärin 6. 23 % tutkittavista käytti statiineja ja verenpainelääkitys oli 54 prosentilla. Fibraatteja, kroonista kortikosteroidilääkitystä ja anti-inflammatorista lääkitystä, kuten ibuprofeiinia ei käyttänyt kukaan tutkittavista. Kontrolliryhmässä yksitutkittavista käytti kasvi- ja

41 kalaöljysuplementteja tutkimuksen alkaessa (viikolla 0). Niiden käyttö tutkimuksen aikana oli kielletty ja viikolla 12 uudelleen kysyttäessä kukaan ei käyttänyt kasvi- ja kalaöljysuplementteja.

Taulukko 9. Tutkittavien taustatiedot tutkimuksen alussa. Rasvainen kala n=20 42 Vähärasvainen kala n=21 Alfalinoleenihapp o n=18 Kontrolli n=20 Sukupuoli miehet/naiset 10/10 11/10 8/10 11/9 0,928 BMI, kg/m 2 29±2 30±3 29±2 29±3 0,712 Ikä, v 59±6 58±8 58±6 61±6 0,698 2 Tupakointi, säännöllisesti tai satunnaisesti, n 3 0 2 1 0,250 Verenpaine, systolinen, mmhg 131±13 129±10 126±12 133±11 0,411 Verenpaine, diastolinen, mmhg 85±7 83±8 85±7 86±5 0,663 Oraalinen glukoosirasituskoe, 0 min, 6±0 6±0 6±0 6±1 0,675 2 Oraalinen glukoosirasituskoe, 120 min, 6±2 7±1 6±2 7±2 0,154 3 Seerumin kokonaiskolesteroli paastossa, 5±1 5±1 5±1 5±1 0,897 Seerumin HDL-kolesteroli paastossa, 1±0 1±0 1±0 1±0 0,684 3 Seerumin LDL-kolesteroli paastossa, 3±1 3±1 3±1 3±1 0,746 Seerumin triglyseridit paastossa, 2±1 1±1 2±1 2±1 0,407 3 Vyötärönympärys, cm 99±9 99±11 98±7 102±7 0,378 2 Statiinit, n (%) 5 (25,0 %) 4 (19,0 %) 4 (22,2 %) 5 (25,0 %) 0,966 Muut lipidejä laskevat lääkkeet, n (%) 1 (5 %) 0 0 0 0,734 Verenpainelääkitys, n (%) 4 10 (50 %) 10 (48 %) 9 (50 %) 14 (70 %) 0,449 Astmalääkitys, n (%) 0 4 0 2 0,061 Tyroksiini, n (%) 3 (15 %) 5 (24 %) 3 (17 %) 2 (10 %) 0,731 Hormonikorvaushoito, n (%) 3 (15 %) 3 (14 %) 1 (6 %) 1 (5 %) 0,617 Antitromboottinen hoito, n (%) 5 2 (10 %) 5 (24 %) 1 (6 %) 2 (10 %) 0,375 Antikoagulatiolääkitys, n (%) 6 0 1 (5 %) 0 0 1,00 Masennuslääkitys, n (%) 0 0 0 1 (5 %) 0,734 Muu krooninen lääkitys, n (%) 0 5 (24 %) 3 (17 %) 5 (25 %) 0,073 Vitamiini- ja/tai mineraalisupplementit, n (%) 11 (55 %) 10 (48 %) 15 (83 %) 11 (55 %) 0,113 Kasvi-tai kalaöljysupplementti, n (%) 0 0 0 1 (5 %) 0,734 Jatkuvien muuttujien arvot esitetty keskiarvo ± SD. Ryhmien välistä eroa on testattu yksisuuntaisella varianssianalyysillä. Luokkamuuttujien ero ryhmissä testattu χ²-testillä (Fisher s exact tests-menetelmällä jos muuten ei ehdot täyttyneet). 1 P-arvo ryhmien erolle 2 Kruskall-Wallisin testi 3 Logaritmimuunnettu muuttuja tilastoanalyysissä. 4 b-salpaajat, ACE-estäjät, angiotensiinireseptoriantagonistit, muut verenpainetta laskevat lääkkeet; 5 esim. asetyylisalisyylihappo; 6 esim. Marevan P-arvo 1

4.2 Tutkimuksen kulku 43 Ennen tutkimuksen alkua järjestettiin seulontakäynnit, joiden perusteella tutkittavat valittiin mukaan tutkimukseen. Seulontakäynnillä tehtiin kliininen tutkimus, jossa mitattiin paino, pituus, vyötärönympärys, verenpaine sekä paastoverinäytteestä mitattiin glukoosi ja kreatiniini sekä TSH, gamma-gt, AFOS, ALAT, triglyseridi- sekä kokonais- ja LDLkolesterolipitoisuudet. Lisäksi EKG tehtiin, mikäli se oli haastattelun pohjalta tarpeellista. Seulonnan perusteella 153 henkilöstä 96 satunnaistettiin interventioryhmiin. Kuukauden sisäänajojakson aikana tutkittavat noudattivat normaalia ruokavaliotaan, mutta eivät saaneet käyttää öljysuplementteja tai stanoli- ja steroliestereitä. Tämän jälkeen tutkittavat satunnaistettiin sukupuoli ja statiinilääkitys huomioiden neljään ryhmään: 1) rasvainen kala 2) vähärasvainen kala 3) ALA ja 4) kontrolli. Tutkimuksen keskeytti yhteensä 17 tutkittavaa, syyt, ja keskeyttämisajankohdat on esitetty kuvassa 6. Tutkimusklinikkakäynnit olivat viikoilla 0, 2, 4, 8 ja 12. Tutkimuskäynneillä mitattiin aina paino ja verenpaine. Viikoilla 0 ja 12 oli kaksi käyntiä, joista toisella otettiin paastoverinäyte ja tehtiin oraalinen glukoosirasituskoe ja toisella käynnillä tehtiin suonensisäinen glukoosirasituskoe. Kuva 6. Tutkimukseen osallistuneet. ALA=alfalinoleenihappo; OGTT=oraalinen glukoosirasituskoe