1. Immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille Isto Leinonen Ohjaajat: FM Saara Wittfooth ja FT Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yksi merkittävimmistä kuolinsyistä maailmanlaajuisesti. Sydänkohtauksessa sydämeen happea kuljettava sepelvaltimo tukkeutuu, jolloin sydämen hapensaanti estyy ja sydän lakkaa toimimasta normaalilla tavalla. Yleensä sepelvaltimon tukkeuman aiheuttaa sepelvaltimon seinämään muodostuneen pääosin rasvasta koostuvan plakin hajoaminen ja sitä seuraava verihyytymä. Sydänkohtauksen hoidossa on tärkeää hoidon nopea aloitus, jotta hapenpuutteen seurauksena sydänlihakseen syntyvän kuolleen alueen koko voidaan minimoida. Nykyisin käytettävät sydänkohtauksen merkkiproteiinit vapautuvat verenkiertoon vasta sydänlihaksen vaurioituessa. PAPP-A -proteiinin (engl. pregnancy associated plasma protein A) vapaan muodon uskotaan erittyvän verenkiertoon jo, kun sepelvaltimon seinämässä oleva plakki hajoaa. Näin ollen vapaa PAPP-A toimii erittäin nopeana merkkiproteiinina sydänkohtauksen toteamisessa toisin kuin nykyiset merkkiproteiinit. Tehdyssä työssä kehitettiin vasta-aineisiin perustuva määritys, joka tunnistaa vapaan PAPP-A -proteiinin. Tehtyä määritystä täytyy vielä optimoida, mutta sitä voitaneen tulevaisuudessa käyttää sydänkohtauksen nopeassa toteamisessa ja näin parantaa potilaiden hoitoennustetta. 2. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisointi ja niistä riippumattoman immunomäärityksen kehitys Emilia Engström Ohjaaja: prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydänlihaksen vauriossa, kuten sepelvaltimotautikohtauksessa, verenkiertoon vapautuu sydänperäisiä biokemiallisia merkkiaineita. Vaurio pystytään havaitsemaan merkkiaineen kohonneesta pitoisuudesta. Sydänperäistä troponiini I:tä (ctni) käytetään sydäninfarktin biokemialliseen havainnointiin. Sen on todettu olevan erittäin kudosspesifinen ja herkkä merkkiaine diagnostiikassa. Nykyään saatavilla olevat kaupalliset troponiini I:n havainnointimenetelmät perustuvat immunomäärityksiin. Immunomääritystä voivat kuitenkin häiritä ihmisen verenkierrossa olevat troponiiniautovasta-aineet. Tällöin immunomääritys ei havaitse kaikkea näytteessä olevaa troponiini I:tä, jolloin sydäninfarktin diagnosointi saattaa vaikeutua. Yleisesti autovasta-aineita muodostuu ihmisessä, kun antigeenia, kuten troponiinia, on läsnä. Troponiiniautovasta-aineiden muodostumisen tarkkaa mekanismia ei tiedetä, mutta niitä syntyy mahdollisesti troponiinipäästöjen seurauksena mm. infarktin, sydänlihaksen
tulehdustilojen, sydämen vajaatoiminnan sekä pitkäkestoisen liikuntasuorituksen yhteydessä. Erikoistyön tarkoituksena oli kartoittaa troponiiniautovasta-aineiden vaikutusta sydänperäiseen troponiini I proteiiniin (antigeeni) sekä kehittää immunomääritys, jota troponiiniautovasta-aineet eivät häiritse. Analysoinnissa käytettiin potilas-paneelia, jossa oli mukana troponiiniautovasta-ainepositiivisia sekä negatiivisia potilaita. Potilailla ei tiettävästi ollut sydänperäisiä sairauksia. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisoinnissa havaittiin autovasta-aineiden vaikuttavan sydänperäisen troponiini I:n keskiosaan, johon markkinoilla olevan 1. sukupolven troponiini I -määrityksen havainnointi keskittyy. Erikoistyössä luotiin immunomääritys, joka 1. sukupolven määritykseen verrattuna havaitsi 70-90 % enemmän troponiini I:tä autovasta-aineita sisältävistä näytteistä. 4. Lääkeaineiden seulontamenetelmän kehittäminen käyttäen β 2 -adrenergista reseptoria mallisysteeminä Eija Martikkala Ohjaajat: FT Anita Rozwandowicz, FT Harri Härmä Tutkimuksessa kehitettiin uusi pesuvaiheita sisältävä fluoresoivaan europium(iii) leimattuun ligandiin perustuva lääkeyhdisteiden seulontamenetelmä. Tutkimuksessa pyrittiin myös kehittämään lääkeaineiden seulontamenetelmä, jossa ei olisi tarvittu erillisiä pesuvaiheita. Potentiaalisten lääkeyhdisteiden seulonta on työlästä, hidasta ja kallista ja tämän vuoksi uudet nopeammat ja helpommat seulontamenetelmät ovat toivottuja. G- proteiinikytkentäiset reseptorit ovat suuri ja monimuotoinen solun pintaproteiinien perhe. Ne säätelevät monia solunsisäisiä prosesseja, kuten esimerkiksi maku-, haju- ja näköaistimuksia sekä vasteita solunulkoisiin ärsykkeisiin. Monet sairaudet voidaan yhdistää G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin ja siksi ne ovatkin yksi suosituimmista lääketeollisuuden lääkeaineiden suunnittelukohteista. Tutkimuksessa käyttämämme mallisysteemi perustui ihmisen alkion munuaissolulinjaan (HEK 293), joka tuotti β 2 -adrenergistä reseptoria, joka on yksi G-proteiinikytkentäisten reseptorien perheen jäsen. Tutkimuksessa käytettiin vertailukohtana HEK 293 solulinjaa, joka ei tuottanut β 2 -adrenergistä reseptoria. Määrityksissä käytettyyn ligandiin oli kiinnitetty europium(iii)-kelaatti, jonka avulla ligandi voitiin havaita mittalaitteen avulla. Määrityksissä käytettiin europium(iii) leimatun ligandin kanssa kilpailevana reseptoriin sitoutujana β 2 -adrenergisen reseptorin toimintaa ehkäisevää lääkeyhdistettä propranololia. Tutkimuksen tarkoituksena oli myös kyetä kehittämään ilman pesuja onnistuva määritysmenetelmä. Tämän menetelmän kehittäminen on kuitenkin vielä kesken.
5 Uuden melanooma-spesifisen CT16-antigeenin määritys seerumista Janne Kulpakko Ohjaajat: FM Noora Ristiniemi, FT Pekka Rappu, prof. Kim Pettersson ja prof. Jyrki Heino Länsimaissa yleistyvä aikuisten syöpäsairaus melanooma saa alkunsa ihon melaniinia tuottavista soluista. Erikoistyössä kehittettiin menetelmä uuden melanooma-spesifisifisen antigeenin havaitsemiseksi potilasnäytteistä. Ei-kilpailevassa määrityksessä biotinyloidun vasta-aineen tarkoituksena oli kiinnittyneenä kuoppalevyn pohjaan siepata seeruminäytteen CT16-antigeeni, joka puolestaan havaittiin Eu-leimatulla vasta-aineella. Kehitetyllä immunomäärityksellä 15:sta IV-vaiheen melanoomapotilaan seerumista löytyi kaksi positiivista näytettä uuden melanooma-antigeenin osalta. Näillä potilailla oli jo laajalle levinneitä etäpesäkkeitä. Tämänhetkisiä melanooman ennustetekijöitä ovat esimerkiksi kasvaimen sijainti, koko, haavautuminen ja imusolmukkeista saadut tiedot. Ihomelanoomapotilaiden seerumista on löydetty merkkiaineita, joita voidaan pitää ennustetekijöinä. Nämä merkkiaineet ovat toistaiseksi olleet vielä tutkimuskäytössä. Tässä työssä kehitetyllä menetelmällä seerumista havaittu uusi melanooma-antigeeni voi osoittautua ennustetekijäksi hoidon seurannassa ja menetelmän käyttökelpoisuutta selvitetään vielä laajemmalla potilasaineistolla. 6. Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais- PSA:lle käyttäen terbium(iii)-kelaattia donorina Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil. yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Homogeeninen multiparametrinen immunomääritys, jonka edellytysten on tässä erikoistyössä osoitettu toimivan, voisi tuoda lisätehoa mm. potilasläheiseen diagnostiikkaan. Homogeeniset eli erotusvapaat määritykset ovat diagnostiikan kannalta erittäin mielenkiintoisia, sillä ne ovat nopeita ja yksikertaisia, toisin kuin monet heterogeeniset määritykset, joihin kuuluu yksi tai useampi pesuvaihe. Useimmat määritykset mittaavat vain yhtä analyyttiä kerrallaan, joten useampaa ominaisuutta yhdellä kertaa samasta näytteestä mittaava ns. multiparametrimääritys voisi parantaa tiettyjen diagnoosien tehokkuutta. Tässä työssä mallianalyyttinä käytetty eturauhasspesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine. Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja. PSA:ta esiintyy
verenkierrossa sekä vapaana että yhdessä liittyneenä toiseen proteiiniin eli kompleksoituneena. Yhdessä nämä kaksi esiintymismuotoa muodostavat verenkierron kokonais-psa:n. Seerumin korkea kokonais-psa -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta. Onkin tärkeää määrittää kokonais-psa:n lisäksi vapaan PSA:n osuus, sillä eturauhasen liikakasvua esiintyy samassa ikäryhmässä jossa eturauhassyöpä on yleistä. Vapaan PSA:n osuus kokonais-psa:sta on pienempi syövän yhteydessä kuin liikakasvussa. Erikoistyössä kehitetty immunomääritys perustuu vasta-aineiden kykyyn kykyyn tunnistaa ja sitoa hyvin tarkasti muiden proteiinien pintarakenteita. Kolmesta käytetystä vasta-aineesta kaksi sitoutuu sekä vapaaseen että kompleksoituneeseen PSA:han ja yksi vain vapaaseen PSA:han. Vasta-aineisiin on kiinnitetty erilaisia fluoresoivia värejä. Yksi väri toimii energian luovuttajana ns. fluoresenssiresonanssienergiansiirrossa, jolloin luovuttajan väri siirtää energiaa lähelle sitoutuneen toisen vasta-aineen väriin, joka puolestaan säteilee selvästi pidemmällä aallonpituudella. Tämä säteilyenergia voidaan mitata ilman häiriötä alkuperäisestä viritysenergiasta. Energiansiirtoa ei tapahdu, mikäli vasta-aineet eivät ole sitoutuneet PSA:han. Koska toinen vastaanottajavasta-aine sitoutuu vain vapaaseen PSA:han, eri väreillä leimatut vastaanottajat voivat siten paljastaa vapaan PSA:n suhteen kokonais PSA:sta. 7. Uudenlainen pinnoitusmenetelmä nanokokoisten upkonvertoivien fosforien muokkaamiseksi Riikka Arppe Ohjaajat: FM Terhi Rantanen ja FT Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Valoa tuottavien partikkelien uudenlainen silikapolymeeriin perustuva pinnoitusmenetelmä mahdollisti pysyvämmän rakenteen vanhaan pinnoitukseen verrattuna. Silikapintaiset partikkelit toimivat sovelluksissa vähintään yhtä hyvin kuin aiemmin käytetyt partikkelit. Up-konvertoivat fosforit ovat epäorgaanisia partikkeleita, joilla on ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisellä infrapunavalolla ja purkaa tämä viritysenergia korkeamman energian aallonpituuksilla tuottaen näkyvää valoa. Tällaista ilmiötä ei tapahdu missään biologisessa materiaalissa. Up-konvertoivia partikkeleita voidaan hyödyntää erilaisissa tautitilaa selvittävissä diagnostisissa määrityksissä. Määritykset perustuvat biomolekyylillä päällystettyjen partikkelien spesifiseen sitoututumiseen tutkittavaan analyyttiin. Up-konvertoivien fosforipartikkelien ainutlaatuiset ominaisuudet mahdollistavat tulevaisuudessa yhä pienempien analyyttipitoisuuksien havaitsemisen jopa värillisistä näytemateriaaleista. Kyseisten partikkelien pinnassa ei ole reaktiivisia ryhmiä, joita tarvitaan biomolekyylien kiinnittämiseen. Aikaisemmin tarkoitusta varten pintaan on adsorboitu polyakryylihappoa, joka kuitenkin voi helposti irrota partikkelista.
Erikoistyön tavoitteena oli kehittää uudenlainen partikkelin pinnoitusmenetelmä silylointi, jossa partikkeli kapseloituu ohuen silikapolymeerin sisään. Polymerisointireaktioon voidaan lisätä reaktiivisia ryhmiä sisältäviä organosilaaneja pinnan muokkaamiseksi. Silyloituja partikkeleita testattiin TSH-immunomäärityksessä (TSH, kilpirauhasta stimuloiva hormoni). TSH:n pitoisuutta mitataan verenkierrosta, jos on syytä epäillä kilpirauhasen toiminnan häiriötiloja. Määritystä varten silikapintaiseen partikkeliin kiinnitettiin TSH:iin sitoutuvaa vastaainetta ja reaktioastian eli mikrotiitterikaivon pintaan toista vasta-ainetta. Mitä enemmän näytteessä on TSH:ta, sitä enemmän up-konvertoivia fosforeita sitoutuu kaivon pohjalle ja nanokokoisten (~ 100 nm) partikkelien määrä voidaan havaita valosignaalina. 8. Nopea määritys myrkyllisille sinileville Henna Hautala Ohjaajat: FM Erik Jokisalo, FM Markus Vehniäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Myrkylliset sinilevien massaesiintymät ovat maailmanlaajuinen ongelma. Jotta niiden aiheuttamia haittoja voitaisiin välttää, tarvitaan luotettavia tapoja niiden tunnistamiseen jo kasvun varhaisessa vaiheessa. Tässä työssä kehitettiin menetelmä, jonka avulla kyetään tunnistamaan tiettyjä maksamyrkkyjä, mikrokystiinejä tuottavia sinileviä. Määritys perustuu tietyn alueen monistamiseen geenistä, joka mikrokystiinejä tuottavilla sinilevillä on perimässään. Kehitetyn määrityksen avulla voidaan myös erottaa kolme eri sinileväsukua toisistaan monistetun geenialueen sukujenvälisten erojen perusteella. Määrityksen avulla pystytään havaitsemaan hyvin pieniä määriä kohteena olevaa geneettistä materiaalia. Kaikki sinilevät eivät tuota myrkyllisiä yhdisteitä, vaan tämä ominaisuus on vain joillain lajeilla. Tilannetta monimutkaistaa vielä se, että toisinaan jopa saman lajin eri kannat eroavat toisistaan kyvyssään tuottaa myrkkyjä. Tästä syystä haitallisten solujen erottaminen vaarattomista on usein hyvin vaikeaa tai mahdotonta. Tämä ongelma voidaan välttää käyttämällä tunnistamiseen mikrokystiinien tuottamiseen tarvittavia geenejä. On tärkeää että kehittyvät myrkkyjä tuottamaan kykenevät massaesiintymät voidaan tunnistaa luotettavasti jo ennen kuin ne aiheuttavat suuria ongelmia. Tällöin kyetään välttämään mikrokystiinien haittavaikutuksia. Niin suurista annoksista kuin jatkuvasta, lievästä altistuksestakin on haittaa terveydelle. Suuret annokset aiheuttavat maksasolujen tuhoutumista ja maksan sisäistä verenvuotoa, kun taas jatkuvan altistuksen on todettu lisäävän riskiä sairastua maksasyöpään. Erikoistyössäni kehitettyä menetelmää on tarkoitus kehittää edelleen siten, että sitä voitaisiin tulevaisuudessa hyödyntää esimerkiksi juoma-, maatalous- ja uimavesien turvallisuuden valvonnassa.
10. VAP-1 -tulehdusproteiinin mittaus verestä Kristiina Aalto Ohjaajat: FT Mikael Maksimow, dosentti Marko Salmi ja professori Sirpa Jalkanen VAP-1 (vaskulaarinen adheesioproteiini-1) tulehdusproteiinin määrää ihmisen seerumissa voidaan uuden kehitetyn menetelmän avulla mitata luotettavasti ja nopeasti. Menetelmä perustuu ihmisen veressä esiintyvän, tulehduksissa elimistölle tärkeän VAP-1:n aktiivisuuteen. Tämä aktiivisuus on yleensä suoraan verrannollinen tulehdusproteiinin määrään ihmisen veressä. Tietyissä tulehdustiloissa VAP-1:n määrä veressä muuttuu; esimerkiksi diabeteksessa liukoisen VAP-1:n määrä seerumissa kasvaa. Ihmisen immuunipuolustuksen tehtävä on löytää tauteja aiheuttavia mikrobeja elimistöstä. Tätä varten elimistön puolustussolujen on päästävä verestä ympäröiviin kudoksiin. VAP-1 on tulehdusproteiini, joka auttaa elimistön puolustussoluja kulkemaan veren ja kudosten välillä. VAP-1:n entsymaattisen aktiivisuuden seurauksena muodostuu elimistölle haitallisia aineita, kuten vetyperoksidia ja ammoniakkia, jotka suurina pitoisuuksina voivat olla haitallisia elimistölle. Kun entsyymin määrä veressä kasvaa, myös aktiivisuus lisääntyy. Lisääntyneen aktiivisuuden myötä haitallisten aineiden määrä kasvaa, jolloin ne puolestaan voivat aiheuttaa pitkäaikaisille tulehdussairauksille tyypillisiä oireita. Nyt kehitetyssä menetelmässä ihmisen verestä erotetaan seerumi, josta VAP-1-entsyymin määrä mitataan muodostuneen vetyperoksidin määrän avulla. Mittaus suoritetaan kuoppalevyllä, jossa on 96 tai 384 kuoppaa. Mitä enemmän kuoppia on levyllä, sitä enemmän näytteitä saadaan määritettyä kerralla. Määrityksen avulla saadaan tietoa sairauksista, joissa VAP-1:n määrä ja aktiivisuus ihmisen seerumissa on muuttunut. 11. VAP-1 D386N :n tuotto, puhdistus ja karakterisointi Minna Peippo Ohjaajat: FT Heli Elovaara ja Prof. Sirpa Jalkanen Biokemia Tekemällä yhden aminohapon muutoksen verisuonenseinämän tarttumisproteiiniin (vaskulaarinen adheesioproteiini-1, VAP-1), pystyimme estämään sen entsymaattisen toiminnan. Tätä D386N mutanttia voidaan mahdollisesti käyttää työkaluna VAP-1 proteiinin vastinmolekyylin tunnistamisessa. VAP-1 liittyy prosessiin, jossa valkosolut siirtyvät verestä kudokseen, mikä on välttämätöntä immuunipuolustukselle. VAP-1 on entsyymi ja sen aktiivisuus tarvitaan tähän kulkeutumisprosessiin. VAP-1:n vastinmolekyyliä valkosolun pinnalla ei kuitenkaan ole pystytty tunnistamaan. Työssä tuotin muutettua proteiinia (VAP-1 D386N ), jonka totesin olevan entsymaattisesti toimimaton. Muutoksen ei kuitenkaan pitäisi vaikuttaa muuhun kuin entsymaattisen
tuotteen irtoamiseen. Näin ollen vastinmolekyyli eli substraatti sitoutuisi normaalisti aputekijään, mutta reaktion pysähtyessä tähän vaiheeseen substraatti jäisi kiinni. Tätä ominaisuutta voitaisiin käyttää luonnollisen substraatin etsimisessä. Työn aikana tuotetuilla ja puhdistetuilla proteiineilla tehdyt substraatin sitoutumiskokeet eivät olleet toistettavia, sillä tuloksissa oli liian paljon hajontaa. Toistettavia sitoutumiskokeita varten tarvitaan huomattavasti suurempi määrä proteiinia, ennen kuin voidaan luotettavasti määrittää voiko mutanttiproteiinia todella käyttää substraatin etsimiseen ja tunnistamiseen. 12. Eri VEGF-C:n muotoja tuottavien stabiilien S2 solulinjojen tekeminen, näiden proteiinimuotojen tuottaminen ja puhdistus sekä niiden bioaktiivisuuksien testaus Jarno Ronkainen Ohjaajat: FT Michael Jeltsch ja prof. Kari Alitalo MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Hiiriperäisen verisuonen endoteelisen kasvutekijä C (vascular endothelial growth factor C, VEGF-C) proteiinin major muoto aktivoi hiiriperäisen VEGF-reseptori-2:n sisältävät Ba/F3 solut (B solut) tehokkaammin kuin ihmisperäisen major proteiinin muoto. Solut vuorovaikuttavat muun muassa tuottamiensa proteiinien välityksellä toisiin soluihin. Eritetyt proteiinit sitoutuvat toisten solujen reseptoreihin, jotka välittävät signaalin edelleen niiden solujen sisään. Tutkimuksen tarkoitus oli tehdä puuttuvat ihmisen reseptori-2:n sisältävä Ba/F3 solulinja, hiiren reseptori-3:n sisältävän Ba/F3 solulinja sekä hiiren proteiini muotoja tuottavat S2 solulinjat. Tarkoituksena oli myös verrata, miten tehokkaasti hiiri- ja ihmisperäiset proteiinin muodot toimivat erilaisissa hiiri- ja ihmisperäisen reseptorin sisältävissä Ba/F3 soluissa. VEGF-C on yksi erikoistuneimmista imusuonien kasvua edistävistä tekijöistä, mikä on tärkeää monien tautien synnyssä, kuten syöpä. Hiirikokeet muodostavat pohjan, josta lähdetään liikkeelle testattaessa uusia lääkkeitä ja muita parannuskeinoja ihmisten sairauksiin. Jo vuosia monet tutkijat ovat käyttävät ihmisperäisiä proteiineja hiirikokeissaan kuvastamaan jotakin ihmisen tautitilaa, esimerkiksi syöpää. On mahdollista, että näin saadut jo julkaistut tulokset osoittautuvat ainakin osittain vääriksi. Pahimmassa tapauksessa näin tulee kehitetyksi lääkkeitä, jotka ovat joko tehottomia tai jopa haitallisia ihmisen terveydelle. Selvästi haitalliset lääkkeet karsiutuvat kuitenkin useimmiten pois kliinisessä lääkeainetestauksessa. Tarvitaan lisää kokeita selvittämään hiirimallien ja vastaavien ihmisen sairauksien välillä vallitsevia eroja.
13. Angusykliiniantibioottien entsymaattiset muokkausreaktiot Pekka Patrikainen Ohjaajat: FM Pauli Kallio ja FT Jarmo Niemi Streptomyces-suvun bakteerit ovat tyypillisiä maaperän asukkeja. Taistellessaan ravinteista ja elintilasta ympäröivien mikro-organismien kanssa ne tuottavat monia kemiallisia yhdisteitä. Joitain näistä yhdisteistä on lääkekäytössä, esimerkiksi antibiootteina ja syöpälääkkeinä. Tutkimukseeni liittyvät angusykliinit ovat myös potentiaalisia lääkeaineita, joskin niitä ei toistaiseksi ole kliinisessä käytössä. Erikoistyöni tarkoituksena on selvittää, mitä tietyissä angusykliinien synteesivaiheissa tapahtuu miten niitä rakentavat entsyymit toimivat. Entsyymitason tutkimuksen tarkoituksena on selvittää uusien lääkkeiden kehittelyyn liittyviä mahdollisuuksia ja rajoituksia. 14. Ei-radioaktiivisen lääkeaineseulontamenetelmän kehittäminen Jari-Matti Sirkka Ohjaaja: FT Heini Frang * MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA * PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku Erikoistyössäni pyrittiin kehittämään ei-radioaktiivinen seulontamenetelmä uusien lääkeaineiden löytämiseksi G-proteiineihin kytkeytyneille reseptoreille. Tutkimuksissa löydettiin kaksi erilaista molekyyliä, joilla tämä uudentyyppinen seulontamenetelmä voidaan mahdollisesti toteuttaa. Reseptorit ovat solun pinnalla kelluvia kanavia, joiden avulla solun ulkopuolelta tuleva signaali kulkeutuu solun sisällä odottaville G-proteiineille. Nämä G-proteiinit jatkavat signaalinvälitystä edelleen omille kohdemolekyyleilleen. G-proteiineihin kytkeytyneet reseptorit ovat eliömaailman suurin ja monipuolisin proteiiniperhe ja tästä syystä ei ole ihme, että noin 50 % markkinoilla jo olevista lääkeaineista vaikuttavat juuri näiden reseptorien kautta. Ihmiselle vaaralliset radioaktiiviset aineet voitaisiin osin poistaa nykyisistä uusien lääkeaineiden seulontamenetelmistä hyödyntämällä harvinaisten maametallien tuottamaa valoilmiötä, fluoresenssia, sekä erilaisia muita fluoresoivia merkkiaineita. Jotta fluoresenssi-ilmiötä voidaan hyödyntää, fluoresoivien molekyylien täytyy jollakin tapaa sitoutua reseptorin aktivoimiin komponentteihin. Reseptorin ollessa lepotilassa, G- proteiinikin on lepotilassa sitoen guaniinidifosfaattia (GDP). Reseptorin aktivoituessa G- proteiinin GDP vaihtuu guaniinitrifosfaatiksi (GTP). Esimerkiksi tähän molekyyliin voidaan kiinnittää fluoresoiva merkkiaine, jota pystytään mittaamaan erityisillä lukijalaitteilla ja näin saadaan tieto reseptorin aktivoitumisesta. Tutkimuksessa yritettiin löytää myös muita sopivia G-proteiiniin sitoutuvia molekyylejä, kuten vasta-aineita. Kahden G-proteiiniin sitoutuvan komponentin löytyminen mahdollistaa liuoksessa
tapahtuvan energiansiirtoon perustuvan määrityksen pystyttämisen. Energiansiirto tapahtuu kahden erilaisen, yhteensopivan merkkiaineen välillä, kun näille annetaan tietty valosykäys ja nämä ovat sopivalla etäisyydellä toisistaan. Toinen lähestymistapa menetelmänkehityksessä oli etsiä molekyylejä, jotka sitoutuvat GTP:hen. Näihin voidaan kiinnittää erityinen sammuttaja-aine, jolloin G-proteiiniin sitoutumaton GTP ei anna lukijalaitteessa signaalia. Tekniikkaa on parannettava vielä monilta osin, jotta menetelmään tarvittava herkkyys olisi riittävä. 15. DNA-leimauksen haasteet arraycgh analytiikassa Katja Laurila Ohjaajat: FM Hanna-Mari Raussi * ja FM Pia Ollikka * * PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku Kehityshäiriöisten lasten kromosomimuutoksia voidaan tutkia arraycgh-analyysillä. Vertailevassa genomisessa hybridisaatiossa eli arraycgh-analyysissä vertaillaan potilaan perimää terveen ihmisen perimään. Perimät eli DNA:t leimataan eri väreillä ja kiinnitetään sirulle. Siru luetaan kuvantamislaitteella ja värien suhteita verrataan tietokoneen avulla. Värisuhteiden avulla muodostetaan perimän kartta, josta voidaan havaita potilaan ja terveen ihmisen näytteiden välinen ero. acgh-analyysillä voidaan nopeasti suorittaa koko perimän kattava testi. Työssäni tutkin erilaisia acgh-analyysissä tehtäviä DNA:n leimaustapoja. acghanalyysin suorittamiseen sirulla tarvitaan vähintään 3µg leimattua DNA:ta ja optimaalinen leimausprosentti on 1.5 2.5 %. DNA:ta voidaan leimata väriaineella suoraan 30 minuutissa, mutta puhdasta DNA:ta on oltava vähintään 3µg, koska näytteen määrä ei kasva reaktiossa. Suoraleimauksella saavutetaan aina optimaalinen leimausprosentti. Entsymaattisessa eli epäsuorassa leimauksessa DNA voi olla hieman epäpuhdasta, ja näytettä tarvitaan vain 0.75µg, koska leimausreaktiossa DNA monistuu noin nelinkertaisesti. Leimausprosentti jää usein alle optimaalisen ja leimaus kestää kaksi tuntia. Jos näytettä on alle analyysin minimivaatimuksen, täytyy sitä monistaa koko genomin monistusreaktiossa. Reaktiolla pystytään monistamaan DNA:ta jopa 500 800- kertaisesti. Jos tähän reaktioon lisätään väriaineet, monistus on vain noin 70-kertaista ja näytettä ei saada riittävästi acgh-analyysiin. Leimausprosentti on kuitenkin hyvä. Suoraleimauksella voidaan nopeuttaa acgh-analyysiä, sillä suoraleimaus on nopeampi suorittaa kuin epäsuoraleimaus. Suoraleimauksessa DNA-näytteen on oltava laadukas optimaalisen leimauksen saavuttamiseksi, sen sijaan epäsuoraleimaus voidaan suorittaa heikompilaatuisellakin DNA-näytteellä. DNA-näytteen laatu ja määrä vaikuttavat siten leimaustavan valintaan.
16. Painettavan entsyymielektrodin kehittäminen biopolttokennosovelluksissa Pauliina Saurus Ohjaaja: TkT Maria Smolander MOLEKULAARINEN JA ELINTARVIKEKEMIA Biopolttokennossa entsyymit muuntavat bioperäisen polttoaineen, muun muassa sokerien ja alkoholien energian sähköksi. Biopolttokennokokeiden tulosten perusteella entsyymien käyttö virtalähteessä katalyytteinä, toiminta matalissa lämpötiloissa ja uusiutuvien kemikaalien käyttö polttoaineina on mahdollista, eli pystyttiin kehittämään täysin entsymaattinen virtalähde painotekniikalla, jossa olivat biokatalyytit (entsyymit) sekä anodisella, että katodisella puolella. Entsyymeinä anodisella puolella käytetyt entsyymit saatiin säilymään aktiivisena painetussa, johtavassa musteessa useita viikkoja, jopa kuukausia. Lisäksi entsyymielektrodeja voitiin käyttää myös uudelleen ilman, että niiden sähkönjohtavuus huononi. Biopolttokennon kehittäminen oli osa VTT:n hankketta Integrading enzymes, mediators and nanostructures to provide bio-powered bio-electrochemical sensing systems (EU- BIOMEDNANO), jossa oli jo kehitetty entsyymielektrodi katodiselle puolelle. Painotekniikalla toteutettujen biopolttokennojen, eli pienten itsenäisten mikro- ja milliwattitasoisten virtalähteiden etuna on niiden ympäristöystävällisyys, kertakäyttöisyys, edullisuus ja pieni koko. Paperille painettuina massatuotteina niiden hinta on mahdollista pudottaa hyvinkin alhaiseksi. Biohajoavat raaka- ja polttoaineet puolestaan mahdollistavat kertakäyttöisyyden. Tämänkaltaisten virtalähteiden tarve tulee lisääntymään muunmuassa uusissa älykkäissä pakkauksissa, antureissa, kannettavan elektroniikan ja joka paikan älykkyyden laitteistosovelluksissa, joita ovat esimerkiksi muistipiirin ja mittaelektrodin sisältävä laastari ja elintarvikkeiden laatua seuraava anturi. Muita tyypillisiä sovellusalueita ovat elintarvikrteknologia, terveysteknologia ja kulutustavaratuotteet, joiden tulee olla poistettavissa käytöstä talousjätteen mukana. Nykyinen patteri- tai akkutekniikka ei tarjoa biohajoavia ja pitkän toiminta-ajan omaavia virtalähteitä. 17. Uutta tietoa proteiinien kulkeutumisesta solujen sisälle Jonna Leinonen Ohjaajat: FM Pasi Kankaanpää, FM Anna-Brita Öst ja professori Jyrki Heino Lopputyössäni tutkin integriiniproteiinien kulkeutumista solun sisälle sekä tapahtumaan liittyviä mekanismeja ja muita proteiineja uusien mikroskopiamenetelmien avulla. Tunnistettiin useita aiemmin huonosti tunnettuja proteiineja, joiden havaittiin olevan tärkeitä mekanismien toiminnalle. Tuloksilla voi olla merkitystä esimerkiksi erilaisten lääkehoitojen kehittämisessä.
Integriinit ovat ns. vastaanottajaproteiineja, jotka läpäisevät solukalvon ja yhdistävät näin toisiinsa solun sisä- ja ulkopuolen. Ne toimivat solujen kiinnittymisessä esimerkiksi kollageeniin ja välittävät viestejä ympäristöstä sisälle soluun. Kollageenit ovat ihmisen yleisimpiä proteiineja. Niitä on erityisesti solujen välisissä tiloissa eri puolilla elimistöä ja ne toimivat kudosten rakenteen ylläpidossa ja aikaansaavat esimerkiksi ihon kimmoisuuden. Solut ja kollageenit vuorovaikuttavat useissa elimistön normaaleissa toiminnoissa, mutta myös erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä. Solujen ja kollageenin vuorovaikutus voi myös edistää sairauden kehittymistä Ryhmämme tutkima α2β1-integriini on nisäkkäissä tärkein kollageenireseptori. Aktivoituessaan integriinit kasautuvat yhteen ja kulkeutuvat sisälle soluun. Työssäni tutkin α2β1-integriinin siirtymistä solun sisälle, ja joidenkin solutukirankaan liittyvien proteiinien, kuten myosiinin, T-plastiinin ja kaveoliinin, vaikutusta integriinien kulkeutumiseen mikroskopian avulla. Laskentatulokset osoittivat, että kaikilla kolmella proteiinilla on vaikutusta integriinin siirtymisessä solun sisään. Muuttamalla α2β1- integriinin toimintaa näiden proteiinien kautta voidaan mahdollisesti vaikuttaa eri sairauksien kehittymiseen, esimerkiksi syöpäsolujen liikkeeseen ja siten syövän etäpesäkkeiden muodostukseen. 18. Rac1-proteiini α2β1-integriinien signaloinnissa Maria Salmela Ohjaajat: FM Johanna Jokinen, professori Jyrki Heino Integriinit ovat solua ympäröivän kalvon läpäiseviä proteiineja, jotka koostuvat yhdestä α- ja yhdestä β-alayksiköstä. α-alayksiköitä tunnetaan 18 erilaista ja β-alayksiköitä 8. Integriinit toimivat solun tarttumisproteiineina, joiden avulla solu kiinnittyy sitä ympäröivään aineeseen, kuten kollageeniin, ja pystyy liikkumaan paikasta toiseen. Integriinit ovat tärkeitä haavan paranemisessa, kun ihon vaurioituneeseen kohtaan kulkeutuu uusia soluja. Ne ovat osallisena myös syövän leviämisessä, joten niiden toiminnan ymmärtäminen on tärkeää. Integriinit välittävät viestin solun sisälle muuttamalla rakennettaan, jolloin solun sisäpuolella sijaitsevaan osaan voi sitoutua viestiä välittävä molekyyli. Integriinien kasaantuminen yhteen eli klusteroituminen vahvistaa signaalia entisestään. Tutkimusryhmässä on aiemmin osoitettu α2β1- integriinien klusteroitumisen ja rakenteenmuutoksen yhdessä aktivoivan p38 MAPkinaasi nimistä proteiinia. Erikoistyössä tutkittiin Rac1 -proteiinin osallistumista α2β1-integriinien signalointiin. Työssä haluttiin saada selville yksityiskohtia siitä, miten integriinien klusteroituminen johtaa p38 MAP-kinaasin aktivoitumiseen. Rac1 -proteiini valittiin tutkimuksen kohteeksi, sillä se osallistuu muuhun solun signalointiin, ja sitoutuu aktiivisena solukalvon kolesterolipitoisille alueille, lähelle integriinejä. Tutkimuksessa käytettiin RNA interferenssi -menetelmää vähentämään Rac1 proteiinin määrää ihmisen luusyöpäsoluissa. Aktiivisen Rac1-proteiinin sitoutumista solukalvolle estettiin poistamalla kolesteroli. RNA interferenssin tai kolesterolinpoiston jälkeen
integriinit klusteroitiin ja soluista mitattiin virtaussytometrillä aktivoituneen p38 MAPkinaasin määrää. Konfokaalimikroskopialla tutkittiin, sijoittuvatko α2β1-integriinit ja Rac1-proteiinit lähekkäin soluissa integriinien klusteroinnin jälkeen, mikä viittaisi niiden vuorovaikutukseen. Virtaussytometri-mittauksilla saatiin viitteitä siitä, että Rac1:n poistaminen soluista vähentää p38 MAP-kinaasin aktivoitumista; tämä tulos havaittiin kuitenkin vain osassa mittauksista. Kolesterolinpoistolla oli yllättäviä vaikutuksia p38 MAP-kinaasin aktivaatioon: aktiivisen p38 MAP-kinaasin määrä nousi verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Konfokaalimikroskoopilla ei kyetty näkemään Rac1:n ja integriinien kolokalisaatiota, mutta kolesterolinpoisto vaikutti integriiniklustereiden muodostumiseen. Tutkimuksia Rac1 -proteiinin parissa on tarkoitus jatkaa, sillä tähän mennessä saatujen tulosten perusteella ei Rac1:n osallistumista α2β1-integriinien signalointiin voida varmistaa. Kolesterolinpoiston vaikutus integriinien toimintaan on myös mielenkiintoinen tutkimusaihe. 19. Ihmisen α 2 β 1 -integriinin solunulkoisen osan tuotto Baculoviruksen avulla Mika Remes Ohjaajat: Dos Jarmo Käpylä, prof. Jyrki Heino Integriinit ovat solun pinnalla olevia reseptoreja, jotka välittävät solujen vuorovaikutuksia ympäristöönsä ja toisiin soluihin. Ne ovat olennaisia elimistön normaalissa toiminnassa, kuten solujen kasvussa, liikkumisessa ja erilaistumisen säätelyssä, mutta ne ovat myöskin osallisina monissa patologisissa tiloissa, kuten tulehduksessa, haavan paranemisessa ja etäpesäkkeiden muodostumisessa. Integriinit koostuvat kahdesta alayksiköstä, alfasta (α) ja betasta (β). Työn tarkoitus oli tuottaa α 2 β 1 -integriiniä liukoisena proteiinina. α 2 β 1 -integriini on solussa kiinni solukalvolla, mutta muokkaamalla sen solukalvon läpäisevä osa saadaan korvattua Fos/Jun leusiinivetoketjulla. Näin saatavalla liukoisella proteiinilla voidaan suorittaa kokeita huomattavasti helpommin verrattuna normaaliin proteiiniin. α 2 - ja β 1 - alayksiköihin lisättiin häntäosat, joihin suunniteltiin Fos/Jun leusiinivetoketjun lisäksi tunnistusalueita valmiin proteiinin eristämistä ja puhdistamista varten. Alayksiköt ja niiden häntäosat liitettiin tuottovektoriin, joka siirretään hyönteissoluun. Proteiini tuotetaan hyönteissoluissa Jyväskylän Yliopiston biotekniikan osastolla.
20. Uusi melanoomassa ilmentyvä antigeeni intensiivisessä tutkimuksessa Eveliina Aro Ohjaaja: FT Pekka Rappu Melanooma esiintyy pääosin iholla ja siihen sairastuu joka vuosi noin 700 suomalaista. Merkittävin riskitekijä sairastua melanoomaan on ylenmääräinen altistuminen auringon ultraviolettisäteille ja tästä seuraava ihon toistuva palaminen. Syöpään ei ole kuitenkaan koskaan yhtä ainutta syytä. Useat eri tekijät yhdessä vaikuttavat syövän kehittymiseen vuosien saatossa. Rokotuksella pyritään ehkäisemään sairauksien haittoja. Rokotuksen tarkoitus on aiheuttaa elimistössä puolustusreaktio, joka jättää elimistöön muistijäljen. Elimistöön muodostuvien soluvälitteisen immuniteetin ja vasta-aineiden on tarkoitus estää tauti tai lieventää taudin aiheuttamia haittoja. Antigeeniksi kutsutaan mitä tahansa molekyyliä, joka aiheuttaa elimistössä immuunivasteen. Cancer/testis antigeenit ovat immunogeenisiä proteiineja joita koodaavat geenit ilmentyvät normaalisti vain ihmisen sukusoluissa, mutta joita esiintyy myös useissa syöpätyypeissä, kuten melanoomassa. Cancer/testis antigeenejä onkin alettu käyttää hyväksi terapeuttisten syöpärokotteiden kohteina ja ne ovat myös potentiaalisia biomarkkereita, vaikka niiden biologista funktiota ei vielä ole täysin selvitetty muutamaa poikkeusta lukuunottamatta. CT16 kuuluu uuteen PAGE cancer/testis antigeeniperheeseen ja se on löydetty ainoastaan kiveksestä ja syöpäkudoksesta. CT16 cancer-testis antigeenia on löydetty mm. melanoomasta, keuhkosyövästä ja rintasyövästä. Sen on myös todettu ilmentyvän useassa syöpäsolulinjassa. Tämän erikoistyön tavoitteena oli selvittää CT16 cancer/testis antigeenin kanssa vuorovaikutuksessa olevia muita proteiineja kahta eri melanoomasolulinjaa käyttämällä. 21. Fosforylaation vaikutus unikon PPaasien p26.1a ja p26.1b aktiivisuuteen Kati Kemppainen Ohjaajat: FM Anssi Malinen ja Prof. Reijo Lahti Useimmissa kukkivissa kasveissa ei tapahdu itsepölytystä ja yleisin sitä estävä mekanismi on nimeltään itseinkompatibiliteetti eli SI. Itseinkompatibiliteetti perustuu siihen, että kasvi tunnistaa emilleen laskeutuvan siitepölyn joko omaksi tai vieraaksi ja vain vieraaksi tunnistettu pölyhiukkanen pystyy kasvattamaan siiteputken emin läpi ja tekemään hedelmöityksen. Yksi kasvinjalostuksen ongelma on itsepölytyksen esto kasveissa, joissa sille ei luonnostaan ole estettä. SI-tutkimuksen tavoitteena onkin kasvinjalostuksen helpottaminen itseinkompatibiliteetin säätelyn kautta.
Unikossa SI-vasteen yksi seuraus on kahden siitepölyn pyrofosfataasin eli PPaasin fosforyloituminen ja niiden aktiivisuuden väheneminen. Tämä on mielenkiintoista toisaalta SI-vasteen tutkimuksen kannalta ja toisaalta siksi, että kyseessä on yksi ensimmäisistä esimerkeistä pyrofosfataasien säätelystä fosforylaatiolla. Ilmiö sopii hyvin yhteen siiteputken kasvun eston kanssa, sillä PPaasit ovat rakennusaineenvaihdunnalle elintärkeitä entsyymejä. Erikoistyön tarkoituksena oli ensinnäkin tutkia edelleen unikossa havaitun fosforylaation vaikutusta PPaasien aktiivisuuteen. Saavutetut fosforylaatiotasot olivat kuitenkin niin matalia, että mahdollista vaikutusta ei pystytty havaitsemaan. Toinen tehtävä oli testata unikon PPaasien fosforyloitumista erään toisen kasvin, lituruohon, fosforyloivalla entsyymillä ja selvittää tämän fosforylaation vaikutus aktiivisuuteen. Kävi ilmi, että tällä fosforylaatiolla ei ollut vaikutusta PPaasi-aktiivisuuteen. Kolmanneksi tutkittiin kolmen mahdollisen fosforylaatiokohdan oikeellisuutta ja tulosten perusteella kyseiset kohdat eivät ole etsittyjä SI-vasteeseen liittyviä fosforylaatiokohtia. 22. Metastaasin säätelijäproteiinin h-prunen entsymaattinen karakterisointi Katja Koivula Ohjaajat: FT Marko Tammenkoski ja professori Reijo Lahti Tutkimuksemme osoittavat, että h-prune on eksopolyfosfataasi, joka saattaa aiheuttaa syövän leviämisen joko pilkkomalla pitkäketjuisia polyfosfaatteja, jotka normaalisti estävät syövän leviämistä ja edesauttavat syöpäsolujen kuolemaa, tai sitoutumalla nm23- H1-proteiiniin, jolloin h-prune pystyy estämään sen syövän leviämistä ehkäisevän vaikutuksen. H-prunen eksopolyfosfataasiaktiivisuus on 3500-kertaa suurempi kuin aiemmin ilmoitettu fosfodiesteraasientsyymiaktiivisuus. H-prune pilkkoo tehokkaasti lyhytketjuisia polyfosfaatteja kuten epäorgaanista tripolyfosfaattia ja nukleosidi 5 - tetrafosfaatteja mutta pitkäketjuisten polyfosfaattien ( 25 fosfaattialayksikköä ketjussa) pilkkoutuminen tapahtuu hitaasti. Pyrofosfaatti ja nm23-h1 puolestaan estävät h-prunen toimintaa. Saatujen tulosten perusteella h-prunea vastaan voidaan suunnitella spesifisiä lääkkeitä, jotka estävät h-prunen toimintaa ja saattavat tällä tavoin hidastaa tai jopa ehkäistä syövän leviämistä muihin kudoksiin. H-prunen kuuluu DHH-entsyymiperheeseen yhdessä perheen II epäorgaanisen pyrofosfataasin ja hiivan eksopolyfosfataasin (scppx) kanssa. Aikaisemmat tutkimukset osoittivat h-prunen olevan fosfodiesteraasi (PDE). PDE-entsyymit pilkkovat 3, 5 - syklisen nukleotidin vastaavaksi 5 -nukleotidimonofosfaatiksi. Lisäksi h-prunen on todettu ylituottuvan esimerkiksi rinta- ja mahasyövässä, jolloin kasvain pystyy muodostamaan helpommin etäpesäkkeitä. Tämä saattaa osittain aiheutua h-prunen entsyymiaktiivisuudesta mutta myös h-prunen kyvystä muodostaa proteiinikompleksi tunnetun metastaasin estäjän, nm23-h1:n, kanssa. Erikoistyöni tarkoituksena oli selvittää minkälainen entsyymi h-prune on: mitkä ovat sen substraatteja ja miten se mahdollisesti aiheuttaa syövän leviämisen. Entsyymin aktiivista
keskusta muokattiin siten, että se muistutti h-prunen lähisukulaisen, scppx:n, aktiivista keskusta. Puhdistettujen h-prune varianttien ja villityypin aktiivisuutta mitattiin erilaisten substraattien ja metalli-ionien kanssa. Myös nm23-h1-proteiinin ja dipyridamolen, joka on tunnettu PDE-entsyymien inhibiittori, vaikutusta h-prunen aktiivisuuteen määritettiin. 23. CBS pyrofosfataasi domeinit. Juho Vuononvirta Ohjaajat: FM Heidi Tuominen ja Proff. Reijo Lahti MOLEKULAARINEN JA ELINTARVIKEKEMIA Tällä hetkellä tunnetaan kaksi eri pyrofosfataasi tyyppiä: liukoinen pyrofosfataasi ja membraaniin sitoutunut pyrofosfataasi. Liukoinen pyrofosfataasi jakautuu vielä kahteen eri alatyyppiin, perhe I ja perhe II, joilla on täysin erilaiset rakenteet toisiinsa nähden. Perhe I pyrofosfataasit on tunnettu jo pitemmän aikaa, mutta perhe II pyrofosfataaseja on tunnettu vasta n. 10 vuoden ajan. Noin neljäsosa perhe II pyrofosfataaseista sisältää ison (n.250 aminohappoa) insertin, joka taas sisältää kaksi CBS-domeinia. Yhtään näistä CBS-pyrofosfataaseista ei kuitenkaan ole vielä onnistuttu eristämään, tai karakterisoimaan. CBS-domeinit ovat jakautuneet laajasti kaikkien kolmen elämänmuodon proteiineissa, mutta silti niiden rooleista on erittäin vähän tietoa. Mutaatioista CBS-domeineissa, tiedetään kuitenkin se, että ne pystyvät tuhoamaan spesifisiä proteiinien toimintoja ja se, että ne aiheuttavat ihmisissä useita perinnöllisiä sairauksia. Tästä syystä tutkimukset bakteerien CBS-PPaasien CBS-domeinien parissa ovat tärkeitä, koska ne saattavat oleellisia verrattaessa tuloksia ihmisen CBSproteiineihin. Tässä työssä eristettiin CBS-geeni, jota käytettiin templaattina PCR:ssä, jossa mutaatiot tehtiin. Tehdyt mutaatiot puhdistettiin ja aktiivisuusmittauksien avulla pyrittiin päättelemään, että onko niillä mitään vaikutusta proteiinien aktiivisuuteen. 24. Toll-like-reseptorien vaikutus neutrofiilien aktiiviisuuteen Marika Lahtinen Ohjaaja: FT Jari Nuutila Toll-like-reseptorit ovat kalvoja läpäiseviä reseptoreita, jotka ovat tärkeitä bakteeri- ja virusinfektioiden havainnoimisessa ja taistelussa niitä vastaan. TLR-reseptorit tunnistavat etenkin synnynnäisessä immuniteetissa ihmiselle vaarallisia mikrobeja mm. mikrobeille ominaisten rakenteiden ja nukleiinihappojen perusteella. Tunnistettuaan mikrobin ne lisäävät elimistön kykyä puolustautua kyseistä mikrobia vastaan. Tutkimuksessa tutkittiin solunsisäisten, nukleotideja sitovien TLR-reseptorien 3,7,8 ja 9 vaikutusta terveiden ihmisten verestä eristettyjen, valkosoluihin kuuluvien neutrofiilien aktiivisuuteen. Tarkoitus oli selvittää TLR-reseptorien kautta vaikuttavien aineiden avulla
millainen vaikutus kullakin toll-like-reseptorilla on neutrofiilin solusyöntiin eli fagosytoosiin, hengitysryöpsähdykseen eli varsinaiseen patogeenin tuhoamisvaiheeseen ja tiettyjen, patogeenien tunnistamiseen erikoistuneiden reseptorien ilmenemiseen neutrofiilin pinnalla. Tutkimuksessa selvisi, että TLR3-reseptorin kautta vaikuttava aine heikentää hengitysryöpsähdystä. Muiden TLR-reseptorien kautta vaikuttavat aineet puolestaan tehostavat sitä. Yksikään TLR-reseptorien kautta vaikuttavista aineista ei kuitenkaan merkittävästi vaikuttanut neutrofiilin kykyyn ottaa patogeeni sisäänsä eikä estänyt neutrofiilien pinnan reseptorien ilmenemistä. 25. Endometrioosipotilaiden ja terveiden naisten kudosnäytteiden erot proteiinitasolla Anni Vehmas Ohjaajat: FT Anne Rokka, FT Garry Corthals MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Tutkimuksen perusteella endometrioosipotilaiden kohdun limakalvossa näyttäisi olevan vähemmän ohjattuun solukuolemaan, synnynnäiseen immuniteettiin, solun jakautumiseen ja verisuonten kasvuun liittyviä proteiineja. Aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että näiden tekijöiden epätasapaino voi olla yhteydessä endometrioosin kehittymiseen. Tutkimuksessa löydettiin myös kaksi proteiinia, jotka ilmenevät ainostaan tietyssä kudostyypissä. Toista proteiineista löydettiin ainoastaan munasarjan endometrioosinäytteistä ja toista kohdun limakalvonäytteistä, sekä niistä munasarjakudoksen osista, joissa oli endometrioosiin viittaavia kudosmuutoksia. Kudosten pintaproteiineja tutkimalla löydettiin myös kiinnostavia eroavaisuuksia terveen kohdun limakalvon ja endometrioosipotilaiden kohdun limakalvon välillä. Työssä tutkittiin endometrioosipotilaiden ja terveiden naisten kohdun limakalvo- ja munasarjan endometrioosikudoksen proteiineja kahdessa kuukautiskierron vaiheessa, yhteistyössä Turun Yliopistollisen Keskussairaalan ENDOMET tutkimusprojektin kanssa. Yhteensä kymmenen potilaan kohdun limakalvo- ja munasarjan endometrioosikudoksien proteiinit kartoitettiin massaspektrometriaan perustuvien menetelmien avulla. Työn tulokset tullaan lähitulevaisuudessa yhdistämään ENDOMET tutkimusryhmän luomaan endometrioosi-tietokantaan. Endometrioosi on yksi yleisimmistä naistentaudeista, jopa joka viidennen naisen arvioidaan kärsivän siitä. Endometrioosissa kohdun limakalvon rakenteita löydetään kohdun ulkopuolella, esimerkiksi munasarjoista. Sairaus voi aiheuttaa vaikeita alavatsakipuja ja lapsettomuutta. Uusia diagnostisia menetelmiä kaivataan, sillä endometrioosi voidaan varmasti todeta vain vatsaontelon tähystyksellä.
26. Ihmisen veren B-lymfosyyttien alaryhmien määrittäminen laskimoverestä Janne Atosuo Ohjaaja: LT, FM Jussi Kantele, Lääketieteellinen Mikrobiologia ja Immunologia, Turun Yliopisto B-Lymfosyytit ovat T-lymfosyyttien ja Luonnollisten tappajasolujen ohella yksi kolmesta lymfosyyttien pääryhmistä. B-solut syntyvät luuytimessä ja siirtyvät sieltä kypsymään imusolmukkeisiin ja kiertäviksi B-soluiksi verenkiertoon ja imusuonistoon. B-solut tuottavat vasta-aineita ja muodostavat tärkeän B-solumuistin, johon esimerkiksi rokotukset pääasiassa perustuvat. Kun elimistö kohtaa antigeenin, esim. mahdollisen taudinaiheuttajamikrobin, kypsymätön, tälle mikrobille spesifinen B-solu tunnistaa sen ja aktivoituu. B-solu aloittaa nopean jakautumisen, jonka tuloksena syntyy suuri määrä kyseiselle mikrobille spesifisiä B-soluja, joista osa alkaa tuottaa vasta-aineita mikrobia vastaan ja osa erikoistuu B- muistisoluiksi. Vasta-aineet kiinnittyvät mikrobin pintaan ja mm. nopeuttavat fagosytoosia. Fagosytoosissa veren syöjäsolut nielaisevat mikrobin ja tuhoavat sen sisällään. Muistisoluiksi erikoistuneet solut jäävät elimistöön odottamaan, jos taudinaiheuttaja tunkeutuu elimistöön uudestaan. Tällöin vaste on nopeampi ja tehokkaampi. Verenkierrosta löytyy B-lymfosyyttien kaikkia kehitysvaiheita kypsymättömästä naiivista B solusta B-muistisoluihin ja vasta-aineita tuottaviin B-soluihin. Eri kehitysvaiheessa olevien B-solujen pinnalla esiintyy erilaisia pintamolekyylejä, joiden perusteella solujen alaryhmiä voidaan määritellä. Virtaussytometrissä solut ohjataan kapean kanavan läpi solu kerrallaan. Havaitsimen ohi kulkiessaan niihin ohjataan lasersäde, jonka taittuminen ja solun läpi kulkeutuminen mitataan. Näin saadaan käsitys solun koosta ja sisäisestä rakenteesta Leimattuja vasta-aineita voidaan käyttää solujen pintamolekyylien merkkaamiseen, jotka voidaan havaita solujen kulkiessa lasersäteen ohi. Mittaustulokset analysoi tietokone. B-lymfosyyttien alaryhmien suhteellinen osuus ja solujen biologiset ominaisuudet antavat merkittävää tietoa erilaisten syöpä- ja autoimmuunisairauksien, infektioiden sekä allergioiden tutkimuksessa ja diagnoosissa.
27. Tyrnimarjan karotenoidit Auli Hänninen Ohjaajat: FM Heidi Leskinen, FT Baoru Yang ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Eri tyrnijalosteilla karotenoidien määrät marjoissa voivat vaihdella suuresti. Mitä punaisempi marja, sitä enemmän siinä on karotenoideja. Karotenoidien määrään ja laatuun kasveissa vaikuttavat mm. kasvupaikka, kasvuolosuhteet (veden, valon, ravinteiden ja lämmön määrä), kypsyysaste sekä sadonkorjuun ja säilytyksen olosuhteet. Lisäksi saman kasvilajin eri alalajeilla, lajikkeilla ja kannoilla voi olla erilainen karotenoidiprofiili. Osa karotenoideista on A-vitamiinin esiasteita ja lisäksi karotenoidit toimivat elimistössä antioksidantteina. Karotenoidien tutkimus on haastavaa, koska ne hajoavat tai muuntuvat hyvin helposti. Tärkeintä on saada menetelmästä tarpeeksi nopea ja hellävarainen, jotta karotenoidit pysyvät mahdollisimman muuttumattomina tutkimuksen aikana. 28. Marjojen terveysvaikutteisten yhdisteiden imeytyminen ihmiseen Outi Lehtinen Ohjaajat: FM Henna-Maria Lehtonen, FT Jukka-Pekka Suomela ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Erikoistyössä tutkittiin marjoissa esiintyvien yhdisteiden imeytymistä ja aineenvaihduntaa ihmisellä. Pienessä syöttökokeessa koehenkilöille annettu marja-annos oli 300g. Syöttökokeen yhteydessä kerättiin plasma-, virtsa- ja ulostenäytteitä. Koehenkilöt noudattivat ennen ja jälkeen koetta ruokavaliota, joka ei sisältänyt tutkittavia yhdisteitä. Näytteet analysoitiin menetelmällä, joka perustui yhdisteiden erottumiseen rakenteensa perusteella, sekä erottumisen jälkeen rakenteen pilkkoutumiseen. Tyrnin ja puolukan syönnin jälkeen koehenkilöiden virtsasta, ulosteesta ja plasmasta (erotettu verestä) löydettiin flavonoliyhdisteitä, joita myös kyseisissä marjoissa esiintyi. Plasmasta analysoitiin korkeimpia pitoisuuksia noin kahden tunnin kuluttua syömisestä. Ulosteista analysoitiin korkeimmat pitoisuudet vuorokauden kuluttua ja virtsasta puolen vuorokauden kuluttua syömisestä. Marjojen terveysvaikutuksia on tutkittu paljon. Todisteita niiden kyvystä vähentää riskiä sairastua kroonisiin sairauksiin on ilmennyt runsaasti. Tärkeä terveysvaikutteinen yhdisteryhmä marjoissa on flavonolit. Flavonolit esiintyvät luonnossa tavallisesti sokeriin liittyneinä johdannaisina, ja ihmiselimistössä niitä muokataan edelleen monimutkaisemmiksi rakenteiksi. Flavonoleja on analysoitu ihmisessä vain vähän näinä johdannaisrakenteina, vaikka näin saadaan uutta tietoa flavonolien imeytymistehokkuudesta ja aineenvaihdunnasta. Mm. flavonoliglukuronidi-johdannaiset
ovat yhdisteitä, joita ihmisen aineenvaihdunnassa muodostuu flavonolisokereista. Tässä erikoistyössä suurimpina pitoisuuksina plasmasta ja virtsasta löytyi juuri flavonoliglukuronidi-johdannaisia, ja ulosteesta flavonolisokerijohdannaisia. 29. Tyrnimarjasta tunnistettu uusi sokeri Marika Lassila Ohjaajat: FT Eila Järvenpää, dos. Baoru Yang ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Tutkimuksessa tyrnimarjan osoitettiin sisältävän erästä sokeria, joka ei ole ominainen marjoille. Kyseinen sokeri on perusrakenteeltaan inositoli eli ksylitolin kaltainen sokerialkoholi. Tunnistetulla sokerilla saattaa olla olennainen vaikutus niin tyrnin makuun kuin terveysvaikutuksiinkin. Tyrnin (Hippophaë rhamnoides L.) marjoilla on ainutlaatuinen ja vahva aromi. Hapoilla ja sokereilla on olennainen vaikutus makuun. Happo- ja sokeripitoisuudet vaihtelevat riippuen lajikkeesta. Marjat ovat yleisesti ottaen happamia ja vähäsokerisia, mutta sisältävät monipuolisesti suojaravinteita. Tyrnin maku saattaa kuitenkin rajoittaa terveydellisten ominaisuuksien hyödynnettävyyttä. Jotta voitaisiin ottaa tästä terveyspommista kaikki hyöty irti ja mahdollisesti vaikuttaa tyrnimarjan makuominaisuuksiin, on tärkeää tuntea marjan tarkka kemiallinen koostumus. Näytemateriaalina tutkimuksessa käytettiin kiinalaista alkuperää olevia tyrnimarjoja, koska kyseisen lajikkeen tiedettiin sisältävän tunnistamatonta sokeria kohtalaisen paljon. Marjanäyte esikäsiteltiin ja tyrnin sokerit erotettiin käyttäen liukoisuuksiin perustuvaa erotusmenetelmää. Tuntemattoman yhdisteen tunnistamiseen käytettiin useampia analyyttisen kemian menetelmiä. Marjanäytteen tuloksia verrattiin vertailuyhdisteisiin (kaupallisiin, puhtaisiin kemikaaleihin). Lopuksi tunnistettiin yhdisteen kolmiulotteinen avaruusrakenne. 30. Marjoista saatavien terveydelle edullisten yhdisteiden määrittäminen Milla Rantala Ohjaajat: FM Henna-Maria Lehtonen, FT Jukka-Pekka Suomela ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Marjoissa on todettu olevan paljon terveydelle edullisia yhdisteitä. Marjojen siniset ja punaiset värisävyt aikaansaavat antosyaniinit kuuluvat flavonoideihin. Flavonoidit on yhdistetty hapettumista ehkäiseviin reaktioihin. Tutkimukset ovat osoittaneet hapettumista ehkäisevien reaktioiden mm. vähentävän riskiä sairastua sydän- ja verisuonitauteihin sekä ehkäisevän syöpäsolujen muodostumista. Lisäksi niillä on tulehduksia ehkäiseviä vaikutuksia.
Tässä tutkimuksessa järjestettiin pienimuotoinen koe, jossa koehenkilöt söivät puolukoita. Heiltä kerättiin näytteitä ennen puolukoiden syömistä sekä kahden vuorokauden ajalta puolukoiden syömisen jälkeen. Erikoistyönä kehitettiin menetelmä, jolla virtsa- ja ulostenäytteistä tunnistettiin sekä puolukassa esiintyviä antosyaniineja että puolukan antosyaniineista ihmisen aineenvaihdunnassa muodostuvia yhdisteitä. Menetelmän avulla määritettyjen yhdisteiden pitoisuuksien muutoksia tarkkailemalla saadaan tietoa antosyaniinien käyttäytymisestä elimistössä. Marjojen syömisen jälkeen ihmisen aineenvaihdunnassa muodostuvia yhdisteitä määrittämällä saadaan tietoa mekanismeista, joiden kautta mm. antosyaniinit vaikuttavat elimistössä. Tämä on tärkeää, jotta flavonoidien terveydelle edullisia mekanismeja pystyttäisiin paremmin ymmärtämään. 31. Viljojen mykotoksiinien kvalitatiiviset ja semi-kvantitatiiviset testausmenetelmät Jenni Hankomäki Ohjaajat: FM Sari Rämö, FT Eila Järvenpää ja Prof. Rainer Huopalahti ELINTARVIKEKEMIA Mykotoksiinit ovat homeiden tuottamia myrkkyjä, jotka vaikuttavat haitallisesti ihmisten ja eläinten terveyteen. Suoritetussa tutkimuksessa testattiin erilaisia nopeita ja edullisia menetelmiä, joilla toksiinien määrää viljoista pystytään toteamaan. Käytettyjen testien tulokset vaihtelivat viljalajista riippuen. Kauran kohdalla kvalitatiiviset tulokset olivat oikeita, kun toksiinipitoisuus oli korkea. Matalissa pitoisuuksissa tulosten hajonta oli suuri. Ohralla puolestaan matalat toksiinipitoisuudet antoivat oikean positiivisen tai negatiivisen tuloksen. Myös semi-kvantitatiivisten entsymaattisten ELISA (Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) testien tulokset olivat riippuvaisia testattavasta viljalajista. Pikatestausmenetelminä käytettiin kvalitatiivisia, negatiivisen tai positiivisen tuloksen antavia liuskatestejä, sekä semi-kvantitatiivisia testejä, joissa tulokseksi saatiin toksiinin määrä kilossa. Kvalitatiivisista liuskatesteistä testattiin kahden eri valmistajan sivuvirtaustestiä, joiden tulos oli luettavissa kyseessä olevalle liuskalle suunnitellulla lukijalaiteella. Liuskatesteillä mitattiin deoksinivalenoli -pitoisuutta, ja testit suoritettiin jauhetusta viljanäytteestä tai karkeasti rikotusta jyvästä. Kolmen eri valmistajan kuoppalevyillä toteutettujen, semi-kvantitatiivisten entsymaattisten testien tulokset määritettiin kuoppalevylukijalla. Kuoppalevyillä testattiin kaikkien kolmen toksiinin määrittämistä. Kaikista käytetyistä näytteistä mykotoksiinipitoisuus oli määritetty kvantitatiivisesti kromatografisin menetelmin. Fusarium- sienten tuottamat mykotoksiinit, deoksinivalenoli (DON) ja tsearalenoni (ZEA) sekä Aspergillus- tai Penicillium- sienten mykotoksiini, okratoksiini A (OTA) ovat viime aikoina olleet mielenkiinnon kohteena EU:n näille toksiineille asettamien maksimiraja-arvojen takia. Raja-arvoja on asetettu viljatuotteille sekä raakaviljalle.