Virtsan mikroskopointi vs partikkelilaskimet Outi Malminiemi Labquality-päivät 8.2.2008
Menetelmät: mikroskopia Kammiolaskenta / peitinlasimenetelmä; vaaleakenttä- / faasikontrastioptiikka; ei värjäystä / supravitaalivärjäys Vakioitu peitinlasimenetelmä (LAKE): Sentrifugointi 5 min 400g Supernatantin poisto vakioidulla imulla, väkevöinti 20x Sakan värjäys Sternheimerin supravitaalivärillä 13 ul pipetoidaan objektilasille mikroskopointi peitinlasin alla faasikontrastioptiikalla, usean kentän keskimääräinen partikkelilukumäärä arvioidaan 2
Menetelmät: partikkelilaskimet Virtaussytometria Sysmex UF-100(i) ja UF-1000i Laitteet käyttävät eri fluorokromeja, UF-1000i mittausperiaatteita kehitetty edelleen Vuoden 2007 lopussa Suomessa käytössä 10 kpl UF-100(i) ja 8 kpl UF-1000i Hahmontunnistus Iris iq200 (Iris Diagnostics, USA) koestettu, ei tällä hetkellä rutiinikäytössä Suomessa 3
UF-100(i): toimintaperiaate, 1/4 Näytteen sähkönjohtokyky mitataan ja se laimennetaan - osmolaliteetti vakioidaan impedanssimittauksen optimoimiseksi -K 3 EDTA kelatoi amorfisen fosfaatin - lämmitys +37 asteeseen hajottaa amorfisen uraatin Solukalvot ja DNA värjätään fluoresoivilla väriaineilla (karbosyaniini ja fenantridiini). Sysmex UF-100i 4
UF-100(i): toimintaperiaate, 2/4 Valon sirontasignaalin korkeus -> koko (halkaisija) Fluoresenssisignaalin korkeus -> värjäytyvyys 5
UF-100(i): toimintaperiaate, 3/4 Fluoresenssisignaalin leveys -> värjäytyvän rakenteen pituus Sirontasignaalin leveys -> partikkelin pituus 6
UF-100(i): toimintaperiaate, 4/4 Impedanssisignaalin korkeus -> partikkelin tilavuus Sähkönjohtokyky -> näytteen (ioni)väkevyys 7
Näytteen esikäsittely, 1/2 Mikroskopia: a) sentrifugointi Virtsanäyte analysoitiin UF-100 -analysaattorilla ennen ja jälkeen sentrifugoinnin (5 min 400 g) Partikkelien saanto sakasta RBC WBC EC Lieriöt Bakt Ka - 2SD 0,3 0,46 0,58 0,63 0,19 Ka 0,58 0,73 0,84 0,88 0,39 Ka -+ 2SD 0,86 1 1,11 1,14 0,6 n = 87 (Hannemann-Pohl et al. 1999) Partikkelien saanto supernatantista RBC WBC EC Lieriöt Bakt Ka 0,39 0,22 0,05 0,21 0,46 n = 16-20 (Ishii et al. 2003) 8
Näytteen esikäsittely, 2/2 Mikroskopia a) Sentrifugointi Mahdollisia syitä huonolle saaliille epätäydellinen sedimentoituminen liuosfaasissa tarttuminen putken seinämiin hajoaminen b) Supernatantin poisto Vakioitu imu: CV vesi-imun kalibroinnissa 10-12% (LAKE) Dekantointi: CV 40% (Hannemann-Pohl 1999) c) Värjäys ja siirto objektilasille Vakioitu näytetilavuus Sysmex UF-100(i): ei esikäsittelyä 9
Mikroskopia: toistuvuus laskennassa Mikroskopian sisäinen laadunohjaus (LAKE): valikoitu näyte sentrifugoidaan, sakka värjätään ja fiksoidaan laboratoriohoitajat siirtävät lasille ja mikroskopoivat itsenäisesti (n=25-28) näyte tutkittavana jopa kuukauden ajan ERYT GRAN Ka, kpl/nk 3,0 11,5 4,9 10,9 21,8 Min 1 7 3 5 15 Max 7 16 8 18 30 CV% 57 21 30 26 17 Ka, kpl/ul 17 67 28 63 126 Partikkelit eivät jakaudu tasaisesti peitinlasin alle! Pitoisuus 1 /nk vastaa 5,8 /ul. Analysoitava näytetilavuus: nk lukumäärä x 0,17 ul/nk. UF-100: 9 ul Bakteerit vastataan sanallisena arviona: vähän, kohtalaisesti, runsaasti. 10
UF-100i: Toistuvuus laskennassa RBC WBC Ka, kpl/ul 5,4 22,8 212 4,5 17,9 1054 CV% 25 5 4 15 10 2 Min 3,9 21,3 196 3,8 14,5 1038 Max 7,8 24,4 223 5,8 20,5 1086 Ka, kpl/nk 0,9 3,9 37 0,8 3,1 182 EC BACT Ka, kpl/ul 2,6 10,5 1631 31354 CV% 22 10 6 4 Min 1,6 7,8 1525 29385 Max 3,4 11,4 1815 32925 Potilasnäytepoolit,10 rinnakkaisajoa, automaattinen näytteensyöttö (oma UF-100i-verifiointi) 11
UF-100 vs kammiolaskenta: RBC (Kouri et al. 1999) Kammiolaskenta: Sternheimerin värillä värjätty sentrifugoimaton virtsa tutkittiin 1 ul:n kammiossa sekä faasikontrasti- että vaaleakenttäoptiikalla, n = 269 UF-100, RBC /ul Kammiolaskenta, RBC /ul 12
UF-100 vs kammiolaskenta: WBC (Kouri et al. 1999) UF-100, WBC /ul Kammiolaskenta, WBC /ul 13
UF-100 vs vertailumenetelmät (Kouri et al. 1999) vs kammiolaskenta Korrelaatio Cut-off Herkkyys Spesifisyys RBC 0,880 10 /ul 82% 86% WBC 0,982 20 /ul 94% 91% Levyepiteelisolut 0,722 3 /ul 77% 72% Pienet epiteelisolut 3 /ul 73% 62% Lieriöt 3 /ul 67% 73% vs bakteeriviljely BACT >10 3 pesäkettä/ml 55% 90% (laitteen bakteerilaskenta muuttunut validoinnin jälkeen) 14
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) Laitehälytykset Tulosten tarkastelu partikkelipopulaatioiden sijainti koordinaatistoissa keltainen väri = tunnistamattomat partikkelit RBC, WBC kokojakaumat numeeriset näytekohtaiset mittasignaalien keskiarvot 15
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) Mikroskooppinen erittely: hiivaa runsaasti, Eryt 2 /nk, Gran yli 30 /nk 16
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) 17
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) RBC vanha näyte -> solut hajonneet hiiva, bakteerit, kiteet: väärät positiiviset / negatiiviset tulokset Hannemann-Pohl 1999: Oksalaattikiteitä 32 näytteessä 438:sta, näistä kolmelle (0.7% kaikista) lievästi kohonnut RBC-tulos UF-100:lla -> kemiallisen seulonnan ja partikkelilaskennan tulosten vertailu RBC vs kiteet erottelukyvyn säilyminen optiikan säätämisen yhteydessä -> näytevertailu samalla laitteella ennen-jälkeen tai kahden laitteen kesken, numeeriset tulokset ja tulosteiden tarkastelu 18
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) 19
Partikkelilaskennan ongelmia (UF-100(i)) 20
UF-100(i) bakteeriviljelynäytteiden seulonnassa Shine Young Kim et al. 2007, 330 avohoitopotilasta - BACT cut-off 3000 /ul -> - herkkyys 94,4% - spesifisyys 73,2% - 58% viljelyistä karsiutui pois - Ehdotus: BACT cut-off 1500 /ul -> - herkkyys 100% - spesifisyys 49,8% - 38,5% viljelyistä karsiutui 21
UF-100(i): bakteerilaskennan laadunohjaus Fsc2-parametri aproksimoi bakteeripopulaation keskimääräistä kokoa Fsc2-taso UFCheck-kontrolli (Sysmex) 80-90 ch potilasnäytteet 12-26 ch -> Kontrollimateriaali ei vastaa potilasnäytteiden bakteeriparametrin ominaisuuksia, eikä luotettavasti kontrolloi laskentaominaisuuksien pysyvyyttä. Muita kontrollointimahdollisuuksia kahden laitteen väliset vertailut potilasnäytteiden tulostasot pitkällä aikavälillä Seuraa bakteerilaskennan tulostasoa laserin vanhetessa optiikan säätämisen yhteydessä 22
Säilöntäaineputket partikkelilaskennassa (Kouri et al., KliinLab 1/2007) Kemiallisella seulonnalla positiivisiksi todetut TAYS:n potilaiden aamuvirtsanäytteet, n = 100 Säilytystavat: Säilöntäaineeton muoviputki, +20 C ( positiivinen kontrolli ) Säilöntäaineeton muoviputki, +4 C ( negatiivinen kontrolli ) Greinerin Vacuette Stabilur-putki (elohopeasuola), +20 C BD Plus C&S muoviputki (boorihappo-formiaatti-puskuri), +20 C Seurantamenetelmät ja -ajankohdat: UF-100 (+ Urisys 2400) Mikroskopia (vakioitu peitinlasimenetelmä) 0 h, 5 h, 1 vrk ja 3 vrk 0 h ja 3 vrk 23
Säilöntäaineputket partikkelilaskennassa Hylkäysrajat: UF-100 Säilytysaikainen pitoisuuden muutos +100% tai enemmän - 50% tai enemmän tai häiriöliputuksen ( Review flag ) ilmaantuminen Mikroskopia: arvioitiin solujen/partikkeleiden morfologiaa Hyväksyttävää oli poikkeama enintään 10%:ssa positiivisista näytteistä (tilastollisen sattuman välttäminen päätelmissä) 24
Tulokset: UF-100 Failure rates (%) in particle counting (Tampere study) Particle type / limit of positive result (x 10 6 /L) Followup time (h) Preservation procedure * Positive Negative Greiner control, control, + Stabilur +20 C 4 C tube BD Plus C&S plastic tube BD Plus UAP tube RBC 54 55 88 81 63 10 5 5 % 9 % 9 % 5 % 16 % 24 19 % 16 % 21 % 11 % 28 % 72 63 % 24 % 31 % 29 % 35 % WBC 63 60 64 61 45 10 5 2 % 0 % 0 % 0 % 5 % 24 11 % 4 % 2 % 4 % 14 % 72 38 % 4 % 8 % 18 % 23 % BACT 87 87 90 87 69 200 5 6 % 0 % 0 % 1 % 7 % 24 35 % 6 % 2 % 6 % 12 % 72 70 % 8 % 3 % 18 % 20 % 25
Tulokset: Mikroskopia Preservation of urine sediments at 3 days in visual microscopy False negative rates (%) were assessed at each of the three preservation limits graded as (a) well preserved, (b) fairly preserved, (c) almost degraded, and (d) all degraded Follow-up grading after 3 days d c b a Original grading d c b a Particle type / procedure False negative rate at each preservation level (%) d/c c/b b/a RBC 1. Positive control, no preservatives, +20 C 23 % 43 % 91 % 2. Negative control, no preservatives, + 4 C 21 % 29 % 83 % 3. Greiner Stabilur tube, + 20 C 8 % 10 % 78 % 4. BD Plus C&S plastic tube, +20 C 8 % 18 % 74 % No of samples initially a-c / no of all samples 52 / 71 Granulocytes 1. Positive control, no preservatives, +20 C 33 % 76 % 94 % 2. Negative control, no preservatives, + 4 C 12 % 53 % 87 % 3. Greiner Stabilur tube, + 20 C 5 % 43 % 100 % 4. BD Plus C&S plastic tube, +20 C 12 % 47 % 100 % No of samples initially a-c / no of all samples 58 / 71 26
Säilöntäaine ja UF-100 Liukenematon säilöntäaine aiheutti punasolutaustaa UF- 100-laskennassa Greiner Stabilur putkilla. RBC < 25 x 10 6 /l in non-preservative tubes, n = 44 80 y = 0.81 x + 23 70 60 Taustaa oli myös BD Plus C&S -putkilla, mutta vähäisemmässä määrin. Greiner Stabilur 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Non-preservative tube 27
Tulokset: säilyvyys U -Solut (virtaussytometria, UF-100) BD Plus C&S plastic 1 vrk Greiner Stabilur: RBC taustaa, WBC ja Bact OK 3 vrk U -Solut (visuaalimikroskopia) Greiner Stabilur 3 vrk BD Plus C&S plastic 1 vrk 28
Laboratoriotutkimukset munuaissairauksissa Laboratory Evaluation of Patients with Chronic Kidney Disease and Persons at Increased Risk for Chronic Kidney Disease* Laboratory Measurements Patients with Chronic Persons at Increased Kidney Disease Risk for Chronic Kidney Disease Serum creatinine to estimate GFR All All Albumin creatinine ratio in a All All random untimed urine specimen Examination of the urine sediment or dipstick All All for erythrocytes and leukocytes Imaging of the kidneys, All Selected patients usually by ultrasonography (symptoms of urinary tract obstruction, infection, or stones or family history of polycystic kidney disease) Evaluations recommended in this table are based on the opinions of the Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Work Group. GFR glomerular filtration rate. Levey et al. 2003, Ann Intern Med 2003;139:137-147 29
Virtaussytometrinen partikkelilaskenta UF-100(i)-laitteilla kliinisessä käytössä Virtsatieinfektion pikadiagnostiikka Bact, WBC Hematurian toteaminen (urologiset ja nefrologiset sairaudet) RBC Munuaissairauden toteaminen hematuria tubulusepiteelin solut, lieriöt -> visuaalimikroskopia Automatisoitu partikkelilaskenta yhdessä kemiallisen seulonnan kanssa: kahden eri periaatteeseen perustuvan menetelmän vahvuuksien yhdistäminen. 30