PMA STIMULAATION VAIKUTUS MONOMAC SOLUJEN MMP 9 JA MMP 2 TUOTANTOON

PMA STIMULAATION VAIKUTUS MONOMAC SOLUJEN MMP 9 JA MMP 2 TUOTANTOON Timo Ojanen Syventävien opintojen kirjallinen työ Tampereen yliopisto Biolääketieteen laitos Lääketieteellinen biokemia 03.2010

Tampereen yliopisto Lääketieteen laitos Lääketieteellisen biokemian tutkimusryhmä TIMO OJANEN: PMA STIMULAATION VAIKUTUS MONOMAC SOLUJEN MMP 9 ja MMP 2 TUOTANTOON Kirjallinen työ, 82 s. Ohjaaja: dos. Tiina Solakivi Maaliskuu 2010 Avainsanat: ateroskleroosi, ECM, migraatio, MMP aktivaatio, SMC, zymografia Tiivistelmä Ateroskleroottisessa valtimosairaudessa valtimoiden seinämän sisäkerrokseen, intimaan, kertyy lipoproteiinien mukana kolesterolia, josta vähitellen kehittyy ateroskleroosiplakkeja. Kolesterolin kertyminen on myös yhteydessä valtimon vaurioitumiseen ja tulehdusreaktioon. Verenkierrosta infiltroituu monosyyttejä valtimon seinämään, ja ne kypsyvät siellä makrofagi syöjäsoluiksi, jotka alkavat hapettaa intimaan kertyneitä lipoproteiineja ja syödä niitä, kunnes muuttuvat lipiditäytteisiksi vaahtosoluiksi. Makrofagit ja muut soluväliaineen läpi tunkeutuvat solut erittävät matriksimetalloproteinaasientsyymejä eli MMP:ja, jotka pilkkovat soluväliaineen kollageeneja. Makrofageja ja MMP 9 tyypin gelatinaasia esiintyy runsaasti kypsissä ateroskleroosiplakeissa, joilla on suuri taipumus revetä ja sen kliinisenä ilmentymänä aiheuttaa aivo ja sydäninfarkteja. PMA stimulaation vaikutus MonoMac solujen MMP 9 ja MMP 2 tuotantoon työssä tutkittiin tekijöitä, jotka vaikuttavat makrofaginkaltaisten solujen kasvuun ja gelatinaasieritykseen. MonoMac soluja kasvatettiin RPMI ja X VIVO pohjaisissa elatusnesteissä PMA:n vaikutuksessa. Solujen MMP eritys selvitettiin mediumeista tehtävillä SDS PAGE zymografioilla ja solujen kasvu proteiinimäärityksillä. Tulosten perusteella kasvutekijät muuttivat merkittävästi solujen reagointia PMA:n aiheuttamaan stimulaatioon. PMA lisäsi voimakkaasti MonoMac solujen prommp 9:n eritystä ja gelatinaasien aktivaatiota etenkin kasvutekijöiden läsnä ollessa ja heikensi solujen kasvua, jota kasvutekijät olivat lisänneet. MMP 2 aktivoi merkittävästi MMP 9:ää. Tulokset auttavat osaltaan selittämään makrofagien kerääntymistä tulehduspesäkkeisiin ja muuttuvaa reaktiota ateroskleroosiplakin kypsyessä.

SISÄLLYS sivu Käytetyt lyhenteet ja termit 6 1. TEORIAKATSAUS 7 1.1. Arterioskleroosi ja sen patologia 7 1.1.1. LDL, sen kertyminen ja hapettuminen 8 1.1.2. Fibroottisen plakin kehittyminen 9 1.1.3. MMP 9:n rooli, plakin seinämän heikkeneminen ja rupturoituminen 10 1.2. Anatomia, sytologia ja makrofagit 11 1.2.1. Ekstrasellulaarimatriksi ja sen rakenneosat 11 1.2.2. Solukontaktien merkitys 13 1.2.3. Makrofagit 13 1.3 Matriksin metalloproteinaasit 14 1.4. Metalloproteinaasientsyymien säätely 18 1.4.1. MMP:en aktiivisuuden käynnistys 18 1.4.2. Aktiivisuuden säätely 19 1.4.3. MT MMP 1:n rooli MMP 2:n aktivaatiossa (oligomerisaatiomalli) 22 1.4.4. Plasmiinin roolit ja MMP:en aktivaatio 23 1.4.5. Metalloproteinaasien inhibitio 24 1.4.6. PMA 26 2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 27 3. YLEISET METODIT 28 3.1. Reagenssit 28 3.2. Soluviljely 28 3.2.1. Käytetty solulinja 28 3.2.2. Käytetyt mediumit 29 3.2.3. Elatusnesteen vaihto 30 3.3. SDS PAGE zymografia 31 3.3.1. Mini PROTEAN II elektroforeesi 31 3.3.2. Geelien valmistus 32 3.3.3. Näytteiden valmistus 33 3.3.4. Näytteiden ajo 34 3.3.5. Värjäys 34 3.4. Proteiinimääritys 35 3.4.1. Näytteiden valmistus 35 3.4.2. Proteiinimäärityksen suoritus 36

4. TYÖKOHTAISET METODIT 37 4.1. Huomioita edeltävien tutkimusten perusteella 37 4.2. Seerumilaimennossarja 38 4.2.1. Tavoite ja aineisto 38 4.2.2. Zymografia 38 4.3. PMA:n vaikutus MonoMac 6 solujen metalloproteinaasieritykseen vertailu sileihin lihassoluihin 39 4.3.1. Tavoitteet 39 4.3.2. Soluviljely 39 4.3.3. Zymografia 39 4.4. MonoMac solujen aktiivisuus ajan funktiona 40 4.4.1. Tavoite 40 4.4.2. Soluviljelyt 41 4.4.3. Zymografia ja proteiinimääritys 41 4.5. Elatusnesteen vaikutus ja seerumittoman mediumin testaus 42 4.5.1. Tavoitteet 42 4.5.2. soluviljely 42 4.5.3. Zymografia 43 4.5.4. Proteiinimääritys 43 4.6. PMA konsentraation vaikutus MonoMac 6 solujen MMP tuotantoon eri elatusnesteissä 43 4.6.1. Tavoitteet 43 4.6.2. Soluviljely 44 4.6.3. Zymografia 45 4.6.4. Proteiinimääritys 45 4.7. Tutkimuksen virhelähteiden arviointi 45 5. TULOKSET 47 5.1. Seerumilaimennossarja 47 5.2. PMA:n vaikutus MonoMac 6 solujen metalloproteinaasieritykseen vertailu sileihin lihassoluihin 48 5.3. MonoMac solujen aktiivisuus ajan funktiona 49 5.3.1. Zymografia 49 5.3.2. Proteiinimääritys 50 5.4. Elatusnesteen vaikutus ja seerumittoman mediumin testaus 52 5.4.1. Soluviljelmien mikroskopointi 52 5.4.2. Zymografia 53 5.4.3. Proteiinimääritys 53 5.5. PMA konsentraation vaikutus MonoMac 6 solujen MMP tuotantoon eri elatusnesteissä 54 5.5.1. Soluviljelmien mikroskopointi 54 5.5.2. Zymografia 54 5.5.3. Proteiinimääritys 56

6. POHDINTA 58 6.1. Seerumin käyttö standardina 58 6.2. SMC:en vertailu MonoMac soluihin 58 6.3. FCS:n entsyymiaktiivisuus 59 6.4. Elatusnesteiden vaikutus MonoMac 6 solujen kasvuun ja MMPtuotantoon 60 6.5. PMA:n vaikutus MonoMac 6 solujen kasvuun ja MMP tuotantoon 61 6.6. MMP:en eritys ja aktivaatio 65 6.7. MMP:en inaktivaatio 66 6.8. MonoMac 6 solujen käyttäytyminen muuttuvassa kasvuympäristössä 67 Kiitokset 69 LÄHTEET 69 LIITTEET 71

Käytetyt lyhenteet ja termit APMA para aminofenyylielohopea asetaatti APS ammoniumpersulfaatti COX 2 syklo oksigenaasi 2 entsyymi EGF epidermaalinen kasvutekijä FCS sikiövasikan seerumi (käytössä myös lyhenne FBS: naudan sikiön seerumi) FGF fibroblastikasvutekijä IL 1β 1β tyypin interleukiini, tulehdusvälittäjäaine LDL matalan tiheyden lipoproteiini (eng. low density lipoprotein) M CSF makrofagien koloniaa stimuloiva faktori MMP matriksin metalloproteinaasi MonoMac monosyyttimakrofagi mrna lähetti RNA MT MMP kalvotyypin matriksin metalloproteinaasi PDGF verihiutalekasvutekijä PMA phorboli 12 myristaatti 13 asetaatti prommp matriksin metalloproteinaasin esimuoto RPMI soluviljelyssä käytetty elatusneste, ks. luku 3.2.2. SDS natrium dodekyylisulfaatti (eng. sodium dodecyl sulphate) SMC sileä lihassolu (eng. smooth muscle cell) TEMED N,N,N,N tetrametyylietyleenidiamiini TGF transformoiva kasvutekijä TNF α tuumorinekroositekijä alfa (olemassa mm. tyypit α ja β) TIMP metalloproteinaasien kudosinhibiittori t PA kudostyypin plasminogeenin aktivaattori u PA virtsan plasminogeenin aktivaattori X VIVO soluviljelyssä käytetty elatusneste, ks. luku 3.2.2. Käytettyjä termejä: Raita = Band (eng.) Kaista = Lane (eng.)

7 1. TEORIAKATSAUS 1.1. Ateroskleroosi ja sen patologia Ateroskleroosi (ja arterioskleroosi) on monitekijäinen valtimoiden patologinen reaktio, jossa ruumiin metabolisten ja tulehduksellisten reaktioiden seurauksena valtimon seinämään kertyy valtimoa ahtauttavia repeämäherkkiä kolesterolikertymiä sisältäviä sidekudosplakkeja. Se on kertymäsairaus ja sen myötä tiiviisti kytköksissä ikääntymiseen, elintapoihin ja geneettiseen alttiuteen. Ateroskleroosi voi johtaa valtimon suonittaman kudoksen hapenpuutteeseen ja esim. kroonisiin haavoihin, valtimon trombiin, läppävikoihin, tai jopa jäsenen kuolioitumiseen. Ateroskleroosin yleinen ja pelätyin ilmentymä on sydän tai aivoinfarkti. [1] Viime vuosien aikainen sepelvaltimotautikuolleisuuden aleneminen johtuu pääasiassa kolmen tärkeimmän riskitekijän vähentymisestä: seerumin kolesteroli, verenpaine ja tupakointi [2]. Ateroskleroosi alkaa valtimon sisäkerrokseen, intimaan kertyvistä lipoproteiinisista rasvajuosteista, joita voi esiintyä melko nuorella iällä (yli 15 vuotiailla). Verenkierron monosyytit tarttuvat näissä kohdissa endoteeliin ja tunkeutuvat intimaan. Intimassa monosyytit proliferoivat ja kypsyvät makrofageiksi. Makrofagit syövät intimaan kertyneitä lipoproteiineja kunnes ovat muuntuneet lipidipisaroiden täyttämiksi vaahtosoluiksi. Ajan mittaan vaahtosolut kuolevat ja vapauttavat sisältönsä ja syömänsä lipidit muodostuvaan nekroottiseen ytimeen. Joihinkin plakkeihin kertyy sileitä lihassoluja (SMC) verisuonen keskikerroksesta eli mediasta, ja nämä tuottavat sidekudosta plakin stabiloimiseksi. Plakki kasvaa uusien monosyyttien ja lipidien kertyessä verestä plakin reunoille sekä solujen jakautuessa ja tuottaessa lisää sidekudosta. Plakki muodostuu helpoimmin verisuonen mutkaan tai haara alueelle, jossa veren virtaus aiheuttaa epätasaista painekuormitusta tai pyörteilee. Näillä alueilla verisuonen sisäpintaa verhoavat endoteelisolut eivät ole järjestäytyneet virtaussuunnan mukaisesti ja niiden permeabiliteetti mm. LDL:lle (low

8 density lipoprotein) on muuta endoteelia korkeampi. LDL diffundoituu passiivisesti endoteelin läpi ja sen retentio suonen seinämässä riippuu liporoteiinien rakeneosan apoliproteiini B:n (apob) ja matriksin proteoglykaanien välisestä vuorovaikutuksesta. LDL:n kaltaisen lipoproteiini(a) molekyylin on etenkin havaittu olevan aterogeeninen, sillä se vaikuttaa fibrinolyysiin ja SMC:en kasvuun. [1] 1.1.1. LDL, sen kertyminen ja hapettuminen Valtimon seinämään kertynyt LDL muokkautuu ajan mittaan oksidaatiossa, lipolyysissä ja proteolyysissä ja kasaantuu paikallisesti, ja tämä muokkaus vahvistaa tulehdusreaktiota. Valtimon solujen aineenvaihduntatuotteet ja hajonneiden solujen jätteet hapettavat lipoproteiineja. Tämä tuottaa minimaalisesti hapettunutta LDL:a (minimally oxidized LDL), joka kiihdyttää tulehdusreaktiota mutta ei kuitenkaan aktivoi makrofagien kerääjä (scavenger) reseptorivälitteistä soluun ottoa. Lipidejä hapettava lipo oksygenaasientsyymi tuottaa runsaasti reaktiivisia happisidoksia sisältäviä lipidien metaboliittien välivaiheita, mikä edistää radikaalien muodostusta ja tulehdusaktivaatiota. HDL (high density lipoprotein) sen sijaan kuljettaa lipidejä pois suonen seinämästä sekä ehkäisee lipoproteiinien oksidaatiota eli toimii antioksidanttina. [1] Hapettunut LDL ehkäisee myös typpioksidin eritystä, minkä seurauksena suonen kyky relaksoitua vähenee ja taipumus korkeaan verenpaineeseen lisääntyy. (Ateroskleroosi on itseään kiihdyttävä prosessi.) Diabeteksen arvellaan voimistavan tulehdusherkkyyttä, sillä sokeroituminen muuttaa endoteelireseptorien toimintaa. Hapettunut LDL käynnistää endoteelisolut erittämään pinnalleen monosyyttien ja lymfosyyttien kiinnittymisproteiineja ja kasvutekijöitä kuten mm. makrofagien koloniaa stimuloiva faktori (M CSF), sekä kemotaktisia proteiineja (mm. monosyyttispesifinen MCP 1). Nämä proteiinit aktivoivat tulehdusreaktiota ja helpottavat leukosyyttien tarttumista valtimon seinämään tulehdusalueella. Endoteeliin kiinnittynyt leukosyytti kykenee sitten tunkeutumaan soluväleihin. M CSF stimuloi monosyyttien erilaistumista makrofageiksi, proliferaatiota ja makrofagien kerääjäproteiinien ekspressiota, joka edistää lipidien soluun ottoa. [1]

9 On näyttöä, että hapettunut LDL stimuloi makrofagien matriksin metalloproteinaasi 9 (MMP 9) tuottoa lisäämällä sen lähetti RNA:n (mrna) ekspressiota, proteiinisynteesiä ja proteaasin gelatinolyyttistä aktiivisuutta, ja näin mahdollisesti edistää ateroskleroosiplakin rupturoitumista [2]. Vaahtosolujen muodostuminen vaatii riittävän runsasta lipidien soluun ottoa makrofagin kerääjäreseptorin avulla, jota tapahtuu vasta kun LDL on voimakkaasti hapettunutta. Hapettumisen aiheuttavat endoteelisolujen ja makrofagien tuottamat reaktiiviset happituotteet ja radikaalit sekä entsyymit, kuten myeloperoksidaasi, sfingomyelinaasi sekä sekretorinen fosfolipaasi, joita esiintyy ateroskleroosiplakeissa. 1.1.2. Fibroottisen plakin kehittyminen Valtimoseinämän vaurioituessa seinämän SMC:t stimuloituvat lepotilasta proliferoimaan ja liikkumaan vaurioalueelle. SMC:en siirtyminen mediasta intimaan alkaa n. 3 vrk:ssa ja solujakautuminen johtaa verisuonen sisimmän kerroksen, intiman, hyperplasiaan. Rajallinen MMP:n eritys on solujen liikkumiselle tarpeellista, ja liikkumiseen yhdistyy ilmeisesti samanaikainen metalloproteinaasien kudosinhibiittorin (TIMP) eritys proteolyysin hallitsemiseksi. Vaskulaariset SMC:t ovat tiettävästi ainoita plakin soluja, jotka tuottavat plakin rakenteen kestävyyden kannalta tärkeitä kollageeni I ja III muotoja. Ateroskleroosiin liittyy intimahyperplasiaa, jolloin kollageenien ja elastiinin määrät ovat lisääntyneet mutta sidekudossäikeistö on huonosti järjestäytynyttä, huonosti joustavaa ja siihen kertyy rasva ja kalsiumhiukkasia. Kasvutekijöiden erittymiseen ja kudoksen hapenpuutteeseen viittaa uudissuonten muodostus. Runsaiden rasvakertymien ympäristössä esiintyy sidekudoksen kalkkeumaa ja kudosnekroosia. [1, 3] Kudoksen plasminogeeniaktivaattorientsyymin (t PA) välityksellä aterogeneesissä tapahtuu plakin kehityksen alkuvaiheessa hyperfibrinolyysiä ja loppuvaiheessa hypofibrinolyysiä. Alun t PA:n liikaeritys stimuloi SMC:en liikettä vauriokohtaan ja vaurion paikkausta solujakautumisella sekä verihyytymän hajotusta. Plakin kypsyessä lisääntyy t PA:n inhibitio ja t PA:n eritys vähenee. Hypofibrinolyysi lisää sidekudoksen paikallista kertymistä ja hyytymistaipumusta. [3]

10 Kollageenin ja proteoglykaanien kertyminen alkaa jo ennen MMP:en laskua. Voisi olla mahdollista, että tämä johtuisi plakin SMC:en vähentymisestä ja niiden MMP:en tuottoa ylläpitävän vaikutuksen loppumisesta. Verisuonen haava arpeutuu ja muuttuu fibroblastivaltaiseksi. Jos tällöin kudoksessa on vielä runsaasti makrofageja ylläpitämässä inflammaatiota, arpi ei muodostu kovin kestäväksi. Liiallinen inflammaatio hidastaa haavan paranemista ja lisää fibroosia. 1.1.3. MMP 9:n rooli, plakin seinämän heikkeneminen ja rupturoituminen Kypsissä plakeissa esiintyy kalkkeutumista (noin 40 %:ssa), vaahtosolukertymiä ja kolesterolisakkaumia. Plakki on histologisesti hyposellulaarinen. Koostumuksellisesti stabiilit ja epästabiilit plakit ovat hyvin samankaltaisia, ja on todennäköistä, että yksittäiset ja melko vähäiset tekijät aiheuttavat plakin epästabiloitumisen esim. elimistön tulehdusreaktion sivutuotteena. Akuutti sydänifarkti aiheutuu useimmin sepelvaltimon ateroskleroottisen plakin rupturoitumisesta, joka johtaa suonen tromboosiin ja valtimon tukkeumaan. Plakin repeämisen riskiä lisäävät sidekudosseinämän ohuus (kollageenin vähyys), valtimoperäisten SMC:en vähäinen määrä, suuri lipidikertymä tai plakin koko ja tulehdussolujen etenkin makrofagien suuri määrä. [1] Aineenvaihdunta on runsainta plakin reunoilla, jossa on myös runsaimmin makrofageja ja erittyy eniten MMP:ja. Epästabiileissa plakeissa kehittyy tulehdusrektio ja tulehdussolut ekspressoivat runsaasti HLA DR antigeenia, jota ei esiinny plakin ulkopuolella. Epästabiileissa plakeissa syklo oksygenaasi 2:n (COX 2), prostaglandiini E syntaasin (PGES) ja MMP 9:n ja 2:n määrä on korkeampi kuin stabiileissa, ja myös makrofagien määrä korreloi plakin oireilevuuteen. Makrofagit, mutta eivät juurikaan T lymfosyytit tai monosyytit, aiheuttavat määräriippuvaisesti apoptoosia karotisplakin, aortan ja sepelvaltimon media kerroksen SMC:issa. Makrofagien indusoima apoptoosi vaatii suoran solujen välisen kontaktin. Myös tulehdussolujen liukoiset sytokiinit (IL 1β, TNF α, interferoni gamma) indusoivat apoptoosia. SMC:en apoptoosi herkistää rupturoitumiselle.

11 Plakin repeäminen tapahtuu yleensä makrofagikertymän kohdalta, ja repeämispaikassa on usein myös T lymfosyyttikertymiä. Näille kohdille plakissa kohdistuu myös suurin verenpaineen aiheuttama rasitus. [1, 4, 5] Koronaaritautia sairastavien veren MMP 9 arvot ovat korkeammat kuin verrokeilla [2, 3]. MMP:lla onkin luultavasti keskeinen rooli plakin rupturoitumisessa. Vaahtosolujen tuottamat sytokiinit ja superoksidit stimuloivat MMP 1:n, 3:n ja 9:n ekspressiota ja MMP 2: ja 9:n aktivaatiota. Myös plakkialueelle migroivien ja proliferoivien SMC:en MMP 2:n, 3:n ja 9:n tuotanto on lisääntynyttä. [2] 1.2. Anatomia, sytologia, makrofagit 1.2.1. Ekstrasellulaarimatriksi ja sen rakenneosat Ekstrasellulaarimatriksin eli soluväliaineen päärakenneosat ovat interstitiaalinen sidekudos ja tyvikalvo. Kollageenisäikeet muodostavat sidekudoksen verkkomaisen perusrakenteen. Iho, jänne, luu, rustokudoksen ja nivelsiteiden orgaanisesta materiasta jopa 90 % on kollageenia ja sitä on runsaasti myös verisuonten seinämässä. Nisäkkään proteiineista 25 % on kollageenia. Kollageenimolekyyli muodostuu kolmesta α ketjusta, jotka asettuvat kierteeksi. Kollageenimolekyylit muodostavat säikeitä, paksumpia kuituja, mikrofilamentteja, verkkoja ja levyjä. Säiemuodostus tapahtuu kovalenttisilla ristisidoksilla. Säikeet asettuvat yleensä rasitusvoimien suuntaisesti luomaan veto ja puristuslujuutta kudokselle. Toistaiseksi on tunnistettu 19 eri kollageenityyppiä. Kollageeni on kestävä molekyyli ja sen hajotukseen kykenevät proteinaasientsyymeistä lähinnä kollagenaasit. Kuituisissa kollageenityypeissä on vain yksi kohta molekyylissä, johon kollagenaasi kykenee tarttumaan, mutta pilkkominen tästä kohdasta purkaa molekyylin kolmoiskierteen. Tätä osin hajonnutta kollageenia nimitetään gelatiiniksi, jota gelatinaasit ja useimmat laajakirjoiset proteinaasit kykenevät pilkkomaan.

12 Kollageenisäikeiden väleissä on amorfinen geelimäinen massa, joka koostuu pääosin glykosamino ja proteoglykaaneista, jotka ovat sitoneet itseensä vesimolekyylejä. Tyvikalvot erottavat parenkymaalisia, epiteliaalisia ja endoteliaalisia solukerroksia alla olevasta sidekudosstroomasta. Tyvikalvo muodostaa päällään olevan solukon tuki ja kiinnittymispinnan, säilyttää kudosrakennetta ja valikoivasti päästää lävitseen eri molekyylejä. Tyvikalvo koostuu pääosin IV tyypin kollageenista, laminiinista, entaktiinista, SPARC proteiineista ja proteoglykaaneista. Yksittäinen kollageeni IV molekyyli on joustava sauva, jonka α ketjut (rakenne α 1 (IV) 2 α 2 (IV)) ovat rinnakkain ja kolmoiskierre katkonainen. Ne muodostavat verkon joko neljän molekyylin sitoutuessa yhteen tetrameeriksi aminopäästään ja toisiin molekyyleihin karboksipäistään tai molekyylin varren rikki tai ristisidoksilla, joiden avulla muodostuu epäsäännöllinen kolmiulotteinen verkko. Tyvikalvon laminiiniproteiinit toimivat solujen kiinnittymiskohtina tyvikalvoon. Suuri osa ekstrasellulaarimatriksin kollageenirakenteista, esim. säikeet ja epäsäännöllinen verkko, muodostuu itsestään kollageenimolekyylien sitoutumistaipumusten mukaisesti, mutta esim. tyvikalvon muodostuminen vaatii solukontaktin. Valmiin lepotilaisen terveen kudoksen kiinteiden rakenneosien muokkautuminen on hidasta; kollageenin puoliintumisaika on useita kuukausia ja elastiinin vuosia, mutta proteoglykaanien vaihto on jatkuvaa ja kestää päivistä viikkoihin. [6, 7] Ekstrasellulaarimatriksin rakenneosia tuottavat fibroblastit erittävät jatkuvasti MMP 2 entsyymin esimuotoa (prommp 2), joka sitoutuu ja varastoituu ekstrasellulaarimatriksiin. Näin ekstrasellulaarimatriksi sisältää jatkuvasti valmiuden pilkkoa itse itseään, jos jokin ulkoinen tekijä, esim. eritetty tai tunkeutuvan solun pintamolekyyli, aktivoi metalloproteinaasin. Matriksin koostumus vaikuttaa siinä olevien solujen reaktiivisuuteen. Ekstrasellulaarimatriksi sitoo mm. kasvutekijöitä, mikä estää niiden leviämistä kudoksessa. Kasvutekijä voi olla aktiivinen sitoutuneena, mutta osa vapautuu vasta matriksia pilkottaessa. Näin kasvutekijää sisältävä kudos voi toimia invasoivalle solulle paikallisena kemotaksina, sillä kasvutekijä edistää matriksiin sitoutuvan solun tunkeutumista syvemmälle. Kullakin solutyypillä on erilainen tarttumis ja leviämiskyky eli kollageenityyppeihin, ja kollageeni, proteoglykaanit tai matriksiin sitoutuneet molekyylit voivat toimia jollekin solutyypille kuten kasvutekijäsignaali. [8]

13 1.2.2. Solukontaktien merkitys Solujen toiminnan kannalta niiden solujenväliset kontaktit ja mahdollisuus kiinnittyä tai ankkuroitua kudoksen tukirakenteisiin, yleensä ekstrasellulaarimatriksin kollageeniin tai tyvikalvoon, on tärkeää. Ilman solujen välistä kontaktia tai soluja ylläpitävää kemiallista signaalia solut päätyvät apoptoosiin eli ohjelmoituun solukuolemaan. Ilman kiinnittymispintaa tai pintareseptorien stimulaatiota solut menettävät rakenteelliset ominaisuutensa. Kiinnittymispisteiden puuttuessa solun mikrotubulustukirakenneverkko purkaantuu, solu pyöristyy ja inaktivoituu ja saattaa menettää jopa erikoistumisensa ja normaalin reagointinsa kasvutekijöiden herätteeseen. Tämä on huomioitava seikka soluviljelmissä, joissa solujen luontaiset tukipinnat yleensä puuttuvat. Integriinit (transmembraaninen glykoproteiini) ovat tärkeitä solukalvon adheesioreseptoreita. Tekijöillä, joilla on vaikutus tukirakenneverkkoon, kuten MMP:llä, on suuri merkitys kudoksen solujen rakenteelle, toiminnalle ja proliferaatiolle. Tätä kautta MMP:illa on kyky periaatteessa missä tahansa kudoksessa paikallisesti muuttaa ja jopa ehkäistä mutta myös mahdollistaa solujen normaali toiminta. 1.2.3. Makrofagit Makrofagit ovat mononukleaarisia valkosoluja ja osa elimistön immuunipuolustusta. Makrofagit toimivat joko kudosmakrofageina, jolloin ne ovat paikallaan kudoksen seinämässä ja siivilöivät ohi virtaavasta kudosnesteestä tai verestä elimistölle vieraaksi tunnistamiaan partikkeleita ja mikrobeja, tai ne kiertävät veressä monosyytteinä, jolloin joutuessaan tekemisiin tulehdusvälittäjäaineiden kanssa ne tunkeutuvat kudokseen, jossa ne jakautuvat ja kypsyvät makrofageiksi. Makrofagit ovat suurikokoisia syöjäsoluja, jotka fagosytoosin avulla kurovat sisäänsä vierasesineitä, myrkkyjä, mikrobeja, hajonneiden solujen kappaleita ja soluvälitilaan kertyvää jätettä. Makrofagi hajottaa syömänsä kappaleet lysosomiensa hydrolyyttisillä entsyymeillä ja happiradikaaleilla tai varastoi hajoamattomat kappaleet sisäänsä pysyvästi. Makrofagit ovat yksi tärkeimmistä solutyypeistä kroonisen tulehdusreaktion käynnistymisessä ja ylläpidossa.

14 Ekstrasellulaarimatriksin proteolyyttinen hajotus on osa useita fysiologisia prosesseja, esim. kudoksen muokkaus, haavan paraneminen, solujen liikkuminen ja invaasio, tulehdukset jne. Makrofageilla on kyky hajottaa ekstrasellulaarimatriksin kaikkia makromolekulaarisia rakenneosia erittämiensä proteolyyttisten entsyymien avulla, joista tärkeimpiä ovat metalloproteinaasit. Makrofagien eniten tuottamia proteinaaseja ovat interstitiaalinen kollagenaasi, 92 kda gelatinaasi (MMP 9) sekä stromelysiini, ja osin myös 72 kda gelatinaasi (MMP 2). Pääosin solut erittävät välittömästi valmistamansa MMP:n, mutta jossain määrin neutrofiilit ja makrofagit kykenevät myös varastoimaan MMP:a solunsisäisesti [3, 9]. Ne eivät varastoi MMP 9:ää, jolloin intrasellulaarisesti havaittu metalloproteinaasi tai MMP 9:n mrna:n esiintyminen viittaa aina synteesiin [5]. Makrofagien MMP 9:n ja 2:n erityksen käynnistys tapahtuu solussa prostaglandiini E2:n ja syklisen adenosiinimonofosfaatin (camp) välityksellä. COX 2:n induktio monosyyteissä lisää niiden prostaglandiini E:n ja siten myös MMP:en tuottoa. [10] 1.3. Matriksin metalloproteinaasit Matriksin metalloproteinaasit ja niitä säätelevät kudosinhibiittorit (TIMP:t) vaikuttavat ekstrasellulaarimatriksin määrään ja kierrätykseen sekä lisäksi kontaktissa olevien solujen elossa säilymiseen, erilaistumiseen, adheesioon ja liikkumiseen. Soluväliaineen määrä on herkässä tasapainotilassa, jossa liiallinen hajotus johtaa kudostuhoon ja liian vähäinen hajotus erilaisiin paikallisiin plakkeihin, arpiin ja kertymäsairauksiin. Solun liikkumiseen on tarpeen vain kollageenisäikeiden hajotus solun itsensä viereisestä perisellulaaritilasta ilman laajaa kudosrakenteen vaurioittamista. Ekstrasellulaarimatriksi toimii myös kasvutekijöiden varastona. Kasvutekijät vapautuvat matriksin proteolyysissä ja aktivoivat solut korjaamaan vauriota. Elimistössä useat solut käyttävät MMP:ja. MMP:en tuotanto on tärkeä osa haavan paranemista, ja niitä erittävät keratinosyytit, fibroblastit sekä endoteelisolut. MMP:en liikatuotanto liittyy joihinkin patologisiin tiloihin, kuten nivelreumaan kroonisiin haavoihin ja ientulehdukseen. [6]

15 Solun liikkumiseen ja invaasioon tarvitaan kolme vaihetta: tarttuminen, paikallinen proteolyysi ja migraatio. Invaasio vaatii kykyä ylittää tai ohittaa rakenteellisia esteitä kuten tyvikalvo, soluvälitilan strooma ja solujen väliset liitokset. Elimistön normaalit solut käyttävät invaasiota fysiologisena tunkeutumismuotona kudokseen esim. angiogeneesissä, trofoblasti invaasiossa sekä neutrofiilien ja makrofagien liikkuessa kudoksessa. MMP:en toiminta on välttämätöntä kasvainsolujen sekä oletettavasti myös normaalien solujen tunkeutumiselle soluväliaineen halki [7]. Rakenteeltaan matriksin metalloproteinaasit ovat Ca 2+ :n aktivoimia sinkkiendopeptidaaseja [3]. Kaikkien metalloproteinaasien rakenne on melko samankaltainen. Molekyylin aminopäässä on hydrofobinen signaalijakso MMP 17:aa lukuunottamatta kaikilla, ja tämän vieressä n. 10 kda:n kokoinen globulaarinen propeptidialue ( domain), joka irtoaa molekyylin aktivaatiossa. Sen vieressä on molekyylin ydinosassa katalyyttinen osa, jossa on sinkki ionin ja kalsiumionien sitoutumispaikat. MMP 2:n ja MMP 9:n katalyttisessä osassa on vastaavat kolmoistoistojaksot kuin fibronektiinin II tyypin kollageenin sitomisosassa, joiden avulla ne kykenevät sitoutumaan kollageniin ja gelatiiniin, ja se mahdollistaa myös elastiinin pilkkomisen. Katalyyttisen osan vieressä on lyhyt proliinipitoinen sarana alue, joka on suurin MMP 9:llä (rakenne on vastaava kuin kollageeni V:n α2 ketju). Sarana liittää molekyyliin hemopeksiinin tai vitronektiinin kaltaisen alueen, joka määrää MMP:n substraattispesifisyyden ja TIMP:ien sitoutumiskyvyn MMP:iin. Hemopeksiinin kaltainen alue sijaitsee molekyylin hiilipäässä. Siinä on neljä neljästä käänteisrinnakkaisesta nauhasta ja yhdestä α kierteestä koostuvaa lapaa. Hemopeksiinialue on välttämätön, jotta MMP kykenee pilkkomaan kolmoiskierteistä interstitiaalikollageenia. Kalvotyypin MMP:en (MT MMP) hiilipäissä on vielä noin kahdenkymmenen hydrofobisen aminohapon transmembraanialue ja 24 aminohapon intrasellulaarialue. [6, 9, 11] Kaikissa MMP:issa alue, joka ympäröi proosassa kysteiiniä (proteiinirakenne (K)PRCGV/NPD(V)) sekä katalyyttisen alueen sinkkiä sitova jakso (HEXGHXXGXXH), eli pro osan ns. kysteiinikytkin ja entsyymin aktiivikohta, ovat MMP:en välillä lähes samat [12].

16 Rakenteensa ja substraattinsa perusteella MMP:t luokitellaan neljään luokkaan: (interstitiaaliset) kollagenaasit, gelatinaasit, stromelysiinit ja kalvotyypin MMP:t. Fibroblastikollagenaasia erittyy lähes kaikista solukoista. Kollagenaasit (MMP 1, 8 ja 13) kykenevät pilkkomaan säikeistä kollageenia α ketjujen spesifistä kohdasta (Gly 775 Ile/Leu 776 ). Ne pilkkovat ketjun ¾ N päästä ja ¼ C päästä kokoisiksi paloiksi. Nämä denaturoituvat spontaanisti gelatiiniksi 37 C:ssa ja ovat sitten alttiita gelatinaasien vaikutukselle. On havaintoja, että myös MMP 2 ja MT MMP:t kykenevät pilkkomaan säikeistä kollageenia ¾ ja ¼ paloiksi. [12] Tässä työssä keskityttiin vain gelatinaasien, eli MMP 9:n ja MMP 2:n tarkasteluun. Gelatinaasit, eli 72 kda:n kokoinen tyypin IV kollagenaasi (MMP 2) sekä 92 kda:n tyypin IV kollagenaasi (MMP 9) hajottavat denaturoituja kollageeneja eli gelatiineja, perusmuotoisia kollageeneja tyyppiä II, IV, V, VII, X ja XI, fibronektiinia, vitronektiinia, elastiinia ja aggrekaania. Taulukko 1: Gelatinaasityypit Gelatinaasit / Tyypin IV kollagenaasit Entsyymi MMP Massa (kda) Substraatit (matriksikomponentit) 72 kda gelatinaasi MMP 2 72 gelatiinit, kollageenit (I), IV, V, VII X ja XI, elastiini, fibronektiini, PGyp 92 kda gelatinaasi MMP 9 80. (92) gelatiinit, kollageenit IV ja V, elastiini, PGyp Substraatit (muut) prommp 1*, 2*, ( 9)*, 13*, plasminogeeni, a2m, protnf alfa, proil1 beta plasminogeeni, a2m, protnf alfa, proil1 beta Muokattu lähteistä [6, 9, 12]. (Suluissa eritettyjen glykosyloituneiden MMP:en molekyylipainot.) Käytetyt lyhenteet: PGyp = proteoglykaanin ydinproteiini, a2m = α2 makroglobuliini. *= seurauksena kollagenaasi ja gelatinaasiaktivaatio Taulukko 2: Gelatinaaseja erittävät kudokset Gelatinaasit / Tyyppi IV kollagenaasit MMP Erittävä kudos/solukko MMP 2 fibroblastit, kondrosyytit, endoteeli, keratinosyyti, monosyytit, muuntuneet solut MMP 9 keuhkoalveolien makrofagit, granulosyytit, osteoklastit, keratinosyytit, trofoblastit, syöpäsolut (mutta ei fibroblastit) Muokattu lähteestä [6].

17 MMP 9: MMP 9 on tyypin IV kollagenaasi (gelatinaasi B). ProMMP 9 on hyvin stabiilia. Se säilyttää proteolyyttisen aktiivisuutensa toistuvien jäädytysten ja sulatusten jälkeen ja kestää säilytystä pitkiä aikoja 20 C:ssa ilman heikkenemistä tai autoaktivaatiota [13]. Tavallisimmat MMP 9:ää erittävät solut ovat (alveolaariset) makrofagit, granulosyytit, osteoklastit, keratinosyytit, invasoivat trofoblastisolut, sekä kasvainperäiset solut. Normaalioloissa fibroblastit eivät eritä MMP 9:ää. MMP 9 eritetään glykosylodussa 92 kda pro muodossa, ja pilkkoutunut aktiivimuoto on n. 84 kda:n kokoinen [6]. MMP 9:n aktivaatio voi tapahtua plasmiinin avulla, fibroblastien välittämänä ja MMP 3:n ja MMP 13:n avulla [3]. [6, 14, 15] MMP 2: Myös MMP 2 on IV tyypin kollagenaasi (gelatinaasi A). Kollageeni IV on keskeinen tyvikalvon rakenneosa. Endoteelisolut ja fibroblastit ovat MMP 2:n päätuottajia. Fibroblastit varastoivat MMP 2:a perisellulaarimatriksiinsa. Myös sileät lihassolut tuottavat runsaasti MMP 2:a [15]. MMP 2:n eritys on tyypillistä myös maligneille soluille ja se korreloi näiden invasiivisuuden ja metastaasitaipumuksen kanssa. Alun perin MMP 2 löydettiinkin juuri syöpäsoluista. MMP 2:n hemopeksiinin kaltainen alue tarvitaan, jotta MT MMP 1 kykenee aktivoimaan prommp 2:n solukalvolla [11]. MMP 2:n aktivaatio tapahtuu kaksivaiheisesti ensin MT MMP:n pilkkoessa proentsyymin 64 kda:n kokoiseksi välimuodoksi, joka pilkkoutuu autoprotolyyttisesti 62 kda:n aktiivimuotoon. Plasminogeeni tehostaa MMP 2:n välimuodon pilkkomista. [3] On havaintoja, että fibroblastien tuottama tyypin IV kollagenaasi (MMP 2) poikkeaa rakenteeltaan ja immunologisesti makrofagien ja granulosyyttien erittämästä MMP 2:sta, ja näiden molekyylipainot ovat 66 72 kda sekä 94 97 kda kullakin. Niiden substraattispesifisyydet ovat kuitenkin identtiset. Vastaavaa aktiivisuutta on havaittu 130 kda:n ja 225 kda:n molekyyleillä. [16]

18 Gelatinaasien esiintyminen verenkierrossa: Ihmisen veressä esiintyy fysiologisesti 72 kda:n (fibroblastiperäinen) ja 92, 130, sekä 225 kda:n (neutrofiiliperäisiä) gelatinaaseja (suuret gelatinaasikomplekseja) [17]. Tavallisesti veressä kiertävä MMP 2 ja MMP 9 esiintyvät pro muodossaan, mutta (tutkimuksessa paksusuolen ) syöpäpotilailla veressä ilmeni myös aktiivimuotoa ja etenkin prommp 9:n määrä oli koholla [14]. Kudoksen paikallinen MMP 9:n määrä ja aktivoituminen lisääntyvät tulehduksellisissa prosesseissa, valtimoaneurysmissa sekä solukon muuttuessa pahanlaatuiseksi [9, 14]. MMP 9:n määrää verenkierrossa voidaan käyttää epäspesifinä tulehdusmerkkiaineena [2]. 1.4. Metalloproteinaasientsyymien säätely 1.4.1. MMP:en aktiivisuuden käynnistys Solut erittävät MMP:t latentissa pro muodossa, joka on n. 10 kda suurempi kuin aktiivimuoto. Myös pro muodolla on vähäinen proteolyyttinen aktiivisuus ja jo aktivoitunut entsyymi voi pilkkoa omaa esimuotoaan. Autoaktivaatiossa metalloproteinaasissa tapahtuu muodonmuutos ja pro osa pilkkoutuu itsestään. Metalloproteinaasin aktiivisessa kohdassa on sinkki ioni. Rakenteellisesti pro osa estää metalloproteinaasin aktiivisuuden kysteiini Zn 2+ sidoksella (pro osan parittomalla kysteiinipäällä) joka taivuttaa pro osan molekyylin aktiivikohdan päälle. Sidoksen muodostus vapauttaa vesimolekyylin ja sellainen tarvitaankin molekyylin aktivoimiseksi jälleen, eli prosessi vaatii vesiympäristön. Tätä kysteiinikytkintä muistuttavat rakenteet jotka sitoutuvat Zn ioniin tai kytkimen sulkijat voivat toimia metalloproteinaasi inhibiittoreina. Kysteiini Zn 2+ sidoksen avaaminen kemiallisesti tai fysikaalisesti (jodiasetaatit, reaktiiviset suolat esim. kaliumjodidi ja natriumsyanidi, elohopeayhdisteet, rikkivedyt, detergentit, APMA, SDS, urea, hapettimet, hapan ph, lämpökäsittely) tai kysteiinipään pilkkoontuminen (mm. trypsiini ja plasmiini) johtaa metalloproteinaasin autolyyttiseen aktivoitumiseen. Elimistön fysiologiset aktivaattorit, mm. plasmiini ja stromelysiini, pilkkovat proteolyyttisesti pro osan, jolloin aktivaatio on pysyvä. Tulehdusreaktiossa vapautuvat ja mm. neutrofiilien ja makrofagien

19 erittämät happiradikaalit voivat reagoida MMP:en kanssa ja aktivoida ne. Aktivaattorin vaikutus kuhunkin MMP:iin vaihtelee molekyylin mukaan. Interstitiaalikollagenaasit, stromelysiinit ja MMP 9 aktivoituvat herkimmin liukoisten entsyymien, kuten plasmiinin, neutrofiilielastaasin ja kymaasin avulla. [6, 9] Metalloproteinaasit osallistuvat myös toistensa aktivaatioon keskinäisen proteolyysin tai autolyysin (itsepilkkominen) kautta. Stromelysiini ja matrilysiini kykenevät aktivoimaan prokollagenaasin ja MMP 9:n ja 2:n progelatinaasit. Stromelysiinin aktivoima kollagenaasi on 4 7 kertaa aktiivisempaa kuin autolyyttisesti APMA:n tai plasmiinin aktivoimana muodostunut ( superaktivaatio ), eli pilkkoutumistavalla ja kohdalla on suuri vaikutus. Stromelysiini (MMP 3) tuottaa voimakkaimman toistaiseksi tunnetun kollagenaasin aktiivisuuden [9]. Esim. urokinaasin kaltainen plasminogeeniaktivaattori (u PA) muodostaa aktivaatioketjun, jossa sen plasminogeenista aktivoitu plasmiini pilkkoo sekä prokollagenaasia että prostromelysiiniä, jolloin stromelysiini suoraan alkaa superaktivoida kollagenaasia. Trypsiiniaktivoitu fibroblastikollagenaasi voi aktivoida prommp 2:n, ja näin aktivoitu MMP 2 pilkkoo kollagenaasin superaktiiviseen muotoonsa. MMP 2 kykenee aktivoimaan prommp 9:n. Korkeilla pitoisuuksilla käynnistyy myös prommp 2:n autolyyttinen aktivoituminen. Myös makrofagien erittämä stromelysiini aktivoi proteolyyttisen kaskadin tapaan MMP 9:ää (pro osan pilkkoutuminen). MMP 9 kykenee hajottamaan kollageeni IV, V ja XI tyyppejä, gelatiinia (denaturoitu kollageeni), proteoglykaaneja ja elastiinia. Proteoglykaanit ja elastiini ovat stromelysiinin ja interstitiaalisen kollagenaasin hajoitusvaikutukselle resistettejä. 1.4.2. Aktiivisuuden säätely MMP:en aktiivisuuden säätely tapahtuu useaa kanavaa: geenitranskription, mrna:n stabiliteetin, erityksen, proentsyymin aktivaation ja inhibiton kautta. Fibroblastikollagenaasin, stromelysiinin ja MMP 9:n määrän ja aktiivisuuden säätely tapahtuu enimmäkseen geeniekspression säätelyn avulla. Kasvutekijöillä on suora vaikutus solun geeniekspression määrään. Neutrofiilien sekretorisiin granuloihin varastoituneen ja jo aiemmin syntetoidun MMP 8:n ja 9:n erityksen säätely tapahtuu

20 lähiympäristön kemiallisten stimulusten vaikutuksesta (transkriptiolla ei ole vaikutusta) kohdekudoksessa. Transkription säätely: Kasvutekijät, kuten EGF, bfgf sekä PDGF, ja tulehdussytokiinit, kuten TNF α sekä IL 1 ja PMA, voivat kiihdyttää transkriptiosäätelylle herkkien MMP:en (fibroblastikollagenaasi, stromelysiini 1 sekä joissain tapauksissa MMP 7, 9, 10 ja 11) mrna tuotannon 20 50 kertaiseksi. Näiden MMP:en geenien promoottorialueella on yhteinen välittäjäaineen sitoutumiskohta ns. TPA responsiivinen elementti (TRE, reagoi 12 O tetradekanoyyliphorboli 13 asetaattiin, eli PMA:an), joka sitoo AP 1 transkriptiotekijäkompleksin. Transkription määrään vaikuttavat transkriptiotekijöiden määrät, niiden muodostus ja hajotus, muodonmuutokset, vaikutukset geenien laskostumiseen ja keskinäiset vuorovaikutukset ja kompleksinmuodostus. [6] Lueteltuna MMP 9:n ja 2:n geenien promoottorialueiden rakenne koostuu seuraavasti 5 ketjusta luettuna. MMP 9:n transkription aloituskohta +1:ssä, TATA box 29:ssä, GT box 68:ssa, TRE 79:ssä, CACA alue 90:sta 131:een, TIE 474:ssä, TRE 533:ssa, GCbox 563:ssa, NFκB 600:ssa, TRE 1651:ssa, promoottorin päätös 2170:ssä. MMP 2:lla +157:ssä AP 2 alue, transkription aloituskohta +10:ssä ja +1:ssä, GC box 69:ssä ja 89:ssä, hiljennysjaksot (silencer) 1600:ssa ja 1620:ssa, AP 2 alue 1650:ssa, promoottorin päätös 2400:ssa. TATA box on geeniluennan alotukseen liittyvä merkkialue. GT ja GC box:it ovat guaniini tymiini ja sytosiini emäksiä vuorotellen sisältäviä toistojaksoalueita, jotka voivat toimia aktivaattorin tai inhibiittorin sitoutumispaikkoina. CACA alue on 42 emäsparin sytosiini adeniinitoistoalue. NFκB ja AP:t ovat aktivaattorispesifejä sitoutumispisteitä. NFκB ja GC box (Sp 1 alue) ovat MMP 9:n promoottorissa PMA:n ja TNF α:n vaikutuksen induktiokohtia. [6] Kasvutekijät ja sytokiinit vaikuttavat lisäksi pidentämällä mrna:n puoliintumisaikaa. Edellä mainittujen kasvutekijöiden lisäksi KGF ja TGF β lisäävät metalloproteinaasitranskriptiota. Myös hormonit, onkogeenit, tuumoripromoottorit, hepariini sekä kontakti ekstrasellulaarimatriksiin voivat voimistaa tai heikentää transkriptiota. Useiden MMP:en

21 tuotannon perustaso määräytyy geneettisesti promoottorialueella sijaitsevien kaksialleelisten yksittäisten nukleotidien polymorfismin kautta. Nämä polymorfismit voivat mutaatioissa johtaa sairauksiin, ja esim. kasvaimissa niiden esiintyminen on yleistä. MMP 9:n ja MMP 12:n promoottorin polymorfismin on havaittu liittyvän sepelvaltimotaudin vakavuuteen ja MMP 9:n tapauksessa komplisoituneiden plakkileesioiden esiintymiseen sepelvaltimoissa, vaikka vaikutus transkriptioon onkin vaatimaton. Viimeaikaisten havaintojen perusteella useiden MMP:en transkriptio aktivoituu solujenvälisten reseptorikontaktien sekä solun ja matriksin kontaktien kautta. Tekijät, jotka vaikuttavat (fibroblasti ) solujen muotoon ja vaikuttavat solun aktiinisäikeiseen tukirankaan, lisäävät herkästi solujen MMP ekspressiota [9]. [2] Aktivaatiovälitteinen säätely: MMP 2:n säätely tapahtuu pääosin proentsyymin aktivaation määrän avulla, sillä tuotto ja eritys on tasaista. MMP 2 pilkkoutuu eri seriiniproteaasien kuten urokinaasin kaltaisen plasminogeeniaktivaattorin (u PA), plasmiinin, trombiinin ja mast soluperäisten proteinaasien tryptaasin ja kymaasin vaikutuksesta 62 kda:n aktiivimuotoon. Reaktio on varsin herkkä ympäristötekijöille ja riippuu paljon solukalvoihin sitoutuneista aktivaattoreista. Aktivaatio estyy seriiniproteaasiinhibiittoreilla, muttei metalloproteinaasi inhibiittoreilla, joten metalloproteinaasit eivät ilmeisesti osallistu MMP 2:n pilkkomiseen. On havaintoja prommp 2:n sitoutumisesta erityksen jälkeen solukalvoon, jossa mm. phorboliesterit, konkavaliini A, vasta aineet ym. voivat aktivoida sen [12]. Proentsyymiaktivaatio tapahtuu ilmeisesti pääosin perisellulaaritilassa erityspaikassa tai suoraan solukalvolla. TNF α, PMA (phorboliesterit) ja lesitiini konkanavaliini A lisäsivät fibrosarkoomasolulinjan MMP 2:n perisellulaarista aktivaatiota, ja ensin mainitut lisäsivät MMP 9:n eritystä. Fibroblastien ja fibrosarkoomasolujen käsittely PMA:lla nosti MMP 2:n mrna:n tuotannon 2 3 kertaiseksi. Toisaalta on havaintoja, että fibroblasteilla PMA vähensi hieman MMP 2 ekspressiota (ei siis aktivaatiota) ja TNF β lisää sen 2 4 kertaiseksi. Osin MMP 2:n säätely tapahtuu siis myös transkriptiovälitteisesti. [18]

22 1.4.3. MT MMP 1:n rooli MMP 2:n aktivaatiossa (oligomerisaatiomalli) MT MMP 1 on tärkeä MMP 2:n aktivaation säätelijä, jonka avulla solu kykenee käynnistämään perisellulaarisen proteolyysin. MMP 2:a erittyy jatkuvasti varastoon. Eritys voi tulla samasta solusta tai viereisestä solusta. Solut säätelevät MT MMP 1:n avulla MMP 2:n aktivoitumista ja siten perisellulaarista proteolyysiä. Molekyylien oligomerisoituminen vähentää inhibitorisia TIMP 2:ja ja tehostaa MMP 2:n toimintaa. Gelatinaasien rypästäminen solukalvolle lisää molekyylikontaktien ja autolyysin määrää. Solut voivat myös vähentää ympäristönsä gelatinolyysiä endosytoimalla MT MMP 1:a kalvoltaan ja varastoimalla sen intrasellulaarisiin rakkuloihin. [12] Oligomerisaatiomallin mukaan MT MMP 1:n, TIMP 2:n ja MMP 2:n muodostamalla kompleksilla on tärkeä rooli MMP 2:n aktivaatiossa ja paikallisessa superaktivaatiossa. Solukalvoon sitoutuneet MT MMP 1:t sitoutuvat aktiivisella kohdallaan TIMP 2 molekyylin inhibitoriseen N päähän ja TIMP 2:n C pää reagoi prommp 2:n C pään kanssa (hemopeksiini domain), jolloin muodostuu solukalvossa kiinni oleva trimolekulaarikompleksi. Tällaisen kompleksin MMP 2:n aktiivikohta ei konformaatiomuutoksen seurauksena enää sido TIMP 2:a, jolloin TIMP 2:n inhibitiovaikutus estyy [6]. Kompleksimuodostukseen vaaditaan edeltävästi siis MT MMP 1:n aktivaatio. Tämän jälkeen viereiset solukalvoon sitoutuneet yksittäiset MT MMP 1:t pilkkovat sitoutuneen prommp 2:n 64 kda:n välimuotoon, ja kaksi välimuotoista MMP 2:a pilkkoo toisensa intermolekulaarisessa autokatalyysissä aktiiviseen 62 kda:n muotoon. Solukalvon yksittäiset MT MMP 1:t pilkkovat samalla toisiaan autokatalyysissä 43 kda:n inaktiivimuotoon. Malli myös selittää, miksi vähäisillä TIMP 2 pitoisuuksilla se lisää MMP 2:n aktivaatiota (lisää prommp 2:n sitoutumista MT MMP 1:een ja vapaat MT MMP 1:t pilkkovat pro osan), mutta korkeilla pitoisuuksilla toimii inhibiittorina (solukalvolla ei ole enää vapaita MT MMP 1:ä jotka aktivoisivat prommp 2:a ja ylimääräiset TIMP 2:t sitovat prommp 2:n). ProMMP 2:n aktivaation lisäämiseksi MT MMP 1:n ja TIMP 2:n tulee esiintyä suunnilleen molaarisissa suhteissa 3:1 3:2. [12]

23 PMA lisää lievästi MT MMP:n ekspressiota ja siten taipumusta MMP 2:n aktivaatioon. MMP 2:n aktivoitumiseen liittyy MT MMP 1:n pilkkoutuminen 43 kda:n muotoon [18]. PMA stimuloiduissa fibrosarkoomasoluissa prommp 2:n aktivaatio korreloi MT MMP 1:n pilkkoutumisen määrään kalvoon sitoutuneeksi 43 kda:n ja liukoiseksi 20 kda:n muodoiksi. (Reaktiossa MT MMP inaktivoituu autokatalyyttisesti. MT MMP:n 60 kda:n muoto on aktiivinen entsyymi, 43 kda:n muoto inaktiivi.) MT MMP 1:n oligomerisaation esto häiritsemällä joko sytoplasmisen tai hemopeksiinialueen toimintaa, esti sekä prommp 2:n aktivaatiota että MT MMP 1:n autokatalyyttistä inaktivaatiota. Solun erittämän MT MMP 1:n endosytoosin esto lisäsi prommp 2:n aktivaatiota. MT MMP 1:n puutos geenimuunnelluissa hiirissä johtaa heikentyneeseen prommp 2:n aktivoitumiseen. [12] 1.4.4. Plasmiinin roolit ja MMP:en aktivaatio Ekstrasellulaarimatriksin hajotukseen osallistuu laaja proteaasien aktivaatioketju. Tässä plasmiinilla on tärkeä rooli. Plasmiini pilkkoo esimuotoisen MMP 1:n, 3:n, 9:n, 10:n ja 13:n aktiivimuotoonsa, ja stromelysiini (MMP 3) taas aktivoi kollagenaasia (MMP 1) ja MMP 9:ää. Kudos ja urokinaasityyppiset plasminogeeniaktivaattorit (t PA ja u PA) pilkkovat plasminogeenia aktiiviseksi plasmiiniksi. U PA:n sitoutuminen solun reseptoriin johtaa perisellulaariseen plasminogeeniaktivaatioon, joka plasmiinin kautta aktivoi MMP:a (stromelysiinit ja kollgenaasit), ja perisellulaariseen proteolyysiin, joka on välttämätöntä SMC:en liikkumiselle. U PA osallistuukin keskeisesti solumigraatioon, mutta sillä ei ilmeisesti ole vaikutusta proliferaatioon. Valtimon vaurioituessa ja ateroskleroosissa erittyy runsaaasti t PA:a ja u PA:a. [3, 19, 20] U PA käsittelyllä (tutkimuksessa u PA konsentraatio oli 40 160 nm) 72 kda:n prommp 2 pilkkoutuu aktiiviseen 62 kda:n muotoonsa [6]. U PA vasta aineet estävät tämän reaktion, mutta plasmiini inhibiittorit eivät, joten ilmeisesti aktivaatio ei tapahdu plasmiinin välityksellä. T PA ei kyennyt MMP 2:n aktivaatioon. MMP 2:n aktivaation epäillään tapahtuvan lähinnä aivan perisellulaaritilassa. ProMMP 2:n pilkkomiseen vaadittavan liukoisen u PA:n pitoisuuden täytyy olla melko korkea reaktion tapahtumiseksi, mutta in vivo u PA esiintyy paikallisesti solukalvoilla sitoutuneena reseptoriproteiineihin ja

24 kiinnittymisalueisiin (adhesion site), joissa sitä esiintyy paikallisesti suurina konsentraatioina. Näin luonnossa MMP 2:n aktivaatio on paikallista ja voimakasta. Verattuna liukoiseen u PA:iin, reseptoriin sitoutuneen u PA:n kyky hajottaa prommp 2:a on myös kohonnut merkittävästi, sillä sopivaan reseptoriin sitoutuneena entsyymi tarjoutuu aktiivipaikka edellä ja mahdollisuus substraattimolekyylin kohtaamiseen oikeassa asennossa kasvaa. Solukalvoon sitoutunut entsyymi on myös paremmin suojautunut itseensä kohdistuvalta hajotukselta, jolloin molekyylin vaikutusaika pitenee. [6] 1.4.5. Metalloproteinaasien inhibitio Gelatinaasin aktiivisuus ja toiminta vaativat vapaata Ca 2+ :a ympäristössä. Solunsisäisen kalsiumin määrän lisääminen vähentää MMP 9:n ekspressiota ja MMP 2:n aktivaatiota ja alentaa siten gelatinolyysiä. Malignisoituneet solut menettävät kyvyn reagoida solunsisäiseen kalsiumiin. [16, 17] Kalsiumionoforit mm. ionomysiini lisäävät solukalvojen kalsiumläpäisevyyttä, mikä lisää solujen kalsiumpitoisuutta. Metallikelaattorit, kuten EDTA ja 1,10 fenantroliini, ehkäisevät metalloproteinaasien aktiivisuutta (eksogeenisiä inhibiittoreita) reagoimalla aktiivikohdan Zn 2+ ionin kanssa tai poistamalla sen. Nämä ovat epäselektiivisiä ja epäsfysiologisia aineita, eikä elimistössä tunneta niiden tapaan toimivaa fysiologista inhibiittoria. [6, 12] Seerumin α2 makroglobuliini on tehokas proteinaasien ja MMP:en inhibiittori. Se toimii vangitsemalla sisäänsä syöttialuetta pilkkovan proteinaasin. α2 makroglobuliini on yleinen plasmaproteiini (pitoisuus veressä on 3 µm) ja on keskeinen MMP inhibiittori kudosnesteissä. Tulehduksen aikana sen pitoisuus soluvälitilassa lähestyy plasmapitoisuutta, jolloin se on 100 1000 kertainen TIMP pitoisuuteen verrattuna. [2, 6]

25 Metalloproteinaaseilla on endogeeniset kudosinhibiittorinsa: TIMP 1, 2 ja 3 (tissue inhibitor of metalloproteinases). Ne rajoittavat metalloproteinaasien vaikutusta kudoksessa. Tavallisesti kudoksessa vallitsee selvä TIMP:en ylimäärä verratuna ekstrasellulaarimatriksia hajottaviin metalloproteinaaseihin, jolloin kudoksen rakenne säilyy. Paikallinen kudoksen hajotusvaikutus saadaan aikaan konsentroimalla metalloproteinaasia hajotuskohtaan yli kudosinhibiittorien määrän tai estämällä TIMP:en pääsy vaikutusalueelle. Yksittäinen inhibiittorimolekyyli voi sitoutua tiiviisti irreversiibelisti mihin tahansa aktiiviseen metalloproteinaasimolekyyliin 1:1 suhteessa (harvoin voi 1:2 tai 2:2). TIMP:t sitoutuvat pääasiassa aktivoituihin MMP:eihin, mutta TIMP 2 sitoutuu lisäksi prommp 2:een ja TIMP 1 prommp 9:ään. TIMP 1:llä on korkea affiniteetti etenkin MMP 1:een, MMP 2:een, MMP 9:ään ja MMP 3:een. [6, 9] TIMP:t sitoutuvat voimakkaasti MMP molekyylin aktiivisiin kohtiin ja estävät siten MMP:n toiminnan. TIMP:t myös aktivoivat MMP:ja. Esim. TIMP 2 sitoutuu kalvotyypin 1 MMP:iin ja muodostunut kompleksi sitoutuu MMP 2:een ja lisää MMP 2:n aktiivisuutta. (ks. oligomerisaatiomalli) MMP 2 ei kykene sitoutumaan solun pintaan ilman TIMP 2:a. Itsenäisenä TIMP 2 inhiboi spesifisti MMP 2:a. MMP 2 TIMP 2 kompleksin proteolyyttinen teho on n. 10 % MMP 2:n aktiivisuudesta. Sitoutuminen TIMP 2:een vähentää MMP 2:n itsehajotusta ja pidentää molekyylin ikää. Samoin TIMP 1 sitoutuessaan stabiloi MMP 9:ää hajotusta (esim. stromelysiinin) vastaan. TIMP 1 ja TIMP 2 ovat liukoisia. [6, 12] TIMP 3 sitoutuu suurella affiniteetilla ekstrasellulaarimatriksiin muodostaen liukenemattoman kompleksin ja näin mahdollisesti suojaa sidekudosta MMP:en vaikutuksilta [3]. Verisuonen SMC:t erittävät jatkuvasti MMP 2:a ja lisäksi TIMP 1:ä, TIMP 2:a ja TIMP 3:a. TIMP 2 erittyy liukoisena kompleksina MMP 2:n kanssa. TIMP 2:n eritys on tasaista ja jatkuvaa, mutta TIMP 1 ja TIMP 3 eritys stimuloituu kasvutekijöiden (PDGF:n, TGF β:n, sekä EGF:n) ja PMA:n, eli samojen tekijöiden vaikutuksesta, jotka stimuloivat myös MMP:en eritystä. [12]

26 TIMP:en lisäksi trombospondiinit kykenevät inhiboimaan MMP 2:a ja MMP 9:ää, ja trombospondiinit lisäävät niiden poistumista kudoksesta lisäämällä kerääjäreseptorivälitteistä (scavenger) endosytoosia. [12] 1.4.6. PMA PMA (eli phorboli 12 myristaatti 13 asetaatti, tetradekanoyyliphorboliasetaatti) on tehokas tuumoripromoottori, ja se stimuloi RNA ja DNA synteesiä. Se toimii proteiinikinaasi C:n aktivaattorina. On arveltu mahdolliseksi, että proteiinikinaasi C on karsinogeenisten phorboliestereiden reseptoriproteiini. Proteiinikinaasi C osallistuu useisiin monosyyttien toimintoihin, mm. fagosytoosiin, ja PMA stimuloi sen kuljetusta solukalvolle. Stromelysiinillä, MMP 9:llä ja mm. t PA:lla on geeninsä 5 ketjun säätelyalueella PMAherkkä phorboliesterivasteyksikkö (TRE), joka välittää PMA:n kollagenaasituotannon induktiota. (ks. Transkription säätely) Alue puuttuu MMP 2:n geenistä. Esim. SMC:issa PMA lisää kollagenaasin, MMP 9:n ja stromelysiinin mrna:n ja proteiinisynteesin määrää, mutta SMC:en MMP 2 tuotantoon sillä ei ole vaikutusta. [19] Fibrosarkoomasoluissa lusiferaasilla leimatun MMP 9:n määrä 2 3 kertaistui PMAkäsittelyllä. Maksimieritys saatiin kuuden tunnin kuluttua käsittelyn alusta, jonka jälkeen eritys laski vähitellen ja oli kolmenkymmenen tunnin kuluttua normaalitasolla [16]. Inkuboitaessa fibroblasteja PMA:ssa maksimaalinen MMP 9 ekspressio saavutetaan 12 h:ssa [6]. PMA:n kiihdyttävä vaikutus ekspressioon on ohimenevä, sillä tämän jälkeen ei MMP 9:n mrna:n määrä solussa lisäänny. Pitkäaikainen korkea annoksinen PMAinkubaatio alentaa solujen vastetta PMA:lle. PMA lisää u PA:n ja u PA reseptorin ekspressiota useissa solutyypeissä. PMA:n gelatinaasien aktivaattorimekanismiksi on ehdotettu myös, että se siirtää solukalvolla MT MMP 1:n ja MMP 2:n vierekkäisille alueille, jolloin ne aktivoivat toisiaan, paikallinen gelatinaasikonsentraatio kasvaa, ja muodostuvien reseptorikompleksien affiniteetti substraateille on korkeampi. [6]

27 2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Suoritettujen tutkimusten yleisenä tavoitteena oli tehdä peruskartoitusta monosyyttimakrofagien käyttäytymisestä eri olosuhteissa, missä olosuhteissa solut saadaan kasvamaan, ja onnistua mittaamaan MMP 9:n aktiivisuutta lineaarisessa tai logaritmisessa suhteessa. Tätä varten ajetuista geeleistä pyrittiin densitometrisesti mittaamaan raitojen kirkkaus, mutta tutkimuksen aikana menetelmästä ei saatu vielä riittävän luotettavaa ja vertailukelpoista.

28 3. YLEISET METODIT 3.1. Reagenssit FCS hankittiin Biochrom AG:lta. LowMM standard hankittiin BioRad:lta. L glutamiini, NEFA, RPMI 1640 ja X VIVO hankittiin BioWhittakerilta. Coomassien sininen (Coomassie blue G250) hankittiin ICN Biomedicals:ilta. Natriumhydroksidi (NaOH) hankittiin JT. Bakerilta. TEMED hankittiin Kodak (Eastman company):lta. 2 propanoli, ammoniumpersulfaatti (APS), bromifenolin sininen, etikkahappo, Folin Ciocaltean fenolireagenssi, glyseroli, glysiini, kaliumnatriumtartraatti (K Na tartraatti), kalsiumkloridi (CaCl 2 ), kuparisulfaatti (CuSO 4 ), natriumkarbonaatti (Na 2 CO 3 ) ja sinkkikloridi (ZnCl 2 ) hankittiin Merck:lta. Akryyliamidi, bisakryyliamidi, natriumdodekyylisulfaatti (SDS) hankittiin Servalta. Albumiinistandardi, gelatiini, Hepes 25 mm, Opi Media Supplement, PMA, pyruvaatti, Tris HCl, TritonX 100 hankittiin Sigma (Sigma Chemical CO):lta. 3.2. Soluviljely 3.2.1. Käytetty solulinja Tutkimuksissa tutkittiin metalloproteinaasien eritystä Mono Mac 6 solulinjan avulla. Solut ovat ihmisen akuutin monosyyttileukemian soluja ja peräisin 64 vuotiaasta miehestä, jolla on uusinut akuutti monosyyttileukemia. Solut on eristetty potilaan ääreisverestä vuonna 1985 myeloidisen metaplasian havaitsemisen yhteydessä. Solulinjaa säilyttää ja ylläpitää Dr. H.W:L. Ziegler Heitbrock Saksassa Münchenin Immunologian Instituutissa. Mono Mac solut ovat rakenteeltaan yksittäisiä pyöreitä tai monimuotoisia soluja, jotka voivat esiintyä pienininä rypästyminä ja ajoittain löyhästi tarttua alustaansa. 1 5 % soluista kehittyy jättiläissoluiksi. Suositeltu kasvatusliuos on 90 %:nen RPMI 1640 ja 10 %:nen