ELEC-C2210 Molekyyli- ja solubiologia

Transkriptio

1 ELEC-C2210 Molekyyli- ja solubiologia Entsyymikatalyysi Vuento & Heino ss ECB: Luku 3, s & luku 4, s Dos. Tuomas Haltia, Biotieteiden laitos, biokemia ja biotekniikka

2 Miten entsyymit toimivat? Spesifisyys: katalysoivat vain tiettyä reaktiota Nopeuttavat reaktiota tyypillisesti miljardikertaisesti tai enemmän Toimivat fysiologisissa oloissa (ph, lämpötila, ionivahvuus)

3 Tässä luennossa: Entsyymit = Proteiineja, jotka katalysoivat kemiallisia reaktioita Eivät itse kulu reaktiossa Nopeuttavat reaktioita ratkaisevasti Sitovat reaktantit katalyysin aikana Eivät voi muuttaa reaktion termodynamiikkaa eli sitä, onko reaktio energeettisesti suotuisa vai ei Vain energeettisesti suotuisa (= alamäkeen oleva ) reaktio voi tapahtua (muttei välttämättä tapahdu!)

4 Entsyymit määräävät, mitä solussa tapahtuu

5 Aineenvaihdunta (metabolia) riippuu siitä, mitkä entsyymit ovat aktiivisia

6 Entsyymit keskeisiä Geneettisissä taudeissa (tietty entsyymi inaktivoitunut mutaation seurauksena) Häiriötiloissa, joissa syynä on liiallinen entsyymiaktiivisuus (esim. tupakoitsijan keuhkolaajentuma; elastaasin inhibiittorin inaktivoituminen)) Lääkkeiden kohdemolekyyleinä (aspiriini, protonipumpun estäjät ) Diagnostiikassa (kudosspesifit isoentsyymit), esim. sydäninfarktin jälkeen Biotekniikassa

7 Entsyymikatalysoitu reaktio

8 Ei-katalysoitu reaktio on hidas, koska Lähtöainetta ja tuotetta erottaa toisistaan korkea energiavalli Alhaisessa lämpötilassa vain pienellä osalla lähtöainemolekyyleistä on riittävästi energiaa energiavallin ylittämiseen Energiavalli = Korkeaenerginen tila, siirtymätila, johon pääsemiseen tarvitaan aktivaatioenergia; jos aktivaatioenergiaa pystytään alentamaan reaktio nopeutuu

9 E+S ES EP E+P Reagoivat molekyylit eli substraatit (S) sitoutuvat entsyymin aktiiviseen keskukseen Sitoutumisenergia ( katalyysi!) Syntyy ES-kompleksi Aktiivisessa keskuksessa substraatti muuttuu tuotteeksi P Aktiivinen keskus on spesifinen osa entsyymin 3-ulotteista rakennetta

10 ES-kompleksi perustuu heikkoihin sidoksiin joita on paljon

11 ENTSYYMIKATALYYSI PERUSTUU AKTIVAATIOENERGIAN ALENTAMISEEN Entsyymit EIVÄT vaikuta reaktion tasapainovakioon eli entsyymit nopeuttavat vain reaktioita joiden energetiikka on suotuisa (reaktiot alamäkeen ) MITEN aktivaatioenergiaa alennetaan? Käyttämällä sitoutumisenergiaa siirtymätilan stabiloimiseen

12 Aktivaatioenergia johtuu lähtöainetta ja tuotetta erottavasta korkeaenergisestä siirtymätilasta. Aktivaatioenergian alentaminen = siirtymätilan stabilointi; entsyymin aktiivinen keskus on komplementaarinen siirtymätilalle Siirtymätila = reaktiopolun energiaprofiilin korkeimmassa kohdassa esiintyvä hyvin lyhytikäinen molekyylirakenne

13 Entsyymit alentavat aktivaatioenergiaa Sitomalla substraatin spesifisesti kuitenkin siten, että kaikkein tiukimmin sitoutuu siirtymätila Käyttämällä sitoutumisenergiaa substraatin vääntämiseen reaktiolle otollisempaan konformaatioon Orientoimalla substraatin ja katalyyttiset ryhmät optimaalisesti Pitämällä veden poissa reagoivilta pinnoilta Keskeisin tekijä on sitoutumisenergia!

14 Entsyymit stabiloivat siirtymätilaa Substraattien keskinäinen asema eri mekanismein Varausten liikuttaminen Substraatin vääntäminen

15 STIKKAASI! Pelkkä substraatin sitominen ei johda katalyysiin, vaan päinvastoin substraatin stabiloitumiseen!

16 ENTSYYMIT Katalyyttejä joissa Aktiivinen keskus joihin Substraatit sitoutuvat Tämä johtaa Siirtymätilan stabiloitumi-seen ja edelleen Aktivaatioenergian alenemiseen Tuloksena on reaktionopeuden kasvu Huom. entsyymi ei vaikuta reaktion tasapainotilaan eli lähtöaineen ja tuotteen määrään tasapainotilassa! (Mutta nopeuttaa tasapainon saavuttamista.)

17 AKTIIVINEN KESKUS JA SATURAATIOKINETIIKKA Michaelis-Mentenin yhtälö: V o = V max [S] / K M + [S] V max Nopeus kun entsyymi on saturoitunut substraatilla K M = se substraattikonsentraatio jossa v = ½ V max

18 Lineweaver-Burk -kuvaaja Saadaan Michaelis- Mentenin yhtälöstä 1/V 0 = (K M /V max ) 1/[S] + 1/V max On muotoa y = ax + c eli suoran yhtälö.

19 Kilpaileva inhibitio Inhibiittori tyypillisesti muistuttaa substraattia ja sitoutuu siis aktiiviseen keskukseen Lineweaver-Burk: K M kasvaa

20 Lineweaver-Burk kompetitiivisen inhibiittorin läsnäollessa Kulmakerroin muuttuu, leikkauspiste ei vain K M muuttuu

21 Ei-kilpaileva (unkompetitiivinen) inhibiittori sitoutuu vain ES-kompleksiin Leikkauspisteet akseleilla muuttuvat, mutta kulmakerroin ei K m ja V max alenevat kummatkin samaan tahtiin

22 Erään entsyymin mekanismi Esimerkki: ymotrypsin.html Chymotrypsin Mechanism Kymotrypsiini: rakenne, aktiivinen keskus, sitoutumisenergian käyttö, siirtymätila, kovalenttisesti sitoutunut välituote

23 Kymotrypsiinin spesifisyys (proteaasi joka katkaisee peptidisidoksen ison hydrofobisen ah:n karboksipuolelta)

24 Tasomainen peptidisidos on inertti (vaikka hydrolyysireaktio on vesiliuoksessa termodynaamisesti alamäkeen)

25 Kymotrypsiinin sekvenssi (primaarirakenne)

26 KYMOTRYPSIINI ja sen AKTIIVINEN KOHTA Punainen = aktiivinen keskus Vihreä = substraatin sivuketjun sitoutumiskohta

27 KATALYYTTINEN TRIADI Vetysidos vahvistuu substraatin sitoutuessa muuttuu reaktiivisemmaksi! Ser-195

28 Kymotrypsiinin reaktiiviinen seriini: katalyyttisen triadin merkitys

29 KYMOTRYPSIININ MEKANISMI

30 Toinen esimerkki: lysotsyymi Puolustusentsyymi: pilkkoo bakteerin soluseinää reikä bakteerin kuolema Hydrolysoi soluseinän polysakkaridin tietyn glykosidisen sidoksen Reaktion vapaan energian muutos on negatiivinen, mutta ilman entsyymiä reaktion tapahtuminen kestää vuosia

31 Katalysoimaton reaktio on usein hyvin hidas!

32 Lysotsyymi sitoo kuuden sokerin pätkän ja pilkkoo sen kahteen osaan

33 Lysotsyymin ES-kompleksi

34 Lysotsyymin mekanismi: sitoutumisenergia vääntö kohti siirtymätilaa & Glu-35 ja Asp-52