Katsaus Hongkongilaisen influenssaviruksen jälkipolvet Suomessa 30 vuotta kujanjuoksua ja perässä pysyttelyä Reijo Pyhälä Ihmiseen siirtyneiden influenssavirusten evoluutio on armotonta peliä. Tartunnan helppous, lyhyt itämisaika ja massiivinen virusten tuotto infektion aikana johtavat maapallon yli vyöryviin epidemioihin. Niiden aiheuttama immuniteetti pakottaa influenssaviruksen oravanpyörään, jossa mutaatiot ja alistuminen tehokkaaseen valintaan ovat ainoa keino säilyttää lisääntymiskyky. Hongkongilaisviruksen 30 evoluutiovuotta ovat muuttaneet sen antigeenirakenteita perin pohjin. Epitooppien aminohapoista valtaosa on useita kertoja muuttunut toisiksi ja osa epitoopeista on kätkössä sokerikuoren alla. Viruksen uusin keino näyttää olevan muutos rakenteessa, jolla se tunnistaa reseptorinsa isäntäsolun pinnalla. Hongkongilaisviruksen kiivas antigeenievoluutio on vaatinut influenssarokotteiden viruskantojen jatkuvaa päivitystä. 1990-luvulla rokotevirukset ovat vastanneet yleensä hyvin Suomessa epidemian aiheuttaneita viruksia. Vuoden 1968 influenssapandemia tunnetaan nimellä hongkongilainen. Sen aiheutti uutta alatyyppiä (H3N2) edustanut influenssa A -virus, joka oli saanut kahdeksasta geenijaokkeestaan kaksi lintujen influenssaviruksilta (Webster ym. 1992). Immuniteetti influenssaviruksen kahta pintaproteiinia kohtaan on tehokas epidemioiden hillitsijä. Uusi hemagglutiniinigeeni teki hongkongilaisviruksesta maailmanvalloittajan. Ihmiselle onneksi neuraminidaasigeeni oli tuttu. Talvella 1968 69 hongkongilainen jätti jälkeensä vähemmän kuolleita kuin edellinen pandemiavirus, vuoden 1957»aasialainen» (Schwarzmann ym. 1971), jonka molemmat pintaproteiinit olivat uusia. Uskotaan, että immuniteetti neuraminidaasia kohtaan hillitsi hongkongilaisviruksen tuhoja (Potter 1998). Sairastuvuus hongkongilaiseen vaihteli kahtena ensimmäisenä talvena maasta toiseen (Oxford 2000). Syytä vaihteluun ei vieläkään tiedetä. Viruskantoja eristettiin eri puolilla maailmaa suuret määrät, mutta harvoja ymmärrettiin säästää odottamaan kehittyvän molekyyliepidemiologian uusia keinoja tutkia adaptaation ja epideemisen ärhäkkyyden mekanismeja. Noin 70 % suomalaisesta aikuisväestöstä sai H3N2-virusten kahden ensimmäisen epidemiatalven aikana kliinisen tai subkliinisen infektion, joka johti hemagglutinaatiota inhiboivien (HI) vasta-aineiden nousuun (Aho ja Pyhälä 1975). Immuniteetin äkillinen voimistuminen kaikkialla maailmassa merkitsi hongkongilaisvirukselle valintapainetta, jonka kurimuksesta vain antigeenisten muunnosten oli mahdollista selvitä. Sellainen oli jo talven 1972 73 virus, jonka kolmen aiemman H3N2-epidemian yhteydessä syntyneet HI-vasta-aineet vaivoin tunnistivat (Pyhälä ja Cantell 1974). Lähes vuosittain yli maa- Duodecim 2000; 116: 2483 8 2483
pallon levinneet epidemiat ovat merkinneet H3N2-viruksille valinkauhaa, jossa niiden hemagglutiniini ja neuraminidaasi ovat jatkuvasti muokkautuneet uuteen muotoon. Kiivas antigeeninen muuntuminen on tehnyt välttämättömäksi muuttaa samassa tahdissa influenssarokotteiden viruskantoja. Onneksi erilaiset valintapaineet ovat olleet niin tehokkaita, että H3N2-virusten evoluutio on johtanut sekä hemagglutiniini- että neuraminidaasigeenin osalta yksirunkoiseen sukupuuhun. Jos rinnakkaisia kehityshaaroja olisi jäänyt aiheuttamaan epidemioita, pintaproteiinien antigeenisuuteen perustuvien influenssarokotteiden suojatehon ylläpitäminen rokoteviruksia päivittämällä olisi ollut vaikeaa ja pahimmassa tapauksessa käynyt mahdottomaksi. Aminohappomuutokset HA1:n evoluutiossa Hongkongilaisviruksen pinnasta trimeereinä sojottavien hemagglutiniinimolekyylien (HA) kärkiosa muodostuu 328 aminohappoa käsittävästä glykosyloituneesta rakenteesta HA1:stä. Se on influenssaviruksen muuntuvin osa. HA1 sisältää reseptoritaskun, jolla virus tarttuu isäntäsolunsa pinnan N-asetyyli-neuramiinihapporeseptoriin. Tarttumista ohjaavat reseptoritaskun ympärille suppilomaisen rakenteen muodostavat polypeptidilenkit. Vahvasti antigeenisina ne ovat influenssaviruksen haavoittuvin kohta, sillä reseptoritaskun ympäristön epitooppeja tunnistavat vasta-aineet estävät helposti viruksen tarttumisen isäntäsoluun. Kuva 1 esittää H3N2-virusten kujanjuoksua, aminohappomuutosten jatkuvaa kerääntymistä immuunipaineen puristuksessa H3N2-virusten HA1:een vuosina 1969 99. Kaikki kuvan virukset on eristetty Suomessa. Runsaan 30 vuoden evoluutiossa 14 % HA1:n aminohapoista on muuntunut. Osuus on jo pitkään kasvanut hitaasti, mutta evoluutionopeus ei ole vähentynyt (Fitch ym. 1997). Hitaus johtuu siitä, että kaikki antigeenisesti tärkeät aminohappopositiot ovat ehtineet kertaalleen muuttua ja menossa ovat uudet muuntumiskierrokset. Ne eivät lisää prosenttiosuuksia kuvassa 1. Äskettäin on kuvattu 18 erityisen tiheään muuntuvaa aminohappopaikkaa, joihin liittyy H3N2-virusten evoluutiossa positiivinen valinta-arvo (Bush ym. 1999). Näissä paikoissa tapahtuvien muutosten otaksutaan ennustavan muita selvemmin uuden virusvariantin epideemistä menestystä. Ihmisen virukseksi siirtyminen on vaatinut lintujen influenssaviruksilta uutta evoluutiostrategiaa, jota ohjaa tarve välttää pitkäikäiselle ja hitaan sukupolvikierron omaavalle isännälle kehittyvä immuniteetin tuhovoima. Taktiset keinot eivät rajoitu epitooppien aminohappomuutoksiin. Toinen tie on peittää epitoopit sokerikuoren alle. Hongkongilaisviruksen HA1:n glykosylaatiopaikat ovat lisääntyneet 30 vuoden evoluution aikana kuudesta kymmeneen (kuva 2). Kaikki uudet glykosylaatiopaikat sijaitsevat tärkeissä antigeenipaikoissa. Neljä uutta sokeripehkoa osallistuu reseptoritaskun ympäristön epitooppien peittämiseen. Erityisen kiivasta uusien sokeripeittojen synty on ollut 1990-luvulla. Saman vuosikymmenen taktisia keinoja ovat olleet muutokset reseptoritaskussa. Niihin palataan jäljempänä. Geneettinen sukulaisuus rokotevirusten kanssa HA1-geenin sukupuu kuvassa 3 käsittää laboratoriossamme tutkitut sekvenssit seitsemästäkymmenestä H3N2 viruksesta, jotka kuutta rokotevirusta lukuun ottamatta on eristetty 1990- luvulla Suomessa, muutamat muissa Pohjoismaissa. Sukupuu osoittaa, että uusi virusmuunnos on saapunut Suomeen viimeistään kahden vuoden välein. Maailman terveysjärjestön suositus seuraavan syksyn influenssarokotteiden viruskannoista annetaan pohjoiselle pallonpuoliskolle helmikuussa. Parhaimmillaan rokotevirukset ovat pysyneet hyvin mukana H3N2-virusten muuntumisprosessissa. Talvina, jolloin epideemiset virukset ovat olleet geneettisesti kirjavia (1991 92, 1996 97), rokotevirus on ollut lähellä kehityshaarojen yhteistä kantamuotoa. Syksyllä 1994 ja 1995 rokotevirukset vastasivat geneettisesti huonommin seuraavan talven epideemisiä viruksia, mutta antigeeninen ero oli siedettävä. Talven 1995 96 epidemian yhteydessä 2484 R. Pyhälä
Kuva 1. Aminohappomuutosten kertyminen influenssa A(H3N2) -virusten pintavalkuaisen HA1-osaan (328 aminohappoa) 1969 99. Seitsemän Suomessa eristetyn viruskannan vertailu pareittain vuonna 1969 eristettyyn Finland/61/69-virukseen. Reseptoritaskun aminohapot on merkitty mustalla, eroavat aminohapot punaisella. Osa eroista on piilossa molekyylin katvepuolella. Kaksi viimeistä numeroa virusten nimissä ilmaisevat eristysvuoden. Eroavien aminohappojen lukumäärän ja prosenttiosuuden kasvu on merkitty molekyylimalleihin. Kuva 2. Potentiaalisten glykosylaatiopaikkojen (asparagiini-x-seriini/treoniini) lisääntyminen influenssa A(H3N2) -virusten pintavalkuaisen HA1:ssa 1968 2000. Aineisto käsittää sekvenssit 124:stä Suomessa eristetystä viruskannasta. Asparagiinin järjestysnumerot on mainittu sekä molekyylimallissa oikealla että glykosylaatiopaikkojen ilmaantumista kuvaavien aikapalkkien yläpuolella vasemmalla. Konservoituneet glykosylaatiopaikat on merkitty sinisellä ja evoluutiossa ilmaantuneet punaisella. Antigeenipaikat, joihin sokereilla on vaikutusta, on merkitty kirjaimilla a e. Hongkongilaisen influenssaviruksen jälkipolvet Suomessa 30 vuotta kujanjuoksua ja perässä pysyttelyä 2485
Kuva 3. Suomessa ja osin muissa Pohjoismaissa epidemioita aiheuttaneiden influenssa A(H3N2) -virusten HA1-geenin ns. juureton sukupuu. Aineisto käsittää 64 potilasvirusta (pienet täytteiset ympyrät merkitsevät yhtä, suuremmat useampaa virusta) kahdeksalta epidemiakaudelta ja niitä edeltävien syksyjen rokotevirukset (tähdet). Sukupuun janojen pituudet vastaavat mutaatioiden kertymiä. Epidemiakaudet (merkitty vuosiluvuin) seuraavat toisiaan vasemmalta oikealle. Isot avoympyrät rajaavat viisi peräjälkeen kehittynyttä, geneettisesti kirjavaa virusmuunnosta, jotka yleensä ovat säilyneet epideemisinä kaksi talvea. Värin perusteella on todettavissa, miten syksyn rokotevirus on geneettisesti vastannut seuraavan talven epideemisiä viruksia (kummallakin sama väri). Huutomerkillä varustettua»pioneerivirusta» käsitellään tekstissä. eristettiin virusmuunnos (huutomerkillä varustettu virus kuvassa 3), joka aiheutti seuraavana talvena epidemian. Näiden pioneerivirusten eristäminen useissa maissa jo alkutalvella 1995 96 oli signaali, joka johti syksyn 1996 rokoteviruksen vaihtamiseen oikeaan aikaan. Geneettiset sukulaisuudet kuvassa 3 viittaavat siihen, että kahtena vuonna, syksyllä 1992 ja syksyllä 1997, rokotevirukset (Beijing/353/89 ja Nanchang/933/95) saattoivat pudota kyydistä, kun seuraavan talven epideemiset virukset saapuivat Suomeen. Miten rokotevirusten päivityksissä onnistuttiin? Kahdeksan epidemiakautta käsittäneen jakson aikana HA1:n aminohappoerojen lukumäärä syksyn rokoteviruksen ja Suomessa seuraavana talvena epideemisten H3N2-virusten konsensuksen välillä vaihteli neljästä kahteentoista. Talven 1999 2000 tilannetta on tarkasteltu toisaalla (Pyhälä ym. 2000). Erottavien aminohappopositioiden sijainnilla molekyylissä on enemmän painoarvoa kuin niiden lukumäärällä. Talvien 1994 95 ja 1995 96 11 aminohappoeron merkitystä vähensi se, että niistä valtaosa sijaitsi kaukana reseptoritaskun ympäristön tärkeistä epitoopeista. Kahtena talvena, 1992 93 ja 1997 98, isohko osa eroista koski kuitenkin juuri näitä epitooppeja ja merkitsi HI-testillä osoitettavaa tuntuvaa antigeenista eroa rokotevirusten ja epideemisten virusten välillä. Pitkään on yleistäen ajateltu, että rokotus antaa sitä huonomman suojan, mitä enemmän epideeminen virus poikkeaa rokoteviruksesta. Toinen yleistys on ollut, että influenssaepidemiasta muodostuu sitä suurempi, mitä enemmän uusi virus poikkeaa antigeenisesti edeltäjästään. Molemmille käsityksille löytyy vahva teoreettinen perusta, ja monet kerrat ne ovat osoittautuneet käytännössä oikeiksi. Talvien 1992 93 ja 1997 98 epidemiat osoittavat kuitenkin, että säännöt eivät ole vailla poikkeuksia ja että poikkeuksiin ovat saattaneet olla vaikuttamassa H3N2-virusten evoluution uudet tuulet 1990-luvulla. Talvella 1992 93 uuden Beijing/32/92-muunnoksen aiheuttama epidemia jäi vastoin odotuksia pieneksi Suomessa ja kaikkialla Euroopassa 2486 R. Pyhälä
Kuva 4. Reseptoritaskuun paikantuvat aminohappomuutokset influenssa A(H3N2)-virusten HA1:ssä 1968 99. Aineisto käsittää sekvenssit 124:stä Suomessa eristetystä viruskannasta. Aminohappojen järjestysnumerot ja yksikirjaimiset lyhenteet on mainittu. Molekyylimalli käsittää 13 Å:n säteellä virusreseptorista (N-asetyylineuramiinihappo, NANA) olevat aminohapot. Reseptoritaskun 16 aminohappoa on esitetty pallorakenteina, muut juosteina; evoluutiossa muuttumattomina säilyneet aminohapot on merkitty sinisellä ja muuttuneet punaisella. Muuttuneiden aminohappojen kuuluminen HA1:n antigeenipaikkoihin a, b ja d on mainittu. (Pyhälä ym. 1993). Suurempi epidemia oli edessä vasta muunnoksen toisena talvena 1993 94 (Pyhälä ym. 1994). Talven 1997 98 epidemia, jonka aiheutti uusi Sydney/5/97-tyyppinen virus, oli Euroopassa korkeintaan keskivoimakas, ja rokotussuoja antigeenievoluutiossa jälkeen jääneellä rokoteviruksella (Nanchang/933/95) ylitti odotukset (Pyhälä ym. 1998); kolmen epidemiaviikon aikaiseksi suojatehoksi saatiin suomalaisessa varuskunnassa tyydyttävä 53 %. Syitä odotusten vastaisiin tapahtumiin 1992 ja 1997 ei ole lopullisesti selvitetty. On mahdollista, että edellisinä vuosina saatu immuniteetti (esim. antineuraminidaasivasta-aineet) riittää toisinaan hillitsemään uuden antigeenisen muunnoksen aiheuttamaa epidemiaa sen ensimmäisenä talvena mutta ei enää seuraavina. Molekyyliepidemiologia tarjoaa muitakin selitysmalleja. H3N2-virusten viimeaikaisessa antigeenievoluutiossa aminohappojen korvautumista on tapahtunut totuttua enemmän konservoituneena pysyneessä reseptoritaskussa. Reseptoritaskun 16 aminohaposta vain yksi muuttui toiseksi 1960- ja 1980-luvuilla ja muutoskertoja oli kaksi, mutta 1990-luvulla kertyi neljään eri aminohappopositioon yhteensä seitsemän muutosta (kuva 4). Samanaikaisesti viruksen eristettävyys kananmunissa on selvästi heikentynyt ja viruksen kyky agglutinoida punasoluja on muuttunut. Kumpikin ilmiö voi selittyä muutoksilla viruksen kyvyssä tunnistaa solun pinnan reseptoreita. Kasvattamalla influenssaviruksia laboratoriossa monoklonaalisten vasta-aineiden läsnäollessa on saatu aikaan mutantteja, joiden kyky tunnistaa reseptoreitaan on muuttunut ja joissa aminohappomuutokset paikantuvat reseptoritaskuun (Temoltzin-Palacios ja Thomas 1994, Thomas ym. 1998). Näyttäisi siltä, että murtaakseen väestön vahvistuneeseen immuniteettiin perustuvan suojan H3N2-virukset ovat 1990-luvulla joutuneet luopumaan optimaalisesta kyvystään tunnistaa reseptorinsa ja ehkä menettäneet sillä sektorilla osan infektiivisyytensä terävintä kärkeä. Evoluutioteoreettisesti tilanne on kiintoisa. Yhden askeleen tappio yhtäällä on siedettävä kompromissi kahden askeleen voitosta toisaalla. Syy-yhteyksien varmistamista vaikeuttaa mm. se, että tarttumis- ja tartuttamiskykyyn vaikuttavat sekä hemagglutiniini että neuraminidaasi, jotka muodostavat toiminnallisen työpa- Hongkongilaisen influenssaviruksen jälkipolvet Suomessa 30 vuotta kujanjuoksua ja perässä pysyttelyä 2487
rin ja ovat influenssaviruksen evoluutiossa eniten muuntuvia rakenteita. Kun otetaan huomioon myönteiset kokemukset talvilta 1992 93 ja 1997 98, jolloin influenssarokotteiden H3N2-virukset vastasivat huonoimmin maamme epideemisiä viruksia, rokotevirusten päivityksiä koko pohjoisen pallonpuoliskon käyttöön voidaan pitää Suomen 1990-luvun epidemioiden osalta varsin onnistuneina. Perässä pysyminen epideemisten virusten antigeenievoluution edetessä edellyttää panostusta influenssan virologiseen valvontaan ja tiivistä kansainvälistä yhteistyötä. Molekyyliepidemiologinen tutkimus on avannut joitakin uusia mahdollisuuksia ennustaa tulevien epidemioiden aiheuttajat (Bush ym. 1999), mikä voi helpottaa rokotevirusten valintaa nykyisen kaltaisiin inaktivoitua virusta tai niiden osia sisältäviin rokotteisiin. Rokotteen ja viruksen kilpajuoksussa influenssavirus tulee kuitenkin yhä olemaan vähintään rinnanmitan edellä. *** Kiitän kahta Kansanterveyslaitoksen emeritusprofessoria, Kari Cantellia ja Kimmo Ahoa innostavasta ohjauksesta ja työtoveruudesta hongkongilaisviruksen kujanjuoksun kahdella ensimmäisellä vuosikymmenellä. Kirjallisuutta Aho K, Pyhälä R. Influenssan epidemiologiaa. Duodecim 1975;91:257 65. Bush RM, Fitch WM, Bender CA, Cox NJ. Positive selection on the H3 hemagglutinin gene of human influenza virus A. Mol Biol Evol 1999;16:1457 65. Fitch WM, Bush RM, Bender CA, Cox NJ. Long term trends in the evolution of H(3) HA1 human influenza type A. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:7712 8. Oxford JS. Influenza A pandemics of the 20th century with special reference to 1918: virology, pathology and epidemiology. Rev Med Virol 2000;10:119 33. Potter CW. Chronicle of influenza pandemics. Kirjassa: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, toim. Textbook of influenza. London: Blackwell Science Ltd, 1998, s. 3 18. Pyhälä R, Cantell K. HI antibodies to influenza A/Finland/1/74. BMJ 1974;3:255 6. Pyhälä R, Ikonen N, Haanpää, M, Kinnunen L, Villberg A. Talven 1993 94 influenssaepidemia ja tulevan kauden näkymät. Suom Lääkäril 1994:49;2420 4. Pyhälä R, Ikonen N, Haanpää M, ym. Influenssa A/Sydney/5/97 talven 1997 98 yllättäjä. Suom Lääkäril 1998;53:2551 6. Pyhälä R, Kinnunen L, Forsten T, Alanko S, Villberg A. Uudet influenssavirukset ja syksyn 1993 rokote. Suom Lääkäril 1993;48:2433 7. Pyhälä R, Tervahauta R, Korpela H, ym. Influenssassa uudelle vuosituhannelle talven 1999/2000 epidemia ja virukset. Suom Lääkäril 2000;55:3695 3701. Schwarzmann SW, Adler JL, Sullivan RJ, Marine WM. Bacterial pneumonia during the Hong Kong epidemics of 1968 1969. Arch Int Med 1971;127:1037 41. Temoltzin-Palacios F, Thomas DB. Modulation of immunodominant sites in influenza hemagglutinin compromise antigenic variation and select receptor-binding variant viruses. J Exp Med 1994;179:1719 24. Thomas DB, Patera AC, Graham CM, Smith CA. Antibody-mediated immunity. Kirjassa: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, toim. Textbook of influenza. Blackwell Science Ltd, 1998, s. 267 77. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev 1992;56: 152 79. REIJO PYHÄLÄ, FT, laboratorionjohtaja reijo.pyhala@ktl.fi Kansanterveyslaitos Mannerheimintie 166 00300 Helsinki 2488