Lääkeaineiden vaikutusmekanismit: reseptorit*

Transkriptio

1 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit* Lääkeaineiden kohdeolekyylit Melkein kaikki lääkeaineiden vaikutukset potilaissa sekä toivotut hoitovaikutukset että ei-toivotut haittavaikutukset perustuvat eliistöön tuotujen lääkeaineolekyylien ja eliistön oien olekyylien vuorovaikutuksiin. Useiat lääkeaineet vaikuttavat eliistössä sitoutualla solujen erikoistuneisiin valkuaisaineolekyyleihin, reseptoreihin, ja uuttaalla niiden toiintaa. Lääkevaikutuksen kohdentuinen eliistössä tiettyihin solutyyppeihin ja näiden solutyyppien toiinnallisen uutoksen laatu ääräytyvät reseptoriolekyylien ja lääkeaineen vuorovaikutuksen pohjalta. Reseptorit ääräävät tällä tavoin lääkevaikutuksen laadun ja lääkeaineiden valikoivan biologisen aktiivisuuden. Lääkeaineiden vaikutuksen kohteena olevat reseptorit ovat usein eliistön oien viestiolekyylien (horonien, välittäjäaineiden, kasvutekijöiden jne.) reseptoreita. Lääkeaine voi vaikuttaa reseptoreihin eliistön oien viestiolekyylien tavoin aktivoialla niitä ja käynnistäällä niihin kytkeytyvät solujen fysiologiset signaalinvälitysekanisit. Se voi yös estää eliistön viestiolekyylien toiintaa sitoutualla niiden reseptoreihin. Reseptoreja viestiolekyylien tavoin aktivoivia lääkeaineita kutsutaan agonisteiksi ja viestiolekyylien toiintaa estäviä lääkeaineita antagonisteiksi eli reseptorinsalpaajiksi. Antagonistilla ei yleensä ole varsinaista oaa vaikutusta kohdesolujen toiintaan, ellei eliistössä ole saaan aikaan agonistia, jonka vaikutusta reseptoriin se voisi estää. Lääkeainereseptoreina voivat toiia yös uut solujen akroolekyylit kuin fysiologisten viestiolekyylien reseptorit. Tällaisia lääkeainevaikutusten kohdeolekyylejä ovat. onet entsyy- reseptorit agonistit antagonistit entsyyit *Tässä luvussa ainitaan esierkkeinä lukuisia lääkeaineita, joiden vaikutuksista tai käytöstä ei lukijalla voi tähän ennessä olla kuvaa. Siksi lukua opiskelevalle suositetaan ensi kerralla keskittyistä yleisiin periaatteisiin ja palaaista yksityiskohtien opiskeluun vasta systeaattiseen farakologiaan perehtyisen aikana ja sen jälkeen. Luvun yärtäinen edellyttää yös kohtuullisia perustietoja fysiologiasta ja biokeiasta. 27

2 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa kuljetusproteiinit ionikanavat nukleiinihapot ohienevä sitoutuinen reseptoriin sitoutuisen keia ionisidokset vetysidokset van der Waalsin sidokset kopetitiivinen antagonisi hydrofobiset voiat it, esi. asetyylikoliiniesteraasi, joka säätelee heroston välittäjäaineena toiivan asetyylikoliinin vaikutuksen kestoa synapseissa, tai angiotensiinikonvertaasi, joka katalysoi verisuonia supistavan peptidihoronin, angiotensiini II:n, uodostusta. Tartuntataudeissa käytettävät ikrobilääkkeet vaikuttavat usein ikrobien elintärkeisiin entsyyeihin; tällä pyritään estäään ikrobien lisääntyistä tai suorastaan tuhoaaan niitä. Herosolujen välittäjäaineiden soluunotosta huolehtivat kuljettajaproteiinit, ahalaukun liakalvon solujen protonipuppu ja onet uut solukalvojen kuljettajaproteiinit ovat tärkeitä lääkevaikutusten kohdeolekyylejä. Myös solukalvojen jännitteen sääteleät ionikanavat ovat onen tärkeän lääkeaineryhän (. paikallispuudutteiden ja sydän- ja verisuonisairauksien hoidossa käytettävien kalsiukanavan salpaajien) vaikutuksen kohteena. Entsyyeihin ja kuljettajaproteiineihin vaikuttavat lääkeaineet ovat useiiten yhdisteitä, jotka estävät kohdeproteiiniensa fysiologista toiintaa sitoutualla niiden aktiivisiin keskuksiin ja estäällä fysiologisten substraattien pääsyä niihin. Useiat nykyisin käytettävien lääkeaineiden kohdeolekyylit ovat solujen toiinnalle tärkeitä valkuaisaineita, utta yös nukleiinihapot voivat välittää lääkeaineiden vaikutuksia. Monet syöpä- ja virussairauksien hoidossa käytettävät lääkeaineet sitoutuvat kohdesolujen nukleiinihappoihin ja uuttavat solujen periäaineksen toiintaa. Taulukkoon 2-1 on koottu esierkkejä lääkeaineiden kohdeolekyyleistä ja niiden kautta vaikuttavista lääkeaineista. Useiiten lääkeaineen vaikutus reseptoriin on ohienevä, ja lääkeaineen pitoisuuden pienetessä reseptorin ypäristössä reseptori-lääkeainekopleksit dissosioituvat ja lääkevaikutuksen kohteena oleva solu palautuu toiinnalliseen perustilaansa. Tilapäisesti sitoutuva lääkeaine voidaan yös syrjäyttää reseptorista yliäärällä toista yhdistettä, joka sitoutuu saoihin sitoutuiskohtiin. Ohienevästi sitoutuvaa reseptorinsalpaajaa kutsutaan kopetitiiviseksi eli kilpailevaksi antagonistiksi. Kilpailevan antagonistin aiheuttaa reseptorin, entsyyin tai kuljetusproteiinin toiinnan esto voidaan kuota suurilla agonisti- tai substraattipitoisuuksilla. Tällä on usein suuri erkitys lääkehoidon turvallisuuden kannalta ja liika-annoksen saaneiden potilaiden hoidossa. Lääkeaineiden ja niiden vaikutuksen kohteena olevien reseptoriproteiinien vuorovaikutus perustuu useiiten suhteellisen heikkoihin fysikokeiallisiin voiiin, ikä selittää sen, että sitoutuinen on ohienevä. Lääkeaineita reseptoriproteiineihin tilapäisesti kiinnittäviä voiia ovat ionisidokset ja niitä heikoat vetysidokset, jotka kuatkin perustuvat vastakkaisten sähkövarausten keskinäiseen vetovoiaan, sekä van der Waalsin sidokset, jotka perustuvat lääkeaine- ja reseptoriolekyyleissä uodostuvien lyhytaikaisten dipolien keskinäiseen vetovoiaan, ja adsorptioon perustuvat hydrofobiset interaktiot. 28

3 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit Taulukko 2-1. Esierkkejä lääkevaikutusten kohdeolekyyleistä. Kohdeolekyyli Vaikuttavia lääke- y. aineita Reseptorit Agonisteja Antagonisteja Asetyylikoliinin nikotiinireseptori Asetyylikoliini Tubokurariini Nikotiini α-bungarotoksiini β-adrenerginen reseptori Noradrenaliini Propranololi Isoprenaliini Histaiinin H 2 -reseptori Histaiini Ranitidiini µ-opioidireseptori Morfiini Naloksoni 5-HT 2A -reseptori Serotoniini Ketanseriini Dopaiinin D 2 -reseptori Dopaiini Klooriproatsiini Brookriptiini Insuliinireseptori Insuliini Ei tunneta Estrogeenireseptorit (α ja β) Etinyyliestradioli Taoksifeeni Progesteronireseptori Noretisteroni Danatsoli Ionikanavat Salpaajat Vasteenuuntajat Jännitteen sääteleät Paikallispuudutteet Veratridiini Na + -kanavat Tetrodotoksiini Munuaistiehyiden Na + -kanavat Ailoridi Aldosteroni Jännitteen sääteleät Kahdenarvoiset kationit Dihydropyridiinit Ca 2+ -kanavat (esi. Cd 2+ ) Bay K8644 ATP:n sääteleät K + -kanavat ATP Krookaliii Sulfonyyliureat GABA:n sääteleät Cl -kanavat* Pikrotoksiini Bentsodiatsepiinit Glutaaatin sääteleät (NMDA) Ditsosilpiini Glysiini kationikanavat* Ketaiini Entsyyit Estäjät Väärät substraatit Asetyylikoliiniesteraasi Koliiniasetyylitransferaasi Syklo-oksigenaasi, tyyppi 1 Syklo-oksigenaasi, tyyppi 2 Fosfodiesteraasit Neostigiini Organofosfaatit Heikoliini Asetyylisalisyylihappo Niesulidi Sildenafiili Arinoni Teofylliini Ksantiinioksidaasi Allopurinoli Angiotensiinikonvertaasi Kaptopriili Hiilihappoanhydraasi Asetatsoliaidi HMG-CoA-reduktaasi** Sivastatiini Dopadekarboksylaasi Karbidopa Metyylidopa Monoaiinioksidaasi A Moklobeidi Monoaiinioksidaasi B Selegiliini Dihydrofolaattireduktaasi Trietopriii Metotreksaatti Kuljettajaproteiinit Estäjät Väärät substraatit Koliinitransportteri Heikoliini Noradrenaliinin transportteri Trisykliset Afetaiini asennuslääkkeet Metyylidopa Kokaiini Noradrenaliinin varastorakkuloiden kuljettajaproteiini Reserpiini Heikkojen happojen kuljettajaproteiini (unuaistiehyissä) Probenesidi P 170 -glykoproteiini Verapaiili *Ligandin sääteleiä ionikanavia käsitellään tässä luvussa reseptoreina **HMG-CoA, 3-hydroksi-3-etyyliglutaryylikoentsyyi A 29

4 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa koliulotteinen selektiivisyys pysyvä kovalenttinen sitoutuinen kilpaileaton antagonisi uut vaikutusekanisit Määräaineen kiinnittyinen ääräreseptoriin perustuu usein oneen saanaikaiseen fysikokeialliseen vuorovaikutukseen. Monien lääkeainereseptorivaikutusten tarkka keiallinen selektiivisyys selittyykin suurelta osin sillä, että niissä on ukana useita sitoutuisekaniseja ja -kohtia saanaikaisesti. Esi. ( )-adrenaliini sitoutuu sydäen sykettä kiihdyttäviin β-adrenergisiin reseptoreihin useita kyeniä kertoja suurealla affiniteetilla kuin (+)- adrenaliini. Nää stereoisoeerit ovat koliulotteiselta rakenteeltaan toistensa peilikuvia; stereoisoeerien rakennetta voi havainnollistaa vaikkapa vertaaalla oikean ja vasean käden uotoa. Stereoisoeerit eivät näin ollen voi sopia sitoutuaan saalla tavoin reseptoriproteiinin uodostaaan taskuun, aivan kuten oikea käsi ei sovi vasean käden hansikkaaseen. Farakologiassa ja etenkin toksikologiassa tunnetaan reseptoreihin ohienevästi sitoutuvien aineiden lisäksi useita yhdisteitä, joiden kiinnittyinen kohdeolekyyleihinsä on pysyvää. Jos kohdeolekyyli on välittäjäaineen reseptori, entsyyi tai solukalvon kuljettajaproteiini, aiheuttaa lääkeaineen tai toksiinin kovalenttinen sitoutuinen sen pysyvän inaktivaation (poikkeustapauksissa yös pysyvän aktivaation, esi. koleratoksiini). Solun toiinnan palautuinen ennalleen edellyttää tällöin uusien proteiiniolekyylien synteesiä ja kuljettaista toiintapaikoilleen. Lääke- tai yrkkyvaikutus jatkuu tällöin usein jopa vuorokausien tai viikkojenkin ajan. Pitkäaikaisen vaikutuksen lisäksi kovalenttisella sitoutuisella on toinenkin tärkeä seurausvaikutus lääkehoidon ja yrkytysten hoidon kannalta: kovalenttisesti reseptoriin sitoutunutta antagonistia ei kyetä syrjäyttäään kohdeolekyylistään suurellakaan yliäärällä agonistia, eikä sen vaikutus näin ollen ole helposti kuottavissa. Tunnetuipia esierkkejä kohdeproteiineihinsa pysyvästi sitoutuvista lääkeaineista ja yrkyistä ovat eräät asetyylikoliinin hajoaista katalysoivan entsyyin, asetyylikoliiniesteraasin, estäjät. Näiden ns. organofosfaattien vaikutustapaa ja käyttöä lääkeaineina, hyönteisyrkkyinä ja keiallisen sodankäynnin välineinä kuvataan tarkein luvuissa 11 ja 75. Kaikkien lääkeaineiden yksityiskohtaisia olekyylitason vaikutusekaniseja ei vielä tunneta. Esi. anestesia-aineiden vaikutustavasta on esitetty useita kilpailevia hypoteesejä (ks. luku 20). Toisaalta tunnetaan yös useita esierkkejä lääkeaineista, joiden hoitovaikutus perustuu uuhun ekanisiin kuin spesifiseen vuorovaikutukseen potilaan eliistön tai potilaasta häädettävän ikro-organisin kohdeolekyylien kanssa. Aneian hoidossa käytettävät rautavalisteet edistävät verisolujen uodostusta lisääällä heoglobiinin heiosan synteesissä tarvittavan raudan saatavuutta. Ihon puhdistuksessa käytettävät desinfioivat aineet tappavat bakteereja denaturoialla ja liuottaalla niiden solurakenteita sekä osoottisella ekanisilla. Mannitolin avulla voidaan säädellä potilaan virtsaneritystä ja kallonsisäistä painetta veren ja virtsan osolaliteetin uutosten kautta. Monet uetuksen hoidossa käytettävät lääkkeet vaikuttavat suolen sisällön koostuukseen, eivät potilaan eliistön solujen toiintaan. Potilaita, joilla on haitallisen suuri äärä kolesterolia veressä, voidaan hoitaa lääkeaineilla, jotka sitoutuvat kolesteroliin suolistossa uodostaen liukeneattoan kopleksin ja siten estävät ravinnon kolesterolin ieytyistä. Eäksisiä aineita, kuten natriubikarbonaattia, käytetään aha- ja pohjukaissuolihaavan hoidossa neutraloiaan ahan sisällön happauutta. Eräitä yhdisteitä käytetään suojaavan kal- 30

5 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit von aikaansaaiseksi esi. ahalaukun liakalvoille tai pinta-aktiivisuutta alentavina aineina. Lääkehiilessä on suuri adsorboiva pinta, ja sillä voidaan yrkytystapauksissa estää onien yhdisteiden ieytyistä ruoansulatuskanavasta. Reseptori-käsitteen kehitys Reseptoreista puhui jo Paul Ehrlich aivan 1900-luvun alussa esittäessään, että yhdisteet ovat inaktiivisia, elleivät ne kiinnity tiettyihin kohdeorganisin kohtiin siten kuin osaiikin palanen sille kuuluvaan paikkaan. Ehrlichin kuuluisa postulaatti Corpora non agunt nisi fixata voidaan suoentaa seuraavasti: Aineet eivät voi vaikuttaa elleivät ne ensin sitoudu (reseptoriin). Ehrlichin ja hänen aikalaisensa, reseptori-sanaa (receptive substance) tässä erkityksessä ensiäisenä käyttäneen Langleyn, reseptori-käsite oli puhtaasti hypoteettinen, utta sellaisenakin ratkaisevan tärkeä farakologian kehittyiselle tieteenalana. Sen avulla voitiin. korvata aikaisein vallinneet aagiset käsitykset lääkeaineiden ja yrkkyjen vaikutustavoista. Reseptori-käsitteen avulla voitiin selittää, iten hyvinkin pienet lääkeannokset voivat aiheuttaa voiakkaita ja kullekin lääkeaineelle oinaisia, kohdentuneita vaikutuksia eliistön toiintaan. Lääkevaikutus voitiin nyt yärtää tavanoaisena keiallisten yhdisteiden (lääkeaineolekyylien ja kudosten akroolekyylien) välisenä fysikaalis-keiallisena vuorovaikutuksena, ilan vitaalienergian tai uiden yliaallisten voiien osallisuutta. Avogadron luvun perusteella (noin 6 x ) voidaan laskea, että yhdessä pisarassa laieaa lääkeaineliuosta, jonka pitoisuus on ol/l, on lähes lääkeaineolekyyliä; tää äärä riittää sitoutuaan suureen joukkoon reseptoreja ja aiheuttaaan erkittäviä biologisia vaikutuksia. Massavaikutuksen lain soveltainen farakologisten iliöiden tarkasteluun ahdollisti kvantitatiivisten enetelien käytön kokeellisessa farakologiassa. Lääkeaine-reseptori-interaktioita kyettiin nyt ittaaaan fysiologian ja biokeian tarjoailla ittausenetelillä ja -laitteilla, ja ittaustulosten ateaattinen analyysi ahdollisti tarkat päätelät lääkeaineiden vaikutustavoista. Lääkeaineiden vaikutusekaniseja tutkiva farakologian osa-alue, farakodynaiikan tutkius, kehittyi itsenäiseksi, uusien lääkeaineiden kehittelyn kannalta tärkeäksi biologian osa-alueeksi. Kun uudet lääkeaineet aiein oli löydetty eneän tai väheän sattualta tai periätiedon perusteella, yleensä kasvikunnan piiristä, ryhdyttiin nyt systeaattisesti uuttaaan lääkeaineolekyylien rakennetta synteettisen keian keinoin, käyttäen hyväksi kvantitatiivisilla enetelillä saatuja, lääkeaineiden rakenne-aktiivisuussuhteita kuvaavia ittaustuloksia. Vasta 1900-luvun jälkipuoliskolla saavuttivat biologisten tieteiden yleiset enetelät sellaisen tarkkuuden ja tason, että suorienkin havaintojen tekeinen lääkeainevaikutuksia välittävien reseptorien oinaisuuksista tuli ahdolliseksi. Entsyyien biokeiallinen reseptori-hypoteesi vaikutuksen kvantitatiivisuus biologisten oinaisuuksien yärtäinen 31

6 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa olekyylitason ekanisien yärtäinen tutkius edistyi nopeasti ja 1960-luvuilla, ja saaan aikaan kehitettiin lukuisia uusia lääkeaineita, joiden vaikutus perustui entsyyien estoon. Reseptorien sitoisoinaisuuksien suoran ittaaisen kehittyinen ja 1970-luvuilla ullisti horoni- ja välittäjäainereseptorien tutkiuksen (ks. tietoruutu L2). Reseptorit uodostavat hyvin pienen osan tutkiuksen kohteena olevan kudoksen tai solujoukon kokonaisproteiiniäärästä, utta reseptoreihin suurella affiniteetilla sitoutuvien lääkeaineiden leiaainen radioaktiivisella erkkiaineella ahdollisti nyt tarkat havainnot reseptorien äärästä, jakauasta kudoksissa ja sitoisoinaisuuksien farakologisesta spesifisyydestä. Biokeiallisen farakologian ja solubiologian uudet havainnot ovat viie vuosikyeninä auttaneet selvittäään onien lääkeaineiden olekyylitason vaikutusekaniseja; yöhein tässä luvussa kuvataan. guaniininukleotideja sitovien säätelijäproteiinien (G-proteiinien) erkitystä reseptorien signaalinvälityksessä ja solukalvon kuljettajaproteiinien toiintaa synapsiraon välittäjäainepitoisuuksien säätelyssä. Molekyylibiologian edistys ja 1990-luvuilla on tarjonnut ahdollisuuden onien reseptoriproteiineja koodittavien geenien eristäiseen ja kloonaaiseen ja reseptorien ainohappojärjestyksen selvittäiseen. Yhdistelä- DNA-tekniikoiden avulla voidaan nyt. tuottaa luonnossa harvinaisia reseptoriproteiineja riittävän suuria ääriä niiden rakenteen ja toiinnallisten oinaisuuksien yksityiskohtaiseksi selvittäiseksi. Reseptori-käsite on siis vajaan vuosisadan aikana kehittynyt hypoteettisesta varsin konkreettiseksi. Tosin vasta hyvin harvan reseptorin rakenne tunnetaan niin yksityiskohtaisesti, että uusien lääkeaineiden suunnittelu voisi perustua kohdeproteiinin rakenteen yksityiskohtien hyödyntäiseen. Eräät entsyyit toiivat jälleen farakologian uusien suuntausten tienraivaajina: ns. rationaalinen lääkeainesuunnittelu pyrkii käyttäään kiteytettyjen entsyyiproteiinien (. asetyylikoliiniesteraasin ja angiotensiinikonvertaasin) koliulotteisesta rakenteesta saatua tietoa pohjana uusien lääkeolekyylien tietokoneavusteisessa suunnittelussa. Seuraavassa kuvaillaan lääkeaine-reseptorivuorovaikutuksia kahdella eri tavalla, ensin yksinkertaistettujen ateaattisten allien avulla ja sitten biokeiallisesta näkökulasta. Lääkevaikutusten kvantitatiivinen kuvaus Sitoutuinen ja vaste lääkeainereseptorikopleksi Jotta lääkeaine aiheuttaisi biologisen vaikutuksen, vasteen, on sen ensin kiinnityttävä reseptoriin. Kun reseptori tunnistaa aineen ja 32

7 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit sitoo sen, uodostuu lääkeaine-reseptorikopleksi: R + L k 1 Tään yhtälön kuvaaja on suora, jota on paljon helpopi käsitellä graafisesti ja ateaattisesti kuin hyperbolisen sitoutuisfunktion kuvaajaa. Saatu lineaarinen kuvaaja tunnetaan Rosenthalin (tai Scatchardin) kuvaajan niellä (tietoruutu L2). Siitä voidaan sekä graafisesti että laskennallisesti äärittää tärkeät sitoutuisvakiot K D ja B ax. Tasapainovakio K D kuvaa lääkeaineen affiniteettia, hanakkuutta sitoutua reseptoriin. K D voidaan äärittää yös toisella tavoin kuin sitoutuneen ja vapaan lääkeaineen suhteellisia osuuksia ittaavan sitoutuiskokeen ja Rosenthalin kuvaajan avulla. Jos pienen, ei-saturoivan lääkeaineäärän sitoutuista reseptoriin seurataan ajan funktiona, voidaan äärittää lääkeaine-reseptorikopleksin uodostuisnopeus ja sitä kuvaava assosiaatiovakio k 1. Vastaavasti voidaan äärittää lääkeaine-reseptorikopleksin dissosiaatiovakio k -1 ittaaalla kopleksin hajoaisnopeus koejärjestelyssä, jossa tasapainotilassa oleva lääkeaine-reseptorikopleksi hajoaa joko laientaisen vaikutuksesta tai koska toinen, kilpaileva lääkeaine estää reseptorista irtoavan leiatun lääkeaineen uudelleen sitoutuista. Tasapainovafg k -1 RL Kaavassa R on reseptori, L on sitoutuva ligandi (lat. ligare = sitoa) ja RL on syntynyt kopleksi. Kahden olekyylin vuorovaikutuksena kuvattu lääkeaineen tai uun ligandin ohienevä sitoutuinen reseptoriin (B, binding, kuvaa syntyneen kopleksin RL äärää) noudattaa usein assavaikutuksen lakia, ja sitä voidaan tällaisessa yksinkertaisessa tapauksessa kuvata Languirin yhtälöllä (1) B = B ax [L] [L] + K D jossa B ax on sitoutuispaikkojen kokonaisäärä tutkittavassa kohteessa (eli yös suurin ahdollinen sitoutuneiden olekyylien äärä), [L] on vapaan ligandin pitoisuus ja K D on sitoutuisaffiniteettia kuvaava tasapainovakio. Tää yhtälö voidaan järjestää uotoon B B ax B (2) = [L] K D K D affiniteetti 33

8 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa kion suuruus on näin ääritettyjen dissosiaatio- ja assosiaatiovakioiden suhde (3) K D = k -1 k 1 annosvasteisuus Tietoruudussa L2 kuvatuilla reseptoriinsitoutuiskokeilla on selvitetty lukuisien eliistön oien viestiolekyylien ja lääkeaineiden kohteena olevien reseptorien oinaisuuksia. Reseptoriin sitoutuiselle on usein tyypillistä hyvin suuri affiniteetti: sitoutuinen saattaa kyllästyä jo nanoolaaristen (10-9 M) pitoisuuksien alueella. Reseptorien pitoisuus kudoksissa (B ax ) on useiiten hyvin pieni, joitakin kyeniä tai satoja fetoooleja (10-15 oolia) kudoksen proteiiniilligraaa kohti eli uutaia iljoonasosia tutkittavan kudoksen tai solukon kokonaisproteiiniäärästä. Radioaktiivisesti leiattujen lääkeaineiden avulla on pystytty saaaan yksityiskohtaista tietoa reseptorien oinaisuuksista, jakautuisesta kudoksissa ja säätelystä, vaikka suoria havaintoja ei ole pystytty tekeään reseptoriproteiinien vähäisen äärän vuoksi. Joissakin tapauksissa farakologisen vaikutuksen (vasteen) voidaan katsoa kuvastavan lääkeaineen sitoutuista reseptoriin saalla tavoin kuin entsyaattisen reaktion tuote kuvastaa entsyyin ja substraatin välistä reaktiota. Massavaikutuksen lain ukaan reaktio on tällöin suorassa suhteessa reagoivan reseptorin äärään. Kun lääkeainetta annetaan pienehköjä utta vaikuttavia annoksia, lisääntyy vaste suorassa suhteessa lääkeannoksen kasvuun. Annosten suuretessa vasteen lisääntyinen kuitenkin vähenee, ja lopulta annoksen lisäys ei enää lisää saavutettavaa vastetta, koska kaikki reseptorit ovat jo käytössä. Tällaisessa tapauksessa iliö on tosin useiiten havainnoitavissa ainoastaan in vitro, farakologisissa kokeissa, eristetyillä elinvalisteilla tai kudos- tai solunäytteillä annosvastekuvaaja on seuraavan yhtälön (4) ukainen hyperbeli. Suurten annosten uut vaikutukset estävät tavallisesti annos-vastekuvaajan täydellisen tarkastelun kokonaisissa koe-eläiissä ja ihisissä. (4) E = E ax D D + ED 50 Yhtälössä (4) E on todettu vaste lääkeannoksella D, E ax on lääkeaineella saavutettavissa oleva aksiivaste ja ED 50 on lääkeannos, joka aiheuttaa vasteen, jonka suuruus on puolet aksiivasteesta. In vitro -koealleissa annoksen (D) sijasta käytetään tavallisesti lääkeaineen pitoisuutta koevalisteessa (C). Vaste voidaan suhteuttaa lääkeainepitoisuuteen yös in vivo -koejärjestelyissä, jos lääkeai- 34

9 TIETORUUTU L2 LÄÄKEAINEIDEN SITOUTUMINEN RESEPTORIIN Radioaktiivisesti leiattujen lääkeaineiden tai uiden reseptoriin sitoutuvien erkkiaineiden avulla saadaan tietoa reseptorien sitoutuisoinaisuuksista. Kuvasarjassa A esitetään koe, jossa saturoiva äärä erkkiainetta sitoutuu kaikkiin solukalvovalisteessa oleviin reseptoreihin. Sitoutuaton erkkiaine erotetaan sitoutuneesta esi. suodattaalla. Solukalvovalisteeseen jääneen erkkiaineen äärä (ooleina) iloittaa nyt näytteessä olevien reseptorien äärän, koska kukin reseptori on sitonut yhden lääkeaineolekyylin. Jos koe toistetaan erkkiaineen eri pitoisuuksilla, saadaan tulokseksi kuvan B ukainen saturaatiokuvaaja. Reseptoriin sitoutuneen erkkiaineen äärä lisääntyy erkkiaineen pitoisuuden lisääntyessä, kunnes kaikki reseptorit ovat iehitettyinä. Saturaatiokuvaajasta voidaan äärittää reseptorien kokonaisäärä näytteessä (B ax ) ja erkkiaineen sitoutuishanakkuutta kuvaava affiniteettivakio K D. Kun vapaan erkkiaineen pitoisuus kokeessa on K D :n suuruinen, on puolet näytteessä olevista reseptoreista iehitettyinä. Saturaatiokokeen tulokset voidaan uuntaa lineaarisen kuvaajan uotoon Rosenthalin (tai Scatchardin) yhtälön avulla (yhtälö (2) s. 33). Tällöin B ax on suoran leikkauspiste X-akselilla ja K D on suoran kulakertoien negatiivinen käänteisluku (K D = -1/k) (kuva C). Käytännössä saturaatiokoetta varten tarvitaan kahdet näytteet kutakin erkkiaineen pitoisuutta varten, sillä osa erkkiaineesta sitoutuu tutkittavaan näytteeseen epäspesifisesti, uualle kuin tutkiuksen kohteena olevaan reseptorijoukkoon. Epäspesifinen sitoutuinen itataan lisääällä näytteeseen erkkiaineen ohella yliäärä toista lääkeainetta, joka sitoutuu saoihin reseptoreihin ja estää erkkiaineen sitoutuisen niihin. Tällöin todettava sitoutuinen kuvastaa erkkiaineen epäspesifistä sitoutuista. näytteen proteiineihin ja suodatinpaperiin. Kuvien B ja C ukaisissa analyyseissä käytetään havainnoitavana uuttujana 35

10 TIETORUUTU L2 spesifisesti sitoutuneen erkkiaineen äärää, joka saadaan vähentäällä havaitusta kokonaissitoutuisesta edellä kuvatulla tavalla ääritetty epäspesifinen sitoutuinen. Sitoutuiskokeilla voidaan yös tutkia reseptorien farakologisia oinaisuuksia ja lääkeaineiden reseptorispesifisyyttä. Kuvasarjassa D tutkittava lääkeaine A kilpailee radioaktiivisen erkkiaineen L kanssa sitoutuisesta näytteessä oleviin reseptoreihin. Mitä suurepi on aineen A affiniteetti reseptoriin, sitä pienepänä pitoisuutena se kykenee estäään erkkiaineen sitoutuisen. Lääkeaineiden A 1 A 4 affiniteetteja reseptoriin voidaan verrata kuvan E ukaisessa koejärjestelyssä, jossa ääritetään, kuinka suuren osuuden radioaktiivisen erkkiaineen sitoutuisesta tutkittavien aineiden pitoisuudet kykenevät estäään. Pitoisuus, joka estää puolet erkkiaineen sitoutuisesta, on tutkittavan aineen A affiniteettia koetilanteessa luonnehtiva suure IC 50. Varsinainen affiniteettivakio K I voidaan helposti äärittää Chengin ja Prusoffin yhtälön avulla: IC 50 K I = 1 + [L]/K D jossa K I on tutkittavan aineen affiniteettivakio, [L] vapaan erkkiaineen pitoisuus ja K D erkkiaineen affiniteettivakio. Edellä kuvatun kaltaisia sitoutuiskokeita voidaan tehdä paitsi solukalvonäytteillä, yös. kokonaisilla soluilla, liukoisilla reseptoreilla ja kudosleikkeissä olevilla reseptoreilla. Vapaan ja sitoutuneen erkkiaineen erottainen toisistaan on järjestettävä kullekin näytetyypille parhaiten sopivalla tavalla. Kuvassa F nähdään α 2 -adrenergisten reseptorien jakautua kahdessa hiiren aivojen leikkeessä. Kuva-analyysin ja tritiustandardien avulla voidaan äärittää sitoutuneen radioaktiivisuuden äärä eri alueilla ja. B ax ja K D. Merkkiaine on [ 3 H]RX (kuva: M. Kulatunga, Turun yliopisto). Mika Scheinin F. TÄHÄN TULEE VÄRIKUVA HIIREN AIVOISTA 72x42 36

11 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit neen pitoisuus vaikutuspaikassa tunnetaan. Yhtälö saa tällöin uodon (5) E = E ax C C + EC 50 Tää yhtälö on täysin analoginen yhtälön (1) kanssa, joka kuvaa assavaikutuksen lain ukaista kahden olekyylin ohienevää sitoutuisreaktiota. Yhtäläisyys voidaan tulkita siten, että lääkevaste on suorassa suhteessa sitoutuisen äärään. Tällaista lääkeainereseptorivuorovaikutuksen luonnetta kuvaa ns. hallussapitoteoria eli iehitysteoria (occupancy theory). Englantilaisen A. J. Clarkin esittäessä 1930-luvulla tään lääkevaikutuksia kuvaavan kvantitatiivisen allin ei lääkeaineen sitoutuista reseptoriin pystytty havainnoiaan suoraan ja käsitys reseptorien toiinnasta perustui toisaalta lääkeaineiden vaikutuksia koskeviin kvantitatiivisiin havaintoihin, toisaalta sitoutuistapahtuan luonnetta koskeviin teoreettisiin pääteliin. Radioaktiivisilla erkkiaineilla suoritetut kokeet ovat osoittaneet allin oikeaksi onien reseptorien osalta. Sitoutuisvakio K D (yhtälöstä 1) kuvaa affiniteettia, hanakkuutta, jolla lääkeaine sitoutuu reseptoriin. Jos K D on pieni, on sitoutuisaffiniteetti suuri, ja päinvastoin. Lääkeaineen pitoisuuden ollessa yhtä suuri kuin K D puolet reseptoreista on iehitettyinä. Vastaavasti ED 50 ja EC 50 kuvaavat lääkeaineen vaikutuksen voiakkuutta. Jos ED 50 (tai EC 50 ) on pieni, riittää pienikin lääkeannos (tai -pitoisuus) aiheuttaaan voiakkaan vasteen. ED 50 :n suuruisella lääkeannoksella (tai EC 50 :n suuruisella lääkepitoisuudella) saavutetaan ääritelän ukaan puolet kyseisellä lääkeaineella saavutettavasta aksiivasteesta. Verrattaessa reseptoreja aktivoivan lääkeaineen (agonistin) sitouista reseptoreihin ja sen aiheuttaaa farakologista vastetta saassa kudos- tai soluvalisteessa todetaan kuitenkin usein, että K D on selvästi suurepi kuin EC 50 ; puolet aksiivasteesta saavutetaan siis lääkepitoisuudella, joka iehittää selvästi väheän kuin puolet reseptoreista. Maksiivaste on tällöin yös saavutettavissa sellaisella lääkeainepitoisuudella, joka iehittää vain osan reseptoreista koevalisteessa. Tää johtuu siitä, että vaste ei ole välitön seuraus lääkeaineen sitoutuisesta reseptoriin, vaan sen syntyyn vaikuttavat onet reseptorille oinaiseen oniportaiseen signaalinvälitysketjuun kuuluvat iliöt. Kun agonisti sitoutuu reseptoriin, on tähän liittyvä reseptoriproteiinin konforaation uutos vain ensiäinen vaihe kohdesolun biokeiallisessa tapahtuaketjussa, joka johtaa vasteen syntyyn. Solun signaalinvälitysketjun tehokkuus ja lääkeaineen aiheuttaan vasteen suuruus ääräytyvät. reseptorien ja ketjun uiden koponenttien absoluuttisesta ja suhteellisesta äärästä solussa. Jos reseptoreja on eneän kuin itä tarvitaan aktivoiaan reseptorien toiinnasta riippuvainen solun signaalinvälitysjärjestelä hallussapitoteoria affiniteetti ja vaste yliääräreseptorit 37

12 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa aksiaalisessa äärin, riittää aksiivasteen saavuttaiseen, että osa reseptoreista on agonistin iehittäiä. Tällöin EC 50 on pienepi kuin K D. Tilanne voi olla saa, jos reseptorin solussa laukaisea biokeiallinen vaste kestää olennaisesti pidepään, kuin itä reseptori on agonistin iehittäänä. Yliääräreseptorien (spare receptors) oleassaolo tulee selvästi esille paitsi verrattaessa agonistin EC 50 - ja K D -arvoja, yös vastetta ittaavissa kokeissa, joissa pysyvästi sitoutuva reseptorinsalpaaja on inaktivoinut osan reseptoreista (ks. jäljepää). Fysiologisesti erkittävä seuraus yliääräreseptorien oleassaolosta on, että sellainenkin agonisti, jonka sitoutuu reseptoriin elko pienellä affiniteetilla, kykenee aiheuttaaan aksiivasteen jo elko pienenä pitoisuutena. Vasteet ovat näin nopeain ohjattavissa, sillä heikkoaffiniteettinen agonisti irtoaa reseptorista nopeasti, kun sen pitoisuus reseptorin ypäristössä alkaa pienetä. Voiakas affiniteetti aiheuttaisi hitaan irtoaisen reseptorista ja pitkittyneen vasteen. Esi. sydäen β-adrenergisista reseptoreista jopa 90 % on tarpeettoia aksiivasteen saavuttaiselle, utta yliääräreseptorit saattavat olla tärkeitä katekoliaiinien sydänvaikutusten dynaaisen ohjailun kannalta. antagonisti osittaisagonisti teho voiakkuus agonisin perusta konforaation uutos oskilloivan konforaation lukitseinen Lääkeaine, joka sitoutuu reseptoriin, utta ei aktivoi sitä eikä siis aiheuta vastetta, on vaikutukseltaan antagonisti eli reseptorinsalpaaja. Antagonistien farakologinen vaikutus perustuu siihen, että ne estävät agonistien (eliistön oien viestiolekyylien tai toisten lääkeaineiden) vaikutukset reseptoriin. Useista reseptorijärjestelistä tunnetaan yös yhdisteitä, joilla saavutettavissa oleva aksiivaste on vain osa tehokkaiilla agonisteilla saavutettavasta vasteesta. Tällaisia yhdisteitä kutsutaan partiaalisiksi eli osittaisagonisteiksi. Lääkeaineen teho (efficacy, intrinsic activity) kuvastaa sillä saavutettavissa olevan aksiivasteen suuruutta. Täyden agonistin teho on 1 ja reseptorinsalpaajan teho on 0 eli sillä ei ole vastetta. Osittaisagonistin teho on suurepi kuin 0 utta pienepi kuin 1. Osittaisagonistin ukanaolo heikentää yös täydellä agonistilla saavutettavia vasteita, sillä osa reseptoreista on osittaisagonistin iehittäinä täyden agonistin saavuttaattoissa; osittaisagonisti toiii tässä tilanteessa antagonistin tavoin. Jos reseptoreja on yliäärin, voi osittaisagonistikin aiheuttaa täyden biologisen vasteen. Lääkevaikutuksen voiakkuus (potency) viittaa pitoisuuteen, jolla lääkeaine kykenee aiheuttaaan tietyn vasteen, esi. puolet aksiivasteesta (EC 50 ). Voiakkuus ja teho ovat toisistaan riippuattoia suureita. Voiakkuuden ja tehon käsitteitä havainnollistetaan kuvassa 2-1. Agonisin olekulaarisena perustana on pidetty lääkeaineiden kykyä aiheuttaa reseptoriproteiinin konforaation eli uodon uutos. Täysi agonisti aiheuttaa reseptorin uodon uutoksen, joka johtaa reseptorin sääteleän signaalinvälitysketjun aktivaatioon. Vastaavasti osittaisagonistin aiheuttaa uutos reseptorissa johtaa signaalinvälitysketjun toiinnan osittaiseen tai lyhytaikaiseen aktivaatioon. Vaihtoehtoinen näkeys tulkitsee ligandi-reseptorivuorovaikutusta reseptoriproteiinin erilaisten toiinnallisten tilojen perusteel- 38

13 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit Kuva 2-1. A. Lääkeaineiden voiakkuus ja teho ovat toisistaan riippuattoia käsitteitä. Asetyylikoliinilla ja asetyylitiokoliinilla on tässä koejärjestelyssä saa teho, eli kuallakin saavutetaan aksiivaste. Asetyylikoliini on kuitenkin voiakkaapi agonisti kuin asetyylitiokoliini, eli sen EC 50 on pienepi kuin asetyylitiokoliinin EC 50. Butyryylikoliinilla saavutettava aksivaste on selvästi pienepi, eli butyryylikoliini toiii osittaisagonistina, jonka teho on > 0 utta < 1. B. Siuloituja pitoisuus-vaikutuskuvaajia: lääkeaineilla on saa teho, utta erilainen voiakkuus (ja affiniteetti, jota kuvaa suure pd 2 ). C. Siuloituja pitoisuus-vaikutuskuvaajia: lääkeaineilla on saa affiniteetti (kaikkien pd 2 = 5.0), utta erilainen teho (α). la (kuva 2-2). Vapaa reseptori voi olla joko aktiivisessa tai inaktiivisessa tilassa tai uodossa. Reseptoriproteiinin aktiivinen ja inaktiivinen konforaatio vaihtelevat spontaanisti. Inaktiivinen uoto on noraalisti vallitseva, eikä iehittäätön reseptori yleensä osoita havaittavaa biologista aktiivisuutta. Agonisti sitoutuu ensisijaisesti reseptorin toiinnallisesti aktiiviseen uotoon ja lukitsee reseptorin tähän tilaan. Siten aktiivisen uodon osuus koko reseptorijoukosta lisääntyy, ja kun se on kasvanut riittävän suureksi, syntyy biologinen vaste. Reseptorinsalpaajana toiiva neutraali antagonisti sitoutuu yhtä hanakasti kupaankin reseptorin uotoon, ja tällöin vapaan aktiivisen uodon äärä ja ahdollisuus agonistin sitoiseen vähenevät. Osittaisagonisti kykenee sitoutuaan kupaankin reseptorin toiinnalliseen uotoon, utta se suosii aktiivista uotoa. Agonistin tehon äärää näin ollen se, illainen suhteellinen sitoutuisaffiniteetti sillä on aktiiviseen ja inaktiiviseen reseptoriin. Joidenkin antagonistien sitoutuinen suosii inaktiivista uotoa. Silloin antagonistin sitoutuinen voi heikentää reseptoriproteiinin biologista aktiivisuutta siihen tilanteeseen verrattuna, että koko reseptoripopulaatio olisi iehittäättöänä. Tällaisia antagonisteja kutsutaan käänteisagonisteiksi (inverse agonist), koska ne aiheuttavat varsinaisiin reseptoriagonisteihin verrattuna vastakkaisen biologisen vasteen. Iliö on kuvattu jo onissa in vitro -koealleissa ja eläinkokeissa in vivo. Käänteisagonistien erkitys hoidossa on vielä selkiytyätön, utta niillä voi olla terapeuttista erkitystä. tilanteissa, joissa reseptorien fysiologinen säätely on häiriintynyt esi. geeniutaation seurauksena. Kuva 2-2. Kaksitilaalliin perustuva käsitys ligandi-reseptorivuorovaikutuksen luonteesta. A. Reseptori voi olla inaktiivisessa (R) tai aktiivisessa (R*) tilassa; L = ligandi; K R = tasapainovakio, joka kuvaa reseptorin R- ja R*-uotojen suhteellista osuutta, kun ligandi ei ole sitoutuneena reseptoriin; K L ja K L * ovat tasapainovakioita, jotka kuvaavat ligandin affiniteettia reseptorin R- ja R*-uotoihin. B. Agonisti lisää R*-uodon osuutta reseptorien kokonaisäärästä, koska sen sitoutuinen suosii R*-uotoa ja estää reseptorin spontaania inaktivaatiota. Käänteisagonisti vaikuttaa vastakkaisella tavalla, sillä sen sitoutuinen suosii R-uotoa. Käänteisagonisti lukitsee reseptorin R-tilaan ja vähentää R*:n osuutta. Neutraaliantagonisti ei uuta R- ja R*-uotojen suhteellisia osuuksia, utta se estää vastetta agonisteille pienentäällä vapaan R*:n äärää. 39

14 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa Kilpaileva ja kilpaileaton reseptorinsalpaus kilpaileva antagonisi kilpaileaton antagonisi Lineweaverin Burkin kuvaaja Kun eliistössä on antagonistia, osa reseptoreista on agonistin saavuttaattoissa ja vaste tiettyyn agonistiannokseen tai pitoisuuteen on heikentynyt. Agonistin annosta on tällöin lisättävä alkuperäisen vasteen aikaansaaiseksi. Jos agonistin logaritiseksi uunnettu annos-vastekuvaaja siirtyy antagonistin lisääisen jälkeen oikealle alkuperäisen suuntaisena, puhutaan kilpailevasta eli kopetitiivisesta antagonisista. Esierkki tästä on kuvassa 2-3: kun adrenaliinia annetaan kilpailevan antagonistin, dihydroergotaiinin, kanssa, täytyy adrenaliinin annoksen olla suurepi kuin pelkkää adrenaliinia annettaessa, jotta saataisiin saa vaste. Agonistin annoksen lisääinen siis kuoaa kilpailevan antagonistin vaikutuksen. Antagonisia kutsutaan kilpaileattoaksi eli ei-kopetitiiviseksi silloin, kun agonistilla saavutettava aksiivaste jää alkuperäistä pieneäksi antagonistin vaikutuksen vuoksi. Tätä havainnollistaa kuva 2-4: adrenaliiniannoksen lisääinen ei palauta kaniinin dibenaiinilla käsitellyn valtiopreparaatin supistusta alkuperäiselle tasolle. Dibenaiini on adrenaliinin kilpaileaton antagonisti. Dibenaiini sitoutuu kovalenttisesti verisuonten supistusta välittäviin α-adrenergisiin reseptoreihin. Koska tää sidos on pysyvä, agonistin lisäys ei kykene syrjäyttäään antagonistia ja palauttaaan aksiivastetta. Antagonisin luonnetta kuvataan farakologisessa tutkiuksessa usein käyttäällä hyväksi entsyyien luonnehtiisessa käytettyä Lineweaverin Burkin graafista enetelää. Koska agonisti riittävänä annoksena aiheuttaa aksiivasteen yös silloin, kun vaikuttaassa on kilpaileva antagonisti, kuvassa 2-5A olevien kuvaajien on leikattava toisensa kohdassa, jossa agonistin pitoisuus on ääretön ja kaikki reseptorit ovat ukana reaktiossa, siis y-akselilla. Kilpaileattoassa antagonisissa agonistin E ax pienenee suhteessa vapaiden reseptorien äärän väheneiseen. Tästä seuraa, että kuvaajan ja y-akselin leikkauskohta nousee ja oleat kuvaajat yhtyvät x-akselilla (kuva 2-5B). Kuva 2-3. Kilpaileva antagonisi: dihydroergotaiinin vaikutus adrenaliinin logaritiseen pitoisuus-vastekuvaajaan. Vaste on α-adrenergisten reseptorien välittää kaniinin aorttasuikaleen sileän lihaksen supistus in vitro. 40

15 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit Kuva 2-4. Kilpaileaton antagonisi: dibenaiinin vaikutus adrenaliinin logaritiseen pitoisuus-vastekuvaajaan. Vaste on α-adrenergisten reseptorien välittää kaniinin aorttasuikaleen sileän lihaksen supistus in vitro. Kilpailevia antagonisteja voidaan farakologisissa koealleissa luonnehtia ns. Schildin analyysin avulla. Jos agonistin pitoisuus C aiheuttaa tietyn vasteen yksin sitä käytettäessä, tarvitaan saaan vasteeseen suurepi pitoisuus C, kun ukana on yös antagonisti pitoisuutena I. Näiden kahden agonistipitoisuuden suhteen avulla voidaan äärittää antagonistin dissosiaatiovakio K I : C I = + 1 C K I Reseptorinsalpaajien oinaisuuksia voidaan tällä tavoin vertailla kvantitatiivisesti. Antagonistin K I on ääritettävissä varsin yksinkertaisesti. Jos kokeessa esi. C on kaksi kertaa niin suuri kuin C, on K I yhtä suuri kuin antagonistin pitoisuus. Schildin yhtälöstä voidaan yös päätellä, että reseptorinsalpauksen aste on riippuvainen antagonistin pitoisuudesta; lääkevaikutuksen voiakkuuden ja keston äärää siis lääkeaineen pitoisuus vaikutuskohdassa, ja tähän puolestaan vaikuttaa. lääkeaineen eliinaationopeus. Reseptorinsalpauksen biologinen vaikutus on riippuvainen yös agonistin pitoisuudesta. Näitä käytännön lääkehoidon toteuttaisen kannalta tärkeitä riippuvuuksia käsitellään yöhein. β-adrenergisten reseptorinsalpaajien ja katekoliaiinien vaikutusten yhteydessä (ks. luku 15). Lääkeaineet voivat vaikuttaa eliistössä vastakkaisesti, vaikka niiden vaikutuskohteena eivät olekaan saat reseptorit. Tällöin antagonisia kutsutaan fysiologiseksi. Esierkki tästä on adrenaliinin keuhkoputkia laajentava ja histaiinin niitä supistava vaikutus. Keiallisessa antagonisissa agonisti ja antagonisti reagoivat keskenään, eivätkä reseptorit tai solujen uut oat ekanisit ota tähän osaa. Niinpä esi. rautayrkytyksen hoitoon käytetty deferoksaiini uodostaa rautaionien kanssa kelaatin, joka poistuu eliistöstä nopeasti unuaisten kautta. Kuva 2-5. Kilpaileva (A) ja kilpaileaton (B) antagonisi kuvattuna graafisesti Lineweaverin ja Burkin ukaan. Yhtenäinen viiva = agonisti yksin; katkoviiva = agonisti ja antagonisti yhdessä. fysiologinen antagonisi keiallinen antagonisi 41

16 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa Reseptorien biokeia: lääkevaikutusten kohdeolekyylit ja solutason vaikutusekanisit Biokeian ja olekyylibiologian uudet enetelät ja tutkiustulokset ovat etenkin 1970-luvulta alkaen ullistaneet käsitykset lääkevaikutusten kohdeolekyyleistä ja lääkeaineiden solutason vaikutusekaniseista. Lääkevaikutusten yärtäisessä on saavutettu aivan uusi konkreettisuuden aste, kun onia kohdeproteiineja koodittavat geenit on kyetty eristäään ja sen kautta selvittäään kohdeolekyylien rakennetta ja toiintaa. Saalla on valjennut, kuinka oniuotoista eliistön signaalinvälitys on ja iten onella tavalla ja tasolla siihen voidaan pyrkiä vaikuttaaan lääkeaineiden avulla. Seuraavassa tarkastellaan lääkevaikutusten kannalta tärkeipien reseptoriproteiinien biokeiallisia ja solubiologisia oinaisuuksia. Reseptorigeenien kloonaus ja reseptoriperheet neljä reseptoriperhettä reaktionopeus Reseptorigeenien kloonaus on tuonut ratkaisevalla tavalla tietoa reseptorien rakenteesta. Saalla on tunnistettu useita satoja aiein kokonaan tunteattoia reseptoreja ja reseptorialatyyppejä. Reseptorigeenien löytäinen ja karakterisointi on auttanut kehittäään yksiselitteisen reseptorien luokituksen, joka perustuu ensi sijassa reseptoriproteiinien rakenteeseen. Aiepi, toiinnallisilla perusteilla tehty jako neljään reseptoriperheeseen solukalvolla sijaitseviin ionikanavareseptoreihin, G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin ja entsyyireseptoreihin sekä solunsisäisiin, DNA:han sitoutuviin reseptoreihin näyttää pätevän yös uuden, reseptoreja koodittavien geenien kloonaukseen perustuvan rakennetiedon valossa (taulukko 2-2). Ionikanavareseptorit reagoivat tyypillisesti illisekunneissa soluvälitilan välittäjäainepitoisuuksien uutoksiin. G-proteiinikytkentäisten reseptorien välittäät vasteet tulevat tavallisesti esille sekuntien kuluessa reseptorin aktivoituisesta. Insuliinia y. kasvu- Taulukko 2-2. Reseptorien neljä päätyyppiä. Ionikanavareseptorit G-proteiinikytkentäiset Entsyyireseptorit Tuareseptori reseptorit Sijainti Solukalvo Solukalvo Solukalvo Tua Vasteenvälittäjä Ionikanava Entsyyi tai ionikanava Entsyyi Geenien aktiivisuuden säätely Kytkentä Suora G-proteiinien kautta Suora DNA:n kautta Esierkkejä Nikotiinireseptorit Muskariinireseptorit Insuliinireseptori Steroidireseptorit GABA A -reseptorit Adrenergiset reseptorit ANP-reseptorit 42

17 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit tekijöitä sitovien tyrosiinikinaasireseptorien ja. steroidihoroneja sitovien tuareseptorien vaikutukset ilenevät solujen toiinnan uutoksina usein vasta tuntien tai jopa päivien kuluttua. Eri reseptoriperheisiin kuuluvat reseptorit poikkeavat suuresti toisistaan sekä rakenteeltaan että toiinnaltaan. Solunsisäisten vasteenvälittäjien eli toisiolähettien tasolla esiintyy kuitenkin erkittävää vuorovaikutusta eri reseptorityyppien välillä. Solujen pääasialliset tavat reagoida reseptorien aktivaatioon ovat toisaalta eritys- ja supistustoiinnan uutokset (neuronit, rauhas- ja lihassolut), toisaalta uutokset proteiinien ja DNA:n synteesissä ja solujen jakautuisessa. Reseptorien aktivaation vaikutus näihin toiintoihin välittyy useiiten viie kädessä solun kalvojännitteen, solunsisäisen Ca 2+ -pitoisuuden, proteiinien fosforylaation tai geenien ilentyisen uutosten kautta. Reseptoriperheiden sisällä onet proteiinien rakenteen ja biokeiallisen toiintatavan oinaispiirteet ovat sen sijaan hyvinkin saanlaisia. Reseptoriperheiden jäseniä koodittavat geenit ovat ileisesti alun perin syntyneet kahdentualla fylogeneettisesti varhaisista geeneistä, joilla lienee useiiten ollut alkeellisepien eläänuotojen viestiolekyylien toiintaan liittyviä tehtäviä; viestiolekyylien oniuotoistuinen ja eliistön signaalinvälitykseen lajien kehityksen aikana kohdistuneet suuret vaatiukset ovat vähitellen evoluution kautta lisänneet reseptorigeenien lukuäärää ja uokanneet niiden rakennetta. Kuvissa 2-6 ja 2-7 esitetään reseptoriperheiden tyypillisten edustajien rakenne ja toiintaperiaate vahvasti yksinkertaistettuna. erot ja interaktiot yhteiset vaikutustavat perheiden sisäiset yhtäläisyydet Kuva 2-6. Reseptorien luokittelu reseptoriperheisiin rakenteen ja toiintatavan ukaan. R = reseptori; G = guaniininukleotideja sitova säätelijäproteiini, G-proteiini; E = entsyyi; = lääkeaine tai fysiologinen ligandi. 43

18 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa Kuva 2-7. Reseptoriperheiden tyypillisten edustajien proteiinirakenne kaavaaisesti esitettynä. Suorakaiteen uotoiset osat koostuvat noin 20 ainohaposta, jotka uodostavat solukalvon sisään sijoittuvan α-kierteisen peptidijakson. nikotiinireseptorit Ionikanavareseptorit Ligandin sääteleät solukalvojen ionikanavat toiivat onien herovälittäjäaineiden,. asetyylikoliinin, glutaaatin, GABA:n ja glysiinin reseptoreina. Välittäjäaineen sitoutuinen reseptoriin avaa ionikanavan, niin että sille tyypillinen ionivirta pääsee kulkeaan solukalvon läpi ionien tasapainotilan suuntaan. Ionivirtojen seurauksena solukalvon sähköinen potentiaali uuttuu. Eksitoivat asetyylikoliini- ja glutaaattireseptorit aiheuttavat solukalvon depolarisaation lisääällä reseptoriproteiineissa olevien kationikanavien ioninläpäisevyyttä. Kun depolarisaatio saavuttaa tietyn kynnystason, avautuvat yös kalvon jännitteen sääteleät kationikanavat, josta seuraa kalvon nopea depolarisaatio ja aktiopotentiaalin synty. Inhibitoriset GABA- ja glysiinireseptorit aiheuttavat päinvastaisen vaikutuksen, hyperpolarisaation, kuljettaalla Cl - virtoja ionitasapainon suuntaan solun sisään. Hyperpolarisaatio estää aktiopotentiaalin syntyä. Nikotiinireseptorit ovat parhaiten tunnettuja ionikanavareseptoreja. Hero-lihasliitoksessa tavattavia otoristen herojen välittäjäaineen, asetyylikoliinin, reseptoreja kutsutaan nikotiinireseptoreiksi, koska asetyylikoliinin ohella yös nikotiini kykenee aktivoiaan ne. Nikotiinireseptorit ovat solukalvon kationikanavia, jotka koostuvat viidestä peptidiosasesta. Niiden väliin jäävä kanava läpäi- 44

19 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit see solukalvon (kuva 2-8). Nikotiinireseptorien rakenne tunnetaan hyvin, sillä tätä reseptoriproteiinia on erittäin runsaasti sähkörauskun (Torpedo arorata) sähköeliessä (jopa % solukalvojen kokonaisproteiinista). Reseptoriproteiini on kyetty puhdistaaan ja kiteyttäään tästä lähtöateriaalista, ja elektronidifraktion avulla on saatu elko tarkka kuva reseptorin koliulotteisesta rakenteesta. Sähköelien ja hero-lihasliitoksen nikotiinireseptorit uodostuvat neljästä erilaisesta peptidiosasesta α, β, γ ja δ. Kussakin reseptorissa on kaksi α- osasta. Kanava avautuu, kun oleat α-osaset sitovat asetyylikoliiniolekyylin. Aivojen ja autonoisen heroston ganglioiden nikotiinireseptorit koostuvat kahdesta α-osasesta ja kolesta β-osasesta. Nää voivat uodostaa lukuisia erilaisia yhdisteliä, sillä neuronaalisia α-osasia on ainakin seitseää ja β-osasia kolea eri tyyppiä. Näin uodostuvien reseptorialatyyppien fysiologiset ja farakologiset erikoispiirteet ovat vielä suureksi osaksi tunteattoia. Lepotilassa reseptorin kanava on suljettuna. Ligandin sitoutuinen ja reseptoriproteiinin konforaation uutos avaa kanavan. Molekyylitasolla nikotiinireseptorien toiinta perustuu kationinläpäisevyyden säätelyyn. Muut ionikanavareseptorit ovat yleiseltä rakenteeltaan nikotiinireseptorien kaltaisia, joskaan kaikista ei vielä tiedetä, uodostuvatko ne neljästä vai viidestä peptidiosasesta. Kationikanavien avautuinen depolarisoi postsynaptisen kalvon; siksi nikotiini- ja glutaaattireseptorien aktivaatio vaikuttaa soluihin ek- Kuva 2-8. Asetyylikoliinin nikotiinireseptorin oletettu rakenne. A. Kukin reseptori koostuu peptidialayksiköistä, joissa hydrofobisten ainohappojen uodostaat jaksot asettuvat α-kierteiksi solukalvon sisään. Rikkisillat ääräävät solunulkoisen osan uodon. B. Peptidiosasten tertiäärirakenne on globulaarinen proteiini, josta osa pistää esiin solukalvosta. C. Reseptorin poikkileikkaus solukalvon tasossa. Ionikanava uodostuu viiden peptidiosasen väliin. D. Elektronidifraktioon perustava esitys reseptorin rakenteesta. 45

20 Yleisfarakologiaa ja -toksikologiaa jännitteen sääteleät ionikanavat sitoivasti. Anionikanavien avautuinen hyperpolarisoi solukalvon; GABA A - ja glysiinireseptoreilla on siksi solutasolla inhiboiva vaikutus. Kanavien ioniselektiivisyys, saoin kuin niiden selektiivisyys aktivoivien ja salpaavien ligandien suhteen, perustuu niiden erilaiseen peptidirakenteeseen. Lääkeaineet voivat vaikuttaa yös jännitteen sääteleien ionikanavien toiintaan. Toisin kuin ligandin sääteleät ionikanavat, nää solukalvojen kanavaproteiinit eivät toii fysiologisten välittäjäaineiden reseptoreina. Esi. sydänlihassoluissa jännitteen sääteleät L-tyypin Ca 2+ -kanavat osallistuvat keskeisellä tavalla sydänlihassolujen sähköisen ärtyvyyden ja supistusvoian säätelyyn. Verisuonten sileän lihaksen depolarisaatio ja supistuinen ääräytyvät yös L- tyypin Ca 2+ -kanavien välittäästä Ca 2+ :n sisäänvirtauksesta. Ca 2+ -kanavien toiintaa estävät lääkeaineet, ns. kalsiukanavan salpaajat, ovat tärkeässä aseassa sydän- ja verisuonitautien lääkehoidossa. Paikallispuudutteet laaavat johtuista heroissa estäällä Na + -ionien kulkua solukalvon läpi. Sekä Ca 2+ -kanavien salpaajat että puudutteet estävät kationikanavien toiintaa sitoutualla ionikanaviin siten, että ionien läpipääsy estyy. Tunnetaan yös yhdisteitä, kuten Bay K8644, jotka sitoutuvat uualle kanavaproteiineihin ja lisäävät Ca 2+ -kanavien aukiolon todennäköisyyttä. Ca 2+ -kanavien avaajien vaikutukset ovat päinvastaiset kuin kalsiukanavan salpaajien: ne lisäävät sydänlihassolujen supistusvoiaa ja supistavat verisuonia. G-proteiinikytkentäiset reseptorit Kuva 2-9. Kryoelektroniikroskoopilla saatu elektronitiheyskartta kiteytetystä rodopsiinista. Mebraanin sisään sijoittuvat peptidijaksot nähdään tihentyinä, joiden väliin retinaalin sitoutuistasku jää. Lähde: Schertler y., Nature 363:770-2, Hasterin β 2 -adrenerginen reseptori oli ensiäinen G-proteiinikytkentäinen reseptori, jonka ainohappojärjestys selvitettiin kloonaaalla sitä koodittava geeni (v. 1986) ja jonka proteiinirakenteesta voitiin ryhtyä esittäään arveluja. Vaikka yhdenkään varsinaisen reseptoriproteiinin rakennetta ei vielä olekaan kyetty visualisoiaan fysikaalisin enetelin, esi. röntgenkristallografian avulla, on käsitys reseptorien rakenteesta vuosi vuodelta tarkentunut. Kaikille G-proteiinikytkentäisille reseptoreille yhteisessä rakenneallissa reseptoripolypeptidi uodostaa seitseän solukalvon läpäisevää jaksoa, joiden väliset sillat ovat sytoplasaan ja solun ulkopinnalle työntyviä silukoita (kuva 2-7). Malli pohjautuu. ainohappojen fysikaaliskeiallisten oinaisuuksien perusteella suoritettuun tietokoneallitukseen, jonka avulla voidaan ennustaa hydrofobisten ainohappojaksojen uodostaien kierteisten rakenteiden sijainti solukalvossa ja hydrofiilisten jaksojen hakeutuinen nesteypäristöön. Tää ns. hydropaattisuusanalyysi paljasti yllättäen, että β 2 -adrenergisen reseptorin oletettu rakenne uistutti toisen G-proteiinikytkentäisen signaaleja välittävän kalvoproteiinin, rodopsiinin, rakennetta. 46

21 2. Lääkeaineiden vaikutusekanisit: reseptorit Rodopsiini on onnistuttu alustavasti kiteyttäään, ja sen kiderakenteen analyysi tukee esitettyä rakenneallia. Kuvassa 2-9 on esitetty rodopsiinin kryoelektroniikroskooppikuva, jossa tään valoaistiusta välittävän reseptoriproteiinin runko-osa on kuvattu kohtisuoraan silän verkkokalvon sauvasolujen kalvon pintaa vasten. Kierteiset, hydrofobiset ainohappojaksot, jotka kuvan 2-7 allissa nähdään jonoon purettuina sivulta päin, nähdään nyt seitseänä tiivistyänä päältä päin. Mallista voidaan ennustaa, itkä ainohapot uodostavat kierteiden väliin jäävän taskun, johon valoreseptorin ligandi, retinaaliolekyyli, kiinnittyy. Tää reseptorialli on saanut tukea. tutkiuksista, joissa on käytetty spesifisiä vastaaineita tunnistaaan solukalvon ulko- ja sisäpuolisia β 2 -reseptorin osia. G-proteiinikytkentäisten reseptorien geeniperhe on varsin suuri siihen kuuluu useita satoja reseptorigeenejä ja se voidaan proteiinirakenteen ja reseptoreja aktivoivien ligandien perusteella jakaa useisiin alaperheisiin (kuva 2-10). Kohdennetun utageneesin avulla on selvitetty, itkä reseptorien osat sitovat ligandeja ja itkä välittävät vaikutuksia G-proteiineihin. Ligandeja sitovat rakenneosat alaperheissä ovat varsin erilaisia. Tää on helposti yärrettävissä, kun ajattelee, iten erilaisia ligandeja ne ovat kehittyneet tunnistaaan (kuva 2-10). Retinaali ja adrenergisiin reseptoreihin sitoutuvat katekoliaiinit ovat suhteellisen pieniä olekyylejä, ja niinpä ne kykenevät tavoittaaan reseptoriensa runko-osan sisään jäävän taskun. Rodopsiini poikkeaa välittäjäaine- ja horonireseptoreista siinä suhteessa, että sen ligandi, retinaali, on koko ajan paikalla sitoutuistaskussa. Fotoni aiheuttaa rodopsiinin sisällä olevan retinaalin isoerisaation inaktiivisesta trans-uodosta aktiiviseen cis-uotoon. Valon aiheuttaa retinaalin konforaation uutos aiheuttaa näin reseptoriproteiinin konforaation uutoksen, joka johtaa reseptorin aktivaatioon ja signaalin syntyyn. Rodopsiinin perusteella arveltiin, että katekoliaiinien ja uiden pieniolekyylisten välittäjäaineiden reseptoreissa tapahtuisi saalla tavoin reseptoriproteiinin konforaation uutos ja reseptorin ak- rodopsiini alaperheet ligandeja sitova osa Kuva Ligandien sitoutuiskohdat G-proteiinikytkentäisissä reseptoreissa. Rodopsiinin ligandi on retinaali, joka on koko ajan sitoutuneena reseptoriin. Saapuvat fotonit aiheuttavat retinaalin isoerisaation ja reseptorin aktivaation. Trobiini katkaisee reseptoriproteiinin, jolloin uodostuva uusi ainopää toiii ligandina, joka aktivoi reseptorin runkoosan. Lähde: Coughlin, Curr Opin Cell Biol 6:191-7,