RET-geenin vaikutus hermostopienan solujen vaellukseen

Transkriptio

1 RET-geenin vaikutus hermostopienan solujen vaellukseen Anastasia Immonen Hammaslääketieteen kandidaatti Kehitysbiologian laitos Helsinki Tutkielma Ohjaaja: Prof. Hannu Sariola Helsingin Yliopisto Lääketieteellinen tiedekunta

2 1 HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Laitos Institution Department Lääketieteellinen tiedekunta Kehitysbiologian osasto Tekijä Författare Author Hlk Anastasia Immonen Työn nimi Arbetets titel Title Ret-geenin vaikutus hermostopienan solujen vaellukseen. Oppiaine Läroämne Subject Lääketiede, kehitysbiologia. Työn laji Arbetets art Level Tutkielma Aika Datum Month and year Sivumäärä -Sidoantal - Number of pages 3+31 Tiivistelmä Referat Abstract Tutkimuksen tavoitteena oli ensisijaisesti oppia kanan alkion manipuloinnin tekniikka ja tutkia sen avulla hermostopienan solujen vaellusta kehittyvässä alkiossa. Toinen tavoite oli tarkastella Ret-geenin mutaation (C634R) vaikutusta hermostopienan migraatiokaavaan. Tutkittu Ret-geenin mutaatio aikaansaa geenin tuotteen uudenlaisen toiminnankuvan, jolloin tuloksena voi olla syöpäsairaus. Tutkimus suoritettiin käyttämällä kanan alkiota. Kananmunia haudottiin inkubaattorissa sopivaan kehitysvaiheeseen, minkä jälkeen alkiota käsiteltiin kuoreen tehdyn aukon kautta. Mikroskoopin avulla alkion kehittyvään hermostoputkeen ruiskutettiin plasmidi- Dna:ta, joka sisälsi gfp-geenin sekä joko tutkittavan geenimutaation tai villityypin geenin. Plasmidin siirron jälkeen alkio elektroporoitiin, jotta siirretty perimäaines pääsisi alkion solujen sisään proteiinisynteesin alkamiseksi. Gfp:n fluoresoivan ominaisuuden avulla voitiin jälkitarkastelussa seurata plasmidin geenien ilmentymistä. Tutkimustulosten perusteella voidaan todeta tarkastellun Ret-geenin mutaation aiheuttavan hermostopienan solujen vaelluskaavioon häiriöitä verrattuna kontrolliin. Häiriöitä olivat mm. solujen rykelmäinen ryhmittyminen sekä hermostopienan solujen vaelluksen paikoittainen katkeaminen ja hajanaisuus. Tutkimusaineiston suppeuden vuoksi, mitään varmoja johtopäätöksiä suoritetun tutkimuksen perusteella ei voida vielä tehdä, vaan asia vaatii lisää tutkimuksia. Avainsanat Nyckelord Keywords Ret, neural crest, migration, chick embryo, gene transfer, electroporation, gfp. Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information

3 2 Tiivistelmä... 1 Sisällysluettelo Johdanto Hermostopiena Hermostopienan muodostuminen ja vaellus Hermostopienan erilaistuminen ja johdannaiset Ret Kanan alkio malliorganismina Tutkimusaineisto Tutkimusmenetelmät Kananmunien valmistelu ja inkubointi Kananmunan kuoren manipulointi ja alkion valmistelu DNA:n siirtoon DNA:n siirto alkioon Elektroporointi ja alkion sulkeminen DNA:n inkorporoitumisen seuranta Alkioiden jatkokäsittely Tutkimusvälineistö Vaikeudet Tulokset Pohdinta Lähteet Liitteet Kaavakuva kanan alkion hermostopienan muodostumisesta Kanan alkion hermostopienan johdannaiset Eräitä hermostopienan johdannaisia Villityypin Ret-konstruktin ekspressio alkiossa Villityypin Ret-konstruktin ekspressio alkiossa Gfp:n ekspressio alkiossa Gfp:n ekspressio alkiossa 2a Gfp:n ekspressio alkiossa 2b Gfp:n ekspressio alkiossa 2c C634R ekspressio alkiossa C634R ekspressio alkiossa C634R ekspressio alkiossa

4 3 1 Johdanto Hermostopiena Hermostopiena (neural crest, NC) on alkion hermostolevyn reunoilla oleva kohouma, josta neurulaation yhteydessä irtoaa soluja, jotka vaeltavat eri puolille kehittyvää alkiota ja muodostavat erilaisia rakenteita. Hermostopienan solut (neural crest cells, NC solut) erilaistuvat pinnan ektodermistä hermostolevyn ja ihon väliin lähes koko alkion pituudelta. Hermostoputken sulkeutumisen aikoihin NC-solut käyvät läpi varhaisen määräytymisen ja jakautumisen, minkä jälkeen ne irtaantuvat hermostolevystä ja alkavat vaeltaa kohti lopullista päämääräänsä. Ennen migraatiota ne muuttuvat epiteliaalisista mesenkymaalisiksi ja tällöin ne menettävät hermostolevylle tyypilliset adheesiomolekyylit (N-Cam, N-kadheriini ja kadheriini-6b) ja alkavat ilmentää hermostopienalle tyypillisiä adheesiomolekyylejä (kadheriini-6, -7 ja -11). Hermostopienan solujen vaellukseen vaikuttavat erilaiset soluväliaineen molekyylit, mm. laminiinit, fibronektiinit, kollageenit ja proteoglykaanit. (1, 13) Hermostopienan muodostuminen ja vaellus Hermostopienan induktio näyttää riippuvan ektodermistä ja ei-aksiaalisesta mesodermistä peräisin olevista signaaleista. Näiden signaalien arvellaan käynnistävän hermostopienan soluissa ohjelman, joka muuttaa solujen transkriptionaalista aktiviteettia, adheesiota, solun tukirangan koostumusta sekä solu-ekstrasellulaaritilan interaktion luonnetta. Näiden tapahtumien seurauksena NC-solujen identiteetti muuttuu ja niiden muuttuminen epiteliaalisista mesenkymaalisiksi käynnistyy. Tällöin solun aktiini-tukirangassa tapahtuu uudelleenjärjestäytymistä, epiteelisoluille ominainen polariteetti menetetään ja solujen välisissä liitoksissa tapahtuu muutoksia. Tämän lisäksi NC-solujen tyvikalvo hajoaa ja nämä tapahtumat helpottavat solujen irtoamista

5 4 hermostolevyn reunoilta. Vaikka eri geenien osallisuutta em. tapahtumiin on tutkittu ja todettu, niin vielä selittämättömäksi jää näiden geenien osallistumisjärjestys sekä NCsolujen erilaisten ominaisuuksien yhdistyminen. (15) Linnuilla hermostopienan solut irtoavat dorsaalisilla alueilla migraatioon vasta hermostoputken sulkeutuessa, mutta nisäkkäillä migraatio alkaa jo hermostokourun muodostuessa (Liite 2). Kanan alkiossa hermostoputken sulkeutuminen alkaa tulevan keskiaivon tasolta ja sulkeutuminen tapahtuu ko. kohdasta molempiin suuntiin. Linnuilla pään alueen hermostoputken sulkeutuminen indusoituu vartalon hermostoputken sulkeutumista aiemmin. Näin ollen yläpään hermostoputken muodostuessa, hännän alueella on vielä gastrulaatio meneillään. (14, 25) Hermostopiena muodostuu hermostoputken ja epidermiksen väliin silloin kun sen muodostukseen tarvittavien signaloivien molekyylien parakriinisten tekijöiden - pitoisuus on riittävä, näitä ovat BMP:t, Wnt:t ja FGF:t. Nämä parakriiniset tekijät indusoivat ryhmän transkriptiotekijöitä, joita kutsutaan hermostolevyn reunojen määrittelijöiksi (the neural plate border specifiers). Tämän ryhmän molekyylit, mm. Pax3 ja Distalless-5, estävät kyseisestä kudosaluetta erilaistumasta epidermiksi tai hermostolevyksi. Lisäksi ryhmän molekyylit indusoivat tulevan hermostopienan soluihin toisen ryhmän transkriptiotekijöitä, mm. Slug ja FoxD3, joita kutsutaan hermostopienan määrittelijöiksi (the neural crest specifiers). FoxD3 on tärkeä tekijä, joka määrittelee ektodermaaliset solut hermostopienan soluiksi, kun taas Slug-proteiinia vaaditaan hermostopienan solujen irtoamiseen epiteelistä ja vaelluksen alkamiseen. Slug:n yksi tehtävistä on aktivoida tekijöitä, jotka erottavat hermostopienan soluja yhdistävät E-kadheriini-molekyylit. Nämä liitosproteiinit esiintyvät normaalisti hermostopienan solujen pinnalla, mutta niitä vaimennussäädellään vaelluksen aikana. Kuitenkin vaelluksen jälkeen hermostopienan solut aloittavat uudelleen kadheriinien ekspression ryhmittyessään lopulliselle sijaintipaikalleen. (25) (Liite 1) Hermostopienan vaellus ohjautuu soluväliaineen ja naapurisolujen erittämien signaalimolekyylien avulla. Tietyt soluväliaineen proteiinit, kuten fibronectin, laminin, tenascin, monet kollageenit ja proteoglykaanit, sallivat hermostopienan solujen

6 5 vaelluksen niiden kautta. Tällöin vaeltavat NC-solut alkavat ilmentää 1- integriiniproteiinia, joka sitoutuu moniin soluväliaineen proteiineihin. Tämän integriinimolekyylin ilmentyminen on tärkeää, koska sen sitoutuminen soluväliaineen proteiineihin ohjaa vastairtautuneiden hermostopienan solujen liikettä ja eloonjäämistä. Ilman 1-proteiinia irronneet NC-solut eksyvät ja usein kuolevat apoptoosilla. Toinen tärkeä vaellusta edistävä proteiini on soluväliaineen Thrombospondin, johon NC-solut kiinnittyvät ja migroituvat. Tietyt soluväliaineen proteiinit, mm. ephrin ja semaphorin- 3F, puolestaan estävät hermostopienan vaellusta ja tällä tavoin myös osallistuvat hermostopienan migraation ohjaamiseen. (16, 25) Hermostopienan erilaistuminen ja johdannaiset Hermostopienan erilaistuminen eri kudoksiksi määräytyy sen mukaan, mitä reittiä solut vaeltavat ja mihin ne asettuvat. Soluväliaineen molekyylien lisäksi ympäröivien solujen viestit, kuten monet neurotrofiset tekijät, säätelevät hermostopienan solujen eri alalajien jakautumista ja eloonjäämistä. (12, 18, 25, 30) Pään hermostopiena kulkeutuu kiduskaariin ja taka-aivojen jaokkeelliset rakenteet, rombomeerit, muodostavat siitä erilaisia soluvirtoja. Näistä erillisistä soluvirroista kukin osallistuu tietyn kudoksen muodostamiseen. Pään hermostopienan määräytymiseen vaikuttavat myös taka-aivojen ja kiduskaarten epiteelin erittämät signaalit. Pään NC osallistuu kallon, kasvojen luiden ja rustojen muodostukseen. (Liite 2) Ruumiin hermostopienan solut vaeltavat kahta pääreittiä pitkin: pinnan epiteelin alla sekä hermostoputken ja somiittien välistä. Pinnan epiteelin alla kulkevat NC-solut muodostavat melanosyyttejä ja toista reittiä kulkevat solut muodostavat mm. selkäydinhermosolmut, autonomisen ääreishermoston, Schwannin solut, lisämunuaisen ytimen ja aorttaa ympäröivät hermosolut. (18, 27, 28)

7 6 Sydämen hermostopienan solut ovat peräisin taka-aivojen alueelta, josta ne vaeltavat kiduskaarten kautta kehittyvään sydänputkeen. Sydämen NC-solut muodostavat mm.ulosvirtauskanavien sydänlihassolut ja aortankaaren sileän lihaksen sidekudossolut. (Liite 1) 1.2 Ret Ret on proto-onkogeeni, joka koodaa reseptorityrosiinikinaasia. Ret-geeniä ekspressoituu pääsääntöisesti hermostopienan soluista peräisin olevissa kudoksissa sekä urogenitaalisoluissa. Sitä tarvitaan monien solulinjojen mm. perifeerisen hermoston, munuaisen morfogeneesin ja spermatogeneesin kypsymiseen ja kehittymiseen. Kehityksen aikana Ret ekspressoituu mm. vaeltavassa hermostopienassa. (19, 21, 24) Ret:n koodaama tyrosiinikinaasi on solukalvon lävistävä reseptoriproteiini. Proteiinin rakenne koostuu kolmesta osasta: solunulkoisesta kysteiinirikkaasta ligandeja sitovasta rakenteesta, hydrofobisesta kalvon läpäisevästä osasta ja solunsisäisestä rakenteesta, johon kuuluu tyrosiinikinaasiosa. Ret:n proteiinista on olemassa kolme isoformista muotoa, joka johtuu vaihtelevasta RNA:n silmukoinnista. Näissä eri muodoissa solunsisäiseen tyrosiinikinaasiosaan liittyy joko 51, 43 tai 9 aminohappoa. Proteiinin loppupään mukaan näitä muotoja nimetään Ret51, Ret43 tai Ret9 nimillä. Näistä Ret9 ja Ret51 ovat vallitsevat muodot ja ne esiintyvät eläinkunnan eri lajeissa. Vaikka kyseessä onkin saman proteiinin hieman erilainen aminohappokoostumus, niin Ret51:n ja Ret9:n fysiologiset vaikutukset ovat osin erilaiset. Esimerkiksi, jos hiireltä puuttuu Ret51-muoto, niin ne kehittyvät normaalisti, mutta Ret9-muodon puuttuessa hiirillä esiintyy munuaisten epämuodostumia ja suoliston hermotuksen häiriöitä, samalla tavalla kuin hiirillä, joilta Ret puuttuu kokonaan. (19, 21, 26) Ret-reseptorityrosiinikinaasin ligandina toimivat GDNF (glial cell line derived neurotrofic factor) perheen kasvutekijät. GDNF-kasvutekijät ovat mm. troofisia molekyylejä selkäytimen motorisille neuroneille ja sentraalisen hermoston noradrenergisille neuroneille, ne ylläpitävät ja indusoivat osan perifeeristen neuroneiden

8 7 erityisesti sympaattisten, parasympaattisten, enteeristen ja sensoristen- erilaistumista, niillä on tärkeä rooli munuaisten kehityksessä ja spermatogeenisten kantasolujen solukohtaloiden säätelyssä. Ret ei kuitenkaan pysty aktivoitumaan pelkästään GDNFproteiinien läsnäollessa, vaan siihen vaaditaan GFR (GDNF-family receptor- ) proteiini, joka on yleensä solukalvon pintaan kiinnittynyt lisäreseptori. Ret reseptorityrosiinikinaasi pystyy sitomaan vasta GDNF/GFR kompleksin, josta seuraa Ret-reseptorin tyrosiinikinaasi-osien aktivaatio. Aktivaatiossa GDNF/GFR -kompleksi saa aikaan Ret-tyrosiinikinaasireseptorin kahden osan dimerisoitumisen, jolloin solunsisäisen tyrosiinikinaasi-osan tyrosiini-aminohappotähteissä tapahtuu transfosforylaatio, joka puolestaan johtaa solunsisäiseen signallointiin. GDNFkasvutekijät voivat tietyissä neuroneissa ja gliasoluissa signalloida ilmankin Retreseptoria muiden solukalvon lävistävien proteiinien avulla. Vastaavasti Ret-reseptorin on todettu aktivoituvan muistakin kasvutekijöistä kuin GDNF:stä, esimerkiksi hermokasvutekijöistä. (19, 21, 25, 26, 29) Ret-geeni voi mutatoitua monella tavalla, jotka voidaan jakaa vaikutuksensa mukaan kahteen luokkaan: gain-of-function mutaatiot ja loss-of-fuction mutaatiot. Gain-offunction mutaation seurauksena ovat syöpä-oireyhtymät MEN 2A ja 2B (multiple endocrine neoplasia) sekä FMTC (familial medullary thyroid carcinoma). MEN 2A ja 2B syndroomissa esiintyvät osittain eriävät oireet. MEN 2A:n oireisiin kuuluvat kilpirauhasen C-solujen hyperplasia ja kilpirauhasen ytimen karsinooma, lisämunuaisen feokromosytooma ja ytimen hyperplasia sekä lisäkilpirauhasen hyperplasia ja adenooma. MEN 2B:hen puolestaan kuuluvat samat kilpirauhasen oireet ja lisämunuaisen hyperplasia, mutta lisäksi ruoansulatuskanavan ja silmien-ihon ganglioneuromatoosi sekä megakoolon. Loss-of-function -mutaatiosta puolestaan seuraa Hirschprungin tautia ja koolonin aganglionoosia, joka ilmenee vastasyntyneillä vaikeana ummetuksena ja megakoolonina. Ret-mutaatiot ovat hyvä esimerkki fenotyyppisestä heterogeenisyydestä. (1, 8, 17, 19, 20, 21, 22, 23)

9 8 1.3 Kanan alkio malliorganismina Kanan (Gallus domesticus) alkiota on käytetty paljon selkärankaisten kehitystä koskevissa tutkimuksissa. Suosituksi mallin tekee sen helppo saatavuus ja kudosten helppo käsiteltävyys, mahdollisuus kehityksenaikaiseen manipulointiin sekä alkion helppo kasvatus in ovo. Kanan alkiot kasvavat myös melko pitkän ajan lasimaljalla, kananmunan ulkopuolella. Kananmuna-mallin avulla on voitu tutkia kehityksen aikaisia solujen kohtaloita käyttäen erilaisia tekniikoita, esim. kana-viiriäinen kimera, paikallinen väriaineella leimaaminen, molekyylitason häiriöt mm. proteiinihelmien implantoimisella tai siirtämällä plasmidi-dna:ta in ovo elektroporaation avulla. (13) Koska kanan immunologinen puolustus on alkiovaiheessa vielä kehittymätön, voidaan alkioita manipuloida geneettisesti myös virusten avulla. (1, 8, 25) 2 Tutkimusaineisto Tutkimus suoritettiin käyttämällä kananalkioita. Tutkimuksen aikana manipuloitiin useiden satojen kananalkioiden hermostoputkia injisoimalla niihin mutatoitunutta dna:ta ja kontrolligeenejä plasmidivektorissa. (10) Lisäksi muutama sata kananmuna-alkiota käytettiin kontrolleina sopivien kasvatus-olosuhteiden määrittämiseksi. Geenimanipuloituja alkioita kasvatettiin inkubaattorissa määrätyn ajan, jonka jälkeen kyseiseen vaiheeseen asti elossa säilyneet alkiot irrotettiin kananmunasta ja fiksoitiin PFA:han. Alkiot kuvattiin tavallisessa valossa ja ultraviolettivalossa gfp:n tutkimiseksi. Tämän jälkeen kyseisistä alkioista tehtiin leikkeitä joko vibratomilla tai mikrotomilla. Leikkeet värjättiin joko vasta-aineilla tai hematoksyliini-eosiini värjäyksellä. Tämän jälkeen leikkeitä tarkasteltiin ja kuvattiin pimeäkenttämikroskoopilla ja valomikroskoopilla riippuen värjäystavasta. Tutkimuksessa kului keskimäärin 50 kananmunaa viikossa ja koko tutkimuksen aikana käytettiin noin 500 kananmunaa. Kananmunat tilattiin samasta kanalasta kahden viikon välein 90 munan erissä. Kanalasta saapuneet, samana päivänä munitut, hedelmöittyneet kananmunat siirrettiin kuljetuksen jälkeen viileäkaappiin, jossa oli vakioitu lämpötila.

10 9 Ne kananmunat, joita ei käytetty tutkimukseen, poistettiin viileäkaapista kahden viikon kuluttua niiden saapumisesta. Viileäkaapissa ylläpidettiin jatkuvasti kosteutta avonaisen vesiastian avulla. Saapuneista kananmunista keskimäärin noin 10 % oli hedelmöitymättömiä, kongenitaalisesti mutatoituneita tai kaksosia, eikä näitä munia näin ollen voitu hyödyntää tutkimuksessa. 3 Tutkimusmenetelmät Kananmunien valmistelu ja inkubointi Tutkimukseen käytettävät kananmunat pyrittiin ottamaan huoneenlämpöön viileäkaapista puolisen tuntia ennen inkuboinnin aloittamista. Munien tylppään päähän merkittiin lyijykynällä yksilöintitunnus, inkuboinnin aloituspäivämäärä ja kellonaika, jolloin munat asetettiin inkubaattoriin. Inkubaattorissa pyrittiin ylläpitämään tasaista lämpötilaa ja kosteutta. Lisäksi inkubaattorin rotaatio-ominaisuutta käytettiin hyväksi edistämään kananalkioiden tasaista kehitystä. Jos kananmunia rotatoitiin inkuboinnin aikana, niin ne asetettiin kennoihin terävä kärki ylöspäin. Tällöin kaksi tuntia ennen kananmunien käyttämistä tutkimuksessa ne täytyi asetella horisontaaliseen asentoon, jotta alkion havaitseminen ja käsittely onnistuisi paremmin. Jos taas munia ei rotatoitu, niin ne inkuboitiin alusta lähtien horisontaalisessa asennossa terävä kärki lievästi koholla ja ennen inkuboinnin aloittamista munien kylkeen vedettiin lyijykynällä merkkiviiva alkion myöhemmän löytämisen mahdollistamiseksi. Näin alkio siis kehittyi merkkiviivan alapuolelle tai sen välittömään läheisyyteen. Kananmunia inkuboitiin tuntia.

11 Kananmunan kuoren manipulointi ja alkion valmistelu DNA:n siirtoon Aseptisuudesta huolehdettiin desinfioimalla työpiste ja välineistö 70%:lla etanolilla, jonka tarkoituksena on vähentää alkion altistumista mikrobiflooralle. Myös kananmunan kuori desinfioitiin samalla liuoksella juuri ennen kuoren avaamista. Ennen kuoren avaamista, kananmunan terävään päähän tehtiin isolla neulalla reikä ja kananmunasta aspiroitiin ruiskuun noin 5ml albumiinia kuoren avaamisen ja alkionkäsittelyn helpottamiseksi. Ruiskulla tehty reikä sinetöitiin myrkyttömällä teipillä tai kirurgisella teipillä. Teipin laadulla oli suuri merkitys, koska monet liimaavat aineet sisältävät toksisia aineita, jotka liukenevat albumiiniin ja täten vaikuttavat alkion kehitykseen ja mahdollisesti voivat aiheuttaa alkion kuoleman. Alkion manipulointia varten tehtiin 2cm x 3cm kokoinen aukko kananmunan kylkeen. Mitä pienempi on avaus, sitä parempi, koska pienemmällä avauksella voidaan säilyttää paremmin kananmunan normaalit olosuhteet, millä on puolestaan suotuisa vaikutus alkion kehitykseen. Alkio paljastettiin leikkaamalla soikea pala kananmunan kuorta pois terävillä ja käyrillä preparointisaksilla. Jos avaus osui kohdalleen, niin aukosta oli nähtävissä keskellä keltuainen ja sen päällä hentona juosteena alkio. Kuoren avauksen jälkeen alkio siirrettiin alustassaan mikroskoopin alle ja seuraavat toimenpiteet suoritettiin mikroskoopin avulla. (3, 4) Jotta alkio erottuisi paremmin, alkion alle keltuaiseen injisoitiin itsevalmisteisella erittäin ohuella lasisella kapillaarineulalla Pelikan Drawing ink 17-black -musteen ja PBS-liuoksen seosta. Tämä seos sekoitettiin niin, että valmiissa liuoksessa oli 5ml PBSliuosta (fosfaatti puskuri liuos) ja 100 l mustetta. Liuos sai aikaan alkion korostumisen harmaata taustaa vasten. (9) Musteen aiheuttama alkion ventraalipuolelle lokalisoitunut värikontrasti ei kuitenkaan kestä kauan, vaan se diffundoitui muutamassa minuutissa koko keltuaiseen, mikä taas heikensi alkion erottamista, joten DNA:n siirto hermostoputkeen oli tehtävä viivytyksettä. Ennen DNA:n injisoimista alkion päälle tiputettiin pipetillä noin 2ml PBS-liuosta, johon oli lisätty Penisilliini-streptomysiini seosta (PBS-Pen.Strep.-liuos) mikrobiflooran kasvun hillitsemiseksi. Samalla liuoksen

12 11 lisäyksellä estetään alkion kuivuminen sekä lisätään etäisyyttä alkiolevyn ja sen päällä olevan Vitallinen membraanin (ruskuaiskalvo) välillä. Tämä antibioottiliuos sekoitettiin lisäämällä kahteen desilitraan PBS-liuosta 1ml penisilliini-stremptomysiiniä. Vitallinen membraani peittää alkiota kauttaaltaan, joten alkion manipulointi edellyttää kalvon poistamisen halutulta alueelta. Tutkimuksessa Vitallinen membraania käsiteltiin kahdella tavalla: siihen tehtiin viilto koko alkion pituudelta, mikä mahdollisti manipulaation koko alkion pituudelta, mutta tällöin alkio oli suojaamaton ulkomaailmalta ja kuivumiselta. Toinen tapa oli tehdä alkion manipulointiin halutulle alueelle pieni viilto Vitallinen membraaniin, jolloin alkio pysyi kalvon suojissa suurimmilta osin, mutta DNA:n siirto oli vaativampaa. Tutkimuksen suorittamisen jälkeen voidaan todeta, että alkion elonjäämisen kannalta aukko Vitallinen membraanissa on paras menetelmä, mutta tutkijalle haasteellisempi DNA:n siirron ja sen seurannan kannalta. Tutkimuksessa viilto Vitallinen membraaniin tehtiin insuliiniruiskun kärjellä, joka oli varsin toimiva ratkaisu, eikä se ohuutensa ja siroutensa vuoksi vaurioittanut alkiolevyä. Muissa kananmunamallia käyttäneissä tutkimuksissa viilto tehtiin erityisellä mikroskalpellilla, joka valmistettiin itse hiomalla tavallista ompeluneulaa Arkansas-kivellä DNA:n siirto alkioon Alkion paljastuksen jälkeen alkiota taas kostutetaan PBS-pen.strep.-liuoksella ja määritetään alkion kehitystaso Hamburgerin ja Hamiltonin kehitysasteikon mukaisesti. Tavoitteena on 9. kehitysaste, jolloin alkiossa hermostokouru on keskikohdastaan alkanut jo sulkeutumaan, mutta anteriorinen ja dorsaalinen pää ovat vielä avonaiset. Alkion kehitysaste pystyttiin päättelemään laskemalla somiittien lukumäärä: yhdeksännessä kehitysasteessa niitä on yhdeksän paria. (11) Tutkimuksessa injisoitava Dna-vektori muodostui plasmidista, jossa oli tutkittava geeni ja/tai reportteri-geeni, joka tässä tapauksessa oli Gfp (green fluorescent protein). (5, 6, 10) Aluksi tutkimuksessa injisoitiin hermostoputkeen ainoastaan Gfp:ia, jolloin näistä alkioista tuli kontrollialkioita. Tutkimuksen keskivaiheessa päätettiin injisoida Gfp-

13 12 geenin lisäksi villityypin Ret-geeniä ja lopuksi tutkittiin Ret:n gain-of-function mutaatiota C634R-geeniä. (8, 9) Tarkoituksena oli seurata miten kukin geenityyppi vaikuttaa NC-solujen migraatioon. Gfp-geenin avulla voitiin varmistua geeninsiirron onnistumisesta ja seurata sitä ilmentävien NCC:n migraatiota. Valmis Dna-vektoriseos vietiin imupipetin avulla lasiseen itsevalmistettuun ohueeseen onttoon kapillaarineulaan, joka vietiin varovasti alkion hermostoputken sisälle. Kun mikroskoopilla tarkastellen varmistettiin neulan pään olevan hermostoputken sisällä eikä kudoksessa, seos voitiin injisoida. Dna-seos oli värjätty siniseksi, millä voitiin varmistaa seoksen tasainen jakautuminen koko putken pituudelta tai jääminen juuri ruiskutusalueelle. Seoksen ulospuhalluksessa kapillaarineulasta oli tärkeää, ettei putkeen muodostu kuplia, jotka voivat vaikuttaa alkionkehitykseen tai pahimmillaan repäistä aukon ohueeseen alkioon Elektroporointi ja alkion sulkeminen Dna:n ruiskutuksen jälkeen vektori pitää saada siirtymään ympäröiviin soluihin, mikä tehtiin elektroporaation avulla. Kun Dna on injisoitu hermostoputkeen, elektroporaattorin elektrodit asetetaan välittömästi alkion molemmin puolin kevyeeseen kosketukseen ja alkiota elektroporoidaan viidesti 30 V jännitteellä 5 ms:n ajan. Elektrodit olivat aseteltu tarkalleen 4 mm etäisyydelle toisistaan. Elektroporoinnin vaikutuksesta solukalvoihin aiheutuu potentiaalieron muutos kalvon eri puolilla, joka saa aikaan solukalvojen ohenemisen, jolloin niiden permeabiliteetti kasvaa ja hermostoputken luumeneen injisoitu vektori siirtyy luumenia reunustavaan neuraalisen epiteelikerroksen soluihin. (2, 5, 7, 9) Tässä kehitysvaiheessa (st. 9) putkea ympäröi vain yhden solukerroksen paksuinen solukerros, mikä mahdollistaa vektorin inkorporoitumisen halutun alueen soluihin (11). Tutkimuksessa elektroporointi suoritettiin kahdella menetelmällä: elektroporoimalla alkion molemmin puolin, jolloin vektori siirtyi hermostoputken molemminpuolin tai elektroporoimalla vain toinen puoli, jolloin toiseen puoleen ei siirtynyt Dna-vektoria ja

14 13 näin ollen se puoli säilyi kontrollina. Kahdesti elektroporoimalla aiheutettiin alkioon enemmän kudostuhoa, mikä vähensi alkion elonjäämistä. (2, 5) Elektroporaation jälkeen elektrodit varovasti irrotettiin alkiosta ja alkion päälle lisättiin taas PBS-Pen-Strepliuosta. Kananmunan kuoreen tehty aukko suljettiin tiivisti myrkyttömällä teipillä, minkä jälkeen alkio siirrettiin välittömästi inkubaattoriin jatkamaan kehitystään DNA:n inkorporoitumisen seuranta Injisoituja kananmunia inkuboitiin yhdestä neljään päivään, joiden aikana alkioita tarkasteltiin päivittäin mikroskoopin avulla. Alkioita tarkasteltiin ensin valomikroskoopilla vitaliteetin tutkimiseksi (sydän ja verenkierto toimivat). Alkion ollessa elävä tarkasteltiin hermostopienan solujen migraatiota UV-valolla, jolloin Gfp:n fluoresenssi paljasti manipuloidut solut kirkkaan vihreänä. Tarkastelun ohella kananmuniin lisättiin joka päivä PBS-Pen.Strep.-liuosta infektioriskin pienentämiseksi. Inkubointi suoritettiin vaakatasossa ilman rotaatiota inkubaattorin vakiolämpötilassa ja -kosteudessa. Inkubaatiota jatkettiin enintään neljä päivää injektion jälkeen, koska Gfp:n ilmentyminen lakkaa tuohon aikaan. (7, 30) Alkioiden jatkokäsittely Alkioiden tarkasteluissa kiinnitettiin huomiota alkion hyvinvointiin. Jos alkion vitaliteetti näytti hiipumisen merkkejä, ne irrotettiin ja fiksoitiin välittömästi. Viimeistään alkiot irrotettiin neljäntenä post-injektiopäivänä. Tällöin Gfp on vielä jonkin verran havaittavissa. Irrotuksessa alkiot leikattiin irti kananmunista ja puhdistettiin kalvoista mikroskoopin alla sekä määritettiin niiden kehitysaste Hamburgerin ja Hamiltonin taulukosta (11). Preparaatiossa alkion päähän tehtiin pieni reikä, jolla varmistettiin myös pään alueen fiksoituminen. Fiksaatioliuoksena käytettiin 4%:sta PFA:ta. Alkioiden annettiin fiksoitua yön yli ja seuraavana päivänä ne huuhdottiin protokollan mukaisesti PFA:sta.

15 14 Alkiot jatkokäsiteltiin kokonsa mukaan. Jos kyseessä oli 1-2 d.p.i (days post injection) irrotettu alkio, niin se valettiin agaroosiin ja leikattiin vibrotomilla leikkeiksi. Jos kyseessä oli 2-4 d.p.i. alkio, niin se valettiin parafiiniin ja leikattiin mikrotomilla 6 m:n paksuisiksi leikkeiksi. Vanhimpia alkioita käyttiin mm. in situ hybridisaatioon. Vibrotomileikkeitä tarkasteltiin sellaisenaan, mutta myös värjättiin immunohistokemiallisesti ja eosiini-hematoksyliinivärjäyksellä. Mikrotomileikkeitä puolestaan värjättiin immunohistokemiallisin menetelmin. 3.2 Tutkimusvälineistö Tutkimuksessa käytettiin Olympus SZ x 12 mikroskooppia alkioiden manipulaatioon ja tarkasteluun. Elektroporaatio suoritettiin Narishige TSS20 Intra Cel Ovodyne elektroporaattorilla. Vibratomileikkeet tehtiin Leica Viti 1000S-vibratomilla. Paraffiinileikkeet alkioista tilattiin Lääketieteen laitoksen histologian laboratoriosta. 3.3 Vaikeudet Tutkimuksessa koettiin muutamia vastoinkäymisiä, jotka liittyivät alkioiden injektionjälkeiseen inkubaatioon ja eloonjäämiseen. Tutkimuksen alkuaikoina havaittiin injektoituihin alkioihin muodostuvan inkubaation aikana homekasvustoa, huolimatta aseptisista työskentelymenetelmistä ja preparointivälineistön desinfioimisesta ja autoklavoinnista jokaisen käyttökerran jälkeen. Tämä ongelma pyrittiin ratkaisemaan pesemällä ja desinfioimalla inkubaattori ja preparointivälineet sekä hävittämällä vanhat pahviset inkubaatiokennot. Ongelman ydin oli siinä, että välillä avatuista ja teipillä suljetuista kananmunista vuosi todennäköisesti johtuen liian paljosta alkion kostutuksesta ja teipin huonosta pysyvyydestä nestettä inkubaattorin kennoille ja sieltä edelleen hyllyille. Asian voisi ratkaista pesemällä ja desinfioimalla inkubaattorin joka viikko ja muutoinkin huolellisella inkubaattorin käytöllä. Laite oli kuitenkin monen tutkijan aktiivikäytössä, joten inkubaattori oli harvoin tyhjillään kananmunista, jolloin

16 15 sen olisi voinut desinfioida ilman pelkoa kehittyvien alkioiden lämpötilan laskemisesta ja näin ollen kehityksen viivästymisestä tai peräti kuolemasta. Toisena ongelmana olivat lähteen infektiot. Välillä injisoituihin alkioihin tuli infektio, joka näkyi albumiinin samentumisena ja pilaantumisen hajulla, joka lopulta johti alkion varhaisena kuolemisena. Asiaa yritettiin ratkaista säätelemällä kostutusliuoksen penisilliini-streptomysiini-pitoisuutta. Käytännön kokeet kuitenkin osoittivat, että infektioita ilmeni suhteessa saman verran sekä kaksinkertaistettaessa antibiootin määrän, että jätettäessä se kokonaan pois. Tutkimuksessa kuitenkin päätettiin jättää 1 ml antibioottilisäys PBS-liuokseen varmuuden vuoksi. Kolmas ongelma oli alkioiden epätasainen kehittyminen. Välillä alkioiden kehittyminen injektio-asteelle kehitysaste 9 vaati alle 29 tuntia ja välillä yli 33 tuntia. Asia yritettiin ratkaista seuraamalla inkubaattorin lämpötilaa ja kosteutta sekä standardoimalla kananmunien inkubaatiota edeltävät säilytysolosuhteet kylmiössä. 4 Tulokset Tutkimuksen tulokset osoittivat Ret-geenin mutaation (C634R) aiheuttavan häiriöitä alkion hermostopienan solujen vaelluksessa. Hermostopienan vaelluskaava näytti paikoitellen katkeilevan, kontrollialkioille ja wt-ret-alkioille tyypillistä hermostopienan dorsaaliosan selkeätä segmentaatiota ei muodostunut sekä pienan soluvirrat alkion ventraalisuuntaan olivat joko todella heikkoja tai eivät muodostuneet lainkaan. Paikoitellen oli myös nähtävissä hermostopienan solujen rykelmäinen ryhmittyminen (clusters). (Liitteet 4-12) Tutkimusaineiston suppeudesta johtuen, mitään tarkkaa johtopäätöstä tutkimuksen tuloksista ei voida tehdä, vaan asia vaatii lisää tutkimista ja saatuja tuloksia voidaankin pitää lähinnä suuntaa antavana havaintona.

17 16 5 Pohdinta Monet tutkimukset ovat selvittäneet Ret:n vaikutuksia ja ilmentymistä vaeltavassa hermostopienassa. Tutkimustuloksissa selvitetään, että Ret-geeni ei ekspressoidu hermostoputkesta vaeltamaan lähtevissä hermostopienan soluissa, mutta sen transkriptiota havaitaan pienan soluissa ruoansulatuskanavan mesenkyymissä anterioriposteriori - akselilla vaihdellen kehityksen eri vaiheissa. (19) Toisessa tutkimuksessa on todettu etteivät kaikki hermostopienaperäiset erilaistumattomat solut ekspressoi Ret- tai GFR -geeniä vaeltaessaan suolen alueelle, vaikkakin GDNF-GFR 1/Ret signallointireitti vaikuttaa olevan välttämätön pienaperäisten enteeristen hermosolujen esimuotojen lisääntymiselle ja erilaistumiselle. (28) Ret:llä on myös kriittinen rooli munuaisen kehityksessä ja siittiönkehityksen kantasolujen biologiassa (20). Ret:n ilmentymisen lisäksi hermostopienan solujen vaellukseen vaikuttavat myös GDNF ja GFR. Useissa tutkimuksissa on havaittu GDNF:n olevan hermostopienaperäisille suolen esisoluille kemotrooppinen ja mitogeeninen tekijä. GDNF ilmentyy alkion ruoansulatuskanavan mesenkyymissä samalla kun GFR 1 ilmentyy laajalti suolessa kehityksen alkuvaiheessa ja myöhemmässä kehitysvaiheessa sen ilmentyminen rajoittuu enteerisen hermoston solujen esisoluihin. Ret-geenin tärkeyttä suoliston kehityksessä kuvaa mm. se, että hiirillä, joilta puuttuu Ret, enteerisen hermoston esisolut käyvät läpi massiivisen solukuoleman vaeltaessaan etusuoleen. Nämä tulokset todistavat, että Ret/GDNF signallointi on avaintekijä pluripotenttien enteeristen hermosolujen esisolujen kohtalolle ja myöhemmässä vaiheessa tämä signallointi myös vaikuttaa alkionkehityksessä. (30) GDNF:llä on myös kemoattraktiivinen vaikutus vaeltavaan hermostopienaan, etenkin suolen alueella, jonka tarkoituksena arvellaan olevan pienan solujen ohjaaminen suolen alueella (29). Yksi Ret/GDNF-vuorovaikutukselle pohjautuva selitysmalli synnynnäisille hermostopienaperäisille taudeille - kuten Hirschprungin tauti - kuvaa solujen herkkyyden ja täten vasteen muuttumista kyseiselle signalloinnille. Tässä mallissa kuvataan hermostopienan solujen määrän säätelyä. Kun suolen hermostopienan solumäärä kasvaa voimakkasti, niin esiastesolut ja erilaistuneet solut kerääntyvät mm.

18 17 GDNF:n vaikutuksesta - suolen seinämään. Tällöin solunmuodostuksen nopeus kasvaa, jolloin erilaistumista täytyy vähentää, jotta muodostuisi toiminnallisesti oikeanlaiset hermosolmukkeet. Tämä erilaistumisen väheneminen osittain johtuu suolen seinämän tuottamien neurotrofisten tekijöiden, mm. GDNF, määrän vähenemisestä, mutta myös enteeristen hermosolujen esiastesolujen vasteen vähenemisestä Ret-signallointireitin aktivaatiolle. Tällöin Ret-geenin signallointireitin mutaatioissa Ret/GDNF-signallointi vähenee, joka johtaa puutteelliseen määrään alkuperäistä enteeristä hermostopienaa. Tämä puolestaan johtaa hermosolmukkeiden määrän vähenemiseen suoliston seinämässä (26). Näiden tulosten valossa oman tutkimukseni tuloksia voisi pohtia seuraavanlaisesti: jos Ret-geeni yliaktivoituu hermostopienan soluissa gain-of-function mutaation seurauksena, niin tämä voi johtaa solujen proliferoitumiseen ja erilaistumiseen etenkin niillä alueilla jotka ilmentävät myös GFR 1- ja GDNF- geenejä. Tämä voisi ainakin osaltaan selittää tutkimuksessa havaittua hermostopienan solujen paikoittaista rykelmäistä ryhmittymistä. Hermostopienan paikoittaista huonoa migraatiota puolestaan voisi selittää se, että Ret-aktivaation on tutkimuksissa - solujen elonjäämisen, proliferaation ja erilaistumisen edistämisen lisäksi havaittu indusoivan kasvun keskeyttämistä ja apoptoosia eri solutyypeissä (23). Ret-geenillä on siis kaksisuuntaisia vaikutuksia soluihin. Tutkittavaksi vielä jää minkälaisella aktivaatiolla ja missä solutyypeissä Ret-aktivaatio saa minkäkinlaisia vasteita aikaseksi.

19 18 Lähteet (1) Sariola H., Frilander M., Heino T., Jernvall J., Partanen J., Sainio K., Salminen M., Thesleff I. Solusta yksilöksi Kehitysbiologia 37-39, 160, 255 (2003). (2) Nakamura H. and Funahashi J. Introduction of DNA into Chick Embryos by in Ovo Electroporation. Methods 24, (2001). (3) Korn M.J., Cramer K.S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. JoVE (2007). (4) Andacht T., Hu W. and Ivarie R. Rapid and Improved Method for Windowing Eggs Accessing the Stage X Chicken Embryo. Molecular reproduction and Development 69: (2004). (5) Itasaki N., Bel-Vialar S. and Krumlauf R. Shocking developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nature Cell Biology 1, E203- E207 (1999). (6) Iba H. Gene transfer into chicken embryos by retrovirus vectors. Develop. Growth Differ. 42, (2000). (7) Sato Y., Kasai T., Nakagawa S., Tanabe K., Watanabe T., Kawakami K., Takahashi Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology 305: (2007). (8) Sauka-Splenger T. and Barembaum M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods in Cell Biology 87: (2008).

20 19 (9) Nakamura H., Katahira T., Sato T., Watanabe Y., Funahashi J. Gain- and loss-offunction in chick embryos by electroporation. Mechanisms of Development 121: (2004). (10) Ishii Y. and Mikawa T. Somatic Transgenesis in the Avian Model System. Birth Defects Research (Part C) 75: (2005). (11) Hamburger V. and Hamilton H.L. The Atlas of Chick Development: A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88 (1): (1951). (12) Cheung M., Chaboissier M-C., Mynett A., Hirst E., Schedl A. and Briscoe J. The Transcriptional Control of Trunk Neural Crest Induction, Survival and Delamination. Developmental Cell, Vol. 8, (2005). (13) Burns A., Delalande J-M. and Le Douarin N. In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development 129, (2002). (14) Trainor P. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Seminars in Cell & Developmental Biology 16: (2005). (15) McLennan R. and Kulesa P. In vivo analysis reveals a critical role for neuropilin-1 in cranial neural crest cell migration in chick. Developmental Biology 301: (2007). (16) Fu M., Lui V., Sham M., Pachnis V. and Tam P. Sonic hedgehog regulates the proliferation, differentiation and migration of enteric neural crest cells is gut. J Cell Biology 166(5): (2004). (17) Tobin J. L. et al. Inhibition of neural crest migration underlies craniofacial dysmorphology and Hirschsprung s disease in Bardet-Biedl syndrome. PNAS vol. 105, no. 18: (2008).

21 20 (18) Anderson R.B., Newgreen D.F. and Young HM. Neural Crest and the Development of the Enteric Nervous System. Madam Curie Bioscience Database. (19) Mason I. The RET receptor tyrosine kinase: activation, signalling and significance in neural development and diseases. Pharmaceutica Acta Helvetiae 74: (2000). (20) Asai N., Takahashi M., Jijiwa M. RET Receptor signaling: Dysfunction in thyroid cancer and Hirschsprung s disease. Pathology International 56: (2006). (21) Arighi E., Borrello M. and Sariola H. RET tyrosine kinase signaling in development and cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews 16: (2005). (22) Inoye K., Shimotake T., Inoue K., Tokiwa K. and Iwai N. Mutational Analysis of the RET Proto-Oncogene in a Kindred With Multiple Endocrine Neoplasia Type 2A and Hirschsprung s Disease. Journal of Pediatric Surgery, Vol 34, No 10: (1999). (23) Ichihara M., Murakumo Y. and Takahashi M. RET and neuroendocrine tumors. Cancer Letters 204: (2004). (24) Manié S., Santoro M., Fusco A. and Billaud M. The RET receptor: function in development and dysfunction in congenital malformation. Trends in Genetics Vol. 17 No. 10 (2001). (25) Scott F. Gilbert. Developmental Biology. Eight edition: (2006). (26) Taraviras S., Marcos-Gutierrez C.V., Durbec P., Jani H., Grigoriou M., Sukumaran M., Wang L-C., Hynes M., Raisman G. and Pachnis V. Signalling by the RET receptor tyrosine kinase and its role in the development of the mammalian enteric nervous system. Development 126: (1999).

22 21 (27) Conner P.J., Focke P.J., Noden D.M. and Epstein M. Appearance of Neurons and Glia with Respect to the Wavefront During Colonization of the Avian Gut by Neural Crest Cells. Developmental Dynamics 226: (2003). (28) Young H.M. and Newgreen D. Enteric Neural Crest- Derived Cells: Origin, Identification, Migration and Differentiation. The Anatomical Record 262: 1-15 (2001). (29) Young H.M., Hearn C.J., Farlie P.G., Canty A.J., Thomas P.Q. and Newgreen D.F. GDNF Is a Chemoattractant for Enteric Neural Cells. Developmental Biology 229: (2001). (30) Young H.M., Bergner A.J., Anderson R.B., Enomoto H., Milbrandt J., Newgreen D.F. and Whitington P.M. Dynamics of neural crest-derived cell migration in the embryonic mouse gut.

23 22 Liite 1: Kaavakuva kanan alkion hermostopienan muodostumisesta (26). Hermostopienan solut muodostuvat epidermaalisen ektodermin ja oletetun neuroektodermin liitoskohtaan.

24 23 Liite 2: Kanan alkion hermostopienan johdannaiset (26). Kuvassa esitetään kanan alkion eri osien hermostopienan vaellusta eri paikkoihin ja erilaistumista erilaisiksi kudoksiksi. Kraniaalinen hermostopiena vaeltaa kiduskaariin ja kasvoihin muodostamaan mm. kasvojen ja kaulan luisia ja rustoisia rakenteita sekä aivohermoja. Vagaalinen hermostopiena (lähellä somiittia) ja sakraalinen hermostopiena (28. somiitin jälkeinen piena) muodostavat ruoansulatuskanavan parasympaattiset hermot. Sydämen hermostopiena (lähellä somiittia) saa aikaan aortan ja keuhkovaltimorungon erottumisen toisistaan. Rungon hermostopiena ( somiitin välillä) muodostaa sympaattisia neuroneja ja pigmenttisoluja (melanosyyttejä). Rungon somiitin välisestä hermostopienasta muodostuu lisämunuaisen ydin.

25 24 Liite 3: Eräitä hermostopienan johdannaisia (26) Johdannainen Perifeerinen hermosto Endokriiniset ja paraendokriiniset johdannaiset Muodostuva solulaji tai rakenne Neuronit, mm. sensoriset hermosolmukkeet, sympaattiset ja parasympaattiset hermosolmukkeet sekä pleksukset, neurogliasolut ja Schwannin solut. Lisämunuaisen ydin, kalsitoniinia erittävät solut, Karotiksen tyypin I solut. Pigmenttisolut Melanosyytit. Kasvojen luiset ja rustoiset Rakenteet Kasvojen sekä kallon rustot ja luut. Sidekudos Hammasnystyt, Odontoblastit. Iho, sileä lihas ja rasvakudos. Sylki-, kyynel- ja kilpirauhasen, kateenkorvan sekä aivolisäkkeen sidekudos. Sarveiskalvon endoteeli ja strooma. Aortan kaaresta lähtöisin olevien valtimoiden sidekudos ja sileä lihaskudos.

26 25 Liite 4: Villityypin Ret-konstruktin ekspressio alkiossa 1 Kuvan alkioon (st. 24) oli injisoitu villityypin Ret-geeni+Gfp. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 1.6 suurennoksella ja UV-valossa. Alkion dorsaalisessa osassa näkyy säännöllinen hermostoputkesta alkava vaeltavien solujen virta kohti alkion sisustaa. Myös alkion niskassa ja kehittyvien aivojen alueella näkyy geenivektorin tasaista ilmentymistä.

27 26 Liite 5: Villityypin Ret-konstruktin ekspressio alkiossa 2 Kuvan alkioon (st. 24) oli injisoitu villityypin Ret-geeni+Gfp. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 0.8 suurennoksella ja UV-valossa. Alkion dorsaalisessa häntäosassa näkyy säännöllinen hermostoputkesta alkava vaeltavien solujen virta kohti alkion sisustaa. Myös alkion niskan alueella näkyy geenivektorin ilmentymistä. Alkion keskiosan hermostopienan solut eivät ole jostain syystä ottaneet ruiskutettua plasmidivektoria sisäänsä, mikä näkyy vektorin ekspression puutoksena alkion keskivaiheella. Yksi mahdollinen syy olisi se, että injektoitaessa plasmidia hermostokouruun, hermostoputki oli jo sulkeutunut keskiosastaan, jolloin keskiosan hermostopienan solut ovat jo irronneet alustastaan ja aloittavat migraatiotaan.

28 27 Liite 6: Gfp:n ekspressio alkiossa 1 Kuvan alkioon (st. 19) oli injisoitu vain Gfp-geeni eli kyseessä on kontrollialkio. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 1.25 suurennoksella ja UV-valossa. Alkiossa näkyy kauttaaltaan koko alkion pituusakselin matkalta säännöllisiä ja tasaisia hermostopienan soluvirtoja matkalla hermostoputken alueelta alkion ventraalisiin osiin. Alkion pään ja niskan alueella näkyy tasaista hermostopienan solujen ilmentymistä.

29 28 Liite 7: Gfp:n ekspressio alkiossa 2a Kuvan alkioon (st. 26) oli injisoitu vain Gfp-geeni eli kyseessä on kontrollialkio. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 0.8 suurennoksella ja UV-valossa. Alkiossa näkyy melkein koko pituudelta, häntää lukuun ottamatta, säännöllisiä hermostopienan solujen segmenttejä ja niiden alkavaa vaellusta hermostoputken alueelta alkion ventraalisiin osiin. Alkion pään ja niskan alueella näkyy voimakasta ekspressiota ja hermostopienan solujen alkavaa vaellusta mm. kohti sydäntä.

30 29 Liite 8: Gfp:n ekspressio alkiossa 2b Edellisen kuvan alkion pään alueella vaeltavan hermostopienan melko tasainen solunäkymä kehittyvien aivojen alueella. Alkiota on tarkasteltu mikroskoopin 2.0- suurennoksella ja UV-valossa.

31 30 Liite 9: Gfp:n ekspressio alkiossa 2c Edellisen kuvan alkion hermostopienan solujen tasainen vaellusvirta sydämen alueelle. Alkiota on tarkasteltu mikroskoopin 2.5-suurennoksella ja UV-valossa.

32 31 Liite 10: C634R ekspressio alkiossa 1 Kuvan alkioon (st. 24) oli injisoitu Ret-geenin gain-of-function mutaatiomuoto C634R ja Gfp-geeni. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 1.0 suurennoksella ja UV-valossa. Alkiossa näkyy lähes koko alkion pituudelta häntää lukuun ottamatta, geenivektorin ilmentymistä vaeltavissa hermostopienan soluissa melko tasaisena massana hermostoputken alueella. Kontrollialkioihin verrattuna tyypilliset jaksottaiset alkion ventraalipuolelle suuntautuvat soluvirrat puuttuvat kokonaan ja paikoitellen esiintyy solujen rykelmäistä ryhmittymistä.

33 32 Liite 11: C634R ekspressio alkiossa 2 Kuvan alkioon (st. 19) oli injisoitu Ret-geenin gain-of-function mutaatiomuoto C634R ja Gfp-geeni. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 1.6 suurennoksella ja UV-valossa. Alkiossa näkyy geenivektorin ilmentymistä vaeltavissa hermostopienan soluissa melko tasaisena massana hermostoputken alueella. Kontrollialkioihin verrattuna tyypilliset jaksottaiset hermostopienan segmentit puuttuvat kokonaan ja niiden tilalla hermostoputken alueella esiintyy solujen rykelmäistä ryhmittymistä. Myös soluvirrat ventraalipuolelle puuttuvat.

34 33 Liite 12: C634R ekspressio alkiossa 3 Kuvan alkioon (st. 24) oli injisoitu Ret-geenin gain-of-function mutaatiomuoto C634R ja Gfp-geeni. Alkion hermostopienan vaellusta ja geenivektorin ilmentymistä tarkasteltiin mikroskoopin 2.0 suurennoksella ja UV-valossa. Alkion pään alueella näkyy geenivektorin ilmentymistä tutkimuksessa havaittuina rykelmäisinä tiivistyminä, klustereina (clusters). Gfp-kontrollialkioissa ja villityypin Ret-alkioissa tällaista solujen ryhmittymistä ei ollut havaittavissa.