Solu tuotantolaitoksena Cell factory

Transkriptio

1 olu tuotantolaitoksena Cell factory Bioteknisiä prosesseja, joissa biokatalyyttinä toimivat solut kutsutaan fermentoinniksi/fermentaatioksi/fermentointi-prosesseiksi Mitä sana fermentaatio alun perin tarkoittaa? vrt. Pasteur Tuotteena voi olla solumassa itse ja/tai solujen tuottama yhdiste Toteutuksen/tuotteen mukaan: olutfermentaatio, aseptinen/epäaseptinen fermentaatio, bakteeri/hiiva/home/levä/mammaalisolu/kasvisolufermentaatio, panos/fed-batch/jatkuva fermentointi etanoli/maitohappo fermentointi submerssi/solid-state fermentointi 1

2 olu tuotantolaitoksena Cell factory Historia: 1. aikakausi: spontaani hyödyntäminen (olut, viini, leipä, hapatetut tuotteet) 2. teollinen fermentointi; aseptiikka tuntematon käsite (hapot, liuottimet) 3. submerssiteknologia; 1940-luku (antibiootit) 4. geenitekniikan aikakausi; 1980 (solujen muokkaus, terapeuttiset prot.) penisilliinin tuoton kehittyminen 2

3 Primaari- vs. sekundaarimetaboliitit Metaboliitti aineenvaihduntatuote Primaarimetaboliitit muodostuvat solujen kasvuvaiheessa Mitkä ovat solujen kasvun eri vaiheet? Esimerkkejä: maitohappo (LAB:lla), sitruunahappo, MG ekundaarimetaboliittien muodostuminen ei liity solujen kasvuun Vastaavaa muodostumista esiintyy indusoituvilla entsyymeillä Esimerkkejä: antibiootit, useat entsyymit, monet heterologisesti tuotetut proteiinit

4 Prim. vs. sek. metaboliitit Insinöörin tapa esittää näiden erot : dp dt 1 r P f ( µ ) P: tuotepitoisuus (g/l, U/L ) t: aika µ: spesifinen kasvunopeus (h -1 ) Tuotteen muodostumisnopeutta (r P ) voidaan arvioida prosessin aikana peräkkäisistä pitoisuusmittauksista ja jälkikäteen P(t) ja (t) käyriltä eri ajankohtina Heterologisessa proteiinituotossa on usein edullista toteuttaa tuotteen muodostuminen kasvusta riippumattomana (ns. indusoitu tuotto vastakohtana konstitutiivinen tuotto) > tuotteen muodostus ei haittaa solujen kasvua eli solumassan tuottovaihetta 4

5 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Panosfermentointi: jokaista panosta varten tuotetaan oma siirroste (engl. inoculum; monikko inocula) siirrostelinjassa (inoculum train) varsinainen tuotantoreaktori (fermentori) valmistellaan panosta varten, siirrostetaan, solut kasvavat ja tuottavat tuotteen, fermentointi lopetetaan, tuote otetaan talteen (talteenottoprosessi eli jälkikäsittelyprosessi; DP: downstream processing) fermentointipanoksen aikana fermentoriin ei lisätä (merkittäviä määriä) ravinteita eikä fermentorista oteta pois prosessilientä ( kasvuliuosta fermentation broth) tuotettua solumassaa hyödynnetään vain kussakin panoksessa Missä kasvuvaiheessa kannattaa siirrostaa pienemmästä isompaan fermentoriin? 5

6 6 Yksisoluisten organismien kasvun kinetiikka ) ( 1 2 ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( tai ) (0) ) ( ln( (0) ) ( t t µ t t µ t µ e t N t N e t t µ t t e t µ spesifinen kasvunopeus kun solut kasvavat eksponentiaalisesti µ vakio eli µ f(t) (t): solumassan pitoisuus tai määrä hetkellä t N(t): solujen lukumäärä hetkellä t

7 Aineenvaihdunta (metabolia): katabolia energian, pelkistysvoiman ja prekursorien tuotto Proteolytic enzymes C, H, N, O,. Lipolytic enzymes Amylolytic enzymes CH a O b N c Precursors : Transport CO 2 H2 O Yhdisteiden hapettuminen vapauttaa elektroneja ( energiaa); elektronit voidaan siirtää joko hapelle tai metabolian välituotteille 7

8 Aineenvaihdunta (metabolia): anabolia synteesitoiminta Yleisesti vaatii: prekursorin (välimetaboliitti tai ravinne) pelkistysvoimaa (yleensä NADPH) energiaa (ATP tai yleisemmin NTP) 8

9 Hiivat Zymomonas mobilis bakteeri Glykolyysi Entner- Doudoroff Tuotteelle voi olla useampia aineenvaihduntareittejä: Esim. etanolin tuotto 9

10 Aineenvaihdunnan eri vaiheille voidaan laskea ja mitata vuoarvoja eri olosuhteissa tai erilaisille mutanteille. ubstraattihiilen jakautuminen eri aineenvaihduntatuotteille selviää kun tarkastellaan erilaisten metaboliittien suhteellisia osuuksia 10

11 Prosessin kvantitointi aantokertoimet: Y : solumassan saanto substraatista R µ kd Y P : tuotteen saanto substraatista Y P : tuotteen saanto soluista µ R Y O : solumassan saanto hapesta + m Y Y H : solumassan saanto per tuotettu lämpö µ Tuottonopeudet: RO + mo YO R i : volumetrinen tuotto/kulutusnopeus; i:,, P, O, H perusajatus: kasvuun verrannollinen osa + ylläpito µ R r i : spesifinen tuotto/kulutusnopeus R i / H + mh Y k D : kuolemisnopeusvakio [h -1 H ] RO OUR; RH HER Käytännön merkitykset: saantokertoimet > raaka-ainekustannukset (), hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) volumetriset tuottonopeudet > investointikustannukset, hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) spesifiset tuotto/kulutusnopeudet > prosessin optimointi Panos ja fed-batch fermentoinneissa joko keskimääräiset tai hetkelliset arvot : solumassa; : substraatti; O: happi; H: lämpö; OUR: volumetrinen hapenkuutusnopeus; HER: volumetrinen lämmöntuottonopeus 11 met

12 Kasvun ja tuoton stokiometria Useat mikrobit pystyvät kasvamaan hyvin yksinkertaisilla ravinteilla tai ainakin kasvua ja tuotteen muodostusta voidaan approksimoida (tapana on, että solumassan kertoimeksi merkitään 1): α CH O + βnh + l m 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 C : 1+ + Tästä saadaan alkuainetase H : l α + 3 β a + p δ + ε + 2 κ Veden muodostumista on lähes aina mahdoton mitata O : m α + 2γ b + q δ + ε + 2 κ H- ja O-tase hyödyttömiä N : β c + r δ 2 yhtälöä, 5 tuntematonta (kertoimet α,β,γ,δ,κ) tarvitaan mittausdataa, jotta kerrointen arvot selviävät; esim. soluhengityssuhde RQ CER/OUR κ/γ (poistokaasumittauksista) sekä saantokerrointen arvot (kokemus tai mittaus); esim. Y 1/α, Y O 1/γ Lisäksi voidaan hyödyntää pelkistystasetta eli elektronitasetta α δ κ Huom: kirjassa erilaiset merkinnät (s. 116) 12

13 Pelkistystase Jokaiselle komponentille ja yhdisteelle voidaan laskea pelkistysaste (degree of reduction, γ): kertoo kuinka monta elektronia komponentti tai yhdiste voi luovuttaa hapelle palaessaan täydellisesti (esim. C CO 2 ) (hiiliyhdisteet esitetään per C-atomi) alkuaineille: olut: γ b 4+ a2b3c C: 4 per atomi C H: 1 ubstraatti: γ s 4+ l 2m O: -2 Tuote: γ p 4+ p2q3r N: -3 [kun NH 3 on N-lähde] α γ s 4 γ γ b + δ γ p +5 [kun NO -1 3 on N-lähde] esim. glukoosi C 6 H 12 O 6 : γ ( )/64 per C atomi 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 α CH O + βnh + l m Tyypillinen mikrobisolun pelkistysaste: 4.291±0,172 (usein: CH 1.8 O 0.5 N 0.2 : MW 24.6 ) 13

14 Pelkistystase:esimerkki Hiiva kasvaa aerobisesti glukoosilla (kasvua rajoittava C-lähde) kemostaatissa ja tuottaa 0,37 g solumassaa per g kulutettua glukoosia. 0,88 g happea kuluu per g muodostunutta solumassaa. Typen lähteenä toimii ammoniakki. olumassan koostumus on CH 1.79 N 0.17 O Muodostuuko sivutuotteita? Kts. kasvun ja tuoton stokiometria-kalvon yhtälöt läpi. 14

15 C f ? MW 25,13g 0,88 25,13mol 32mol Pelkistystase : 24 1, ,68 11,02 glyseroli 6 + bnh 0,37g / mol Pelkistystase nyt 24 1, ao a 0,69 2,65 1,83 γ H O Y O Pelkistystase:esimerkki 2 / g 0,69mol f 0 cch ,37g MW 0,88g / mol MW 1g / g a / c 2,65 4,16??? ((3x4) + (8x1) + (3x( 2)) / 3 14 / 3 Y O O O O N + fch 0,37 180mol 25,13mol 0,88gO MW 4,16 Olisiko mahdollisesti glyseroli se tuote? O 14 3 f 2,65 4, γ p O q N MW g C - atomia kohti r + dh f x 2 O + eco 0,4 2 2,65 c Glyserolisaanto olisi: 0,4x92 g/180 g 0,2 g/g. Glyserolia kyllä yleensä muodostuu hiivan kasvaessa, koska sen muodostus tasapainottaa ylimäärin muodostuneen NADH:n. Tämä on kyllä liikaa käytännössä.

16 Pelkistystase:esimerkki Olisiko mahdollisesti etanoli se tuote? γ etanoli ((2x4) + (6x1) + (1x ( 2))/2 6 C-atomia kohti 12 2 f Pelkistystase nyt 241,83 4 2,65 4,16+ 2 f 0,47 Etanolisaanto olisi: 0,47x46 g/180 g 0,12 g/g. Etanolia muodostuu myös hiivan kasvaessa, varsinkin korkeassa glukoosikonsentraatiossa. Lisäksi muodostuu asetaattia ja kaikki kuluvat lopulta pois, joten lopetusajankohta ratkaisee myös mitä eri tuotekonsentraatiot ovat. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16: (2011)

17 Ravinteiden tarve Tyypilllinen mikrobisolujen koostumus: CH 1,8 O 0,5 N 0,2 Kaikki solujen alkuaineet ovat peräisin ravinteista; eri lajien vaatimukset ravinteiden kemiallisesta laadusta vaihtelevat suuresti Teollinen rikas kasvualusta Melassi 198 kg Ammoniakki 10,5 kg Kaliumdivetyfosfaatti 8,75 kg Magnesiumsulfaatti 0,75 kg Biotiini 50 mg Kalsiumpantotenaatti 10 mg Inositoli 10 g ynteettinen alusta yhteensä 21 eri yhdistettä: Glukoosi Ammoniumsulfaatti 12 eri hivenainetta 6 vitamiinia 17

18 Ravinteiden tarve < solujen alkuainekoostumus Hiili 50 % dw Happi 20 Typpi 14 Vety 8 Kalium 1 Fosfori 3 Magnesium 0.5 Kalsium 0.5 Rikki 1 Muuta 2 Hivenaineita: Zn, Fe, Cu, Na, Mn, Mo Fungeissa bakteereita vähemmän N Mistä tämä johtuu? 18

19 Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 19

20 Ravinnekomponentteja Hiilen/energian lähteitä Melassi Mallasuute Tärkkelys ulfiittijäteliemi Lignoselluloosa Hera Metanoli, etanoli Biomassa Typen/vitamiinien, hivenaineiden lähteitä Ammoniumsuolat, ammoniakki Urea Hiivauute Autolyysi, o C Plasmolyysi, NaCl Peptonit (proteiinihydrolysaatit) Liha-, kaseiini- oijajauho 50% proteiinia, 30% hiilihydraattia 20

21 Toteutustavat - sovelluksia Panosfermentointi yksinkertainen toteutus; sopii sekä prim. että sek. metaboliiteille pienin riski kontaminaatioille ja tuotantokannan muutoksille (esim. muutokset geenitasolla eli kannan degeneraatio, palautuminen tai plasmidilukumäärän pieneneminen vähäisiä) tuotettua solumassaa hyödynnetään huonosti tuotantoon liittyy paljon luppoaikaa (downtime): panoksen valmistelu, sterilointi, lag-vaihe, fermentorin tyhjennys panoksen jälkeen ja pesu panosfermentoinnissa ei missään vaiheessa solut tai prosessi ole steady-state tilassa useat panosprosessit on muutettu fed-batch toteutukseen panosfermentointi sopii edelleen hyvin, kun prosessi sietää huonosti fed-batchissä syötettävien komponenttien paikallisia pitoisuuseroja (epähomogeenisuus) Miksi tämä korostuu fed-batchissä? Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 21

22 Toteutustavat - sovelluksia Fed-batch fermentointi sopii kaikentyyppisille tuotteille, erityisesti sek. metaboliiteille hyödyntää solumassaa hieman paremmin kuin panosfermentointi syötön avulla voidaan järjestää joidenkin muuttujien suhteen steady-state ( quasi-steady-state); usein tavoitteena välttää ns. overflow-metabolia tai solujen helposti käyttämän hiililähteen (carbon- eli C-source) aiheuttama kataboliittirepressio (ccr: carbon catabolite repression) sovelluksia runsaasti: entsyymien tuotto, antibioottien tuotto, indusoitu proteiinien heterologinen tuotto, aminohappojen tuotto, leivinhiivan tuotto 22

23 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Fed-batch fermentointi aloitetaan panoksena kun kasvu muuttaa olosuhteet halutuiksi, aloitetaan jonkin komponentin syöttö korkeassa pitoisuudessa fermentoriin yleensä syöttö lopetetaan vasta fermentorin täytyttyä ja fermentointi lopetetaan ja aloitetaan jälkikäsittelyprosessi ja sitten taas uusi panos samaan tyyliin Kuvassa 23

24 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Jatkuva fermentointi: fermentori valmistellaan ja siirrostetaan prosessi ajetaan ylös panosfermentointina tämän jälkeen prosessiin aletaan syöttää ravinneliuosta ja vastaavasti otetaan fermentorista pois valmista kasvuliuosta prosessia jatketaan periaatteessa loputtomasti; käytännössä viikkoja kuukausia vuosia prosessi pyritään pitämään tasapainotilassa (steady-state) tavallisin toteutus: kemostaatti, jossa Fin Fout eli V vakio F in F out V 24

25 Toteutustavat - sovelluksia Jatkuva fermentointi sopii prim. metaboliiteille, parhaiten itse solumassan tuotolle ongelma prim. metaboliiteillakin: kun tuotteen muodostus vähentää solumassan saantoa substraatista, jatkuva fermentointi usein johtaa alhaiseen solupitoisuuteen, mikä taas alentaa volumetrista tuottavuutta volumetrinen tuottavuus (R) spesifinen tuottonopeus (r) x solupitoisuus () pitkäkestoisena herkkä kontaminaatioille ja kannan muutoksille vähiten luppoaikaa; mahdollistaa suurimman volumetrisen tuottonopeuden (g L -1 h -1 ) jatkuva fermentointi, jossa on jatkuva ravinteiden syöttö ja samalla tilavuusvirtauksella kasvuliuoksen poisto fermentorista (kemostaatti) johtaa muuttujien steady-state tilaan (muuttujan arvo ei ole ajan funktio) sovelluksia: esim. CP:n tuotto (CP: single cell protein), jätevesien puhdistus muita harvemmin käytettyjä: turbidostaatti (sameus vakio), ph-staatti (ph vakio), A-stat (accelerostat) (laimennusnopeutta lisätään vakionopeudella), D-stat (Dvakio, mutta jonkin komponentin pitoisuutta muutetaan vakionopeudella) 25

26 Muita toteutustapoja Jatkuva fermentointi solujen (osittaisella) palautuksella: solujen erotus (konsentrointi) poistovirrasta esim. kalvo-suodatuksella tai keskipakoerotuksella (cell recycle) [lohkokaaviona kirjassa s. 115] Jatkuva fermentointi, jossa solut pidätetään fermentorissa (cell retention): esim. siivilän avulla (isot partikkelit), solujen flokkuloinnin avulla tai immobilisoimalla solut kiinteän kantajamateriaaliin Useampivaiheinen jatkuva (eri fermentoreissa erilaiset olosuhteet, esim. tilavuudet voivat poiketa toisistaan) Toistettu panos: panoksen loputtua jätetään pieni osa kasvuliuoksesta siirrosteeksi seuraavaan panokseen 26

27 Kasvun ja toteutusten matemaattisia kuvauksia (malleja) Yleisimmin käytetty kasvumalli: Monod n malli perustuen ajatukseen kasvua rajoittavasta substraatista (pitoisuus kasvuliuoksessa ) pesifinen kasvunopeus: d µ ( ) t dt 1 ( t),, P ovat prosessin tilasuureita Monod n yhtälö: µ µ max + K Panoskasvatus: d µ : solupitoisuus [esim. g L -1 ] dt Y : solusaanto :stä [esim. g g -1 ] d µ + m m : ylläpitokerroin [esim. g g -1 h -1 ] dt Y Y P : kasvuun liittyvä tuotesaanto dp µ m P : ylläpitoon liittyvä tuottonopeus + mp dt Y K : kyllästysvakio [mg L -1 tai mm] P 27

28 Matemaattisia malleja Yksinkertaisimmat mallit perustuvat ainetaseisiin (kokonaisainetase, komponentin ainetase, alkuainetase); voidaan käyttää myös energiataseita olujen kasvuun liittyvä erityismenetelmä on elektronitase eli pelkistystase, jossa tarkastellaan summareaktioita solujen sisällä ( aineenvaihdunnassa) Aineenvaihduntaa voidaan myös mallittaa aineen ja alkuaineiden häviämättömyyden lakiin perustuen (kts. kirja s. 89) (nämäkin siis tasemalleja), kun metaboliareitit tunnetaan, (kts. metaboliareitit esim. ja 28

29 Bioprosessien mallinnus Mekanistiset ja empiiriset mallit taattiset ja dynaamiset mallit Bioprosessi on monimutkainen kokonaisuus. Yksinkertaistusten määrää voidaan kuvata solupopulaatioiden ja rakenteen huomioimisen kannalta tyypillisellä nelikentällä (kuva) Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 29

30 Jatkuva fermentointi Kemostaatissa laimennusnopeus (D) määrää spesifisen kasvunopeuden Kemostaatti on lähinnä tutkimusmenetelmä, jossa prosessi ja solut ovat tasapainotilassa (-) > voidaan tutkia prosessin ja solujen käyttäytymistä eri tasapainotiloissa Miksi panoskasvatus ei ole tasapainotilassa? dv Fin Fout 0 ; Fin Fout dt F (kemostaatti) olumassatase: d( V ) Fin in + Fout out dt d( V ) d dv in 0; out ; V + V dt dt dt 0 + V d dt F V µ F µ F V d dt D Jokaisen prosessiin tehdyn muutoksen jälkeen on odotettava uuden tasapainotilan syntymistä; yleensä tämä aika 5 x viipymäaika 5 x (1/D) µ d dt 1 -: steady-state tasapainotila: muuttujien arvot f(t) 30

31 Tilasuureet ja kemostaatissa Monod n yhtälön avulla: olumassan tuottonopeus R D x Miten ratkaistaan solumassan tuoton kannalta optimaalinen D? Ratkaise. Oikea vastaus: 31 Bioprosessitekniikka 1 - olu tuotantolaitoksena ) ( µ D m D µ D K Y D µ D K K D µ m in m out out out + Jatkuva fermentointi ) ( D R D µ D K Y D m in ) (1 0 K K µ D m opt +

32 Jatkuva fermentointi 32

33 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella Kemostaatissa D < µ max, muuten solut huuhtoutuvat ulos fermentorista Toimittaessa lähellä D µ max on systeemi haavoittuva, koska häiriöt voivat johtaa uloshuuhtoutumiseen Tuotteen volumetrista tuottonopeutta voidaan parantaa palauttamalla osa ulosvirtauksen soluista takaisin fermentoriin solujen konsentroinnin jälkeen* Tyypillinen esimerkki: aktiivilieteprosessi jäteveden puhdistuksessa *: Mikä voi D:n arvo teoreettisesti olla, jos kaikki solut palautetaan elinkykyisinä? Mitä ongelmia voit kuvitella liittyvän solujen palautukseen? 33

34 Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 34

35 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella F, F (1+r)F (1+r)F (1-w)F E, E V x d/dtµv, µ Ainetaseet: :n suhteen/ilmastusallas: µv + rf R (1+r)F (1) :n suhteen/koko prosessi: 0 + µv (1-w)F E + wf R (2) Oletetaan: E 0 (1) : µv + rf D F V F V (1 + r r ( 1+ r)f µv (1 + r) F rf R R rf, R, R ) nimellinen laimennusnopeus R F F µ (1 + r) r V V R µ D [1 ( 1) r] Bioprosessitekniikka 1 - olu tuotantolaitoksena R (2) : wf, R, R µv 0 + wf R <> kaikki muodostunut solumassa poistuu ylijäämälietteenä 35

36 Fed-batch Usein syöttö on solujen hiililähdettä (esim. glukoosi) hyvin korkeassa pitoisuudessa ja pyrkimyksenä on pitää ko. komponentin pitoisuus fermentorissa lähellä 0 g/l Kaksi tyypillistä tapausta: 1) syöttönopeus on vakio 2) µ on vakio; 1) µ? 2) F? 1) V 0 alkutilavuus fermentorissa F syöttönopeus total solumassan kokonaismäärä fermentorissa d total dv V ( ) d total ( ) total V ( t) V dt dt 0 + F t 2 V dt V d total dv F µ total ja F ja D dt dt V d d F F ( µ D) 0 µ D D dt dt V V + F t 0 µ pienenee kasvatuksen edetessä 2) µ D V V 0 dv V µ F µ V t 0 F V dt µ as ln dv dt V V F µ V e 0 0 F µ t µt dv dt µ V V V e 0 µt V feed t 0 µ V e e µ µ t 0 µt µt 0 e dt µ V0 V0 ( e 1) 36

37 Hyvin perinteinen käymisprosessi Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 37