Toteutustavat - sovelluksia

Transkriptio

1 Toteutustavat - sovelluksia Panosfermentointi yksinkertainen toteutus; sopii sekä prim. että sek. metaboliiteille pienin riski kontaminaatioille ja tuotantokannan muutoksille (esim. muutokset geenitasolla eli kannan degeneraatio, palautuminen tai plasmidilukumäärän pieneneminen vähäisiä) tuotettua solumassaa hyödynnetään huonosti tuotantoon liittyy paljon luppoaikaa (downtime): panoksen valmistelu, sterilointi, lag-vaihe, fermentorin tyhjennys panoksen jälkeen ja pesu panosfermentoinnissa ei missään vaiheessa solut tai prosessi ole steady-state tilassa useat panosprosessit on muutettu fed-batch toteutukseen panosfermentointi sopii edelleen hyvin, kun prosessi sietää huonosti fed-batchissä syötettävien komponenttien paikallisia pitoisuuseroja (epähomogeenisuus) Miksi tämä korostuu fed-batchissä? Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 1

2 Toteutustavat - sovelluksia Fed-batch fermentointi sopii kaikentyyppisille tuotteille, erityisesti sek. metaboliiteille hyödyntää solumassaa hieman paremmin kuin panosfermentointi syötön avulla voidaan järjestää joidenkin muuttujien suhteen steady-state (= quasi-steady-state); usein tavoitteena välttää ns. overflow-metabolia tai solujen helposti käyttämän hiililähteen (carbon- eli C-source) aiheuttama kataboliittirepressio (ccr: carbon catabolite repression) sovelluksia runsaasti: entsyymien tuotto, antibioottien tuotto, indusoitu proteiinien heterologinen tuotto, aminohappojen tuotto, leivinhiivan tuotto 2

3 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Fed-batch fermentointi aloitetaan panoksena kun kasvu muuttaa olosuhteet halutuiksi, aloitetaan jonkin komponentin syöttö korkeassa pitoisuudessa fermentoriin yleensä syöttö lopetetaan vasta fermentorin täytyttyä ja fermentointi lopetetaan ja aloitetaan jälkikäsittelyprosessi ja sitten taas uusi panos samaan tyyliin Kuvassa 3

4 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Jatkuva fermentointi: fermentori valmistellaan ja siirrostetaan prosessi ajetaan ylös panosfermentointina tämän jälkeen prosessiin aletaan syöttää ravinneliuosta ja vastaavasti otetaan fermentorista pois valmista kasvuliuosta prosessia jatketaan periaatteessa loputtomasti; käytännössä viikkoja kuukausia vuosia prosessi pyritään pitämään tasapainotilassa (steady-state) tavallisin toteutus: kemostaatti, jossa Fin = Fout eli V = vakio F in F out V 4

5 Toteutustavat - sovelluksia Jatkuva fermentointi sopii prim. metaboliiteille, parhaiten itse solumassan tuotolle ongelma prim. metaboliiteillakin: kun tuotteen muodostus vähentää solumassan saantoa substraatista, jatkuva fermentointi usein johtaa alhaiseen solupitoisuuteen, mikä taas alentaa volumetrista tuottavuutta volumetrinen tuottavuus (R) = spesifinen tuottonopeus (r) x solupitoisuus (X) pitkäkestoisena herkkä kontaminaatioille ja kannan muutoksille vähiten luppoaikaa; mahdollistaa suurimman volumetrisen tuottonopeuden (g L -1 h -1 ) jatkuva fermentointi, jossa on jatkuva ravinteiden syöttö ja samalla tilavuusvirtauksella kasvuliuoksen poisto fermentorista (kemostaatti) johtaa muuttujien steady-state tilaan (muuttujan arvo ei ole ajan funktio) sovelluksia: esim. CP:n tuotto (CP: single cell protein), jätevesien puhdistus muita harvemmin käytettyjä: turbidostaatti (sameus vakio), ph-staatti (ph vakio), A-stat (accelerostat) (laimennusnopeutta lisätään vakionopeudella), -stat (=vakio, mutta jonkin komponentin pitoisuutta muutetaan vakionopeudella) 5

6 Muita toteutustapoja Jatkuva fermentointi solujen (osittaisella) palautuksella: solujen erotus (=konsentrointi) poistovirrasta esim. kalvo-suodatuksella tai keskipakoerotuksella (cell recycle) [lohkokaaviona kirjassa s. 115] Jatkuva fermentointi, jossa solut pidätetään fermentorissa (cell retention): esim. siivilän avulla (isot partikkelit), solujen flokkuloinnin avulla tai immobilisoimalla solut kiinteän kantajamateriaaliin Useampivaiheinen jatkuva (eri fermentoreissa erilaiset olosuhteet, esim. tilavuudet voivat poiketa toisistaan) Toistettu panos: panoksen loputtua jätetään pieni osa kasvuliuoksesta siirrosteeksi seuraavaan panokseen 6

7 Kasvun ja toteutusten matemaattisia kuvauksia (malleja) Yleisimmin käytetty kasvumalli: Monod n malli perustuen ajatukseen kasvua rajoittavasta substraatista (pitoisuus kasvuliuoksessa = ) pesifinen kasvunopeus: dx µ = ( ) t 1 X ( t) X,, P ovat prosessin tilasuureita Monod n yhtälö: µ = µ max + K Panoskasvatus: dx = µ X X: solupitoisuus [esim. g L -1 ] Y X : solusaanto :stä [esim. g g -1 ] d µ X = + m m : ylläpitokerroin [esim. g g -1 h -1 ] X YX Y PX : kasvuun liittyvä tuotesaanto dp µ X m P : ylläpitoon liittyvä tuottonopeus = + mp X Y K : kyllästysvakio [mg L -1 tai mm] PX 7

8 Matemaattisia malleja Yksinkertaisimmat mallit perustuvat ainetaseisiin (kokonaisainetase, komponentin ainetase, alkuainetase); voidaan käyttää myös energiataseita olujen kasvuun liittyvä erityismenetelmä on elektronitase eli pelkistystase, jossa tarkastellaan summareaktioita solujen sisällä (= aineenvaihdunnassa) Aineenvaihduntaa voidaan myös mallittaa aineen ja alkuaineiden häviämättömyyden lakiin perustuen (kts. kirja s. 89) (nämäkin siis tasemalleja), kun metaboliareitit tunnetaan, (kts. metaboliareitit esim. ja 8

9 Bioprosessien mallinnus Mekanistiset ja empiiriset mallit taattiset ja dynaamiset mallit Bioprosessi on monimutkainen kokonaisuus. Yksinkertaistusten määrää voidaan kuvata solupopulaatioiden ja rakenteen huomioimisen kannalta tyypillisellä nelikentällä (kuva) Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 9

10 Jatkuva fermentointi Kemostaatissa laimennusnopeus () määrää spesifisen kasvunopeuden Kemostaatti on lähinnä tutkimusmenetelmä, jossa prosessi ja solut ovat tasapainotilassa (-) => voidaan tutkia prosessin ja solujen käyttäytymistä eri tasapainotiloissa Miksi panoskasvatus ei ole tasapainotilassa? dv = Fin Fout = 0 ; Fin = Fout = F (kemostaatti) olumassatase: d( V X ) Fin X in + = Fout X out d( V X ) dx dv X in = 0; X out = X ; = V + X = V 0 + V dx = F X V µ X = F X µ = F V = dx Jokaisen prosessiin tehdyn muutoksen jälkeen on odotettava uuden tasapainotilan syntymistä; yleensä tämä aika = 5 x viipymäaika = 5 x (1/) µ = dx 1 X -: steady-state = tasapainotila: muuttujien arvot f(t) 10

11 Tilasuureet X ja kemostaatissa Monod n yhtälön avulla: olumassan tuottonopeus R X = x X Miten ratkaistaan solumassan tuoton kannalta optimaalinen? Ratkaise. Oikea vastaus: 11 Bioprosessitekniikka 1 - olu tuotantolaitoksena ) ( µ m µ K Y X µ K K µ m in X m out out out = = + = = Jatkuva fermentointi ) ( R X µ K Y X m in X = = ) (1 0 K K µ m opt + =

12 Jatkuva fermentointi 12

13 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella Kemostaatissa < µ max, muuten solut huuhtoutuvat ulos fermentorista Toimittaessa lähellä = µ max on systeemi haavoittuva, koska häiriöt voivat johtaa uloshuuhtoutumiseen Tuotteen volumetrista tuottonopeutta voidaan parantaa palauttamalla osa ulosvirtauksen soluista takaisin fermentoriin solujen konsentroinnin jälkeen* Tyypillinen esimerkki: aktiivilieteprosessi jäteveden puhdistuksessa *: Mikä voi :n arvo teoreettisesti olla, jos kaikki solut palautetaan elinkykyisinä? Mitä ongelmia voit kuvitella liittyvän solujen palautukseen? 13

14 Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 14

15 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella F, F (1+r)F (1+r)F (1-w)F X E, E V x dx/=µxv X, µ = Ainetaseet: X:n suhteen/ilmastusallas: µxv + rfx R = (1+r)FX (1) X:n suhteen/koko prosessi: 0 + µxv = (1-w)FX E + wfx R (2) Oletetaan: X E = 0 (1) : µxv + rfx = F V F V (1 + r r = ( 1+ r)fx µxv = (1 + r) FX rfx R X X R rf, X R, R ) = nimellinen laimennusnopeus R F F µ = (1 + r) r V V X R µ = [1 ( 1) r] X X X Bioprosessitekniikka 1 - olu tuotantolaitoksena R (2) : wf, X R, R µxv = 0 + wfx R <=> kaikki muodostunut solumassa poistuu ylijäämälietteenä 15

16 Fed-batch Usein syöttö on solujen hiililähdettä (esim. glukoosi) hyvin korkeassa pitoisuudessa ja pyrkimyksenä on pitää ko. komponentin pitoisuus fermentorissa lähellä 0 g/l Kaksi tyypillistä tapausta: 1) syöttönopeus on vakio 2) µ on vakio; 1) µ =? 2) F =? 1) V 0 = alkutilavuus fermentorissa F = syöttönopeus X total = solumassan kokonaismäärä fermentorissa dx total dv V ( ) X X dx total ( ) total V ( t) = V 0 + F t X = = 2 V V dx total dv F = µ X total ja = F ja = V dx dx F F = ( µ ) X = 0 µ = = = V V + F t 0 µ pienenee kasvatuksen edetessä 2) µ = V V 0 dv V = µ F = µ V t 0 F V = µ as ln dv V V F = µ V e 0 0 = F = µ t µt dv = µ V V = V e 0 µt V feed = t 0 µ V e e µ µ t 0 µt µt 0 e = µ V0 = V0 ( e 1) 16

17 Prosessin kvantitointi aantokertoimet: Y X : solumassan saanto substraatista RX = µ X k X Y P : tuotteen saanto substraatista Y PX : tuotteen saanto soluista µ X R Y XO : solumassan saanto hapesta = + m X YX Y XH : solumassan saanto per tuotettu lämpö µ X Tuottonopeudet: RO = + mo X YXO R i : volumetrinen tuotto/kulutusnopeus; i: X,, P, O, H perusajatus: kasvuun verrannollinen osa + ylläpito µ X R r i : spesifinen tuotto/kulutusnopeus = R i / X H = + mh X Y k : kuolemisnopeusvakio [h -1 XH ] RO = OUR; RH = HER Käytännön merkitykset: saantokertoimet => raaka-ainekustannukset (), hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) volumetriset tuottonopeudet => investointikustannukset, hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) spesifiset tuotto/kulutusnopeudet => prosessin optimointi Panos ja fed-batch fermentoinneissa joko keskimääräiset tai hetkelliset arvot X: solumassa; : substraatti; O: happi; H: lämpö; OUR: volumetrinen hapenkuutusnopeus; HER: volumetrinen lämmöntuottonopeus 17 met

18 Kasvun ja tuoton stokiometria Useat mikrobit pystyvät kasvamaan hyvin yksinkertaisilla ravinteilla tai ainakin kasvua ja tuotteen muodostusta voidaan approksimoida (tapana on, että solumassan kertoimeksi merkitään 1): α CH O + βnh + l m 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 C : = 1+ + Tästä saadaan alkuainetase H : l α + 3 β = a + p δ + ε + 2 κ Veden muodostumista on lähes aina mahdoton mitata O : m α + 2γ = b + q δ + ε + 2 κ H- ja O-tase hyödyttömiä N : β = c + r δ 2 yhtälöä, 5 tuntematonta (kertoimet α,β,γ,δ,κ) tarvitaan mittausdataa, jotta kerrointen arvot selviävät; esim. soluhengityssuhde = RQ = CER/OUR = κ/γ (poistokaasumittauksista) sekä saantokerrointen arvot (kokemus tai mittaus); esim. Y X =1/α, Y XO =1/γ Lisäksi voidaan hyödyntää pelkistystasetta eli elektronitasetta α δ κ Huom: kirjassa erilaiset merkinnät (s. 116) 18

19 Pelkistystase Jokaiselle komponentille ja yhdisteelle voidaan laskea pelkistysaste (degree of reduction, γ): kertoo kuinka monta elektronia komponentti tai yhdiste voi luovuttaa hapelle palaessaan täydellisesti (esim. C CO 2 ) (hiiliyhdisteet esitetään per C-atomi) alkuaineille: olut: γ b = 4+ a2b3c C: 4 per atomi C H: 1 ubstraatti: γ s = 4+ l 2m O: -2 Tuote: γ p = 4+ p2q3r N: -3 [kun NH 3 on N-lähde] α γ s 4 γ = γ b + δ γ p +5 [kun NO -1 3 on N-lähde] esim. glukoosi C 6 H 12 O 6 : γ= ( )/6=4 per C atomi 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 α CH O + βnh + l m Tyypillinen mikrobisolun pelkistysaste: 4.291±0,172 (usein: CH 1.8 O 0.5 N 0.2 : MW 24.6 ) 19

20 Pelkistystase:esimerkki Hiiva kasvaa aerobisesti glukoosilla (kasvua rajoittava C-lähde) kemostaatissa ja tuottaa 0,37 g solumassaa per g kulutettua glukoosia. 0,88 g happea kuluu per g muodostunutta solumassaa. Typen lähteenä toimii ammoniakki. olumassan koostumus on CH 1.79 N 0.17 O Muodostuuko sivutuotteita? Kts. kasvun ja tuoton stokiometria sivulla

21 Ravinteiden tarve Tyypilllinen mikrobisolujen koostumus: CH 1,8 O 0,5 N 0,2 Kaikki solujen alkuaineet ovat peräisin ravinteista; eri lajien vaatimukset ravinteiden kemiallisesta laadusta vaihtelevat suuresti Teollinen rikas kasvualusta Melassi 198 kg Ammoniakki 10,5 kg Kaliumdivetyfosfaatti 8,75 kg Magnesiumsulfaatti 0,75 kg Biotiini 50 mg Kalsiumpantotenaatti 10 mg Inositoli 10 g ynteettinen alusta yhteensä 21 eri yhdistettä: Glukoosi Ammoniumsulfaatti 12 eri hivenainetta 6 vitamiinia 21

22 Ravinteiden tarve <= solujen alkuainekoostumus Hiili 50 % dw Happi 20 Typpi 14 Vety 8 Kalium 1 Fosfori 3 Magnesium 0.5 Kalsium 0.5 Rikki 1 Muuta 2 Hivenaineita: Zn, Fe, Cu, Na, Mn, Mo Fungeissa bakteereita vähemmän N Mistä tämä johtuu? 22

23 Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 23

24 Ravinnekomponentteja Hiilen/energian lähteitä Melassi Mallasuute Tärkkelys ulfiittijäteliemi Lignoselluloosa Hera Metanoli, etanoli Biomassa Typen/vitamiinien, hivenaineiden lähteitä Ammoniumsuolat, ammoniakki Urea Hiivauute Autolyysi, o C Plasmolyysi, NaCl Peptonit (proteiinihydrolysaatit) Liha-, kaseiini- oijajauho 50% proteiinia, 30% hiilihydraattia 24