Bromodomain-inhibiittorien vaikutus tulehdusvasteeseen silmän verkkokalvon epiteelisoluissa

Transkriptio

1 Bromodomain-inhibiittorien vaikutus tulehdusvasteeseen silmän verkkokalvon epiteelisoluissa ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Kliinisen lääketieteen laitos Silmätaudit Syventävien opintojen opinnäytetyö syyskuu 2016 Ella-Noora Määttä Ohjaajat: Anu Kauppinen ja Maria Hytti

2 2 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Lääketieteen koulutusohjelma MÄÄTTÄ ELLA-NOORA: Bromodomain-inhibiittorien vaikutus tulehdusvasteeseen silmän verkkokalvon epiteelisoluissa Opinnäytetutkielma, 31 sivua Tutkielman ohjaajat: Anu Kauppinen, Maria Hytti syyskuu, 2016 Avainsanat: silmänpohjan ikärappeuma, krooninen tulehdus, BET-proteiinit, SIRT1, JQ1, PFI-1, I-BET151 Bromodomaineja sisältävät proteiinit eli esimerkiksi BET (bromodomain and extra terminal)-proteiinit säätelevät muun muassa useita tulehdusta edistäviä geenejä. BET-proteiinien estosta voisi olla hyötyä silmänpohjan ikärappeuman tai muiden tautien hoidossa, joihin liittyy pitkäkestoinen ja matalatasoinen tulehdus. Kirjallisuusosiossa käydään läpi silmänpohjan ikärappeuman perusteita sekä tulehdusreaktion syntymistä. Tulehdusreaktiossa keskeisenä toimijana on NF-κB (nuclear factor kappa beta). Sen aktivoituminen voi aikaansaada tulehduksellisten välittäjäaineiden tuotannon ja vapautumisen solusta. NF-κB:n aktivoitumiseen voivat vaikuttavat useat eri molekyylit, kuten SIRT1 ja BET-proteiinit. Työssä tutkittiin kolmen eri bromodomain-inhibiittorin vaikutusta tulehdusvasteeseen liittyvien välittäjäaineiden määrään ja tulehdukseen vaikuttavien proteiinien aktiivisuuden määrään. Tulehdus luotiin verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluihin etoposidilla. Tutkittavia bromodomain-inhibiittoreita olivat JQ1, PFI- 1 ja I-BET151. Välittäjäaineista mitattiin IL (interleukiini)-6:n ja IL-8:n määriä. Lisäksi työssä tutkittiin SIRT1:n (sirtuin 1) määrää. SIRT1:n aktiivisuutta tutkittiin mittaamalla p53:n asetylaatio-astetta. Näitä mitattiin in vitro kasvatetuista silmänpohjan pigmenttiepiteelisoluista Western Blot-menetelmällä ja kasvatusliuoksesta ELISA (enzyme-linked immune sorbent assay)-menetelmällä. Tässä tutkimuksessa saaduissa tuloksissa bromodomain-inhibiittorit vähensivät IL-6:n ja IL-8:n määriä. Lisäksi ne eivät lisänneet todistettavasti SIRT1:n määrää. Bromodomain-inhibiittorit vähensivät p53:n asetylaatio-astetta. Tutkimustulokset ovat yhteneviä kirjallisuusosiossa esitettyjen, aikaisempien tutkimustulosten kanssa. Tutkittujen bromodomain-inhibiittoreiden tulehduksellisten välittäjäaineiden (IL-6 ja IL-8) määriä vähentävän vaikutuksen mekanismi ei ole vielä selvillä. Tässä työssä on pohdittu vaikutusmekanismien mahdollista yhteyttä NF-κB:aan ja SIRT1:een.

3 3 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine Medicine MÄÄTTÄ ELLA-NOORA MARIA KATARIINA: Effect of Bromodomain-inhibitors to the inflammatory response in retinal pigment epithelium cells Thesis, 31 pages Supervisor: Anu Kauppinen, Maria Hytti September 2016 Keywords: age-related macular degeneration, chronic inflammation, BET-proteins, SIRT1, JQ1, PFI-1, I- BET151 Bromodomain-containing proteins, for example BET-proteins (bromodomain and extra terminal) regulate many proinflammatory genes. Inhibition of BET-proteins could be useful in the treatment of age-related macular degeneration as well as other diseases associated with long-term inflammation. This review focuses on basics of age related macular degeneration and explains how an inflammatory response is created. The main factor in this process is the transcriptional factor NF-κB. Activation of NF-κB can cause the production and the release of inflammatory cytokines in cells. Many proteins such as SIRT1 and BET-proteins can have an impact on the activation of NF-κB. The purpose of this study was to find out how three different bromodomain-inhibitors affect the etoposideinduced inflammation in retina pigment epithelium cells. The inhibitors used in this study were JQ1, PFI-1 and I-BET151. Detected inflammatory mediators were IL-6 and IL-8. Furthermore the amount and the activity of SIRT1 were studied. Activity of SIRT1 was concluded from the acetylation rate of p53. Amounts of SIRT1 and acetylated p53 were measured using the Western Blot-method from the lysates of cultured retinal pigment epithelial cells, and the release of IL-6 and IL-8 were determined using the ELISA-method from growth medium. In this study the results showed that bromodomain-inhibitors reduced the release of IL-6 and IL-8. The inhibitors did not affect the levels of SIRT1. All bromodomain-inhibitors decreased the acetylation rate of p53. Results from this experiment were consistent with the results from previous studies. The studied bromodomain-inhibitors could decrease the amount of inflammatory cytokines (IL-6 and IL-8). The mechanism behind this process remains unknown. There is a discussion in this study if the mechanism could be related to the activity of NF-κB or SIRT1.

4 4 Sisällys JOHDANTO 5 1 YLEISTÄ SILMÄNPOHJAN IKÄRAPPEUMASTA Silmänpohjan ikärappeuma Pigmenttiepiteelisolut Ikärappeuman syntyminen silmänpohjassa Lipofuskiini Drusenit Nykyinen hoito.11 2 TULEHDUS Tulehduksellisten geenien ilmentyminen Hahmontunnistusreseptorit DAMP ja PAMP TLR Inflammasomi Muita hahmontunnistusreseptoreita tulehduksessa Välittäjäaineiden tuotanto NF-κB Yleistä Aktivaatio Tulehduksen välittäjäaineet Tulehdusta edistävät sytokiinit Kemokiinit SIRTUIINIT SIRT SIRT1:n aktiivisuuden selvittäminen etoposidin avulla BROMODOMAIN-INHIBIITTORIT BET-proteiinit JQ PFI I-BET TYÖN TARKOITUS JA TAVOITTEET MATERIAALIT JA MENETELMÄT Solujen kasvatus...20

5 5 6.2 Solujen käsittely ELISA-menetelmä Western Blot-menetelmä TULOKSET JQ1 ja I-BET151 vähensivät etoposidilla aiheutettua tulehdusta Bromodomain-inhibiittorit vähensivät etoposidilla nostetun asetyloidun p53:n määrää, mutta SIRT1:n määrä ei muuttunut merkitsevästi PÄÄTELMÄT...25 LYHENNELMÄLUETTELO...28 LÄHTEET...29 Johdanto Silmänpohjan ikärappeuma on yleisin näkövammaisuuden aiheuttaja Suomessa. Se on etenevä ja iän myötä yleistyvä sairaus. Ikärappeuman kehittymiseen kuuluvat iän lisäksi keskeisesti myös geneettinen alttius, sydän- ja verisuonisairauksin kanssa yhteiset riskitekijät sekä verkkokalvon solujen pitkäaikainen hapetusstressi ja tulehdustila. (Kaarniranta ym. 2009) Sairaus vaikuttaa erityisesti tarkan näkemisen alueeseen eli makulan alueeseen. Se on vastuussa keskeisestä näöstä ja tarkkuutta vaativien yksityiskohtien havainnoinnista (Ratnayaka ym. 2015). Ikärappeuma jaetaan kosteaan ja kuivaan muotoon. Näille yhteistä ovat verkkokalvon pigmenttiepiteelisolujen sisäiset lipofuskiini-kertymät ja solun ulkoiset drusen-kertymät. Kosteassa muodossa verkkokalvolle kasvaa lisäksi uudisverisuonia, jotka vuotavat herkästi terävänäköalueelle aiheuttaen näön nopeaa huonontumista. (Summanen 2013, Kaarniranta ym. 2009) Ikärappeumaan ei ole tällä hetkellä parantavaa hoitoa ja sen syntymekanismi on vielä osittain tuntematon. Kosteassa muodossa näön huonontumista voidaan hidastaa silmän sisäisillä VEGF (vascular-endothelial growth factor)-pistoshoidoilla. (Summanen 2013, Kaarniranta ym. 2009) Tulehduksen syntymisen kannalta keskeinen asia on NF-κB:n aktivaatio ja siihen vaikuttavat molekyylit. Sen aktivoituminen voi saada aikaan tulehduksellisten välittäjäaineiden tuotannon ja vapautumisen solusta. NFκB:n aktivoitumiseen voivat vaikuttavat useat eri molekyylit, kuten SIRT1 ja BET-proteiinit. Bromodomainit säätelevät asetyloituja ja histoneihin pakattuja tulehdusgeenejä tulehdusta edistävän ärsykkeen vaikutuksesta (Kokkola ym. 2015). Yksi bromodomaineja sisältävien proteiinien perheistä on BET-

6 6 proteiinit, johon kuuluu esimerkiksi BRD4 (bromodomain-containing protein) (Kauppinen ym. 2016, Belkina ym. 2013). BRD4 toimii HAT (histoni asetyyli transferaasi)-entsyymien ohella osana NF-κB:n aktivaatiota. (Huang ym. 2009) Tässä tutkimuksessa käsitelty SIRT1 kuuluu sirtuiini-perheeseen. SIRT1:llä on tulehdusta vähentäviä vaikutuksia muun muassa NF-κB:n alayksikön deasetylaation ja siten NF-κB:n aktivaation eston avulla (Cao ym. 2013). SIRT1 voi myös vähentää NF-κB:aa asetyloivien HAT-entsyymien aktiivisuutta (Yeung ym. 2004, Huang ym. 2009). Tutkitut bromodomain-inhibiittorit (JQ1, PFI-1 ja I-BET151) estävät BET-proteiinien toimintaa. Niiden on tutkittu estävän BRD2:n ja BRD4:n sitoutuminen histoneihin ja IL-6:n promoottoriin NF-κB:n aktiivisessa alayksikössä. (Belkina ym. 2013, Picaud ym. 2013, Barrett ym. 2014) Lisäksi aikaisemmassa tutkimuksessa JQ1 lisäsi SIRT1:n aktiivisuutta (Kokkola ym. 2015). Bromodomain-inhibiittorien on todettu vähentävä tulehdusta edistävien sytokiinien, muun muassa IL-6:n, IL-8:n ja TNFα:n (tuumorinekroosifaktori), määriä. (Belkina ym. 2013, Khan ym. 2014, Barrett ym. 2014) Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää bromodomain-inhibiittorien kykyä vähentää tulehdusta verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa ja SIRT1:n roolia tässä kyseisessä tapahtumassa. Tutkimuksessa tarkasteltiin kolmen yllä mainitun bromodomain-inhibiittorin (JQ1, PFI-1 ja I-BET151) vaikutusta verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa aiheutettuun tulehdusvasteeseen. Tulehdus luotiin etoposidilla. Tulehdusvastetta tutkittiin mittaamalla solujen erittämiä välittäjäaineita (IL-6 ja IL-8) kasvatusliuoksesta ELISA-menetelmällä. Bromodomain-inhibiittorien vaikutusta SIRT1:n aktiivisuuteen tutkittiin mittaamalla soluissa olevan asetyloituneen p53-proteiinin määrää Western Blot-menetelmällä. Samalla menetelmällä mitattiin lisäksi SIRT1:n määrää solulysaateista. Tällä tutkimuksella oli tarkoitus selvittää bromodomain-inhibiittorien vaikutuksia verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa aiheutettuun tulehdusvasteeseen. Jatkuvan tulehduksen mekanismien ymmärtäminen ja niihin vaikuttaminen voisivat auttaa kehittelemään ikärappeumaan estävää tai jopa parantavaa hoitoa.

7 7 1 Yleistä silmänpohjan ikärappeumasta 1.1 Silmänpohjan ikärappeuma Silmänpohjan ikärappeuma on Suomessa yleisin näkövammaisuuden aiheuttaja. Sen yleisyys kasvaa iän myötä niin, että vuotiaista sitä esiintyy %:lla ja yli 85-vuotiaista 30 %:lla. (Kinnunen ym. 2014) Maailmanlaajuisesti ikärappeumaa sairastaa arviolta noin 50 miljoonaa ihmistä (Ratnayaka ym. 2015). Silmänpohjan ikärappeuma on monimuotoinen silmäsairaus, joka vaikuttaa erityisesti tarkan näkemisen alueeseen eli makulan alueeseen. Makula-alue on vastuussa keskeisestä näöstä ja tarkkuutta vaativien yksityiskohtien havainnoinnista. (Ratnayaka ym. 2015) Sairauden oireita ovat suorien viivojen vääristyminen, kuvakoon muutokset, keskellä näkyvä harmaa alue tai keskeisen näön puutosalue, värinäön muutokset sekä lähi- ja kaukonäön huonontuminen (Summanen 2013). Ikärappeuman riskitekijöitä ovat iän lisäksi tupakointi, valtimonkovettumatauti, verenpainetauti, hyperkolesterolemia, ylipaino ja epäterveelliset syömistottumukset. Lisäksi ikärappeumalle on todettu olevan perinnöllinen alttius. (Kinnunen ym. 2014) Ikärappeuman diagnoosi perustuu silmänpohjan tyypilliseen löydökseen (Summanen 2013). Silmänpohjan ikärappeuma jaetaan kuivaan ja kosteaan muotoon. Kuivaa muotoa sairastaa noin % potilaista. Silmänpohjan ikärappeumassa verkkokalvon solujen altistuminen krooniselle hapetusstressille yhdessä riskitekijöiden kanssa aiheuttaa muutoksia silmänpohjaan. Yhteisinä löydöksinä silmänpohjan ikärappeuman molemmissa muodoissa esiintyy solunsisäisiä lipofuskiini-kertymiä, solunulkoisia drusenkertymiä ja verkkokalvon pigmentin epätasaisuutta. Lisäksi sairauteen liittyy krooninen, paikallinen tulehdus verkkokalvolla. Erotuksena kuivasta ikärappeumasta kosteaan muotoon kuuluvat suonikalvosta verkkokalvolle kasvavat uudisverisuonet, jotka vuotavat herkästi terävänäköalueelle. Tämä aiheuttaa kudosturvotusta terävänäköalueelle ja näön nopeaa heikentymistä. (Kinnunen ym. 2014, Kaarniranta ym. 2009) 1.2 Pigmenttiepiteelisolut Verkkokalvon pigmenttiepiteelisolut eli RPE-solut (retinal pigment epithelium) ovat postmitoottisia soluja, eli ne eivät yleensä jakaannu terveessä silmänpohjassa. RPE-solut sijaitsevat yksisoluisena kerroksena näköreseptorisolujen ja Bruchin kalvon välissä. Ulkosegmentti erottaa RPE-solut näköreseptorisoluista eli tapeista ja sauvoista. Bruchin kalvo erottaa puolestaan RPE-solut suonikalvostosta. (Taulukko 1)

8 8 taulukko 1 Silmänpohjan kerrokset. kovakalvo* suonikalvosto Bruchin kalvo** pigmenttiepiteelisolut eli RPE-solut ulkosegmentti tapit ja sauvat bipolaarisolut gangliosolut *uloin kerros ** osa suonikalvostoa KUVA 1. OCT (optical coherence tomography)-kuvassa oranssilla merkittynä pigmenttiepiteelisolukerroksen sijainti silmänpohjassa. RPE-solujen tehtäviin kuuluvat muun muassa hapen ja ravintoaineiden välitys suonikalvostosta tapeille ja sauvoille sekä kasvutekijöiden tuotanto ja näköreseptorisolujen ulkosegmentin poisto. Lisäksi RPE-solut osallistuvat näkösyklin ohjaukseen välittämällä signaaleja verkkokalvolta kohti gangliosoluja, verkkokalvon suojelemiseen liialliselta valolta, veri-verkkokalvo esteen muodostamiseen yhdessä verisuonten endoteelin kanssa ja makulan immuunipuolustukseen. (Kaarniranta ym. 2009, Kauppinen ym. 2016) RPE-solujen rappeutuminen johtaa tappien ja sauvojen kuolemaan, koska tuolloin niille ei välity elintärkeitä ravintoaineita tai happea (Kauppinen ym. 2016).

9 9 1.3 Ikärappeuman syntyminen silmänpohjassa Ikärappeumassa silmänpohjan pigmenttiepiteelisolut vaurioituvat ikääntymisen, kroonisen hapetusstressin ja muiden riskitekijöiden kasaantumisen vuoksi. RPE-solut altistuvat krooniselle hapetusstressille valoaltistuksen, tehokkaan aineenvaihdunnan ja erittäin runsaan verenvirtauksen vuoksi. Keskeisenä osana ikärappeuma kehittymistä on paikallinen ja pitkäaikainen tulehdustila silmänpohjassa. (Kaarnirata ym. 2009) Lipofuskiini Yksi iän myötä huonontuvista toiminnoista on RPE-solujen lysosomien puhdistuskyky. Lysosomit puhdistavat ulkosegmenttiä erityisesti rasvapitoisista A-vitamiinin metaboliiteista pilkkomalla niitä. Lysosomien huonontunut toiminta muun muassa iän myötä johtaa lipofuskiini-nimisen lipidi-proteiiniaineksen muodostumiseen RPE-solujen sisään. (Kaarniranta ym. 2009) Ikärappeumassa hapetusstressiä lisäävät lipofuskiini-kertymissä olevista molekyyleistä muun muassa A2E (N-retinylidene-Nretinylethanolamine). A2E-molekyyli lisää valon vaikutuksesta happiradikaalien määrää ja vaurioittaa näin mitokondrioita ja lysosomeja. Tämä aiheuttaa samalla lisääntyvää lipofuskiinin kertymistä soluihin. (Kaarniranta ym. 2009) Lipofuskiinin kertymisen aiheuttama lysosomien vaurioituminen heikentää RPE-solujen kykyä hajottaa valoreseptorisolujen ulkosegmenttiä, proteiinisaostumia ja soluelimiä. Tämä saattaa siten lisätä drusenien muodostumista. (Kaarniranta ym. 2009) Drusenit Drusenien määrä ja niiden koko ovat verrannollisia kostean ikärappeuman esiintymisen todennäköisyyteen (Kaarniranta ym. 2009). Drusenit aiheuttavat tulehdusta muun muassa aktivoimalla NF-κB:a ja inflammasomia (Kauppinen ym. 2016). Drusenit sisältävät muun muassa vitronektiinia, β-amyloidia, amyloidi P:tä, apolipoproteiini E:tä, MHC (major histocompatibility protein)-luokan II antigeenejä, immunoglobuliineja, CRP:tä (C-reaktiivinen proteiini) ja useita komplementtitekijöitä. (Kaarniranta ym. 2009) Drusenien sisältävän β-amyloidin arvellaan olevan yksi avaintekijöistä ikärappeumaan johtavassa patogeneesissä. β-amyloidin määrä on suhteessa henkilön ikään ja drusenien määrään. β-amyloidi myös itsessään lisää tulehdusta edistävien sytokiinien ja VEGF:n määrää muun muassa RPE-soluissa. (Ratnayaka ym. 2015) Drusenien muodostumiseen vaikuttavat monet tekijät, joista keskeisenä on RPE-solujen proteiinien kuljetusmekanismin eli transsytoosin häiriintyminen. Transsytoosin häiriintymisen taustalla arvellaan olevan muun muassa komplementtijärjestelmän häiriö ja paikallinen, pitkäaikainen tulehdustila.

10 10 (Kaarniranta ym. 2009) Komplementti on luontaisen immuunijärjestelmän osa, jonka tehtäviä ovat muun muassa opsonisaatio, tulehdusreaktion muodostaminen, välittäjäaineiden vapauttaminen syöttösoluista, fagosyyttien houkuttelu ja aktivaatio sekä B-soluvälitteisen immuunivasteen voimistaminen (Mäkinen ym. 2012). Paikallinen tulehdus aiheuttaa normaalisti komplementtijärjestelmän aktivaation, dendriittisolujen ja makrofagien invaasion RPE-solujen ja Bruchin kalvon väliin sekä sytokiinien tuotannon. Makrofagit ja muut fagosytoivat solut ovat tarpeellisia jätemateriaalin, muun muassa kuolleiden solujen, poistossa tällä alueella. Komplementtitekijä H:n geenivirhe aiheuttaa häiriön CRP:n sitoutumisessa ja toiminnassa sekä huonontaa makrofagi-välitteistä puhdistusta. Lisäksi komplementtitekijä H:n tulehdusta hillitsevä vaikutus heikkenee. Nämä tekijät yhdessä johtavat B- ja T-lymfosyyttien kertymiseen sekä sytokiinien lisääntyneeseen tuotantoon RPE-solujen ja Bruchin kalvon väliin. RPE-solujen ja Bruchin kalvon väliin kertyy lisäksi proteiinimateriaalia, mikä aiheuttaa proteiinisakkaumia ja paikallisen tulehdustilan tälle alueelle. (Kaarniranta ym. 2009) KUVA 2. Silmänpohjan valokuva, jossa runsaasti kellertäviä druseneita. Esimerkkejä druseni-kohdista ympyröity mustalla.

11 Nykyinen hoito Kuivaan ikärappeumaan ei ole olemassa tehokasta hoitoa tällä hetkellä. Runsaalla antioksidanttien syömisellä voisi mahdollisesti olla ennaltaehkäisevä vaikutus ikärappeuman kehittymiseen (Summanen 2013). Hoitokeinoja yritetään etsiä. Mahdollisia kohteita voisivat olla esimerkiksi komplementtijärjestelmään tai inflammasomiin vaikuttaminen sekä kantasolujen siirto. (Yonekawa ym. 2015) Kosteaan ikärappeumaan on aikaisemmin käytetty esimerkiksi laserointia ja fotodynaamista terapiaa. Silmän-sisäinen pistoshoito on syrjäyttänyt nämä hoitomuodot jo lähes kokonaan. (Yonekawa ym. 2015) Silmän sisälle pistettävät aineet estävät verisuonten kasvutekijän VEGF:n sitoutumista reseptoriinsa. Sitoutuneena reseptoreihinsa se lisää verisuonten läpäisevyyttä ja aiheuttaa endoteelisolujen jakautumista ja migraatiota sekä aiheuttaa uudisverisuonten muodostumista. VEGF:n esto usein pysäyttää näöntarkkuuden huonontumisen ja voi jopa parantaa sitä. (Kinnunen ym. 2014) Pistoshoidolla voidaan estää jopa 90 % sokeutumisista kosteassa ikärappeumassa. Haitoista tärkeimpiä ovat korkea hinta ja epämukavuus potilaalle. (Yonekawa 2015) Kosteaa ikärappeumaa sairastava potilas saa vuosittain keskimäärin 5-8 silmän-sisäistä pistosta. Yhteen pistokseen käytettävä lääkeainemäärä maksaa euroa. (Kinnunen ym. 2014) Silmän sisäiset pistoshoidot ovat rasite terveydenhuoltojärjestelmälle ja ne aiheuttavat väestön vanhetessa mittavia kustannuksia. 2 Tulehdus Tulehdusreaktio on solujen nopea reaktio uhkaavaan vaaraan. Tulehdusreaktion tarkoituksena on poistaa vieras tai vaurioitunut materiaali sekä varoittaa muita soluja. Hahmontunnistusreseptorit (esimerkiksi Tollin kaltaiset reseptorit) tunnistavat mikrobien tuotteita sekä tulehtuneen tai muuten rasittuneen solun tuottamia molekyylejä. Hahmontunnistusreseptorin aktivoituminen saa aikaan nopeasti monimuotoisen solun sisäisen signaloinnin polun. Tollin kaltaisten reseptorien aktivoitumisen aiheuttama NF-κB:n aktivaatio voi esimerkiksi tuottaa tulehdusta edistäviä välittäjäaineita. (Kauppinen ym. 2016) Paikallinen ja pitkäaikainen tulehdustila silmänpohjassa on tärkeä tekijä ikärappeuman kehittymisessä (Kaarnirata ym. 2009). NF-κB:n aktivaatio sekä aktivaation esto ovat keskeisiä asioita tulehdusprosessin kannalta. Tässä työssä käsitellään NF-κB:a aktivoivia bromodomaineja sekä aktivaatiota estävää SIRT1:stä. Bromodomainien rooli tulehduksellisessa vasteessa välittyy niiden kyvyillä lisätä tulehdusta edistävien transkriptionaalisten tekijöiden aktiivisuutta eli esimerkiksi NF-κB:n aktiivisuutta (Ferri ym. 2015). SIRT1:llä

12 12 on tulehdusta vähentävä vaikutus NF-κB:n alayksikön deasetylaation ja siten NF-κB:n aktivaation eston avulla (Cao ym. 2013) Tulehduksellisten geenien ilmentyminen Histonit ovat DNA:ta (deoksiribonukleiinihappo) kromatiiniksi pakkaavia proteiineja, joiden hännät muokkautuvat translaation jälkeen esimerkiksi asetylaatiolla, fosforylaatiolla tai metylaatiolla. Histonien häntien muunnoksilla on tärkeä rooli kromatiinin aktiivisuuden säätelyssä. Muokkautumiset voivat muuttaa epäaktiivisen, tiukasti pakatun kromatiinin avoimeksi ja aktiiviseksi tai toisinpäin. (Tietava ym. 2012) Tulehdusta edistävä ärsyke aiheuttaa transkriptionaalista uudelleenohjelmointia asetyloimalla tiettyjä histoneja (Belkina ym. 2013). Tulehduksellisten geenien ilmentyminen on tarkasti säädeltyä. Tätä säätelyä toteuttavat tiukasti kromatiinin lukijat. Ne sitoutuvat täsmällisesti histonien translaation jälkeisiin muokkauksiin yhdessä sekvenssikohtaisten transkriptiotekijöiden kanssa. Tämä muodostaa proteiinikompleksin, joka voi transkriptionaalisesti aiheuttaa elimistön eri soluissa joko tulehduksellisten geenien aktivaatiota tai päinvastaisesti tukahduttamista. Kromatiinin lukijat vaikuttavat myös useisiin immuunijärjestelmän ärsykkeiden aiheuttamiin tulehdusvasteisiin. (Belkina ym. 2013) 2.2 Hahmontunnistureseptorit Hahmontunnistusreseptorit eli PRR (pattern recognition receptors)-molekyylit ovat solujen sisäisiä, ulkoisia tai solukalvon lävistäviä sensoreita, joihin kuuluvat muun muassa TLR:t (toll like receptors). Muita hahmontunnistusreseptoreita ovat muun muassa RAGE:t (receptors for advanced glycation end products), NLR:t (NOD-like receptors), CLR:t (C-type lectin receptors) ja systolisen DNA:n sensorit. (Kauppinen ym. 2016) Hahmontunnistusreseptoreihin sitoutuminen johtaa tulehdusta edistävien sytokiinien ja kemokiinien (IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, and IL-8) tuotantoon sekä vapautumiseen solussa. (Said-Sadier ym. 2012, Kauppinen ym. 2016) Hahmontunnistusreseptorien aktivoituminen saa aikaan myös tiettyjen T-solujen aktivaatioon tarvittavien molekyylien ilmentymistä (CD40, CD80 tai CD86) (Kauppinen ym. 2016) DAMP ja PAMP Hahmontunnistusreseptorit tunnistavat mikrobien tuotteita, joita kutsutaan PAMP (pathogen-associated molecular patterns)-rakenteiksi. Ne tunnistavat myös tulehtuneen tai muuten rasittuneen solun tuottamia DAMP (damage-associated molecular patterns)-rakenteita. (Said-Saidier ym. 2012)

13 13 DAMP-rakenteet ovat yleistuntomerkkejä vauriosta. DAMP-rakenteita tunnistavia reseptoreita on sekä immunologisissa, että ei-immunologisissa soluissa. DAMP-rakenteiden tunnistaminen voi solutyypistä ja ympäristöstä riippuen johtaa solujen erilaistumiseen tai kuolemaan sekä tulehduksen vähenemiseen tai lisääntymiseen. DAMP- tai PAMP-rakenteen liittyminen PRR-molekyyliin johtaa tulehdusta edistävien sytokiinien muodostumiseen ja erityksen. (Said-Sadier ym. 2012) TLR Tollin kaltaiset reseptorit muodostuvat kolmesta osasta: LRR (ligand-sensing leucine-rich repeat)-osasta, kalvon läpäisevästä osasta ja solulimassa olevasta TIR (Toll/IL-1 receptor)-osasta. Tollin kaltaiset reseptorit voivat lävistävää solukalvon. Ne voivat tunnistaa rakenteita solun sisä- tai ulkopuolelta. (Kauppinen ym. 2016) Tollin kaltaisten reseptorien toiminta riippuu solutyypistä ja niiden kohtaamista DAMP- tai PAMPrakenteista. Eri DAMP-rakenteiden kohtaaminen voi johtaa eri signaalipolkuihin, joissa lopputuloksena voi olla esimerkiksi solukuolema tai tulehdusta edistävien välittäjäaineiden tuotanto. (Said-Sadier ym. 2012) Tollin kaltaisten reseptorien aktivoituminen voi johtaa muun muassa tulehdusta edistävien sytokiinien, kemokiinien, tyypin 1 interferonien tai mikrobivastaisten peptidien tuotantoon. Tollin kaltaisten reseptorien signalointi voidaan jakaa Myd88-välitteiseen polkuun, joka johtaa tulehdusta edistävien sytokiinien tuotantoon ja TIRF-välitteiseen polkuun, joka johtaa tyypin 1 interferonin tuotantoon virusten aiheuttamassa tulehdusreaktiossa. (Kauppinen ym. 2016) MyD88 voi vuorovaikutuksessa TIR-osan kanssa aiheuttaa NF-κB:n aktivaation ja siirtymisen solulimasta tumaan. Tämä aiheuttaa tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannon ja vapautumisen solusta. (Said-Sadier ym. 2012, Kauppinen ym. 2016) Inflammasomi Myös inflammasomit aktivoituvat kohdatessaan DAMP- ja PAMP-rakenteita. Inflammasomit ovat solun sisäisiä sensoreita ja ne täydentävät Tollin kaltaisten reseptorien toimintaa säätelemällä IL-1β- ja IL-18- sytokiinien muodostumista. (Junttila ym. 2013) Inflammasomiin sisältyviä reseptoreita on useita: esimerkiksi NLRP1 (nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing protein), NLRP3, NLRP4 ja AIM2 (absent in melanoma 2). Näistä NLRP3 ilmentyy myelooisissa soluissa. Sen voivat aktivoida esimerkiksi LPS (lipopolysakkaridi), kolesteroli ja β-amyloidi. (Junttila ym. 2013). Myös A2E voi aktivoida NLRP3:ta. NLRP3:n aktivaatio aiheuttaa IL-1β:n ja IL-18:a kehittymistä ja tuotantoa. (Junttila ym. 2013, Kauppinen ym. 2016) Muita hahmontunnistusreseptoreita tulehduksessa RAGE vaikuttaa NF-κB:n toimintaan ja sitä kautta tulehdusta edistävien sytokiinien tuotantoon. RAGE:n voi aktivoida esimerkiksi β-amyloidi. Nodin kaltaisia reseptoreita (NLR) on tunnistettu ainakin 23 eri reseptoria.

14 14 Näistä osa voi vaikuttaa inflammasomin kautta muun muassa IL-1:n ja IL-18:a aktivaatioon. (Kauppinen ym. 2016) 2.3 Välittäjäaineiden tuotanto Hahmontunnistusreseptorin aktivoituminen se saa aikaan nopeasti monimutkaisen solun sisäisen signaloinnin polun. Tollin kaltaisten reseptorien aktivoitumisen aiheuttama NF-κB:n aktivaatio voi esimerkiksi tuottaa tulehdusta edistäviä välittäjäaineita. (Kauppinen ym. 2016) Välittäjäaineista esimerkiksi IL-1β ja TNF-α liittyvät endoteelisolujen aktivaatioon. Endoteelisolujen aktivaatiossa tapahtuu leukosyyttien adheesiomolekyylien, sytokiinien, kasvutekijöiden ja HLA-molekyylien ilmentymisen lisääntyminen. Verisuonten läpäisevyys lisääntyy ja kiertävät leukosyytit tarttuvat endoteelisolujen tuottamiin adheesiomolekyyleihin. Vauriopaikalle siirtyy myös nestettä ja plasman proteiineja. Kemokiinit houkuttelevat paikalle neutrofiilisiä granulosyyttejä. Ne puolestaan houkuttelevat monosyyttejä, jotka erilaistuvat paikallisista olosuhteista riippuen joko makrofageiksi tai dentriittisoluiksi. Makrofagit ja dentriittisolut ovat antigeeniä esitteleviä soluja eli APC:tä (antigen presenting cells). APC:t prosessoivat fagosytoimastaan materiaalista peptidipätkiä, joita kutsutaan antigeeneiksi. Solut vaeltavat paikallisiin imusolmukkeisiin esitellen siellä MHD-molekyylin välitykselläantigeeninsä muille immuunijärjestelmän soluille. Imusolmukkeessa hankitun immuniteetin solut (lymfosyytit) avustavat luontaisen immuniteetin soluja (monosyytit, granulosyytit) ja tekevät reaktiosta tarkemmin suunnatun kehittämällä antigeenikohtaisen vasteen. Tulehtuneessa ympäristössä markrofagit muuntautuvat M1- soluiksi. M1-solut voivat tuottaa suuria määriä tulehdusta edistäviä sytokiinejä, kuten IL-1β:aa, TNF-α:aa, IL- 6:a, IL-12:a sekä inos:a (inducible nitric oxide synthase). (Kauppinen ym. 2016) 2.4 NF-κB Yleistä Transkriptoritekijät Rel/NF-κB -perheessä toimivat luontaisen ja opitun immuniteetin tärkeimpinä säätelijöinä. Rel/NF-κB -perheestä tunnetaan viisi tekijää: RelA (p65), c-rel, RelB, NF-κB 1 (p105) ja NF-κB 2 (p100). Yleisin näistä on RelA, jota esiintyy useimmissa soluissa. C-Rel-komplekseja esiintyy puolestaan useimmissa verisolualkuperää olevissa soluissa. C-Rel-kompleksien esiintyvyys ja aktivoituminen esimerkiksi T-soluissa ja APC:ssa ohjaa niiden kehitystä ja erilaistumista. (Viserkruna ym. 2012)

15 15 NF-κB:n aktiivisuuden häiriintyminen on osana monia syöpiä ja tulehduksellisia sairauksia. NF-κB on mukana transkription avulla monissa solun sisäisissä säätelytapahtumissa, kuten solun kasvu ja jakaantuminen, immuunivaste, ohjelmoitu solukuolema sekä stressivaste monille haitallisille tekijöille. (Dyson ym. 2012) Aktivaatio IκB (inhibitor of κb) esiintyy solulimassa kompleksina NF-κB:n kanssa. Tällöin IκB toimii inhibitorisena proteiinina estäen NF-κB:n toiminnan ja transkription. (Dyson ym. 2012) Muun muassa Tollin kaltaisten reseptorien aktivaatiosta seuraa solun sisäinen signaalivälitystie, joka johtaa IκB:n fosforylaatioon (Janeway ym. 2001). Tämä tapahtuma aktivoi NF-κB:n. NF-κB siirtyy solun tumaan ja kiinnittyy useisiin promoottoreihin. Tällöin NF-κB myös aiheuttaa transkriptionaalista aktivaatiota useissa geeneissä, jotka ovat yhteydessä muun muassa immuniteettiin ja tulehdusta edistäviin proteiineihin esimerkiksi sytokiineihin. (Janeway ym ja Dyson ym. 2012) Samalla aktivoitunut NF-κB aloittaa IκBα:n transkription. Tuotettu IκBα yhdistyy NF-κB:aan palauttaen solun lepotilaan. (Dyson ym. 2012) NF-κB asetylaatiosta vastaa p300/cbp, joka on HAT-perheen molekyyli. Asetylaation vaikutus riippuu siitä mikä NF-κB:n lysiineistä asetyloidaan. Lysiini-221:n asetylaatio edistää NF-κB:n sitoutumista DNA:han. Yhdessä lysiini-218:n asetylaation kanssa se heikentää RelA:n sitoutumista IκBα:aan. (Huang ym. 2009) Tällöin IκB:n toiminta NF-κB:n inhibittorina estyy (Dyson ym. 2012). Lysiini-310:n asetylaatio on tärkeä RelA:n trankskriptionaalisessa aktiivisuudessa. Lysiini-310:n asetylaatio ei vaikuta sen yhdistymiseen IκBα:aan. (Huang ym. 2009) Tulehduksen kannalta NF-κB:n aktivoitumisessa yksi kriittisimmistä asioista on sen alayksikön RelA:n ja sen osan lysiini-310:n asetyloituminen. NF-κB:n aktivoitumisessa BRD4 toimii yhteistyössä p300:n kanssa. BRD4 sitoutuu RelA:n asetyloituun lysiini-310:een. Kumoamalla lysiini-310:n aseylaation voidaan merkittävästi estää NF-κB:n aktivoitumista ja tulehduksellisten sytokiinien tuotantoa. (Huang ym. 2009) SIRT1 voi inhiboida NF-κB:n transkriptiota ja siten aktiivisuutta deasetyloimalla lysiini-310:n. (Yeung ym. 2004) SIRT1 voi myös vähentää NF-κB:aa asetyloivan HAT-entsyymien aktiivisuutta. (Yeung ym. 2004, Huang ym. 2009) 2.5 Tulehduksen välittäjäaineet Sytokiinit ovat pieniä proteiineja kehossa. Useat solut tuottavat niitä ärsykkeen vaikutuksesta. Sytokiinit toimivat reseptorien kautta vaikuttamalla joko autokriinisesti eli vapauttamansa solun toimintaan tai endokriinisesti eli umpieritteisesti. (Janeway ym. 2001)

16 Tulehdusta edistävät sytokiinit Tulehdusta edistäviin eli proinflammatorisiin sytokiineihin kuuluvat muun muassa IL-6, IL-1 ja TNF-α (Mäkinen ym. 2012). IL-6 aktivoi T- ja B-soluja. Se myös lisää vasta-aineiden tuotantoa ja aiheuttaa akuutin vaiheen proteiinien tuotantoa esimerkkinä maksan tuottama CRP. CRP puolestaan aktivoi komplementtijärjestelmää. IL-1 aktivoi verisuonten endoteeliä sekä T- ja B-soluja. TNF-α aktivoi verisuonten endoteeliä ja lisää sen läpäisevyyttä, mikä johtaa IgG:n (immunoglobuliini G), komplementin ja muiden solujen lisääntymiseen kudoksessa. Tulehdusta edistävät sytokiinit myös yhdessä nostavat kehon lämpötilaa aiheuttaen kuumeen. (Janeway ym. 2001) Kemokiinit Yksi sytokiinien alaluokka on kemokiinit. Kemokiinien päätehtävä on houkutella tulehdussoluja verestä tulehduspaikalle. Ne auttavat tulehdussoluja siirtymään verisuonten seinämien läpi ja lisäksi ohjaavat oman pitoisuutensa avulla tulehdussoluja oikeaan paikkaan. Yksi esimerkki kemokiineistä on IL-8. Sen tärkeimmät tehtävät ovat neutrofiilien, basofiilien ja T-solujen houkuttelu tulehduspaikalle, neutrofiilien aktivaatio ja verisuonten uudismuodostus. IL-8:aa voivat tuottaa esimerkiksi patogeenin ensimmäisenä kohdanneet markofagit tai RPE-solut. (Janeway ym. 2001) 3 Sirtuiinit Sirtuiinit 1-7 kuuluvat NAD-välitteisiin III luokan deasetylaasientsyymeihin. Sirtuiinien aktiivisuuden on todettu olevan yhteydessä geenien transkriptionaaliseen vaimentamiseen, metaboliseen säätelyyn, ohjelmoituun solukuolemaan, solujen selviytymiseen, tulehdukseen ja terveeseen ikääntymiseen. (Yeung ym. 2004, VIllabla ym. 2012) Sirtuiineihin vaikuttaminen on suosittu tutkimuskohde, koska niillä voisi olla hoidollisia mahdollisuuksia tulehdukseen liittyvissä, ikään liittyvissä, metabolisissa tai sydän- ja verisuoniperäisissä sairauksissa (Villabla ym. 2012). 3.1 SIRT1 Eukaryoottisoluissa on kahdenlaista DNA:n geenien vaimentamista: aktiivinen- ja perusvaimennus. Aktiivinen vaimennus aloitetaan stimulaation jälkeen ja se vähentää transkriptiota. SIRT1 toimii tällä tavalla vähentäen NF-κB:n transkriptiota. (Yeung ym. 2004) SIRT1 vaikuttaa inhibitorisesti tulehduksen

17 17 välittäjäaineisiin ja signalointiin (Kokkola ym. 2015). SIRT1:llä on tulehdusta vähentävä vaikutus NF-κB:n alayksikön deasetylaation ja siten NF-κB:n aktivaation eston avulla (Cao ym. 2013). SIRT1 vaikuttaa suoraan NF-κB:n RelA-alayksikköön. SIRT1 deasetyloi lysiini 310, mikä inhiboi NF-κB:n aktiivisuutta. (Yeung ym. 2004) SIRT1 voi myös vähentää NF-κB:aa asetyloivan HAT-entsyymien aktiivisuutta. (Yeung ym. 2004, Huang ym. 2009) SIRT1:llä on vaikutusta myös solusyklissä. SIRT1:n on todettu voivan inaktivoida p53:n välittämää transkriptiota ja ohjelmoitua solukuolemaa. Tämä vaikutus tapahtuu deasetylaation avulla. Toisaalta SIRT1 voi herkistää soluja TNFα:n aiheuttamalle solukuolemalle inhiboimalla NF-κB:n transkriptiota. (Yeung ym. 2004) SIRT1:n määrä lisääntyi RPE-soluissa, joissa oli saatu aikaan tulehdus β-amyloidilla. β-amyloidi lisää NF-κB:n aktivaation kautta IL-6:n, IL-8:n ja MMP-9:n (matrix metallopeptidase 9) määrää soluissa. SIRT1 suojaa RPEsoluja β-amyloidin tulehduksellisilta ja vammauttavilta vaikutuksilta. IL-6, IL-8 ja MMP-9:n määrät lisääntyivät, jos SIRT1:n toiminta estettiin soluissa. (Cao ym. 2013) 3.2 SIRT1:n aktiivisuuden selvittäminen etoposidin avulla Etoposidi on yleisesti käytetty lääke syöpähoidoissa. Se aiheuttaa DNA-vaurioita Topoisomeraasi II eston avulla. Etoposidillä hoidetut solut pysähtyvät solusyklin G2/M vaiheeseen joko p53-välitteisen tai itsenäisen tien kautta. Suurella etoposidi-pitoisuudella käsiteltyjen solujen ohjelmoitu solukuolema lisääntyy ja niiden p53:n transkriptio-välitteiset toiminnot lisääntyvät. (Jamil ym. 2015) DNA:n vaurioituessa p53:ssa tapahtuu asetylaatio kahdessa kohdassa: K320:ssä ja K382:ssa. SIRT1 voi kiinnittyä p53:een ja spesifisesti deasetyloida K382:n. (Vaziri ym. 2001) SIRT1:n aiheuttama deasetylaatio estää solusyklin pysähtymiseen ja ohjelmoituun solukuolemaan liittyvien geenituotteiden ilmentymistä (Yeung ym. 2004). SIRT1:n aktiivisuutta soluissa ei voi mitata suoraan, mutta sen aiheuttamaa p53:n deasetylaatiota voidaan tutkia Western Blot-menetelmällä. Deasetylaatioiden määrästä voidaan tehdä päätelmiä SIRT1:n aktiivisuudesta.

18 18 4 Bromodomain-inhibiittorit Bromodomainit ovat histonien asetylaation epigeneettisiä lukijoita. Ne osallistuvat lisäksi kromatiinin uudelleen muokkaamiseen sekä transkription säätelyyn. Bromodomaineja sisältävät proteiinit ovat monimuotoinen ryhmä ja ne jaetaan kahdeksaan perheeseen rakenteen perusteella. Yhteisenä rakenteena useimmista bromodomaineista löytyy Kac:n (ε-n-asetyloitu lysiini jäänne) tunnistava osa. (Ferri ym. 2015) Bromodomainit toimivat kudoskohtaisesti sitoen proteiinikomplekseja asetyloituihin histoneihin tai kromatiiniin (Sanches ym. 2009). Ne säätelevät asetyloituja ja histoneihin pakattuja tulehdusgeenejä tulehdusta edistävän kiihokkeen vaikutuksesta (Kokkola ym. 2015). Bromodomainien rooli tulehduksellisessa vasteessa välittyy niiden kyvyillä lisätä tulehdusta edistävien transkriptionaalisten tekijöiden aktiivisuutta (esimerkiksi NF-κB:n aktiivisuutta) (Ferri ym. 2015). 4.1 BET-proteiinit Histonien asetylaation säätelyllä voidaan vaikuttaa geenien ilmentymiseen ja kromosomien kromatiinin rakenteeseen. BET-proteiinit tunnistavat histonien asetylaatiota. (Kokkola ym. 2015) Tämä voi aiheuttaa BET-proteiinin sitoutumisen esimerkiksi NF-κB:aan ja NF-κB:n aktivoitumisen (Huang ym. 2009). SIRT1 puolestaan voi deasetyloida histoneja ja se voi toimia geenien transkriptiota vaimentavana (Kokkola ym. 2015). Yksi bromodomaineja sisältävien proteiinien perheistä on BET-proteiinit. (Kauppinen ym. 2016) BETproteiineja ovat muun muassa BRD2, BRD3 ja BRD4. Nämä kaikki esiintyvät nisäkkäillä kaikissa kudoksilla. (Belkina ym. 2013) BET-proteiinit ovat tärkeitä solusyklin säätelyssä, minkä vuoksi ne ovat osallisena monien syöpien ja tulehduksellisten sairauksien kehittymiseen. (Flippakopoulos ym. 2010, Kokkola ym. 2015) BRD2 on välttämätön tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannolle makrofageissa. Alhaiset BRD2-tasot latistavat tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannon. Tämä voisi selittyä BRD2:n kyvyllä säädellä NF-κB:n aktiivisuutta. (Belkina ym. 2013) BRD4 on mukana NF-κB:n aktivoitumisessa sitoutumalla sen RelAalayksikön asetyloituun lysiini-310:een (Huang ym. 2009). BRD2 ja BRD4 ovat makrofageissa fyysisesti yhteydessä tulehduksellisten sytokiinien geenien kanssa (Belkina ym. 2013). Soluissa, joissa SIRT1 oli estetty, tulehduksen lisääntyminen ja siitä aiheutuvat vaikutukset pystyttiin kumoamaan BET-inhibiittoreilla (Kokkola ym. 2015). Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt bromodomain-inhibiittorit (JQ1, PFI-1 ja I-BET151) ovat BET-proteiinien spesifisiä inhibiittoreja.

19 JQ1 JQ1 on löydetty ensimmäisenä bromodomain-inhibiittorina Se kilpailee sitoutumisesta kromatiiniin bromodomainien asetyloitujen lysiini-jäänteiden kanssa. Kolmiulotteisista muodoista JQ1 (-) ei ole aktiivinen, mutta JQ1 (+) on aktiivinen. (Flippakopoulos ym. 2010) Vain aktiivisella muodolla käsitellyissä soluissa saatiin aikaan TNFα:n ja IL-6:n tasojen lasku (Belkina ym. 2013). JQ1 estää BRD2:n ja BRD4:n sitoutumisen histoneihin ja myös IL-6:n promoottoriin. Tämä vähentää IL-6:n, IL-10:n, MCP-1:n (monocyte chemotactic protein 1) ja TNFα:n määriä. (Belkina ym. 2013) Vaihtoehtoinen vaikutustapa histonien asetylaatiolle on, että BRD2 ja BRD4 voivat sitoutua ja aktivoida NF-κB:n RelAproteiiniin yhtymällä sen asetyloituun K310-osaan. Tuolloin JQ1 toimisi häiritsemällä RelA:n K310:n ja BETproteiinien sidettä. (Belkina ym. 2013) JQ1-käsittely vähensi myös IL-8:n määrää LPS:llä aiheutetussa tulehdusreaktiossa (Kokkola ym. 2015). JQ1 voi solutyypistä riippuen lisätä SIRT1:n ilmentymistä tai lisätä sen aktivaatiota. Jo 24 tunnin käsittely JQ1:llä lisäsi huomattavasti SIRT1:n määrää mm. mikrogliasoluissa. BET-proteiinien esto esimerkiksi JQ1:n avulla paljastaa SIRT1:lle lisää asetyloituja kohtia deasetyloitavaksi ja lisää SIRT1:n solun sisäistä aktiivisuutta. Käsittely myös lisäsi p53-proteiinien deasetyloitumista ihmissoluissa. Tämä todennäköisesti johtui SIRT1:n ilmentymisen lisääntymisestä sillä SIRT1 säätelee p53:n deasetylaatiota. (Kokkola ym. 2015) 4.3 PFI-1 PFI-1 estää yhteyden BET-proteiinien bromodomainien ja asetyloityjen histonien välillä. PFI-1:n esto tapahtuu varaamalla asetyyli-lysiini sitoutumiskohta BRD2:ssa ja BRD4:ssa. (Picaud ym. 2013) PFI-1 estää erityisesti BRD4:n toimintaa. PFI-1 voi vähentää NF-κB:n välitteistä IL-6:n ja IL-8:n määrien nousua esimerkiksi tulehtuneissa ihmisen ilmateiden epiteelisoluissa. (Khan ym. 2014) PFI-1:llä voisi olla teoreettisesti mahdollista pienentää muiden tulehdusta edistävien sytokiinien tai kemokiinien määriä tulehtuneissa soluissa BRD4:n toiminnan (ja tätä kautta esimerkiksi NF-κB:n aktivaation) eston avulla. 4.4 I-BET151 I-BET151 vaikuttaa erityisesti BRD4:n toimintaan estäen sitä liittymästä asetyloituun NF-κB:n RelAalayksikköön. Se vähensi LPS-käsittelyn aiheuttamaa IL-6:n tuotantoa soluissa. Suurempi I-BET151-pitoisuus kasvatusalustalla vähensi myös tuotetun TNFα:n määrää (Barrett ym. 2014).

20 20 5 Työn tarkoitus ja tavoitteet Ikärappeuman kehittymiseen kuuluu iän lisäksi keskeisenä tekijänä verkkokalvon solujen pitkäaikainen tulehdustila. Tässä tutkimuksessa pääaiheena on tulehdusreaktion syntyminen sekä sen estämiseen tai vaimentamiseen vaikuttaminen. Työssä tutkittiin in vitro kolmen bromodomain-inhibiittorin vaikutusta verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa etoposidillä aiheutettuun tulehdusvasteeseen. Tutkittavia bromodomain-inhibiittoreita olivat JQ1, PFI-1 ja I-BET151. Tulehdusvastetta tutkittiin mittaamalla solujen erittämiä välittäjäaineita kasvatusliuoksesta. Välittäjäaineista tutkittiin IL-6 ja IL-8 ELISA-menetelmällä. Bromodomain-inhibiittorien kykyä lisätä SIRT1:n aktiivisuutta tutkittiin mittaamalla soluissa olevan asetyloituneen p53-proteiinin määrää Western Blot-menetelmällä. Myös SIRT1:n määrää mitattiin samalla menetelmällä. Työn tarkoituksena oli selvittää mahdollisuutta vähentää tulehdusta käyttämällä bromodomain-inhibiittoreita verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa ja lisäksi tutkia SIRT1:n roolia kyseisessä prosessissa. 6 Materiaalit ja menetelmät 6.1 Solujen kasvatus Verkkokalvon pigmenttiepiteelisolut olivat solulinjaa ARPE-19 (American Type Culture Collection, USA). Kasvatusliuoksena oli DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium):F-12 (1:1) (GIBCO, UK), jossa oli lisäksi 10 % FBS:a (Fetal Bovine Serum) (Thermo Fisher Scientific, USA), 100 U/ml Penisilliiniä (Lonza, Sveitsi), 100 µg/ml Streptomysiiniä (Lonza, Sveitsi) ja 2mM L-glutamiinia (Lonza, Sveitsi). Soluja kasvatettiin inkubaattorissa +37 o C:een lämpötilassa ja 5 % CO 2 pitoisuudessa kasvatuksen ja tutkimusten aikana. Solut jaettiin uusille maljoille 3-4 päivän välein peruskasvatuksen aikana käyttämällä Trypsiini-EDTA:ta (Life Technologies, USA). 6.2 Solujen käsittely Solulaskennan avulla jokaiselle 12-kuoppalevyn kuopalle laitettiin kasvamaan ARPE-19 solua yllä mainitussa kasvatusliuoksessa. Soluja inkuboitiin lämpökaapissa +37 o C:ssa, 5 % hiilidioksidissa tuntia, kunnes kuoppalevyn pohjasta noin 95 %:a oli täyttynyt soluilla. Jokaiselle kuopalle vaihdettiin koko

21 21 kasvatusliuos. Kasvatusliuoksessa oli mukana joko DMSO:ta (Sigma, USA) tai yhtä bromodomaininhibiittoria: JQ1 (BioVision, USA), PFI-1 (BioVisio, USA) tai I-BET151 (BioVision, USA). Inhibiittorien loppupitoisuus oli jokaisella kasvatusmaljalla 400 nm. Kuopille 3, 4, 7 ja 8 (Taulukko 3) lisättiin DMSOliuosta. Kuopille 13, 14, 15 ja 16 (Taulukko 4) lisättiin 400 nm JQ1-liuosta jokaiselle kuopalle. Kuopille 17, 18, 19 ja 20 (Taulukko 4) lisättiin 400 nm PFI-1-liuosta jokaiselle kuopalle. Kuopille 21, 22, 23 ja 24 (Taulukko 4) lisättiin 400 nm I-BET151-liuosta jokaiselle kuopalle. Soluja inkuboitiin lämpökaapissa viisi tuntia. Tämän jälkeen kuopille 9 ja 10 (Taulukko 3) lisättiin suoraan 5 µl DMSO:ta (loppupitoisuus 0,5 %) ja kuopille 5, 6, 7, 8, 15, 16, 19, 20, 23 ja 24 (Taulukko 3 ja Taulukko 4) lisättiin suoraan 5 µl etoposidia (Sigma, USA). Loppupitoisuus oli 100µM etoposidia jokaisella kuopalla. Soluja inkuboitiin 24 tuntia lämpökaapissa. Kasvatusliuos kerättiin talteen IL-6:n ja IL-8:n analysointia varten. Kuopilla olevat solut pestiin kahdesti PBS:llä (phosphate buffer saline). Solut hajotettiin M-PER-liuoksella (Thermo Fisher Scientific, USA). Jokaisen kuopalta hajotettiin mekaanisesti solut ja liuokset kerättiin talteen. Niistä analysoitiin asetyloitu p53:n, SIRT1:n ja GAPDH:n määrä Western Blot-menetelmällä. taulukko 2: kuoppalevy 1, DMSO toimi kuopilla 3, 4, 7 ja 8 kontrollina inhibiittoriliuosten sisältämälle DMSO:lle kontrolli kontrolli DMSO (8 µm) DMSO (8 µm) inhibiittoreille inhibiittoreille DMSO (8 µm) 8. DMSO (8 µm) etoposidi (100 µm) etoposidi inhibiittoreille + inhibiittoreille + etoposidi (100 µm) etoposidi (100 µm) (100 µm) DMSO (100 µm) DMSO (100 µm) kontrolli kontrolli etoposidille etoposidille

22 22 taulukko 3: kuoppalevy JQ-1 (400 nm) JQ-1 (400nM) JQ-1 (400 nm) + JQ-1 (400 nm) + etoposidi etoposidi (100 µm) (100 µm) PFI-1 (400 nm) PFI-1 (400 nm) PFI-1 (400 nm) + PFI-1 (400 nm) + etoposidi (100 µm) etoposidi (100 µm) I-BET151 (400 nm) I-BET151 (400nM) I-BET151 (400 nm) + I-BET151 (400 nm) + etoposidi (100 µm) etoposidi (100 µm) 6.3 ELISA-menetelmä ELISA-menetelmässä käytettiin BD OptEIA Human IL-6 ELISA-pakkausta (BD, USA) ja BD OptEIA Human IL-8 ELISA-pakkausta (BD, USA). Pesuliuoksena oli 0,05 %:nen Tween (Sigma, USA) PBS:llä. Menetelmän käytössä noudatettiin pakkausten valmistajan ohjeita. Määritykset suoritettiin valmistajan antaman ohjeen mukaisesti. Absorbanssiarvot mitattiin spektrofotometrillä 450 nm:n aallonpituudella. Referenssiaallonpituus on 665 nm. 6.4 Western Blot-menetelmä Western Blot- menetelmässä käytettiin 10 %:a geelejä. Jokaisen näytteen proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-menetelmällä (Bradford 1976). Jokaiseen ajoa varten valmistettuun näytteeseen tuli 1:5 näytepuskuria (SDS, ylägeelipuskuri, glyseroli, bromophenol blue) ja 1:20 Merkaptoetanolia (Sigma, USA). Lisäksi jokaisessa näytteessä oli yhdessä tutkimuksessa aina sama määrä proteiinia (15-40 µg). Tilavuudet tasattiin Milli-Q vedellä. Western Blot-näytteitä kuumennettiin +95 o C:ssa viisi minuuttia. Seokset pipetoitiin geelille omiin kuoppiinsa ja geeliä ajettiin 200 V:ssa 2 3 tunnin ajan. Märkäblottaus tehtiin nitroselluloosakalvolle (Amersham, USA). Blottaus tapahtui 17 V:ssa yön yli. Kalvoja blokattiin yhden tunnin ajan huonelämmössä 5 %:ssa maito-, 0,05 %:ssa tween-tbs-liuoksessa. Tämän jälkeen ne olivat yön yli +4 o C:ssa primäärivasta-

23 23 aineliuoksessa. Kalvot pestiin pesuliuoksella ja niitä inkuboitiin sekundäärivasta-aineessa kahden tunnin ajan. (Taulukko 4) Tulokset siirrettiin analysoitavaksi ImageJ-ohjelmaan joko skannaamalla kehitetyltä filmiltä tai Image Quant RT ECL-kameralaitteistolla. taulukko 4: tutkimuksessa käytetyt primääri- ja sekundäärivasta-aineet primäärivasta-aine 1:1000 asetyloitu p53 [K384] (AbCam, UK) sekundäärivasta-aine 1: anti-rabbit vasta-aineen 5 % maito laimennusliuos pesuliuoksessa* *0,05 % tween TBS **0,1 % Tween PBS 1:3000 SIRT1 (Merck Millipore, USA) 1: anti-rabbit 3 % maito pesuliuoksessa* 1: GAPDH (AbCam, UK) 1: anti-mouse pesuliuos** 7 Tulokset 7.1 JQ1 ja I-BET151 vähensivät etoposidilla aiheutettua tulehdusta Etoposidi-käsittely nosti selkeästi mitattujen tulehduksen välittäjäaineiden (IL-6 ja IL-8) määriä ARPE-19- solujen kasvatusliuoksessa. 100 µm:n etoposidi-pitoisuus lisäsi myös solukuolleisuutta kuopilla. (julkaisematon data) Ilman etoposidin vaikutusta tutkituissa soluissa kaikkien kolmen bromodomaininhibiittorin käyttö laski IL-6:n pitoisuutta verrattuna kontrollisoluihin (kuva 3). Jokaisella bromodomaininhibiittorilla altistaminen pienensi IL-6:n määrää verrattuna kontrollina toimiviin DMSO-soluihin (kuva 3). Etoposidi-käsittelyllä aikaansaatu IL-6:n määrän lisääntyminen oli merkitsevästi vähäisempää soluilla, joita oli käsitelty myös JQ1:llä tai I-BET151:llä. PFI-1:n vaikutus IL-6:n vähenemiseen etoposidi-käsitellyillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. IL-6:n määrä ei ollut siis merkitsevästi vähäisempi PFI-1:llä sekä etoposidilla käsiteltyjen solujen sekä kontrollina toimivien etoposidi-solujen välillä. (kuva 3) Jokaisen kolmen bromodomain-inhibiittorin käyttö laski myös IL-8:n määrää verrattuna kontrollisoluihin sekä pelkällä DMSO:lla käsiteltyihin soluihin. (kuvat 3 ja 4) JQ1 ja I-BET151 vähensivät tilastollisesti merkitsevästi IL-8:n määrää etoposidi-käsitellyissä soluissa. PFI-1 ei tilastollisesti vähentänyt merkitsevästi

24 24 IL-8:n määrää myös etoposidilla käsitellyissä soluissa verrattuna kontrollina toimiviin etoposidi-soluihin. (kuva 3) KUVA 3. Tulehdusta edistävien sytokiinien eritys bromodomain-inhibiittoreilla sekä etoposidilla käsitellyissä ARPE-19-soluissa. Etoposidi-käsittely lisäsi välittäjäaineiden määriä selkeästi. Kaikki bromodomaininhibiittorit laskivat välittäjäaineiden määriä verrattuna DMSO-kontrolleihin. Sekä IL-6:n, että IL-8:n määrä oli pienempi soluilla, joita oli käsitelty etoposidin lisäksi joko JQ1:llä tai I-BET151:llä. Verrattaessa etoposidilla käsiteltyjä soluja PFI-1:llä sekä etoposidilla käsiteltyihin soluihin, ei välittäjäaineiden määrässä saatu tilastollisesti merkitsevää eroa. *merkitsevä tulos P< 0,05, **merkitsevä tulos P< 0,01, ***merkitsevä tulos P< 0,001 ns=vertailussa ei eroa tilastollisesti 7.2 Bromodomain-inhibiittorit vähensivät etoposidilla nostetun asetyloidun p53:n määrää, mutta SIRT1:n määrä ei muuttunut merkitsevästi Etoposidi-käsittely nosti asetyloidun p53-proteiinin määrän mitattavalle tasolle (kuva 4). Tutkimuksessa ei ollut tilastollista eroa DMSO:lla käsiteltyjen kontrollisolujen asetyloidun p53-proteiinin määrässä verrattuna pelkällä bromodomain-inhibiittorilla käsiteltyjen solujen asetyloidun p53-proteiinin määrään. Etoposidilla sekä yhdellä bromodomain-inhibiittorilla (JQ1, PFI-1 tai I-BET151) käsitellyt solut sisälsivät selkeästi vähemmän asetyloitua p53:a, kuin vain etoposidilla käsitellyt solut (kuvat 4).

25 25 Etoposidi-käsittely tai JQ1:llä käsittely lisäsi SIRT1:n määrää verrattuna kontrollina toimiviin DMSO-soluihin. PFI-1:llä tai I-BET151:llä käsitellyt solut eivät sisältäneet suurempaa määrää SIRT1:a verrattuna DMSOsoluihin. Pelkällä etoposidilla käsitellyissä soluissa ei ollut tilastollisesti merkitsevästi vähemmän SIRT1:a verrattuna sekä etoposidilla, että bromodomain-inhibiittorilla käsiteltyihin soluihin. (Kuva 4) KUVA 4. Asetyloitu p53- ja SIRT1-tasot etoposidilla ja bromodomain-inhibiittoreilla altistetuissa ARPE-19- soluissa. Asetyloitua p53:a määrä on vähäinen käsittelemättömissä soluissa. Tässä tutkimuksessa asetyloidun p53:n määrää nostettiin etoposidi-käsittelyllä. Kaikki inhibiittorit onnistuivat vähentämään etoposidilla nostetun asetyloidun p53:n määrää selkeästi. SIRT1:n määriin ei saatu merkitsevää eroa tässä tutkimuksessa. Tosin JQ1 erottui muista inhibiittoreista, sillä se nosti SIRT1:n määrää verrattuna kontrollina toimiviin DMSO-soluihin. Sama tulos ei toistunut, kun molempia soluja oli käsitelty etoposidilla. **merkitsevä tulos P< 0,01, ***merkitsevä tulos P< 0,001 ns=vertailussa ei eroa tilastollisesti 8 Päätelmät Tässä työssä tutkittiin BET bromodomain-inhibiittorien vaikutusta tulehdusvasteeseen silmänverkkokalvon epiteelisoluissa. Bromodomain-inhibiittorit vähensivät tulehduksellisten välittäjäaineiden määriä ARPE-19-

26 26 soluissa. Vaikutus tuli ilmi sekä käsittelemättömissä, että etoposidillä käsitellyissä soluissa. Tutkimustulos on yhtenevä aikaisemmin julkaistujen tutkimusten kanssa, joissa oli tutkittu samoja bromodomaininhibiittoreita. (Belkina ym. 2013, Kokkola ym. 2015) Tutkituista inhibiittoreista selkeimmin tulehdusta vähentävät vaikutukset tulivat esille JQ1:llä ja I-BET151:llä. Kolmannen tutkitun inhibiittorin, PFI-1:n vaikutus muun muassa välittäjäaineiden määrään oli samansuuntainen, mutta heikompi. PFI-1:n vaikutusmekanismi solutasolla on periaatteessa samanlainen kahden muun tutkitun bromodomaininhibiittorin kanssa, mutta tässä tutkimuksessa vasteet poikkesivat toisistaan. Mahdollisia selityksiä ovat PFI-1:n heikompi vaikuttavuus tutkituissa soluissa. Toinen mahdollinen vaihtoehto on, että PFI-1 olisi vaatinut suuremman pitoisuuden soluissa saman lopputuloksen aikaansaamiseksi. Tässä tutkimuksessa tulehdusta edistävistä välittäjäaineista mitattiin IL-6:n ja IL-8:n määriä. Muissa tutkimuksissa on saatu esille, että bromodomain-inhibiittorit voivat vähentää tulehduksellisista välittäjäaineista esimerkiksi TNFα:n määrää (Belkina ym. 2013, Barrett ym. 2014). Mahdolliseksi vaikutusmekanismiksi on JQ1:n kohdalla esitetty yhdessä tutkimuksessa, että se voisi estää BRD2:n ja BRD4:n sitoutumisen histoneihin ja vähentää siten tulehduksellisten välittäjäaineiden määriä (Belkina ym. 2013). Tulehduksellisten välittäjäaineiden vähentyminen käsiteltäessä soluja tutkituilla bromodomaininhibiittoreilla voisi johtua myös esimerkiksi NF-κB:n aktivaation estosta. NF-κB:n aktivaatio aiheuttaa transkriptiota useissa geeneissä, jotka liittyvät muun muassa tulehdusta edistäviin sytokiineihin ja kemokiineihin. (Janeway ym. 2001, Dyson ym. 2012) Tulehduksen kannalta NF-κB:n aktivoitumisessa yksi kriittisimmistä asioista on sen alayksikön RelA:n ja sen osan lysiini-310:n asetyloituminen. NF-κB asetylaatiosta vastaa p300/cbp, joka on HAT-perheen molekyyli. NF-κB:n aktivoitumisessa BRD4 toimii yhteistyössä HAT:n kanssa. BRD4 aktivoi NF-κB:n sitoutumalla RelA:n asetyloituun lysiini-310:een. Kumoamalla lysiini-310:n aseylaation voidaan merkitsevästi estää NF-κB:n aktivoitumista ja tulehduksellisten sytokiinien tuotantoa. (Huang ym. 2009) Kolmas mahdollinen vaikutusmekanismi voisi tutkimusten mukaan olla SIRT1:n aktivaation lisääntyminen (Cao ym. 2013, Kokkola ym. 2015). Tutkimuksessa SIRT1 vähensi NF-κB:n aktivaatiota deasetyloimalla sen RelA-alayksikköä (Kokkola ym. 2015). Vaikutusmekanismina voisi olla se, että tutkittu bromodomaininhibiittori (JQ1) estäisi yhteyden BET-proteiinien ja asetyloitujen lysiinien kanssa täten mahdollistaen SIRT1:n aikaansaaman deasetylaation (Cao ym. 2013). SIRT1 vaikuttaa inhibitorisesti tulehduksellisten välittäjäaineiden määrään (Kokkola ym. 2015). Sen tulehdusta vähentävä vaikutus perustuu RelA:n lysiini 310:n deasetylaatioon. Deasetylaatio inhiboi NF-κB:n transkriptionaalista aktiivisuutta ja sen aktivoitumista. (Yeung ym. 2004) SIRT1 voi myös vähentää NF-κB:aa asetyloivien HAT-entsyymien aktiivisuutta. (Yeung ym. 2004, Huang ym. 2009)