Johdatus biofysiikkaan

Transkriptio

1 Johdatus biofysiikkaan luento: Marja Hyvönen Yhteydenotot: p huone (porras J3 Fysiikan kadulta 2.kerrokseen) Kaikki elävät olennot koostuvat soluista, joita rajaa ympäristöstään solukalvo Kaikki solut sisältävät soluelimiä, joita niitäkin rajaa solukalvo Kaikki elävät olennot soluineen ja kalvoineen muodostuvat biomolekyyleistä: vesi, perintöaineksen DNA&RNA, aminohapoista koostuvat proteiinit eli valkuaisaineet, lipidit eli rasvat, sekä sokerit 1

2 1. luento (KH) : Mitä biofysiikka on? Historia, opiskelu ja tutkimus 2. luento: Molekyylien biofysiikka (MH) 3. luento: Solukalvojen biofysiikka (MH) 4. luento: Solujen biofysiikka (MH) 5. luento (KH) 6. luento (KH) 7. luento (KH) SIIS à 2. luento: - Biomolekyylit ja biomolekyylisysteemien biofysiikkaa ( kemiaa) - Esimerkkejä niiden tutkimuksesta laskennallisesti mallinnukseen ja simulaatioihin perustuen, mutta myös kokeellisia menetelmiä mainitaan MITTASKAALAT à 2

3 MITTASKAALOISTA punasolut DNA 1 m 1 dm 10-1 m 1 cm 10-2 m 1 mm 10-3 m 10-4 m 10-5 m 1 µm 10-6 m 10-7 m 10-8 m 1 nm 10-9 m 1 Å m

4 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA... I. vesi II. lipidit eli rasva-aineet à molekyylitason kalvot, esim. solukalvo III. nukleiinihapot à DNA, RNA IV. aminohapot à proteiinit ja peptidit (eli valkuaisaineet) V. sokerit eli hiilihydraatit

5 Molekyylien liikkeistä Molekyylien ja isompienkin aineiden satunnaisista liikkeistä liuoksissa raportoitiin ensimmäisen kerran 1800-luvun alkupuolella, jolloin Robert Brown havaitsi siitepölyn liikkeet vesiliuoksessa. Hän oletti myös vesimolekyylien oman satunnaisliikkeen oleellisesti vaikuttavan asiaan tämän kaltaiselle liikkeelle käyttöön nimitys Brownin liike Brownin liikkeen eli diffuusion perustan tutkimukset olivat Albert Einsteinin ensimmäisiä merkittäviä julkaisuja aivan 1900-luvun alussa (näiden perusteella yhdessä valosähköisen ilmiön selvittämisen kanssa hän myös sai Nobelin palkinnon) Kaikki molekyylit (ja partikkelit) ovat liuoksissa (kuten kaasuissakin) aina liikkeessä: - molekyylien (partikkelien) kineettinen liike-energia riippuu lämpötilasta - tämä molekyylien satunnaisliike on perusteena molekyylien, ionien yms. partikkelien diffuusiolle ja muille ominaisuuksille nesteissä ja soluissa 5

6 Vesi, H 2 O H O H - on kaikkien elävien olentojen tärkein molekyyli - osallistuu suoraan moniin elimistön reaktioihin, mutta on myös mukana aineena, jossa muut molekyylit ovat - on hyvin polaarinen aine: elektronien orbitaalit ovat hyvin epäsymmetriset molekyylin vetykärjet ovat positiivisesti varautuneet ja happi negatiivisesti varautunut, ts. muodostavat voimakkaan dipolin o

7 - vesimolekyylit vaikuttavat toisiinsa dipoli-dipoli-vuorovaikutuksen kautta - nestemäisenäkin veden dipolimomentti on suuri osa vesimolekyyleistä on aina vetysidoksilla kiinni toisissaan - niinpä nesteenä oleva vesi on tavallaan rakenteinen ja siinä olevat vesimolekyylit ovat koko ajan vaihtuvassa, vetysidosten määräämässä ryhmityksessä - jos vesiliuoksessa ei ole riittävästi lämpöenergiaa, muodostavat eri molekyylien vedyt ja hapet lisää vetysidoksia, jotka sitovat veden tetraedrin muotoisiksi kiteiksi lopulta lämpöenergian määrän laskiessa vesi jäätyy - veden puolestaan kuumetessa se muuttuu vähitellen vähemmän ja vähemmän rakenteiseksi eli vetysidosten olemassaolo lyhenee ja vähenee, kunnes kiehuessaan vesi höyrystyy vetysidosten kokonaan kadotessa 7

8 - vesiliukoisten, ns. hydrofiilisten aineiden on oltava myös hyvin polaarisia yhdisteitä, liuetessaan näiden aineiden on kilpailtava vesimolekyylien kanssa sidosmuodostuksesta Kääntäen: veteen liuenneet molekyylit, ollen polaarisia, jakavat veden kanssa samat ominaisuudet, ja ovat normaalisti voimakkaasti vuorovaikutuksessa sekä vesimolekyylien kanssa että keskenään, sekä vetysidosten että dipoli-vuorovaikutusten kautta - monet apolaariset aineet, kuten rasvat eivät liukene veteen ja vesiseoksessa erottuvat omaksi faasikseen pienimpään mahdolliseen energiatilaan (misellit ja membraanit) 8

9 LIPIDEJÄ ~ itseorganisoituminen vesiolosuhteissa... - vesihakuiset, hydrofiiliset eli polaariset osat (valkoiset pallot esittävät lipidimolekyylien varautuneita pääryhmiä) - vesipakoiset, hydrofobiset eli apolaariset osat (ketjumaiset rakenteet tummemmilla alueilla esittävät lipidimolekyylien varautumattomia hiilivetyketjuja liposomi miselli kaksoiskalvo

10 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA... Lipidejä ~ rasva-aineita... solukalvo 1 m 1 dm 10-1 m 1 cm 10-2 m 1 mm 10-3 m 10-4 m 10-5 m 1 µm 10-6 m 10-7 m 10-8 m 1 nm 10-9 m 1 Å m

11 LIPIDEJÄ ~ RASVA-AINEITA... fosfatidyylikoliini PC kolesteroliesteri CE triglyseridi TG sfingomyeliini SM kolesteroli CHOL Kaksoiskalvojen rakenteissa Kuljetus ja varastointi

12 M. Hyvönen, T.T. Rantala and M. Ala-Korpela, Structure and Dynamic Properties of a Diunsaturated PLPC Lipid Bilayer from a Molecular Dynamics Simulation, Biophys. J., 73 (1997) solukalvo 1m 1 dm 10-1 m 1 cm 10-2 m 1 mm 10-3 m 10-4 m 10-5 m 1 µm 10-6 m 10-7 m 10-8 m 1 nm 10-9 m 1Å m 12

13 RAKENNE- & SÄÄTELYTEHTÄVÄ: kaksoiskalvot - solukalvoissa - solun sisäisissä kalvoissa KULJETUS- & VARASTOINTI- TEHTÄVÄ: - kuljetus solun ulkoisesti lipoproteiineissa paha LDL (Low Density Lipoprotein) - varastointi solun sisäisissä dropleteissa kolesteroliesteri, jonka rasvahappo on ω-3 dokosaheksanoaatti eli ns. välttämätön rashahappo

14 Lipidien epätasainen jakautuminen pinnan tasossa lipidien lauttamaisten muodostelmien arvellaan olevan tärkeässä roolissa biologisten kalvojen rakenteellisten ominaisuuksien ja sitä kautta niiden toiminnan säätelyssä esim. Simons & Ikonen, Functional rafts in cell membranes. Nature. Lipidilauttojen (raft) raft - koko? kaikkea >nm ehdotettu; erittäin vaikea tutkia; todennäköisesti hyvin dynaamisia - koostumus? SM & CHOL -vuorovaikutus ajava voima - merkitys kalvoproteiineille? SIMULAATIOT POPC & SM & CHOL - SEOKSILLE lipids in total - simulations of 100 ns tietyt proteiinit vaativat tietyn lipidikoostumuksen toimiakseen

15 Lipidien epätasainen jakautuminen pinnan tasossa lipidien lauttamaisten muodostelmien arvellaan olevan tärkeässä roolissa biologisten kalvojen rakenteellisten ominaisuuksien ja sitä kautta niiden toiminnan säätelyssä esim. Simons & Ikonen, Functional rafts in cell membranes. Nature. POPC:SM:CHOL = 1:1:1 SIMULAATIOT POPC & SM & CHOL - SEOKSILLE lipids in total - simulations of 100 ns POPC:SM:CHOL = 2:1:1 POPC:SM:CHOL = 62:1:1

16 Lipidien epätasainen jakautuminen pinnan tasossa lipidien lauttamaisten muodostelmien arvellaan olevan tärkeässä roolissa biologisten kalvojen rakenteellisten ominaisuuksien ja sitä kautta niiden toiminnan säätelyssä esim. Simons & Ikonen, Functional rafts in cell membranes. Nature. Niemelä et al, Assessing the nature of lipid raft membranes. PLoS Comp. Biol. jo ~100 ns aikaskaalalla ja 10 nm pituusskaalalla lipidimolekyylit eivät enää satunnaisesti pinnan tasossa, vaan voidaan erottaa toisistaan, esim. ketjujen järjestyksen suhteen poikkeavia alueita POPC:SM:CHOL = 1:1:1 SIMULAATIOT POPC&SM&CHOL - SEOKSILLE lipids in total ns simulations for each system POPC:SM:CHOL = 2:1:1 POPC:SM:CHOL = 62:1:1

17 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA... nukleiinihapot à DNA FOSFORI- HAPPO EMÄS SOKERI adeniini guaniini tymiini sytosiini 1950-luvulla Lontoon King's Collegessa vaikuttanut Rosalind Franklin ja Cambridgen yliopistossa vaikuttaneet James D. Watson ja Francis Crick ratkaisivat DNA:n rakenteen. Kertomuksen mukaan Maurice Wilkins näytti salaa Watsonille ja Crickille Franklinin DNA:n röntgenkuvia hänen siitä tietämättä. Miehet julkaisivat tulokset ennen Rosalind Franklinia kuuluisassa artikkelissaan "Molecular structure of nucleic acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid" Nature-lehdessä DNA:n rakenteen tunteminen mahdollisti kaikki molekyylibiologian edistysaskeleet tästä eteenpäin. Watson ja Crick saivat Nobelin palkinnon 1962 DNA-tutkimuksistaan yhdessä Maurice Wilkinsin kanssa. Rosalind Franklinin varhainen kuolema 1958 esti häntä saamasta Nobelin palkintoa, koska sitä ei jaeta postuumisti.

18 nukleiinihapot à DNA FOSFORI- HAPPO EMÄS SOKERI FOSFORI- HAPPO EMÄS Aà T;Cà G EMÄS SOKERI FOSFORI- HAPPO EMÄS Aà T;Cà G EMÄS SOKERI FOSFORI- HAPPO EMÄS Aà T;Cà G EMÄS SOKERI

19 heikkoja vetysidoksia, jotka kuitenkin pitävät kierteen kasassa!

20 vetysidoksia! oikeita kovalenttisia sidoksia!

21 Solun jakautuessa DNA kahdentuu

22 Valkuaisainesynteesi 1. transkriptio: DNA avautuu à tumassa koodataan lähetti-rna (mrna), joka on emäsjärjestykseltään peilikuva DNA:sta 2. translaatio: mrna tuman ulkopuolelle à kolmen peräkkäisen emäksen koodi vastaa yhtä aminohappoa - soluliman ribosomeissa valmistuvat vesiliukoiset valkuaisaineet - solun sisäisten kalvojen ribosomeissa valmistuvat kalvoihin kiinnittyvät valkuaisaineet (kalvoproteiinit)

23 DNA TEKNIIKAT YHDISTELMÄ-DNA TEKNIIKKA: organismin geneettistä materiaalia voidaan hallitusti eristää, muuntaa ja siirtää toiseen organismiin - elintarviketuotannossa systemaattisesti käytössä - lääketuotannossa joiltain osin rutiinia, esim. insuliinituotanto - geeniterapiassa kehitteillä virus- ja lipidipohjaisia kuljettimia - elektroniikassa DNA-origameihin perustuvia piirejä

24 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA aminohapot à proteiinit ja peptidit (eli valkuaisaineet) poolittomat sivuketjut: Gly Ala Val Leu Ile Met Pro Phe Trp polaariset sivuketjut: varautumattomat: Ser Thr Asn Gln Tyr varautuneet: Cys Lys Arg His Asp Glu

25 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA aminohapot à proteiinit ja peptidit (eli valkuaisaineet) peptidisidoksen muodostuminen: jäävät vapaiksi vetysidoksia varten à polypeptidiketju

26 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA aminohapot à proteiinit ja peptidit (eli valkuaisaineet) laskostuminen: alfa-kierteeksi beta-levyksi tai sitten ei à random coil

27 paha LDL (Low Density Lipoprotein) Amfifiilinen β-levy, 67 aminohappoa sähköstaattinen potentiaali Tyr & Trp osallistuvat hydrofobiseen pintaan kiinnittymiseen Koivuniemi, Kovanen, & Hyvönen; Molecular Dynamics Simulations of a Lipovitellin derived Amphiphilic β-sheet Homologous to ApoB-100 β-sheets at a Hydrophobic Decane-water Interface, BBA Proteins and Proteomics, 3. Nov

28 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA Sokerit ~ hiilihydraatit... - tärkeimmät kasvien glukoosipolymeerit - selluloosa: tärkkelys: β(1-4) linkki à hyvä lujuus amyloosia/amylopektiiniä (kuten selluloosa, mutta α(1-4) / α(1-6) linkki) à joustava ja helposti entsyymeillä sulatettava à kasvien energiavarasto, ja suurin osa ihmisravinnosta (paitsi karppaajilla)

29 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA Sokerit ~ hiilihydraatit... - glykogeeni, eläinten glukoosipolymeeri - analoginen amylopektiinille à ihmisten energiavarasto

30 PERUSRAKENNUSPALIKOISTA Sokerit ~ hiilihydraatit... - osana elimistön elintärkeitä rakennekomponentteja, kuten glykolipidit: sokeriosa lipidin hydrofiilisenä pääryhmänä tai sen osana glykoproteiinit: esim. solun ulkopinnalla solun puolustukseen ja tunnistukseen liittyviä tehtäviä proteoglykaanit: solun ulkoisessa verkostossa (extracellular matrix) esim. vahvasti negatiivisesti varautunut C6S (chondroitin-6-sulphate) -polymeeri kykenee tarttumaan LDL-lipoproteiineihin mahdollisesti LDL:n pinnalla olevien positiivisten Lys-rikastumien avulla à rooli ateroskleroosin synnyssä?

31 Oulun yliopisto, Fysiikan laitos, Biofysiikka 31

32 DIFFERENCE between atoms and molecules - ATOMS: An atom has the nucleus and electrons circulating around it at their electronic orbitals (electron cloud) e.g. He atom In biological molecules (of organic molecules) most important atoms are C, H, O, N, S, and P - MOLECULES (the focus in biophysics!): Molecules form when two or more atoms share their electrons (electron orbitals) à COVALENT BONDS Such condition is favorable, as the energy minimum is achieved! à Breaking of the covalent bond requires energy à Bond energy esim. N N O O 32

33 Molekyylisysteemin (tässä proteiini) oikea toiminta määräytyy sen 3D rakenteesta! à Molekyylien lisäksi niiden 3D -rakenteen selvittäminen ensiarvoisen tärkeää! à 3D -rakenteen selvittämisen tärkeimmät keinot: - NMR-spektroskopia 1) pienille vesiliukoisille proteiineille, sillä spektrikartat muuten liian vaikeaselkoisia 2) vaatii usein leimattuja proteiineja, joiden tuotto kallista ja aikaavievää - Röntgenkristallografia 1) suurille vesiliukoisille ja jopa kalvoproteiineille 2) monet proteiinit hyvin vaikea saada kiteytymään taso:

34 - NMR-spektroskopia 1) pienille vesiliukoisille proteiineille, sillä spektrikartat muuten liian vaikeaselkoisia 2) vaatii usein leimattuja proteiineja, joiden tuotto kallista ja aikaavievää L.C. Sellin, K. Mattila, A. Annila, M. Hyvönen, J.J. Schmidt, T.T. Rantala, T. Kivistö, J. J. McArdle, Conformational Analysis of a Toxic Peptide from Trimeresurus Wagleri Which Blocks the Nicotinic Acetylcholine Receptor, Biophys. J., 70 (1996) taso:

35 - Röntgenkristallografia 1) suurille vesiliukoisille ja jopa kalvoproteiineille 2) monet proteiinit hyvin vaikea saada kiteytymään à low-density-lipoproteiini (LDL) ollut toistaiseksi mahdoton saada kiteytymään korkean resoluution rakenteiden muodostamiseksi (yrityksiä on kyllä ollut jopa avaruudessa asti!) à lipovitellinille taas korkean resoluution rakenne jo vuosia (>10 v) sitten [1] T.A. Anderson, D.G. Levitt, L.J. Banaszak, The structural basis of lipid interactions in lipovitellin, a soluble lipoprotein, Structure 6 (1998) [2] J.R. Thompson, L.J. Banaszak, Lipid protein interactions in lipovitellin, Biochemistry 41 (2002) taso:

36 Molekyylisysteemien oikea toiminta määräytyy sen 3D rakenteesta! à Rakenteen selvittäminen ensiarvoisen tärkeää à Rakenteen selvittämisen tärkeimmät keinot: - NMR-spektroskopia 1) pienille vesiliukoisille proteiineille, sillä spektrikartat muuten liian vaikeaselkoisia 2) vaatii usein leimattuja proteiineja, joiden tuotto kallista ja aikaavievää - Röntgenkristallografia 1) suurille vesiliukoisille ja jopa kalvoproteiineille 2) monet proteiinit hyvin vaikea saada kiteytymään KUN TARPEEKSI HYVÄ RAKENNE TIEDOSSA, TUTKIMUSTA VOIDAAN JATKAA LASKENNALLISESTI MALLINNUKSELLA JA MOLEKYYLIDYNAMIIKAN (MD) SIMULAATIOILLA TÄHÄN SUOMESSA ERINOMAISET MAHDOLLISUUDET (Espoon ja Kajaanin supertietokoneet) TARKKAA tietoa ominaisuuksista ja toiminnasta atomi- ja molekyylitasolla taso:

37 TÄRKEYS... biomolekyylisysteemien mallinnuksella ja simuloinneilla voidaan hankkia tietoa, joka olisi kokeellisilla menetelmillä hyvin vaikeaa tai mahdotonta hankkia... usein mallinus- ja simulaatiotuloksia vaaditaan haastavan kokeellisen datan tulkitsemiseen... Certainly no subject or field is making more progress on so many fronts at the present moment, than biology, and if we were to name the most powerful assumption of all, which leads one on and on in attempt to understand life, it is that all things are made of atoms and that everything that living things do can be understood in terms of the jiggling and wiggling of atoms. The Feynman Lectures on Physics, 1963 Nobel laureate of Physics, 1965

38 TÄRKEYS Molekyylimallinnus ja simulaatiot usein korvaamattomia yksinkin Kokeellinen tutkimus laboratorioissa esim. Patch-clamp, NMR spektroskopia,...

39 SIMULAATIOIDEN TOTEUTTAMINEN Molekyylien liikkeitä (à koordinaatit r ja nopeudet v) aikaaskeleittain lasketaan numeerisesti ratkaisemalla Newtonin liikeyhtälöitä (atomeille i=1, 2, N), kun atomien sijainti r i tiedetään: Voimat F i saadaan potentiaalienergian (tässä V) negatiivisena gradienttina: Runsaasti ohjelmistoja, joilla molekyylidynamiikkasimulaatioita on kohtalaisen helppo tehdä, koska valmiita voimakenttiäkin on saatavilla. Esim. GROMACS, CHARMM, AMBER, NAMD Koodataan atomit paikoilleen ja pistetään aika kulumaan. Simuloinnissa pätevät samat periaatteet kuin lukiosta tutuissa Newtonin liikeyhtälöissä, kun mopon kiihtyvyydestä voidaan laskea mopon paikka ajan funktiona ajan t jälkeen. Mopon sijaan simulaatiossa vaan on esim. viisi miljoonaa atomia, kun proteiini on sijoitettu kalvorakenteeseen ja ympäröity vedellä luonnollisesssa suolapitoisuudessaan.

40 Esimerkiksi MD-simulaatioita varten systeemin osien (perinteisesti atomien) väliset vuorovaikutusenergiat kuvataan voimakentän avulla, kunkin sidoksen ominaisuudet huomioon ottaen... Kokonaispotentiaalienergia: E = E + E + E + E + E + E + tot pituus kulma kierto taso vdw elec SIDOSVÄLITTEISET KAIKKIEN ATOMIEN VÄLILLÄ SIDOKSET määrävät suurelta osin molekyylien molekyylisysteemien rakenteen ja toiminnan E vdw JA E elec taso:

41 TULOKSIAKIN SAADAAN raakadata: 1) koordinaatit ja nopeudet ajan funktiona à fysikaaliset ominaisuudet & dynamiikka esim. jakumat atomiryhmittäin (H 2 O, P ja kaksoissidokset) lipidikalvon normaalilla H 2 O P Hyvönen and Kovanen, Eur. Biophys. J., 2005

42 TULOKSIAKIN SAADAAN raakadata: raakadata: 1) koordinaatit ja nopeudet ajan funktiona à fysikaaliset ominaisuudet & dynamiikka esim. sfingomyeliinien vetysitoutuminen molekyylien sisäisesti ja molekyylien välillä Hyvönen and Kovanen, Molecular dynamics simulation of sphingomyelin bilayer. J. Phys. Chem. B. 107 (2003)

43 Koivuniemi A, Vuorela T, Kovanen PT, Vattulainen I, Hyvönen MT (2012) Lipid Exchange Mechanism of the Cholesteryl Ester Transfer Protein Clarified by Atomistic and Coarse-grained Simulations. PLoS Comput Biol 8(1): e HDL, good cholesterol altogether ~ atoms (including good enough hydration)

44 LISÄTIETOJA Kurssit esim: Biosysteemien analyysi Biosysteemien simulointi Molekyylien biofysiikka Laskennallinen fysiikka Lopuksi esimerkki turkulaisten artikkelista kokeelliseen keinotekoisten kalvojen hyödyntämisestä Halling, K., Ramstedt, B., and T. Nyholm, 2008, Biophysical Journal, Cholesterol Interactions with Fluid-Phase Phospholipids: Effect on the Lateral Organization of the Bilayer

45 Kysymyksiä...??? Molekyylitason biofysiikkaan törmää hyvin monilla biofysiikan kursseilla asioista on vaikea puhua ilman biomolekyylien huomioimista, esim ionikanavien toiminta: Fysiikan laitoksella tarjolla olevia kursseja: - Biofysiikan perusteet - Solujen biofysiikan perusteet - Solukalvot - Molekyylien biofysiikka - Molekyylifysiikka 45