Candida-hiivojen asetaldehydin tuotto etanoli- ja glukoosiinkubaatiossa

Candida-hiivojen asetaldehydin tuotto etanoli- ja glukoosiinkubaatiossa in vitro Mikko Nieminen Syventävä tutkielma perustuu kansainvälisesti vertaisarvioituun artikkeliin: Acetaldehyde production from ethanol and glucose by non-candida albicans yeasts in vitro. Nieminen MT, Uittamo J, Salaspuro M, Rautemaa R. Oral Oncology. 2009 Syventävät opinnot HLK Mikko Nieminen Opiskelijanumero 012046227 Ohjaaja: EHL,HLT, dosentti Riina Richardson Lääketieteellinen tiedekunta Hammaslääketieteen laitos, suulääketiede ja Haartman-instituutti, bakteriologian ja immunologian osasto Helsinki 2011

1 Sisällysluettelo Sivu 1. Lyhennelmä 2 2. Tutkimuksen tausta 3 3. Aineisto ja menetelmät 4 a. Candida-kannat 4 b. Asetaldehydin mittaaminen kaasukromatografilla 6 c. Tilastolliset menetelmät 6 4. Tulokset 7 5. Pohdinta 9 6. Kiitokset 10 7. Lähteet 11

2 Lyhennelmä Yläruoansulatuskanavan syöpien tärkeimpiä riskitekijöitä ovat tupakointi, alkoholin suurkulutus ja huono suuhygienia. Näiden tekijöiden vaikutuksesta sylkeen erittyy korkeita pitoisuuksia asetaldehydiä, jonka Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos (IARC) on luokitellut 1-ryhmän karsinogeeniksi. Suuri osa syljen asetaldehydistä on suun mikrobien tuottamaa. Tiedetään, että suun mikrobiomiin kuuluvat bakteerit ja Candida albicans -hiivat kykenevät tuottamaan mutageenisiä määriä asetaldehydiä. C. albicansin aiheuttaman kroonisen mukosiitin onkin todettu olevan karsinogeeninen. Muiden kandidalajien (non- albicans Candida, NAC) määrän on todettu kasvavan etenkin suusyöpähoitoja saavilla potilailla ja toisinaan osalle näistä potilaista kehittyy uusi primäärikarsinooma kandidamukosiitin läheisyyteen. NAC-lajien kykyä tuottaa asetaldehydiä ei kuitenkaan ole aiemmin tutkittu. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää pystyvätkö NAC-lajit tuottamaan karsinogeenisiä määriä asetaldehydiä etanoli- ja glukoosi-inkubaatiossa in vitro. Kaikkiaan kolmenkymmenen (n=30) kliinisen ja kantapankkinac-kannan kyky tuottaa asetaldehydiä etanoli- ja glukoosi-inkubaatiossa mitattiin kaasukromatografilla. Yksi C. albicans kantapankkikanta oli mukana kontrollina. Kaikki kandidahiivat tuottivat merkittäviä määriä asetaldehydiä etanoliinkubaatiossa in vitro. C. tropicalis kannat tuottivat eniten (252,3 µm) ja C. krusei kannat vähiten (54,6 µm) asetaldehydiä etanolista. NAC-lajeista ainoastaan C. glabrata tuotti merkittäviä määriä asetaldehydiä glukoosia fermentoimalla. Suuontelon kolonisoituminen merkittävään asetaldehydituotantoon pystyvällä NAC-lajilla kuten C. glabratalla voi altistaa suun limakalvon paikallisesti korkeille määrille asetaldehydiä, mikä voi johtaa suusyövän kehittymiseen.

3 Tutkimuksen tausta Yläruoansulatuskanavan syöpien tärkeimpiä riskitekijöitä ovat tupakointi, alkoholin suurkulutus ja huono suuhygienia (Pelucchi C 2008, La Vecchia 1997). Näiden tekijöiden vaikutuksesta sylkeen erittyy korkeita pitoisuuksia asetaldehydiä. Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos (IARC, International Agency for Research on Cancer) luokittelee alkoholin käytön yhteydessä muodostuvan asetaldehydin I-ryhmän karsinogeeniksi (Secretan B 2009). Asetaldehydin karsinogeenisuus on osoitettu niin eläinkokeissa kuin myös laajoissa epidemiologisissa tutkimuksissa (Boccia S 2009, Salaspuro M 2011). Asetaldehydin mutageenisyys perustuu sen kykyyn muodostaa DNA-addukteja hyvinkin matalissa pitoisuuksissa (40-100 µm) (Brooks PJ 2005, Seitzh HK 2007). Asetaldehydi on etanolimetabolian ensimmäinen välituote. Itse etanoli ei ole karsinogeenista, vaan sen kyky aiheuttaa syöpää on selitettävissä siitä syntyvällä asetaldehydillä. Alkoholia nautittaessa etanoli jakautuu tasaisesti elimistön vesifaasiin, jolloin myös veren ja syljen etanolipitoisuudet tasaantuvat. Suuri osa syljen asetaldehydistä on suun mikrobien tuottamaa (Homann N 1997). Muodostuvan asetaldehydin määrä riippuu mikrobien alkoholidehydrogenaasi-entsyymin (ADH) aktiivisuudesta ja mikrobien kokonaismäärästä (Salaspuro M 1996). Huono suuhygienia altistaa näin ollen korkeille acetaldehydipitoisuuksille. Tämän lisäksi tietyt alkoholijuomat kuten Calvados sisältävät jo itsessään huomattavia määriä karsinogeenista asetaldehydiä (Linderborg K 2008, Lachenmeier DW 2009). Useat suun mikrobiomiin kuuluvat mikrobit tuottavat aktiivista ADH:a. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet mm. Neisseria ja Streptokokki sukujen bakteerien pystyvän tuottamaan merkittäviä määriä asetaldehydiä etanolista in vitro (Kurkivuori J 2000, Muto M 2000). Myös Candida albicans -hiivojen on todettu kykenevän tuottamaan korkeita asetaldehydipitoisuuksia etanolista (Tillonen J 1999). Tämän lisäksi ne pystyvät tuottamaan asetaldehydiä glukoosista fermentoimalla (Uittamo J 2009). Kroonisen C. albicansin aiheuttaman mukosiitin onkin todettu olevan karsinogeeninen in vivo (Rautemaa R 2007).

4 C. albicans on yleisin suusta eristetty hiivasieni. Sen lisäksi useat muut kandidalajit (non-albicans Candida, NAC) kuten C. krusei, C. glabrata ja C. tropicalis voivat kolonisoida ja infektoida suuonteloa (Richardson MD 2003). Candida albicansin ja muiden kandidalajien määrän on osoitettu kasvavan suusyöpähoitojen aikana (Rautemaa R 2006). Suusyövän kirurgisen hoidon osana tehtävät ihoa sisältävät mikrovaskulaarisiirteet lisäävät keratinisoituneen epiteelin pinta-alaa suuontelossa ja sädehoidot puolestaan vaurioittavat sylkirauhasia minkä seurauksena syljen eritys vähenee tai lakkaa kokonaan. Nämä tekijät suosivat opportunististen hiivapatogeenien kasvua. Lisäksi atsoliryhmän sienilääkkeiden käyttö syöpähoitojen aikana suosii niille luonnostaan resistenttien NAC-lajien kolonisaatiota. NAC-lajien kykyä tuottaa karsinogeenistä asetaldehydiä ei ole aiemmin tutkittu. Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää muiden kandidalajien kyky tuottaa karsinogeenistä asetaldehydiä etanoli- ja glukoosi-inkubaatiossa in vitro. Tutkimuksen hypoteesinä on että muilla kandidalajeilla on kyky tuottaa merkittäviä määriä karsinogeenistä asetaldehydiä in vitro. Tämä voisi selittää niiden paikallista karsinogeenistä vaikutusta suuontelossa sekä etiologista roolia suusyövän taustalla. Aineisto ja menetelmät Candida -kannat Tutkimukseen valittiin yksi Candida albicans kantapankkikanta (ATCC 90028) ja 30 NAC-kantaa (Taulukko 1). NAC-kannoista neljä oli kantapankkikantoja (ATCC, American Type Culture Collection tai CCUG, Culture Collection of University of Gothenburg), kolme UK-NEQAS (United Kingdom National External Quality Assessment Service) laadunvarmistuskantoja ja 23 kliinistä kantaa HUSLABin Kliinisen mikrobiologian osaston kantapankista (T-kannat) ja Helsingin Yliopiston Hammaslääketieteen laitoksen kantapankista (D- ja G- kannat). Kantojen tunnistus perustui pesäkemorfologiaan CHROM elatusmaljoilla (CHROMagar, Pariisi, Ranska) ja API ID 32C (Bio-Merieux, Lyon, Ranska) assimilaatiotestin tuloksiin. Eristetyt kannat varastoitiin

5 glyserolimaitoliemeen ja pakastettiin (-70 o C). Kantojen kasvu ja puhtaus varmistettiin ennen käyttöä viljelemällä vähintään kaksi kertaa Saboraud agar elatusmaljalle (SAB, LAB M, Lancashire, UK) ja kertaalleen kromogeeniselle elatusmaljalle (Chrom agar, Pariisi, Ranska) ennen käyttöä. Taulukko 1. Tutkimuksessa käytetyt Candida kannat.

6 Tutkimusta varten hiivakantoja kasvatettiin SAB-elatusmaljoilla aerobisissa olosuhteissa 48 tuntia 37 Celsius -asteessa. Maljan pesäkkeistä tehtiin 1,0 x 10 7 solua/ml suspensio PBS (Phosphate buffered saline, 6 M) puskuriliuokseen spektrofotometrin avulla. Solumäärä varmistettiin viljelemällä laimennussarja SAB-elatusmaljoille. Asetaldehydin mittaaminen kaasukromatografilla Mikrobisuspension asetaldehydin tuotto mitattiin kaasukromatografilla (Perkin Elmer Headspace sampler HS 40XL, Perkin Elmer Autosystem Gas Chromatograph equipped with Ionization Detector FID, USA). Kutakin mikrobisuspensiota laitettiin kolmeen rinnakkaiseen koeputkeen 400 µl. Tämän jälkeen putkiin lisättiin 50 µl 11mM etanolia tai 100 mm glukoosia, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 30 minuutin ajan 37-asteisessa vesihauteessa tiiviisti suljettuina. Tämän jälkeen solujen metabolia pysäytettiin lisäämällä koeputkiin 50 µl 6M perkloorihappoa (PCA) ilmatiiviisti ja koeputket siirrettiin kaasukromatografiin. Artefaktuaalinen asetaldehydi mitattiin kontrollinäytteen avulla siten, että mikrobisuspensioon lisättiin ensin 50 µl PCA:a ja tämän jälkeen välittömästi 50 µl etanolia. Kontrollinäytteet inkuboitiin kuten muut näytteet. Syntynyt artefaktuaalinen asetaldehydi vähennettiin tutkimusnäytteiden asetaldehydituloksista. Kaikki mittaukset toistettiin kerran. Tilastolliset menetelmät Tilastolliset analyysit tehtiin kunkin Candida-kannan kolmen rinnakkaisen putken keskiarvoilla. Asetaldehydituotot ilmaistiin muodossa: keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe (mean ± SEM, standard error of mean). Analyysejä varten kannat jaettiin kolmeen ryhmään tuotetun asetaldehydin perusteella: >200 µm korkea, 40-200 µm kohtalainen ja <40 µm matala. Jako perustui aiempaan kirjallisuuteen (Secretan B 2009, Brooks PJ 2005, Seitz HK 2007, Homann N 1997, TIllonen J 1999, Rautemaa R 2007). Tutkimuksen tulokset analysoitiin SPSS (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) tilasto-ohjelmalla. Lajien välisten asetaldehyditasojen merkitsevyyserot laskettiin varianssianalyysillä (ANOVA,

7 analysis of variance) ja korrelaatioanalyseihin käytettiin Spearmanin (Spearman s rho) testiä. P<0,05 katsottiin merkitseväksi. Tulokset Kaikki Candida kannat tuottivat yli 50µM asetaldehydiä etanoli inkubaatiossa (Taulukko 2a). C. tropicalis kannat tuottivat asetaldehydiä eniten (252,3 ± 14,9 µm), mutta C. parapsilosis ja C. albicans kannat tuottivat myös korkeita määriä asetaldehydiä etanoli inkubaatiossa (243,3 ± 8,8 µm ja 235,1 ± 2,8 µm). C. tropicalis ja C. parapsilosis kannat tuottivat merkittävästi enemmän asetaldehydiä etanolista kuin muut kannat (p<0,05). Vähiten asetaldehydiä etanolista tuotti C. krusei (54,6 ± 2,9 µm). Se tuotti merkittävästi vähemmän asetaldehydiä kuin muut kannat (p<0,001). C. glabrata ja C. albicans tuottivat korkeimmat määrät asetaldehydiä glukoosi-inkubaatiossa (81,8 ± 2,9 ja 45,2 ± 2,1 µm, taulukko 2b). Muiden kantojen tuottamat asetaldehydimäärät olivat matalia (<40 µm) glukoosiinkubaatiossa. C. glabrata tuotti merkittävästi enemmän asetaldehydiä glukoosi-inkubaatiossa kuin muut käytetyt kandidakannat (p<0,001). Taulukko 2. C. albicans- ja muiden kandidalajikantojen asetaldehydin tuotto (a) etanoli- ja (b) glukoosi-inkubaatiossa sekä lajien väliset merkitsevyyserot tuotetun asetaldehydin osalta.

8 Saman lajin viiden eri kannan asetaldehydin tuotossa havaittiin merkittävää variaatiota etanoli-inkubaatiossa (kuva 1). Variaatio oli pienintä vähiten asetaldehydiä tuottavien lajien sisällä. Asetaldehydituoton variaatio lajien sisällä oli huomattavan pientä glukoosi-inkubaatiossa. Asetaldehydituotto etanoliinkubaatiossa ei korreloinut glukoosi-inkubaatiossa tuotetun asetaldehydin määrän kanssa (r s =0,182). Kuva 1. Mitattujen asetaldehydimäärien vaihtelu kunkin lajin kohdalla etanoli- ja glukoosi-inkubaatiossa. Yksi ympyrä kuvassa vastaa yhtä mittausarvoa (kuusi mittausarvoa/kanta). Pystyviiva kuvaa kunkin lajin viiden kannan asetaldehydituoton keskiarvoa.

9 Pohdinta Kaikki tutkitut Candida kannat tuottivat karsinogeenisiä määriä asetaldehydiä etanolista in vitro. Kokeessa käytetty 11mM etanolipitoisuus saavutetaan sylkeen juomalla 0,5 g etanolia painokiloa kohden. 80 kiloinen mies saavuttaa kyseisen tason juomalla kolme lasillista viiniä. Näin ollen kokeessa käytettyä etanolikonsentraatiota voidaan pitää kliinisesti merkittävänä. C. glabrata oli ainoa muista kandidalajeista, joka kykeni tuottamaan karsinogeenisiä määriä asetaldehydiä glukoosista (100 mm). Kyseinen glukoosikonsentraatio (18 g/l) vastaa useiden makeutettujen elintarvikkeiden sokeripitoisuutta. Muut kandidalajit tuottivat matalia määriä asetaldehydiä glukoosista. Mikrobiperäisen asetaldehydituoton ajatellaan suurelta osin olevan syynä alkoholin karsinogeenisuuteen erityisesti suusyövän kohdalla (Homann N 1997). C. albicans -hiivojen on aiemmin todettu pystyvän tuottamaan merkittäviä määriä asetaldehydiä in vitro ja suun limakalvojen kroonisen kandidamukosiitin olevan karsinogeeninen in vivo (Rautemaa R 2007, Uittamo J 2009). C. parapsilosis ja C. tropicalis kannat tuottivat enemmän asetaldehydiä etanolista kuin C. albicans -kannat. C. glabrata oli ainoa laji, joka tuotti enemmän asetaldehydiä glukoosista kuin C. albicans. Tuotettujen asetaldehydimäärien suuri vaihtelu niin lajien sisällä kuin välillä kertoo todennäköisesti asetaldehydi tuotannosta vastaavien metaboliareittien välisistä eroista. Tutkimuksen perusteella voidaan kuitenkin sanoa, että muilla kandidalajeilla on mahdollisesti tärkeä rooli asetaldehydin paikallisessa muodostuksessa suuontelossa. Runsas hiivakolonisaatio on tyypillistä kaikille laajakirjoisia antibioottihoitoja saaville potilaille (Samarayanake LP 2009). Erityisesti se on tyypillistä suusyöpähoitoja saaville potilaille, joiden suuontelossa nähdään lukuisia hiivojen kolonisaatiolle altistavia muutoksia (Davies AN 2002). Erityisesti C. glabrata ja C. krusei sienten aiheuttamat infektiot ovat suusyöpäpotilailla yleisiä ja niiden hoito on vaikeaa tehokkaiden ja avohoitoon soveltuvien lääkkeiden puutteessa. Toisinaan suusyöpäpotilaalle muodostuu uusi primäärikarsinooma kroonisen Candida-mukosiitin läheisyyteen (Rautemaa R 2006, Rautemaa R 2007). Kolonisaatio runsaaseen etanoli-metaboliaan ja

10 asetaldehydin tuottoon pystyvällä Candida-kannalla yhdessä runsaan alkoholinkulutuksen kanssa aiheuttaa suuren paikallisen altistuksen karsinogeeniselle asetaldehydille suuontelossa. Tämä voi osin selittää uusien primäärikarsinoomien synnyn tässä potilasryhmässä. Kolonisaatio sokerifermentaatiolla runsaaseen asetaldehydin tuottoon pystyvällä Candidakannalla puolestaan voisi selittää karsinogeeneesiä potilailla, jotka eivät käytä alkoholia. Kiitokset Suuri kiitos ohjaajalleni dos. Riina Richardsonille kaikesta avusta ja tutkimustyöhön innostavasta sekä asiantuntevasta ohjauksesta! Kiitos myös prof. Mikko Salaspurolle asetaldehydiin liittyvästä asiantuntemuksesta ja Pertti Kaihovaaralle kaasukromatografiaan liittyvästä teknisestä osaamisesta ja ohjauksesta.

11 Lähteet Boccia S, Hashibe M, Galli P, De Feo E, Asakage T, Hashimoto T, et al. Aldehyde Dehydrogenase 2 and Head and Neck Cancer: A Meta-analysis Implementing a Mendelian Randomization Approach. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009;18:248-54. Brooks PJ, Theruvathu JA. DNA adducts from acetaldehyde: implications for alcohol-related carcinogenesis. Alcohol 2005;35:187-93. Davies AN, Brailsford S, Broadley K, Beighton D. Oral yeast carriage in patients with advanced cancer. Oral Microbiol Immunol 2002;17:79-84. Homann N, Jousimies-Somer H, Jokelainen K, Heine R, Salaspuro M. High acetaldehyde levels in saliva after ethanol consumption: methodological aspects and pathogenetic implications. Carcinogenesis 1997;18:1739-43. Homann N, Karkkainen P, Koivisto T, Nosova T, Jokelainen K, Salaspuro M. Effects of acetaldehyde on cell regeneration and differentiation of the upper gastrointestinal tract mucosa. J Natl Cancer Inst 1997;89:1692-7. Kurkivuori J, Salaspuro V, Kaihovaara P, Kari K, Rautemaa R, Gronroos L, et al. Acetaldehyde production from ethanol by oral streptococci. Oral Oncol 2007;43:181-6. La Vecchia C, Tavani A, Franceschi S, Levi F, Corrao G, Negri E. Epidemiology and prevention of oral cancer. Oral Oncol 1997;33:302-12. Lachenmeier DW, Kanteres F, Rehm J. Carcinogenicity of acetaldehyde in alcoholic beverages: risk assessment outside ethanol metabolism. Addiction 2009;104:533-50.

12 Linderborg K, Joly JP, Visapaa JP, Salaspuro M. Potential mechanism for Calvados-related oesophageal cancer. Food Chem Toxicol 2008;46:476-9. Muto M, Hitomi Y, Ohtsu A, Shimada H, Kashiwase Y, Sasaki H, et al. Acetaldehyde production by non-pathogenic Neisseria in human oral microflora: implications for carcinogenesis in upper aerodigestive tract. Int J Cancer 2000;88:342-50. Pelucchi C, Gallus S, Garavello W, Bosetti C, La Vecchia C. Alcohol and tobacco use, and cancer risk for upper aerodigestive tract and liver. Eur J Cancer Prev 2008;17:340-4. Rautemaa R, Hietanen J, Niissalo S, Pirinen S, Perheentupa J. Oral and oesophageal squamous cell carcinoma--a complication or component of autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED, APS-I). Oral Oncol 2007;43:607-13. Rautemaa R, Rusanen P, Richardson M, Meurman JH. Optimal sampling site for mucosal candidosis in oral cancer patients is the labial sulcus. J Med Microbiol 2006;55:1447-51. Richardson MD WD. Fungal infection; Diagnosis and Management. 3rd edition Oxford: Blackwell Publishing. 2003. Salaspuro M. Acetaldehyde and gastric cancer. J Dig Dis. 2011 Apr;12(2):51-9. Salaspuro M. Microbial metabolism of ethanol and acetaldehyde and clinical consequences. Addict Biol 1996;2:35-46. Samaranayake LP, Keung Leung W, Jin L. Oral mucosal fungal infections. Periodontol 2000 2009;49:39-59.

13 Secretan B, Straif K, Baan R, Grosse Y, El Ghissassi F, Bouvard V, et al. A review of human carcinogens--part E: tobacco, areca nut, alcohol, coal smoke, and salted fish. Lancet Oncol 2009;10:1033-1034. Seitz HK, Stickel F. Molecular mechanisms of alcohol-mediated carcinogenesis. Nat Rev Cancer 2007;7:599-612. Tillonen J, Homann N, Rautio M, Jousimies-Somer H, Salaspuro M. Role of yeasts in the salivary acetaldehyde production from ethanol among risk groups for ethanol-associated oral cavity cancer. Alcohol Clin Exp Res 1999;23:1409-15. Uittamo J, Siikala E, Kaihovaara P, Salaspuro M, Rautemaa R. Chronic candidosis and oral cancer in APECED-patients: production of carcinogenic acetaldehyde from glucose and ethanol by Candida albicans. Int J Cancer 2009;124:754-6.