Bioaktiivisten tripeptidien (IPP ja VPP) vaikutus ihmisen verisuonitonusta sääteleviin entsyymeihin ACE1, enos ja COX-2 napanuoran laskimon

Bioaktiivisten tripeptidien (IPP ja VPP) vaikutus ihmisen verisuonitonusta sääteleviin entsyymeihin ACE1, enos ja COX-2 napanuoran laskimon endoteelisoluissa (HUVEC) Pro gradu -tutkielma Riikka Viitanen Biolääketieteellisen teknologian yksikkö Tampereen yliopisto Marraskuu 2011

ALKUSANAT Pro gradun laboratoriotyöt suoritettiin Helsingin yliopiston farmakologian oppialalla, professori Riitta Korpelan tutkimusryhmässä. Työn ohjaajina toimivat laboratorio-osuudella emeritusprofessori Heikki Vapaatalo ja tietokonemallinnuksessa FT Jarkko Valjakka. Haluan vilpittömästi kiittää Riittaa sekä molempia ohjaajiani ystävällisestä, jatkuvasti eteenpäin suuntaavasta, mutta myös joustavasta ohjaamisesta. Molemmilta ohjaajilta on löytynyt aina aikaa tieteelliseen keskusteluun. Haluan kiittää myös Anne Kivimäkeä, Aino Siltaria, Martta Raatikaista ja Tuomas Heiniä, sekä kaikkia muita tutkimusryhmän jäseniä käytännön vinkeistä ja miellyttävästä työskentelyilmapiiristä. Erityisesti laboratoriomestarit Nada Bechara-Hirvonen ja Lahja Eurajoki, osastonhoitaja Anneli von Behr sekä FM Alyona Inzhutova ovat kultaisilla käytännön neuvoillaan helpottaneet ja nopeuttaneet töitäni, suuri kiitos siitä heille. Kiitos myös Jussi Kaatialle tietoteknisestä tuesta sekä Sampo Kukkuraiselle IPP-mallien luomisesta. IBT ja farmakologian oppiala ovat tarjonneet minulle kannustavan ympäristön saada pro graduni kansiin osastoilla on vallinnut ystävällinen ja eteenpäin kannustava ilmapiiri. Olen iloinen, että sain tehdä pro gradu - tutkielmani juuri näissä tutkimusympäristöissä. Tutkimusta tuettiin Pirkanmaan sairaanhoitopiirin tutkimusapurahalla (9K144). Opiskelujeni tukena ja tarvittaessa sopivana vastapainona minulla on ollut rakas perheeni - isä, äiti, isosisko perheineen sekä avopuolisoni. Arvostan suuresti sitä tukea, jonka olen saanut teiltä elämäni, erityisesti opiskelujeni aikana. Kiitos myös herra Hodgkinille, joka on jaksanut läpi opiskeluajan muistuttaa elämän suurista suuntaviivoista. Jyväskylässä 5.11.2011 Riikka Viitanen

MASTER S THESIS Place: UNIVERSITY OF TAMPERE Institute of Biomedical Technology Author VIITANEN, RIIKKA Title: Effect of bioactive tripeptides (IPP and VPP) on the vascular tone regulating enzymes ACE1, enos and COX-2 in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Pages: 73 p. + appendix 1 p. Supervisors: Professor (emer.) Heikki Vapaatalo, MD, PhD and Jarkko Valjakka, PhD Reviewers: Professor Markku Kulomaa, PhD and Jarkko Valjakka, PhD Date: November 2011 ABSTRACT Background and aims: Elevated blood pressure is a serious health problem which according to the present knowledge can be influenced with dietary factors such as bioactive tripeptides (IPP and VPP) containing functional foods. However, the mechanism behind this is still unknown. The innermost layer of blood vessels that consists of endothelial cells is the object of the present study. Endothelial cells (HUVEC) express ACE1, enos, COX-2 and arginase-1, the enzymes which participate in the blood pressure control. The purpose of the present study was to investigate the effect of IPP and VPP on the above mentioned enzymes (with the exception of arginase-1) in the HUVEC-cells in vitro. Computer aided modelling was used to find a possible correlation with the experimental findings. The work supplements previous studies with commercial enzymes and in vivo animal and clinical testing. Methods: The effect of IPP and VPP on the activity of ACE1 of the HUVEC-cell lysate was determined by monitoring the release of His-Leu from the substrate hippuryl-l-histidyl-lleucine by a fluorescence spectrophotometer. Effect of IPP and VPP on COX-2 was determined by measuring 6-ketoPGF 1α concentration by the competitive-elisa method from the medium of the HUVEC cells. In addition to the above mentioned enzymes binding and interaction of enos and arginase-1 with IPP were modelled on computer program AutoDock version 4.2. Results: IPP and VPP inhibited ACE1 in the HUVEC-cells dose dependently (0,1-3,3 µm). On the basis of computer modelling cis-trans IPP bound to the zinc cofactor of ACE1. Incubation of HUVEC-cells with 50 µm VPP showed also significant COX-2 inhibition. NOx and cgmp concentrations in the medium as indicator of enos activity were not measurable. Computer aided modelling refers to the importance of cofactors in the case of IPP possible binding to the enzymes. Conclusion: Dose-dependent inhibition of endothelial ACE1 (HUVEC) by IPP and VPP was shown and can explain their antihypertensive and vasodilating effects in vivo. Inhibition of COX-2 by high concentrations of VPP does not play a part in these effects. Keywords: ACE1, arginase-1, COX-2, endothelium, enos, HUVEC, IPP, vascular tone, VPP

PRO GRADU -TUTKIELMA Paikka: TAMPEREEN YLIOPISTO Biolääketieteellisen teknologian yksikkö Tekijä VIITANEN, RIIKKA Otsikko: Bioaktiivisten tripeptidien (IPP ja VPP) vaikutus ihmisen verisuonitonusta sääteleviin entsyymeihin ACE1, enos ja COX-2 napanuoran laskimon endoteelisoluissa (HUVEC) Sivumäärä: 73 s. + liite 1 s. Ohjaajat: Professori (emer.) Heikki Vapaatalo, LKT ja Jarkko Valjakka, FT Tarkastajat: Professori Markku Kulomaa, FT ja Jarkko Valjakka, FT Aika: Marraskuu 2011 TIIVISTELMÄ Tausta ja tavoitteet: Kohonnut verenpaine on vakava terveysongelma, johon nykytiedon mukaan voidaan vaikuttaa bioaktiivisia tripeptidejä (IPP ja VPP) sisältävällä ruokavaliolla. Vaikutusmekanismi on toistaiseksi puutteellisesti tunnettu. Verisuonten sisin kerros muodostuu endoteelisoluista, joiden merkitys verisuoniston toiminnan ja sitä kautta verenpaineen säätelyssä on tärkeä. Endoteelisoluissa (HUVEC) ilmentyvät ACE1 enos, COX-2 ja arginaasi-1 entsyymit ovat tässä säätelyssä keskeisiä. Työn tarkoituksena oli selvittää HUVEC-soluissa IPP:n ja VPP:n vaikutus edellä mainittuihin entsyymeihin (lukuun ottamatta arginaasi-1:tä) in vitro. Tietokonemallinnuksella haettiin riippuvuutta kokeellisiin tuloksiin. Tutkimuksen on tarkoitus täydentää aikaisemmin tehtyjä kokeita (kaupallisilla entsyymeillä) sekä in vivo eläin- ja kliinisiä tutkimuksia. Menetelmät: IPP:n ja VPP:n vaikutus HUVEC-solujen lysaatin ACE1:n aktiivisuuteen määritettiin mittaamalla His-Leu:n vapautumista substraatti hippuryyli-l-histidyyli-l-leusiinista fluoresenssispektrofotometrisellä menetelmällä. IPP:n ja VPP:n vaikutus COX-2:een määritettiin mittaamalla kilpailevalla ELISA-menetelmällä 6-ketoPGF 1α -pitoisuus HUVEC-solujen mediumista. Edellä mainittujen entsyymien lisäksi enos:n ja arginaasi-1:n sitoutumista ja vuorovaikutuksia IPP:n kanssa mallinettiin tietokoneella AutoDock versio 4.2. ohjelmalla. Tulokset: IPP ja VPP estivät pitoisuusriippuvaisesti (0,1-3,3 µm) HUVEC-solujen ACE1 entsyymiä. Tietokonemallinnuksen perusteella cis-trans IPP sitoutuu ACE1:n kofaktori sinkkiin. HUVEC-solujen altistus 50 µm VPP:lle sai aikaan COX-2:n estovaikutuksen. HUVEC-solujen enos:n aktiivisuuden mittarina toimivien NOx:n ja cgmp:n pitoisuuksien muutoksia ei pystytty määrittämään menetelmien herkkyyden puitteissa. Tietokonemallinnus antaa viitteitä siitä, että enstyymin kofaktorilla on tärkeä merkitys IPP:n mahdollisessa sitoutumisessa. Johtopäätökset: Osoitettiin pitoisuusriippuvainen ACE1:n (HUVEC) esto IPP:llä ja VPP:llä, joka voi selittää verenpainetta alentavaa ja verisuonta rentouttavaa vaikutusta in vivo. VPP:n aikaan saaman COX-2:n esto suurilla pitoisuuksilla ei näytä selittävän merkittävästi antihypertensiivistä vaikutusta. Avainsanat: ACE1, arginaasi-1, COX-2, endoteeli, enos, HUVEC, IPP, verisuonitonus, VPP

SISÄLLYSLUETTELO ALKUSANAT ABSTRACT TIIVISTELMÄ SISÄLLYSLUETTELO LYHENTEET 1 KIRJALLISUUSKATSAUS...8 1.1 Verenkiertojärjestelmä ja verenpaineen säätely...8 1.2 Valtimoiden rakenne ja toiminta...9 1.2.1 Endoteelisolut...10 1.3 Verenpaineen säätely...12 1.3.1 Verenpainetta säätelevät entsyymit...14 1.3.1.1 Angiotensiiniä konvertoiva entsyymi 1 (ACE1)...14 1.3.1.2 Endoteelin typpioksidisyntaasi (enos)...16 1.3.1.3 Syklo-oksigenaasi 2 (COX-2)...17 1.3.1.4 Arginaasi-1...19 1.3.2 Farmakologiset hoitokeinot kohonneen verenpaineen alentamiseksi...19 1.4 Bioaktiivisten tripeptidien vaikutus verenpaineeseen...20 1.4.1 IPP ja VPP kokeet in vitro...22 1.4.2 IPP ja VPP kliiniset ja eläinkokeet in vivo...22 1.5 Tietokonemallinnus...23 1.5.1 AutoDock versio 4.2...24 2 TUTKIELMAN TARKOITUS...26 3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT...27 3.1 HUVEC-soluviljelmä...27 3.2 ACE1:n eston mittaaminen...28 3.2.1 HUVEC-solujen valmistaminen estomittauksia varten...28 3.2.2 ACE1:n eston fluoresenssispektrofotometrinen mittaus...28 3.3 HUVEC-solujen valmistaminen NOx, cgmp ja 6-ketoPGF1 α -määrityksiä varten...31 3.4 enos aktiivisuuden mittaaminen...34 3.4.1 Nitriitti/nitraattituotannon (NOx) mittaus...34 3.4.2 cgmp mittaus...35 3.5 COX-2 eston mittaus...36 3.5.1 6-ketoPGF 1α -tuoton mittaaminen...36 3.6 Solujen kunnon määritys...37 3.6.1 Mykoplasmamääritys...37 3.7 Tietokonemallinnus...38 3.7.1 Entsyymin telakointialueen rajaaminen...39 3.7.2 Liikkuvien aminohappotähteiden määrittäminen sekä telakointi...40 3.8 Tulosten tilastollinen analysointi...42 4 TULOKSET...44 4.1 Laboratoriotyöt...44 4.1.1 ACE1...44 4.1.2 enos...46 4.1.3 COX-2...48

4.1.4 Mykoplasmakoe...50 4.2 Tietokonemallinnus...50 4.2.1 IPP:n suotuisin telakoituminen ACE1-entsyymiin...51 4.2.2 IPP:n suotuisin telakoituminen enos-entsyymiin...53 4.2.3 IPP:n suotuisin telakoituminen COX-2-entsyymiin...55 4.2.4 IPP:n suotuisin telakoituminen arginaasi-1-entsyymiin...57 5 TULOSTEN TARKASTELU...60 5.1 ACE1...60 5.2 enos...62 5.3 COX-2...63 5.4 Arginaasi-1...64 5.5 Mykoplasma...64 5.6 Jatkotutkimukset...64 6 JOHTOPÄÄTÖKSET...67 7 LÄHDELUETTELO...68 8 LIITTEET...74

LYHENTEET ACE1 Angiotensiiniä konvertoiva entsyymi 1 ALA Alaniini ASN Asparagiini ASP Aspartaatti BSA Naudan seerumista eristetty albumiini cgmp Syklinen guanosiini 3, 5 -monofosfaatti COX-2 Syklo-oksigenaasi 2 DMSO Dimetyylisulfoksidi EDTA Etyleenidiamiinitetraetikkahappo (engl. ethylenediaminetetra acetic acid) enos Endoteelin typpioksidisyntaasi ELISA Entsyymi-immunologinen määritys (EIA) GLN Glutamiini GLU Glutamaatti GMP Guanosiinimonofosfaatti HEM Hemi HETATM Heteroatomi HHL Hippuryyli-L-histidyyli-L-leusiini HIS Histidiini His-Leu L-histidyyli-L-leusiini HUVEC Ihmisen napanuoran laskimon endoteelisolulinja (engl. human umbilical vein endothelial cells) IPP Isoleusiini-proliini-proliini LPS Lipopolysakkaridi NO Typpioksidi NOx Nitraatti/nitriitti OPA Ortho-phtaldialdehydi PBS Fosfaattisuolapuskuri (engl. phosphate saline buffer) PDB Protein Data Bank pdb-tiedosto Protein Data Bank tiedosto pdbqt-tiedosto Osittaisvarauksen ja atomityypin sisältävä AutoDock-tiedosto PHE Fenyylialaniini RAS Reniini-angiotensiinijärjestelmä TRP Tryptofaani TYR Tyrosiini VAL Valiini VPP Valiini-proliini-proliini ZN Sinkki 6-ketoPGF 1α 6-keto prostaglandiini F 1α

1 KIRJALLISUUSKATSAUS Vuonna 2003 Maailman terveysjärjestö (World Health Organization, WHO/ISH) määritti kohonneen verenpaineen maailmanlaajuiseksi sydän- ja verenkiertotautien riskitekijäksi. Verenpainetaudin ennaltaehkäisyn ja hoidon on osoitettu vähentävän näitä, erityisesti länsimaiden väestöä vaivaavia, sairauksia. Kohonneen verenpaineen lääkehoito aiheuttaa huomattavia taloudellisia kustannuksia. 1 Maidon β-kaseiinista peräisin olevilla bioaktiivisilla peptideillä on havaittu olevan terveydelle hyödyllinen, kohonnutta verenpainetta alentava vaikutus. Kohonneen verenpaineen lääkkeetön hoito korostamalla terveitä elämäntapoja (alkoholin käytön ja tupakoinnin lopettaminen, liikunta sekä ravinto) sekä ennaltaehkäisy tarjoavat edullisen ja tehokkaan keinon edistää terveyttä. Bioaktiivisia pieniä peptidejä sisältävät tuotteet voisivat olla hyödyllinen osa terveellistä ravintoa. 1.1 Verenkiertojärjestelmä ja verenpaineen säätely Nisäkkäiden verenkierto jakautuu sydämen kammioiden kautta kahteen verenkiertoon, isoon ja pieneen. Sydämen vasen kammio pumppaa verta kaikkialle elimistöön suuren verenkierron kautta. Veri kiertää aortasta valtimoiden kautta muun muassa sydänlihakseen, päähän, yläraajoihin, sisäelimiin sekä lonkkavaltimoiden kautta alaraajoihin. Sen mukana kulkee elimistölle tärkeitä aineita, kuten ravinteita ja happea. Lopuksi veri palaa laskimoiden kautta takaisin sydämen oikeaan eteiseen. Oikeasta eteisestä vähähappinen ja runsashiilidioksidinen veri tulee oikeaan kammioon, josta se pumpataan keuhkovaltimon kautta keuhkoihin. Happirikas veri palaa keuhkolaskimoja pitkin takaisin sydämen vasempaan eteisen kammioon ja edelleen uudelleen isoon verenkiertoon. 2 Verenpaine on riippuvainen sydämen ison verenkierron minuutissa pumppaamasta verimäärästä (minuuttitilavuus) ja verenkierron ääreisvastuksesta. Ääreisvastuksen suurin vaikuttava tekijä on verisuonten läpimitta. Halkaisijalta suuremassa suonessa on pienempi ääreisvastus. Verisuonten halkaisijaan vaikuttaa verisuonten sileän lihaksen jatkuva jännitystila eli tonus. 2 Verenpaineella tarkoitetaan suurten valtimoiden painetta, kun vasen kammio pumppaa verta suuriin valtimoihin. Sydämen supistuksen aikaisen (systolisen) verenpaineen lisäksi huomioon on otettava myös 8

suurten valtimoiden pienin, sydämen lepotilan aikainen (diastolinen) verenpaine. Normaali systolinen verenpaine aikuisella on noin 120 129 mmhg, korkean rajaksi on määritetty 140 mmhg. Diastolinen verenpaine terveellä aikuisella on 80 84 mmhg, korkeassa tapauksessa yli 90 mmhg. 3 1.2 Valtimoiden rakenne ja toiminta Valtimon seinämät käsittävät kolme kerrosta. Verisuonen sisin kerros muodostuu yksikerroksisesta endoteelin verhoamasta sisäkalvosta (lat. tunica intima). Endoteelikerrosta ympäröi sileän lihaksen ja sidekudoksen (nuorten fibroblastien) muodostama keskikalvo (lat. tunica medula). Ulommaisena on sidekudoksesta muodostunut ulkokalvo (lat. tunica adventitia), joka liittää suonen ympäröivään kudokseen. 4 Laskimot ovat rakenteeltaan hyvin samankaltaisia kuin valtimot. Poikkeuksena on valtimon keskikalvo, joka on laskimon keskikalvoa huomattavasti paksumpi. Isot valtimot jakautuvat pienemmiksi pikkuvaltimoiksi, jotka ovat hiussuonten välityksellä yhteydessä laskimoihin. (Kuva 1) Kuva 1. Valtimoverisuonen poikkileikkaus. Verisuonen sisin osa, sisäkalvo (intima), on yksikerroksisinten endoteelisolujen sekä ohuen sidekudoksen muodostama. Monikerroksiset sileät lihassolut sekä sidekudos muodostavat keskikalvon (media). Verisuonen uloimmassa kalvossa (adventitia) on sidekudosta sekä fibroblasteja. Kuva on piirretty Wolinsky ym. artikkelin 4 pohjalta. Sisäkalvon endoteelisolujen muodostamaa kerrosta pidettiin pitkään vain verisuonen hemostaattisena esteenä, mutta sittemmin sillä on havaittu merkitys muun muassa verisuonen supistusasteen säätelijänä 5. Verisuonten sisäkalvon endoteelisolut muodostavat ja välittävät useita eri tekijöitä, jotka vaikuttavat muun muassa verisuonten kehittymiseen, läpäisevyyteen ja tonukseen, 9

sekä tulehdusvasteisiin ja hemostaasiin. Ne ovat myös suorassa yhteydessä myoendoteelisten aukkoliitosten välityksellä keskikalvon sileään lihaskudokseen. Liitosten kautta tapahtuu pienten molekyylien ja ionien, kuten syklisten nukleotidien, kaliumin ja kalsiumin, kalvojen välinen vaihto. 6 Valtimon fysiologiset muutokset ovat pitkälti riippuvaisia verisuonen keskikalvon ominaisuuksista. Sileiden lihassolujen toiminta perustuu supistumiseen ja relaksoitumiseen säädellen verisuonen ominaisuuksia, kuten esimerkiksi joustavuutta ja halkaisijan kokoa. 7, 8 Sian aortan keskikalvon kokeissa on havaittu sileiden lihassolujen kyky tuottaa arakidonihaposta prostasykliiniä, jolla on verisuonia laajentava vaikutus 5. Sileiden lihasten uusiutuminen on hidasta aikuisilla 9. Ulkokalvoa pidettiin aikaisemmin valtimon rakennetta tukevana tekijänä, mutta sen merkitys verisuonen toiminnalle on tarkentunut. Somoza ym. 10 tutkimuksissa ulkokalvo on havaittu oleelliseksi tekijäksi verisuonen supistumistekijöiden vasteiden muuntajana. Se säätelee angiotensiini II:n stimuloimaa typpioksidin (NO) vapautumista endoteelisoluista angiotensiini II tyypin 2- reseptorien välityksellä. NO:lla on keskeinen vaikutus sileiden lihassolujen relaksaation aiheuttajana. Ulkokalvon välityksellä siirtyy myös hermostollisia käskyjä. Niiden avulla voidaan vaikuttaa esimerkiksi verisuonen laajenemiseen, mikäli sisäkalvon endoteelin toiminta on estynyt. 11 1.2.1 Endoteelisolut Verisuonen sisin kerros muodostuu yhdestä kerroksesta endoteelisoluja, jotka yhdessä keskikalvon sileiden lihassolujen kanssa ovat verisuonen säätelyn päätekijöitä. Endoteelisolut muodostavat suuren solujärjestelmän, endoteelin, joka kattaa veri- ja imusuonten onteloita sekä sydämen sisäpinnan. Hiussuonet muodostuvat pääasiassa kokonaan endoteelisoluista, kun taas suurissa valtimoissa, kuten aortassa, kontaktissa muiden solutyyppien kanssa ne muodostavat vain suonen sisimmän kerroksen 12. Endoteelisolujen reagointi perustuu ympäristön aikaansaamiin muutoksiin, kuten venytykseen, hankausvoimaan, ph:n muutoksiin sekä moniin kiertäviin aineisiin. Endoteelisolut syntetisoivat ja vapauttavat erilaisia tekijöitä, jotka vaikuttavat muun muassa verisuonen tonukseen, läpäisevyyteen, tulehdukseen sekä angiogeneesiin. Endoteelisolujen aikaansaama vaikutus voi olla joko verenpainetta nostava tai laskeva. Verisuonia supistavia teki- 10

jöitä ovat Ang II, endoteliini 1, tromboksaani A 2 sekä superoksidianioni, isoprostaanit, uridiini adenosiini tetrafosfaatti ja relaksoivia ovat NO, prostasykliini, epoksieikosatrieenihappo, adenosiini, vetyperoksidi sekä C-natriureettinen peptidi. Mikäli tämän tiukasti säädellyn endoteelisolujen toiminnan jokin osa järkkyy, on seurauksena endoteelisolujen toiminnan häiriö. 6 Elimistössä, in vivo, endoteelisolut ovat veren virtaukseen liittyvien voimien ja jännityksen vaikutuksen alaisena. Nämä tekijät saavat aikaan monien erilaisten solun signalointireittien aktivoitumisen. Hypoksia saa aikaan endoteelisolujen tulehdusvasteiden ja -tekijöiden nousun, sekä pidemmällä altistuksella erilaisten kasvutekijägeenien ilmentymisen aktivoitumisen 13. Endoteelisolut ovat heterogeenisiä 14-16. Chin ym. vuonna 2003 tehdyn tutkimuksen mukaan endoteelisolujen sijainti eri suonityypeissä tai anatomisesti jaotelluissa paikoissa vaikuttavat kyseisten solujen geenien ilmentymiseen. On myös vahvoja viitteitä siitä, että erilaisia viljeltyjä endoteelisoluja voidaan luokitella eri solutyypeiksi geeni-ilmentymisten eroavaisuuksien pohjalta 16. Tutkimuksia suunniteltaessa on otettava huomioon solujen eroavaisuudet, jotka ilmenevät niiden morfologiassa sekä toiminnassa. Geenien ilmentymisen näkökulmasta endoteelisolut voidaan jakaa kolmeen alatyyppiin; suuret suonet, valtimot ja laskimot sekä missä anatomisissa rakenteissa ne sijaitsevat. Myös erot eri lajien välillä vaikuttavat endoteelisolujen toimintaan. 16 Endoteelisolut ovat geneettisesti stabiili solutyyppi. Fysiologisissa olosuhteissa rotan aortan endoteelisolujen mitoosi välivaiheineen tapahtuu hyvin hitaasti, mutta sitä voidaan kiihdyttää erilaisilla aineilla, kuten lipopolysakkaridilla (LPS). Solujen kiihtyvää jakautumista seuraa solukuolema. 17 Rajallisen jakautumiskyvyn omaavat endoteelisolut ovat loppuvaiheessaan herkempiä apoptoottisille stimulaatioille. Niiden oksidatiivinen stressi lisääntyy ja muun muassa NOtuotanto vähenee 18. Ihmisen napanuoran laskimon endoteelisolut (HUVEC) ovat yleisesti käytetty solulinja verenpainetutkimuksissa. Napanuoran laskimo kuljettaa happirikasta verta sikiön sydämeen. HU- VEC-solujen käytön suosiminen perustuu muun niiden helppouteen, primaaristen solujen eristämisen lisäksi niitä on saatavilla myös kaupallisesti pakasteampulleissa. HUVEC-solujen jakautumiskyky ei ole loputon. Kaupalliset valmistajat takaavat solujen toiminnan arviolta 15 jakautumiskertaan, joka vastaa siirrostusnumeroilla ilmoitettuna 3-4. 11

1.3 Verenpaineen säätely Veren jakautuminen eri elinten kesken riippuu verenkierron säätelystä. Verenkierron paikallinen, humoraalinen sekä hermostollinen säätely vastaavat verisuonten läpimitasta ja siten veren jakautumisesta. Vaikka verenpaineen säätely tunnetaan jo osin, on järjestelmän toiminnan kokonaisvaltainen hahmottaminen edelleen tutkimuksen alla. Paikallisessa säätelyssä pieneten valtimoiden ja sileiden lihasten muodostamat sulkijat reagoivat ulkoisiin ärsykkeisiin. Venytys, kudoksen lämpötilan muutokset ja verisuonessa kuljetettavat yhdisteet saavat aikaan vasteen, valtimoiden sileiden lihasten relaksoitumisen tai supistumisen. Verenpaineen kasvaessa lihassyyt supistuvat ja vähetessä veltostuvat. Itsesäätely on erityisen tehokasta munuaisissa ja aivoissa niiden tasaisen verenpaineen takaamiseksi. Verisuonten laajenemista, vasodilaatiota, saavat aikaan muun muassa hapen väheneminen, ph:n lasku sekä endoteelisoluista vapautuva typpioksidi. Supistumiseen, vasokonstriktioon, vaikuttaviksi tekijöiksi on havaittu endoteelisolujen erittämät, voimakkaasti supistavat peptidit, endoteliinit, Ang II sekä tromboksaani A 2. Humoraalisella säätelyllä tarkoitetaan elimistön verenkierron mukana kulkeutuvien tekijöiden aikaansaamaa säätelyä. Esimerkiksi elimistön soluhengityksessä syntyvä hiilidioksidi saa aikaan verisuonten laajenemista. Verenkierron keskeinen säätelyjärjestelmä on reniini-angiotensiinijärjestelmä (RAS), jonka olemassaolo osoitettiin suomalaisten tutkijoiden toimesta jo vuonna 1898 19. RAS johtaa useiden entsymaattisten reaktioiden kautta bioaktiivisten angiotensiinien II-IV syntymiseen. Reaktiosarja saa alkunsa munuaisten erittämän reniinin pilkkoessa maksaperäistä angiotensinogeeniä verisuonia heikosti supistavaksi angiotensiini I:ksi (Ang I). Reniinin eritykseen vaikuttavat useat eri tekijät, kuten verenpaine, suolatasapaino, sytokiinit, sympaattiset hermot sekä verisuoniin vaikuttavat vasoaktiiviset aineet 20. Ang I puolestaan pilkotaan angiotensiiniä konvertoivan entsyymi I:n (ACE1) toimesta Ang II:ksi. Ang II:lla ja siitä edelleen aminopeptidaasien pilkkoma Ang III osallistuu verenpaineen säätelyyn angiotensiini tyypin 1 ja 2 reseptorien välityksellä. Endoteelisolut ilmentävät sekä angiotensiini tyypin 1 että 2 reseptoreja 21. Angiotensiinireseptorit kompensoivat toistensa toimintaa. Tyypin 1 reseptori säätelee muun muassa 12

verisuonten supistumista, nestetasapainoa sekä voimakkaan verisuonten supistajan vasopressiinin ja aldosteronin erittymistä. Tyypin 2 reseptori saa aikaan verisuonten laajentumisen, NO:n vapautumisen sekä solujen jakautumisen ja kasvun eston. ACE1-entsyymin on osoitettu katalysoivan myös ACE2-entsyymin Ang I:stä pilkkoman Ang 1-9:n reaktiota Ang 1-7:ksi ja siitä edelleen Ang 1-5:ksi 22. Verenpaineen säätely lihasten toiminnan kautta sekä nestetasapainon säätely munuaisen välityksellä ovat RAS-järjestelmän tärkeimmät vaikutuskohteet. ACE1- entsyymin on havaittu katalysoivan vasodilatoivan peptidin, bradykiniinin, hydrolysoitumista pienemmiksi inaktiivisiksi peptideiksi. Kallikreiini-kiniini kaskadissa kallikreiinistä pilkottu bradykiniini vaikuttaa bradykiniinireseptori 2:n kautta saaden aikaan endoteeliperäisten NO:n ja prostasykliinin tuoton verisuonia laajentaen. 23-25 RAS-järjestelmän on havaittu vaikuttavan monissa elimissä ja kudoksissa, ja sen toiminta voi olla joko paikallista tai vaikutuskohteeseen verenkierron kautta kulkeutuvaa. (Kuva 2) Kuva 2. Reniini-angiotensiinijärjestelmä, johon on merkitty angiotensiiniä konvertoivien entsyymien 1/2 (ACE1/ACE2) katalysoimat reaktiot. AT1/2-reseptori=angiotensiini tyypin 1 ja 2 reseptorit ja BK1/2= bradykiniini reseptorit 1 ja 2. ACE1:n ja ACE2:n lisäksi useat muutkin entsyymit saattavat osallistua eri kudoksissa kyseisten peptidien syntyyn. Kuva on piirretty artikkeleita 22, 27 mukaillen. Suurin osa kudoksista ja kaikki verisuonet pienimpiä lukuun ottamatta ovat sympaattisten hermojen säätelemiä 26. Aivojen vasomotorinen keskus ohjaa näitä hermoja saaden pääasiassa aikaan jatkuvan vasomotorisen verisuonten jännityksen. 13

1.3.1 Verenpainetta säätelevät entsyymit Verenpaineen säätelyyn osallistuvat lukuisat entsyymit. Pro gradu työssäni tutkimuksen pääasiallisiksi kohteiksi on valittu HUVEC-solujen entsyymit ACE1, endoteelin typpioksidisyntaasi (enos), syklo-oksigenaasi 2 (COX-2), sekä tietokonemallinnuksen osalta arginaasi-1. 1.3.1.1 Angiotensiiniä konvertoiva entsyymi 1 (ACE1) Verenpaineen säätelyn yksi keskeisimmistä entsyymeistä on peptidaasi ACE1 (EC 3.4.15.1). Se on tyypin I solukalvoon ankkuroitunut dipetidyyli karboksipeptidaasi, josta esiintyy nisäkkäiden kudoksissa kahta eri muotoa. Somaattinen muoto on dimeeri. Se koostuu kahdesta homologisesta osasta, karboksyyli- ja aminoterminaalisesta, joilla molemmilla on epäidenttinen katalyyttinen kohta. Testikulaarinen ACE (90 100 kda) vastaa somaattisen ACE1:n (150 180 kda) karboksyylipään domeenia. Molemmissa muodoissa domeeni jakautuu vielä kahteen aladomeeniin muodostaen syvän uurteen niiden väliin. Testikulaarisen ACE1:n ja sitä estävän lisinopriilin muodostamasta kompleksista on havaittu, että entsyymin rakenne muodostaa eräänlaisen kannen, joka rajoittaa suurten ja kierteisten polypeptidien pääsyä entsyymin aktiiviseen kohtaan. Ihmisen endoteelisolujen somaattisen muodon karboksyylipään domeenin on havaittu vastaavan testikulaarisen ACE1:n aminohapposekvenssiä tähteestä 37 lähtien sisältäen samat aktiivisen alueen aminohapot (taulukko 1). Sekvenssi sisältää sinkkiä sitovan alueen (HIS-GLU-MET- GLY-HIS). 28 Verenpainetta alentavia vaikutuksia ei ole havaittu somaattisen ACE1:n aminopuolen domeenia estävällä fosfiinipeptidi PXR407:lla 29. Karboksyylipään domeenia on pidetty verenpainetta säätelevänä osana. Molempia ACE1:n muotoja on mitattu seerumissa sekä muissa elimistön nesteissä. Somaattista muotoa ACE1:stä ilmenee lähes kaikissa endoteelisoluissa keuhkojen verisuonia lukuunottamatta, tietyissä sileissä lihaksissa, monosyyteissä, T lymfosyyteissä sekä rasvasoluissa. 30, 31 ACE1:n geenin ilmentyminen vähenee mitä kauemmin soluja viljellään. 32 ACE1 hydrolysoi Ang I:n, Ang 1-9:n, Ang 1-7:n sekä bradykiniinin karboksyylipään pilkkoutumista kahden aminohappotähteen mittaiseksi palaksi (kuva 3). Zn 2+ -ioni polarisoi nukleofiilisen vesimolekyylin, deprotonoituminen tapahtuu glutamaatti 384:n iskiessä peptidin karbonyyliryhmään. Sinkki-ioni vaikuttaa myös peptidin asemoitumiseen sekä aktivoi reaktiota kohti nuk- 14

leofiilistä hyökkäystä. Lisäksi se vakauttaa tyrosiinien 523:n ja 353:n ja histidiini 513 vetysidosten karbonyylihappien negatiivisen varausten kasautumista. Alaniini 354 vakauttaa välituotteen amidin positiivista varausta. Protonaation seurauksena glutamaatti 384:sta lähtevä amiiniryhmä viimeistelee reaktion tetraedrisen välituotteen pilkkoutumisen. 34 Dipeptidin pilkkoutuminen tapahtuu, mikäli oligopeptidin pilkottavan peptidisidoksen aminopään aminohappotähde ei ole proliini eikä sidoksen karboksyylipään tähde ole glutamaatti tai asparagiini 35. Tästä syystä ACE1 ei pilko esimerkiksi Ang II:ta. Taulukko 1. Testikulaarisen ACE1:n (PDB 1O8A) aktiivisen alueen aminohappotähteet 33. Aminohappotähde domeeni numero HIS A 353 ALA A 354 GLU A 384 HIS A 513 TYR A 523 Wei ym. 36 havaitsivat, että ACE1:n domeenit eroavat toisistaan substraattispesifisyyden, estäjien, fysiologisten toimintojen sekä kloridiaktivaation puolesta, vaikkakin molemmat hydrolysoivat sekä Ang I:tä että bradykiniiniä. Metalloproteaaseihin kuuluva ACE1:n kofaktorina toimii sinkki. Lisäksi entsyymin toiminta on kloridi-ionin aikaansaamasta aktivaatiosta riippuvainen. ACE1:n aikaansaama reaktio on merkittävä välivaihe RASjärjestelmän usean entsyymin katalysoimassa kaskadissa. Sen estäjät, kuten kaptopriili, ovat 31, 37 yleisesti käytettyjä lääkkeitä kohonneen verenpaineen hoidossa. Ang I ASP - ARG - VAL - TYR - ILE - HIS - PRO - PHE + HIS - LEU Ang 1-9 ASP - ARG - VAL - TYR - ILE - HIS - PRO + PHE - HIS Ang 1-7 ASP - ARG - VAL - TYR - ILE + HIS - PRO Bradykiniini ARG - PRO - PRO - GLY - PHE - SER - PRO + PHE - ARG Kuva 3. ACE1 pilkkoo neljän eri reniini-angiotensiinijärjestelmässä esiintyvän polypeptidin karboksyylipäästä dipeptidejä 31. 15

1.3.1.2 Endoteelin typpioksidisyntaasi (enos) Ihmisen verenkiertojärjestelmässä on kolme erilaista muotoa typpioksidisyntaasia; jatkuvasti syntetisoitava neuraalinen, indusoitava sekä endoteelin typpioksidisyntaasi (EC 1.14.13.39). Verisuonissa NO:n pääasiallinen lähde on enos, mutta myös neuraalinen osallistuu tuottoon 38. Kaikki muodot koostuvat kahdesta konservoituneesta osasta, elektroneja pelkistävästä reduktaasiosasta sekä katalyyttisestä oksygenaasiosasta. Reduktaasi sisältää sitoutumispaikat NADPH:lle, FAD:lle ja FMN:lle. Katalyyttinen osa sitoo L-arginiinin substraatin lisäksi kaksi kofaktoria, 5,6,7,8-(6R)-tetrahydrobiopterin ja hemin, sekä sinkin. Reaktiossa hapen läsnä ollessa L-arginiinista muodostuu sitrulliinia ja NO:ta. 39 Ihmisen enos:n katalyyttisiksi aminohapoiksi on määritetty molemmissa domeeneissa neljä aminohappotähdettä (taulukko 2). Taulukko 2. Ihmisen endoteelin typpioksidisyntaasin (PDB 3NOS, homologi 1M9K:lle) aktiivisen alueen aminohappotähteet 33. aminohappotähde domeeni numero CYS A/B 184 ARG A/B 187 TRP A/B 356 GLU A/B 361 NO:sta riippuvaiseen, endoteelisolujen aikaansaamaan paikalliseen verenpaineen säätelyyn sepelvaltimoissa vaikuttavat solun ulkoiset tekijät. Vaikka enos:a syntetisoidaan jatkuvasti endoteelisoluissa, on sen aktiivisuus tarkasti kalsiumin (Ca 2+ ) ja kalmoduliinin säätelemä 40. NO:n tuotto saa alkunsa solun kemiallisista ja hemodynamisista ärsykkeistä. Bradykiniini ja asetyylikoliini saavat aikaan solun pinnan reseptorien kautta solunsisäisen kalsiumpitoisuuden nousun. Vaikutus saa aikaan inaktiivisen enos:n irtoamisen endoteelisolunsolun kaveolista. Irronnut enos aktivoituu fosforyloinnin myötä johtaen NO:n tuoton lisääntymiseen. Aktivoivaa fosforylaatiota aikaansaavia kinaaseja ovat proteiinikinaasi B (Akt), syklinen AMP-riippuvainen proteiinikinaasi A, AMP-aktivoituva proteiinikinaasi sekä kalsium/kalmo-duliiniriippuvainen kinaasi II. Proteiinikinaasi C saa puolestaan aikaan enos:a estävän vaikutuksen. 41-43 Rotan aortan endoteelisoluilla tehdyn tutkimuksen mukaan enos-entsyymin fosforylaation väheneminen näyttäisi olevan seurausta solujen ikääntymisestä ja proteiinikinaasi Akt:n aktiivisuuden heikkenemisestä 44. 16

Lyhyen puoliintumisajan (pari sekuntia) omaava kaasumainen NO diffundoituu endoteelisoluista verisuonen sileisiin lihaksiin edistäen syklisen guanosiini 3, 5 monofosfaatin (cgmp) syntymistä liukoisen guanylaattisyklaasin katalysoimassa reaktiossa. Substraattina liukoinen guanylaattisyklaasi käyttää guanosiinitrifosfaattia. Bradykiniinin ja NO:n lisäksi cgmp:n tuottoa viljellyissä endoteelisoluissa aktivoivat adenosiinidifosfaatti sekä kalsiumionofori (A23187). Kalsiumionoforin aikaansaama cgmp:n tuotto on pitkäkestoisin, mutta määrä jää adenosiinidifosfaattia ja NO:ta huomattavasti pienemmäksi. 45-47 NO-lähtöinen cgmp:n tuotto aktivoi cgmpriippuvaista proteiinikinaasia saaden aikaan solunsisäisen kalsiumin laskun ja sileän lihaksen relaksaation johtaen verenpaineen laskuun 48. Hiljattain julkaistussa tutkimuksessa Ha ym. 49 osoittivat, että endoteelisoluista riippuvaiseen verisuonten relaksoitumiseen ja verenpaineen säätelyyn voidaan vaikuttaa verihiutaleperäisellä kasvutekijällä (PDGF, engl. platelet-derived growth factor). PDGF:n vaikutus kohdistuu Akt1- riippuvaisen mekanismin kautta aktivoiden fosforylaation avulla endoteelin typpioksidisyntaasia ja NO:n tuottoa. Nitraatin (NO - 3 ) ja nitriitin (NO - 2 ) pitoisuuden määritystä käytetään yleisesti epäsuorana menetelmänä määrittämään solujen NO tuottoa ja enos:n aktiivisuutta. Nitraattin tai nitraatin ja nitriitin kokonaissumman (NO x ) perusteella voidaan mitata luotettavasti endoteelin NO tuottoa. Voidaan myös olettaa, että plasman nitriitti on pääosin peräisin juuri endoteelien typpioksidisyntaasista. 50 Asetyylikoliini saa aikaan soluviljelmässä NO x -pitoisuuden nousun 51. 1.3.1.3 Syklo-oksigenaasi 2 (COX-2) Nisäkkäillä esiintyy kahta eri muotoa COX oksidoreduktaasia; jatkuvasti rakenteellisesti (konstitutiivisesti) ilmentyvä COX-1 sekä säädellysti vain tietyissä kudoksissa esiintyvä, solukalvoon (solulimakalvosto, tumakotelo ja solukalvo) kiinnittynyt indusoituva COX-2 (EC 1.14.99.1). COX-2 muodostuu kahdesta homodimeeristä, joissa molemmissa on kaksi aladomeenia. Toinen on aminohapposekvenssiltään ainutlaatuinen, sillä se sisältää entsyymin aktiivisen kohdan (taulukko 3). Arakidonihappometaboliaan osallistuvat COX:t katalysoivat monityydyttymättömiä rasvahappoja bioaktiivisiksi yhdisteiksi. Reaktiossa pääasiallinen substraatti arakidonihappo hapettuu kolmen välivaiheen kautta prostaglandiini G 2 :ksi. Ensimmäinen vaihe on 17

reaktionopeuteen vaikuttava. Stimulaation aikaansaamana fosfolipaasi A2 mobilisoi arakidonihapon vapautumista solukalvon fosfolipideistä. Seuraavassa reaktiossa prostaglandiini G 2 pelkistetään COX-2:n toimesta prostaglandiini H 2 :ksi, ja siitä edelleen bioaktiivisiksi prostaglandiineiksi (PGE 2, PGF 2α, PGD 2 ja prostasykliini PGI 2 ) sekä tromboksaani A2:ksi. Prostasykliini kulkee ulos endoteelisolusta sileän lihaksen pinnalle, jossa se vaikuttaa prostasykliini- tai TP-reseptorin kautta adenylyylisyklaasiin. Adenylyylisyklaasi saa aikaan syklisen adenosiinimonofosfaatin tuoton ja kalsiumpitoisuuden laskun johtaen sileiden lihassolujen rentoutumisen. Arakidonaatin vapautumista endoteelisoluista aktivoivat muun muassa bradykiniini ja asetyylikoliini. 52, 53 Toksinen LPS saa aikaan endoteelisoluissa peroksinitriitin muodostumisen johtaen prostasykliinisyntaasin inaktivoitumiseen. Häiriö käynnistää sileiden lihassolujen COX-2 synteesin, jonka seurauksena lihassolut voivat alkaa tuottaa itse prostasykliiniä. Sileiden lihassolujen prostasykliini sitoutuu lihassolun kalvolla olevaan prostasykliinireseptoriin lopulta saaden aikaan kalsiumpitoisuuden ja verenpaineen laskun. Prostasykliini estää myös verihiutaleiden kokkaroitumista. Mikäli endoteelisolut suosivat peroksinitriitin pitoisuuden nousun seurauksena prostaglandiini H 2 :n muodostumista, se saa aikaan sileän lihassolujen pinnalla olevien prostaglandiini H2-reseptorien kautta kalsiumpitoisuuden nousun, ja verenpaineen kohoamisen. 54 Taulukko 3. Syklo-oksigenaasi 2:n (PDB 5COX) aktiivisen kohdan aminohapotähteet, jotka osallistuvat prostaglandiini G2:n hapettamiseen prostaglandiini H2:ksi. Valiini 291 merkityksestä katalyysireaktiossa ei ole selkeää varmuutta 33. aminohappotähde domeeni numero GLN A 203 HIS A 207 (VAL) A 291 TYR A 385 Verisuonten solujen eristystavat ja kasvuolosuhteiden muutokset verisuoniston supistukseen vaikuttavat prostaglandiinien tuotantoon. Sian primaarisoluviljelmien endoteelikudos ja sileä lihaskudos omaavat samanlaisen prostaglandiinia tuottavan mekanismin. Primaariviljelmästä peräisin olevien jatkoviljelmien prostaglandiinituotanto hiipuu alkuperäisestä. Vastaava sileiden lihassolujen prostaglandiinituotanto puolestaan kasvaa, päätuotteena syntyy eniten PGE 2 :ta. Kineettisten tutkimusten perusteella on päätelty, että soluviljeltyjen verisuonten solujen prostaglandiinituotannossa tapahtuu muutoksia siirrostusten ja mediumin vaihdon yhteydessä. Lisäksi solukohtainen prostaglandiinien tuotanto vähenee solujen kasvutiheyden lisääntyessä. Prosta- 18

glandiinituotannon muutokset vastaavat solujen reagointikykyä ympäristön muutoksiin in vivo olosuhteissa. 5 1.3.1.4 Arginaasi-1 Arginaasi entsyymejä esiintyy kolmea eri muotoa. Arginaasi-1 (EC 3.5.3.1) katalysoi sytoplasmassa arginiinin hydrolyysiä ureaksi ja ornitiiniksi joko arginiinin tai homoarginiinin indusoimana. Arginaasin arvellaan vaikuttavan verenpaineeseen L-arginiini-ureasyklin välityksellä. L-arginiini toimii enos:n substraattina aiheuttaen kilpailevan tilanteen yhteisestä substraatista arginaasi-1:n kanssa. Kilpailun on havaittu vaikuttavan endoteelisolujen NO-tuotantoon eri- 55, 56 tyisesti normaalin toiminnan omaavissa verisuonissa. Arginaasi-1 muodostuu kolmesta homologisesta domeenista, joissa jokaisessa on kaksi aladomeenia. Molemmista aladomeeneista löytyy kaksi katalyyttisesti aktiivista aminohappotähdettä (taulukko 4). Taulukko 4. Arginaasi-1:n (PDB 2ZAV) katalyyttisiksi määritetyt aminohappotähteet 33. aminohappotähde domeeni numero ASP A/B 128 GLU A/B 277 Sian sepelvaltimon pienissä suonissa on osoitettu rakenteellisen arginaasi-1 entsyymin jatkuvaa ilmentyminen, joka vaikuttaa suonen lihasjännitykseen. L-arginiinin saatavuuden heikentymisen on havaittu vaikuttavan verisuonten toiminnan heikkenemiseen. Arginaasin aktiivisuuden esto estää myös sepelvaltimoiden verenkierron pienenemistä endoteeliperäisen NO-tuotannon lisääntymisen myötä. 56 1.3.2 Farmakologiset hoitokeinot kohonneen verenpaineen alentamiseksi Verenpaineen säätelyn häiriöt aiheuttavat erilaisia seurannaisvaikutuksia ja lisäävät ennenaikaisia kuolemia. Vuonna 2005 julkaistun tutkimuksen 57 mukaan arviolta yhden kolmasosan länsimaisista ihmisistä arvellaan sairastuvan verenpainetautiin tai kohonneeseen verenpaineeseen, 19

joka on riskitekijä sydän- ja verisuonitaudeille (sepelvatimotauti, aivoverenvuoto sekä perifeeriset verisuonisairaudet). Uhka on suuri ja merkittävä maailmanlaajuisen terveydenhuollon ongelma, joka aiheuttaa sairauksien lisäksi muun muassa mittavia kustannuksia terveydenhuollolle. Korkean verenpaineen havaitsemiseen, estämiseen, hoitamiseen ja kontrolloimiseen tulisikin kiinnittää erityistä huomiota. Mikäli elämäntapamuutokset (suolan ja alkoholin käytön rajoittaminen, painonhallinta, liikunta, tupakoinnin lopettaminen sekä oikeanlainen ravinto) eivät ole riittäviä kohonneen verenpaineen hoitoon, aloitetaan lääkehoito. Verenpaineen hoidossa käytettäviä lääkeryhmiä on useita. ACEestäjät laajentavat valtimoita estämällä angiotensiini II:n muodostumista. Angiotensiinireseptorien salpaajat saavat myös aikaan verisuonten laajentumisen. Tiatsidityypin diureetit lisäävät veden sekä ionien erittymistä virtsaan, tosin hitaalla viiveellä. Beetasalpaajat puolestaan vaikuttavat sydämen minuuttitilavuuden vähenemiseen harventamalla syketaajuutta sekä pienentämällä supistustilavuutta. Kalsiumkanavan salpaajat laajentavat valtimoita estämällä kalsiumin liikkumista solun sisään. Tarvittaessa hoitomuotona voidaan käyttää kahden tai jopa useamman lääkeaineen yhteisvaikutusta. Tutkimusten mukaan noin 35 50 % kohonnutta verenpainetta sairastavista potilaista ei käytä määrättyä lääkitystä säännöllisesti, koska lieväasteinen verenpainetauti on oireeton. Lisäksi lääkehoidon kustannukset ovat huomattavia. 58-61 Lääkehoidolla pyritään saamaan verenpaine ainakin tasolle 140/90 mmhg 3. 1.4 Bioaktiivisten tripeptidien vaikutus verenpaineeseen Kohonneen verenpaineen farmakologisten hoitojen lisäksi on havaittu, että tietyt proteiineista pilkkoutuneet peptidit (kooltaan 2-50 aminohappotähdettä) alentavat kohonnutta verenpainetta sekä eläinkokeissa että kliinissä kokeissa. Bioaktiiviset peptidit ovat peräisin nautitusta ruoasta, kuten maitoproteiini β-kaseiinista 62, 63. β-kaseiinin aminohapposekvenssi sisältää kolmen aminohappotähteen mittaisia paloja, isoleusiini-proliini-proliinia (IPP) ja valiini-proliini-proliinia (VPP), joilla on verenpainetta alentava ominaisuus (kuva 4). Elimistöön päästyään ruoansulatuksen entsyymit muokkaavat ravintoproteiinia niin, että epiteelin pinnalla olevat entsyymit, kuten pepsiini, trypsiini, kymotrypsiini sekä peptidaasi pilkkovat proteiinista erimittaisia paloja, sisältäen muun muassa edellä mainittuja tripeptidejä. Proteiineja voidaan pilkkoa myös ruoan teollisessa käsittelyvaiheessa entsymaattisesti hydrolyysin ja fermentaation avulla. IPP:tä ja 20

VPP:tä sisältäviä kaupallisia tuotteita valmistetaan myös fermentoimalla maitoa L. helveticusmaitohappobakteerin läsnäollessa. 64 Tripeptideihin IPP ja VPP on kiinnitetty erityisesti huomiota, sillä niillä on verenpainetta alentava ominaisuus ACE-entsyymin aktiivisuuden eston kautta 65. Kuva 4. Ile-Pro-Pro eli IPP (A) ja Val-Pro-Pro eli VPP (B) rakennekaavat. Verenpaineeseen vaikuttavat peptidit voivat käydä läpi fysiologisia muutoksia, joilla on vaikutus niiden toimintaan. Bioaktiivisten peptidien muodostumisen kannalta keskeisiä tapahtumia ovat ruoansulatuskanavassa tapahtuva proteiinien pilkkoutuminen sekä imeytyminen. Plasman peptidaasit puolestaan vaikuttavat niiden fysiologiseen stabiiliuteen veressä. 64 ACE-entsyymiin kohdistuneissa verenpaineen säätelyn tutkimuksissa on havaittu, että estoa aikaansaavan peptidin rakenteella on suuri vaikutus sen tehokkuuteen. Kokonsa puolesta liian suuri peptidi ei mahdu ACE1:n aktiiviseen kohtaan entsyymin muodostaman kansimaisen rakenteen takia 30. Edelleen on osoitettu, että tehokkaimmat estovaikutuksen määrittävät aminohappotähteet ovat peptidiketjun C-päädyn kolmen viimeisintä aminohappotähdettä, erityisesti isoleusiini, proliini ja valiini. Kyseisten kolmen viimeisen aminohappotähteen konformaation on oltava aminohapoille luonnossa tyypillisessä L-muodossa. Erityisesti proliinin cis-trans kon- 64, 66 formaation muutokset voivat vaikuttaa merkittävästi ACE:n eston tehokkuudessa. Kaseiiniperäiset peptidit sitovat mineraaleja, kuten kalsiumia, rautaa ja sinkkiä spesifisten ja eispesifisten sitoutumiskohtien välityksellä. Mineraaleihin sitoutuminen mahdollistaa, että peptidit voivat absorboitua helpommin ruoansulatuskanavan epiteelin läpi 67. Peptidi voi toimia myös kelaattorina, ja täten rajoittaa tai tehostaa solujen mineraalien saatavuutta 68. 21

1.4.1 IPP ja VPP kokeet in vitro Bioaktiivisten peptidien vaikutusta voidaan tutkia useilla in vitro menetelmillä. In vitro olosuhteissa suoritetut entsyymikokeet vastaavat suljettua systeemiä, vaikka ne on suoritettu soluilla ja kudoksilla. Suljetussa systeemissä metaboliittien liikkumista on rajoitettu, toisin kuin esimerkiksi kokoeläinmalleissa. 69 Käytetyimmät menetelmät liittyvät ACE1-entsyymin estovaikutuksen tutkimiseen. Jäkälä ym. 70 ovat osoittaneet, että kaseiiniperäisellä IPP:llä ja VPP:llä on suojaava vaikutus geneettisesti verenpainetautisten rottien endoteelin toimintaan in vitro. Vaikutus perustunee ainakin osittain ACE1:n estoon kaliumin ja kalsiumin tehostamana. Normaalipaineisten rottien valtimoiden ACE1:n aktiviteetti estyi IPP:llä ja VPP:llä korkeina pitoisuuksina. IPP ja VPP estivät elimistössä saavutettavilla mikromolaarisilla pitoisuuksina ACE1:tä, mutta eivät ACE2 aktiivisuuksia käytettäessä kaupallisia puhtaita entsyymeitä. Arginaasi-1 estyi kolme kertaluokkaa suuremmilla pitoisuuksilla. 71 Bioaktiivisten peptidien tiedetään saavan aikaan ACE1-entsyymin eston in vitro olosuhteissa sekä vapautuvan ruoansulatusjärjestelmässä suuremmista proteiineista in vivo, mutta vielä toistaiseksi niiden fysiologiset vaikutukset ei ole täysin selvillä 72. In vitro kokeet ovat olleet toistaiseksi osittain ristiriitaisia ACE1:n in vivo kokeiden kanssa. Verenpaineen säätely tapahtuu luonnossa fysiologisissa olosuhteissa, jonka perusteella onkin oletettu, että jokin muu mekanismi ACE1:n eston lisäksi voisi olla verenpainetta laskevien mekanismien taustalla. 64, 73 Tripeptidejä pidetään kuitenkin potentiaalisena, ei-farmakologisena ravinnon tarjoamana vaihtoehtona kohonneen verenpaineen hoitoon. 1.4.2 IPP ja VPP kliiniset ja eläinkokeet in vivo Bioaktiivisten tripeptidien IPP ja VPP fysiologisia vaikutuksia tutkittaessa geneettisesti verenpainetautisten rottien (SHR) verenpaineen ei ole huomattu reagoivan akuutisti, mutta pitkään jatkuneena tripeptidien anto laskee seerumin ACE-aktiivisuutta ja laskee verenpainetta 74, 75. Verenpainetautisten rottien endoteelista riippuvaista verisuonten relaksaatiota suoliliepeen valtimoissa tai aortassa ei havaittu puhtaita peptideitä juomavedessä annettuna 75, 76, toisin kuin dia- 22

beettisilla rotilla 77. Myöskään pitkäkestoinen maitoperäinen tripeptidikäsittely ei saanut aikaan endoteelistä riippuvaista verisuonten relaksaatiota suoliliepeen valtimoissa tai aortassa, mutta fermentoidun maidon ja mineraalien kanssa tripeptidit paransivat relaksaatiota 78. Endoteeliperäiseen relaksaatioon liittyen enos:n ja COX-2:n osalta on suhteellisen niukkaa tutkimustietoa. Geneettisesti verenpainetautisilla rotilla tehdyn kokeen perusteella IPP ja VPP eivät vaikuta merkittävästi aortan COX-1 geenin ilmentymiseen, mutta lähes kaksinkertaistavat enos:n geenin ilmentymisen 79. 1.5 Tietokonemallinnus Tietokoneella tehtävä biologisten molekyylien vuorovaikutusten tutkiminen, in silico, on osa nykypäivän modernia biolääketiedettä. Juuret in silico-tutkimuksella johtavat 1970-luvun puoliväliin 80. Tietokoneella tehtävä kolmiulotteinen mallinnus on ennustavaa, ja tuloksia pyritään hyödyntämään laboratoriotyöskentelyssä. Menetelmällä voidaan yrittää selvittää biologisia tapahtumia, kuten mahdollisia kahden molekyylien välisiä interaktioita. Tällaisia tutkimuskohteita voivat olla esimerkiksi peptidien ja entsyymien väliset vuorovaikutukset molekyylirakenteiden pohjalta. Pääsääntöisesti tietokonemallinnusta varten mallinnettavien molekyylien rakenne on tunnettava riittävän tarkalla erotuskyvyllä (resoluutio). Joissain tapauksissa tietokonemallinnus on mahdollista ilman määritettyä molekyylirakennetta. Atomitason rakenteen selvittämiseksi käytetään röntgenkristallografiaa ja ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa. 33, 81, 82. Eri menetelmillä selvitettyjä proteiinien sekä proteiinikompleksien rakenteita tallennetaan erilaisiin tietokantoihin, kuten Brookhaven Protein Data Bank (PDB)-internetsivustolle tutkijoiden vapaasti käytettäväksi. Proteiinirakenteissa atomien erotuskykyä kuvataan pituuden mittayksiköllä, ångströmillä (Å). Entsyymien rakennetta tutkittaessa oleelliseksi tekijäksi nousee riittävän tarkka erotuskyky, joka on ihannetapauksessa alle yhden ångströmin. Tarkkaa entsyymin rakennetta voidaan mallintaa atomitasolla yksityiskohtaisesti. Riittävä erotuskyky mahdollistaa vetyatomien suuntautumisen havaitsemisen kolmiulotteisessa rakenteessa, ja näin ollen myös rakenteen kannalta tärkeiden 23

aminohappotähteiden asemoituminen tarkentuu. Entsyymin toimintaa tutkittaessa proteiinin pinnan muodoilla on suuri merkitys. Aminohappotähteiden sivuketjujen avaruudellinen asemoituminen määrittää pitkälti millä tavalla toinen molekyyli, esimerkiksi IPP tai VPP, pystyy muodostamaan vuorovaikutuksia kohdemolekyylin kanssa. Molekyylin pinnan muodoilla on todettu suuri merkitys entsyymin biologiseen aktiivisuuteen. 83, 84 Käytännössä kuitenkin sopivaa proteiinimallia valittaessa joudutaan ottamaan useita muita asioita huomioon, kuin pelkkä atomitason erotuskyky. Kaikkien proteiinien rakenteita ei ole vielä määritetty, eikä määritetyistäkään ole välttämättä saatavilla riittävän tarkkoja rakenteita tai natiivimuotoja. Tällöin joudutaan valitsemaan proteiinin ja vieraiden molekyylien kompleksimuotojen sekä riittävän erotuskyvyn väliltä sopiva kompromissi tutkimussuunnitelman mukaan. Tässä työssä laboratorio-olosuhteiden entsyymien oletetaan lähtökohtaisesti olevan tilassa, jossa niihin ei ole sitoutunut mahdollinen estäjä. Tällöin tietokonemallinnuksessa käytettäväksi entsyymiksi samankaltaisimmat entsyymirakenteet ovat joko natiivirakenne tai rakenne, josta on manuaalisesti poistettu sitoutunut, ylimääräinen komponentti. Mallinnuksessa käytettäessä muokattua kompleksimuodossa olevaa entsyymiä, ei kuitenkaan voida olla varmoja, onko sitoutuminen muuttanut entsyymin rakennetta. Lisäksi on otettava huomioon eri lajien homologisten entsyymien aminohapposekvenssien mahdolliset eroavaisuudet. Muun kuin kohdelajin entsyymejä tutkittaessa on suoritettava sekvenssirinnastus mahdollisten erojen selvittämiseksi. 1.5.1 AutoDock versio 4.2 AutoDock versio 4.2 on lääkeainesuunnitteluun kehitetty ilmainen, automatisoitu tietokoneohjelma, joka ennustaa ligandin sitoutumista tunnettuun makromolekyyliin. Tapahtumaa kutsutaan telakoinniksi. Muihin vastaaviin ohjelmiin verrattuna käytetty ohjelma helpottaa ja nopeuttaa prosessia laskemalla itse potentiaalisia sitoutumiskohtia, joka pitäisi muutoin tehdä työläällä manuaalisella menetelmällä. AutoDock versio 4.2 koostuu kahdesta pääohjelmasta, esivalmistelevasta laskennallisesta AutoGridistä sekä varsinaisesta telakoinnista, AutoDockista. AutoDock versio 4.2 mahdollistaa perustietokoneella nopean hilapohjaisen energian laskemisen sekä tehokkaan, sallituissa rajoissa tapahtuvan makromolekyylin tai ligandin rakenteen liikkuvuuden huomioon ottamisen. Sen tarkoituksena on löytää mahdollisimman pieni sitoutumiseen kuluva kokonaisenergia, joka voi syntyä ligandin ja makromolekyylin välille käyttäjän rajaamissa eh- 84, 85 doissa. Menetelmä perustuu makromolekyylin tarkan pinnanrakenteen tuntemiseen. 24

AutoDock versio 4.2-ohjelmaan ladataan valittu makromolekyyli sekä ligandi pdbtiedostomuodossa. Ladatut pdb-tiedostot muokataan ohjelmaan sopivaksi poistamalla vesimolekyylit sekä lisäämällä rakenteen vedyt. Pdb-tiedostot käännetään ohjelman avulla pdbqttiedostoiksi, jotka sisältävät pdb-tiedostoista poiketen atomien varaukset sekä atomityypit. Pdbqt-tiedostoista on poistettava ohjelman ajoa häiritsevät heteroatomit (HETATM) sekä määritettävä niiden molekyylien varaukset, joille ohjelma on virheellisesti jättänyt laskematta Gasteigerin varaukset. Lisäksi voidaan määrittää haluttuja aminohappotähteiden liikkuvuusominaisuuksia. Tämän jälkeen valmistellaan tutkimuskohde AutoGrid-ohjelman ajoa varten rajaamalla makromolekyylistä alue, jolle ohjelma telakoi ligandia. AutoGrid ohjelman ajo tapahtuu tietokoneen komentoikkunan kautta. AutoGridissä ohjelma esikäsittelee ligandin laskemalla sen jokaiselle atomille affiniteettipotentiaalin. Makromolekyyli määritetään kolmiulotteiseksi hilaverkostoksi, jonka jokaiseen kohtaan kokeillaan telakoida ligandia. Näin lasketaan jokaiselle ligandin atomille, yleensä hiilelle, typelle, hapelle ja vedylle, affiniteettihila, sekä elektrostaattiset että liukenemispotentiaalit. AutoGrid-laskennan valmistuttua suoritetaan varsinainen telakointi, eli AutoDock-ajo komentoikkunan kautta. AutoDockissa optimoidaan energeettisesti suotuisimmat telakointivaihtoehdot Lamarckian geneettisellä algoritmillä. Tulosten analysointi tapahtuu AutoDock versio 4.2-ohjelman sisältämässä AutoDockTools-työskentelyikkunassa, jossa voidaan vertailla ohjelman kymmentä energeettisesti suotuisinta tulosta. 85 AutoDock versio 4.2. on ladattavissa ilmaiseksi internetistä 86. 25