Peptidisynteesi. SPPS:n Periaate

Transkriptio

1 Tapio Nevalainen Lääkeainesynteesit II 2011 eptidisynteesi i eptidisynteesi Suoritetaan yleensä kiinteän faasin pinnalla; solid phase peptide synthesis (SS) Suuret peptidiainemäärät valmistetaan liuosfaasissa. R. B. Merrifield: ribonukleaasientsyymin synteesi vuonna 1969 (Nobel 1984) SS:n eriaate Aminohappo kytketään linkkerin avulla kovalenttisesti karboksyylipäästään liukenemattomaan polymeeriin. Sivuketjut suojataan pysyvästi Liitettävän aminohapon t. peptidin N-terminaaliin kiinnitetään väliaikainen suojaryhmä Liitettävän aminohapon t. peptidin karboksyyliterminaali aktivoidaan Kunkin reaktiovaiheen jälkeen peptidin sisältävä polymeeri suodatetaan ja pestään sopivilla pesuliuottimilla. Valmis peptidi irrotetaan polymeeristä reagensseilla, joka katkaisee peptidin ja polymeerin välisen kovalenttisen sidoksen. 1

2 Kiinteän faasin peptidisynteesi Solid phase peptide synthesis (SS) Y H N AA C L L 1) olymeeriin liitetään linkkeri (L) johon ensimmäinen suojattu aminohappo liitetään. Y H 2 N AA C H H Y N AA C N AA C L H H H N AA C N AA C N AA C L n H H H 2 N AA C N AA C N AA C H n L 1) Suojaryhmä (Y) poistetaan terminaalisesta aminoryhmästä. 2) Lisätään seuraava aminohappo ja muodostetaan t peptidisidos. 3) Toistetaan vaiheet 2 ja 3 (nkertaa) kunnes saadaan haluttu peptidi 4) oistetaan viimeinen N- terminaalinen suojaryhmä sekä sivuketjujen suojaryhmät ja peptidi irrotetaan linkkeristä. Aktivointireagensseja Disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) eptidisidoksen muodostamiseen tarvitaan karboksyyliterminaalin aktivointi. DCC muodostaa -asyyliurearakenteen, joka aktivoi karbonyylihiilen aminoryhmän nukleofiiliselle hyökkäykselle; peptidisidos muodostuu ja kiinteä disykloheksyyliurea (DCU) saostuu. 2

3 Muita aktivointireagensseja Fosfoniumsuolat: esim. B (Bentsotriatsol 1 yylioksitris( yylioksitris(dimetyyliamino) fosfoniumheksafluorofosfaatti) Aminoryhmän suojaryhmät DCC-koplauksessa aminoryhmä suojataan polymeroitumisen estämiseksi. Yleisimmät suojaryhmät ovat karbamaatteja Kullakin suojaryhmällä on oma poistomenetelmänsä Fmoc aq. NH 3 tai 20% piperidiini tboc 100% TFA, rt, 1h Cbz H 2 /d-c Suojaryhmän poisto-olosuhteet on valittava sellaisiksi, etteivät ne poista sivuryhmien suojaryhmiä. 3

4 Bentsyylioksikarbonyyli (Cbz tai Z) Emässtabiili Voidaan poistaa hydraamalla (H 2,d/C) tai voimakkaalla hapolla Kysteiini ja metioniini voivat myrkyttää d/c- katalyytin, joten sen sijaan käytetään Boc- ja Fmoc-suojaryhmiä Käytetään edelleen sivuryhmien suojauksessa Useimpia CBz, Boc ja Fmoc-aminohappoja on kaupallisesti saatavissa. Tert butyylioksikarbonyyli (Boc) Boc-suojaryhmä voidaan liittää Boc-anhydridillä tai Boc-n -reagenssilla (Boc) 2 tai N CN Boc-n (t-butoxycarbonyloximinophenylacetonitrile) R R - NaH tai H 3 N Et 3 N NH Boc-AA (Butyloxycarbonyl) Boc on emässtabiili ja kestää vedytyksen Boc-suoja poistetaan hapolla (TFA, HBr, HCl, HF) 4

5 Merrifield peptidisynteesi aminohapon amiinipää suojataan Boc-ryhmällä sivuketjut suojataan bentsyyliryhmillä illä (Bn) Boc-suojan poisto 50% TFA/DCM Fenyyliasetamidometyyli (AM) AM)-linkkeri Sivuketjujen suojaryhmät poistetaan vahvalla hapolla (HF tai HBr/TFA) 9 (Fluorenyylimetyylioksi)karbonyyli (Fmoc) Yleisin suojausmenetelmä Kestää happoja ja vedytystä oistetaan miedolla emäksellä (esim. piperidiinillä tai morfoliinilla) Muita Fmoc-reagensseja: 5

6 Fmoc peptidisynteesi N CH 2 H N H H N H 2 N piperidine NH NH TFA Sivuketjut suojataan tert- butyyliryhmillä 4-Bentsyylioksibentsyyli-alkoholi (Wang)-linkkeri Amiinipään Fmoc-ryhmä poistetaan piperidiinillä Sivuketjujen suojaryhmät poistetaan TFA:lla ja samalla peptidi irtoaa hartsista. + Wanghartsi TFA Sivuryhmien suojaus Gly (glysiini), Ala (alaniini), Val (valiini), he (fenyylialaniini), Leu (leusiini) Ile (isoleusiini), Met (metioniini), ro (proliini), Trp (tryptofaani), Asn (asparagiini) ja Gln (glutamiini) aminohappoja ei yleensä tarvitse suojata Lysiinin aminoryhmä ja kysteiinin SH ryhmä on suojattava aina Muiden ryhmien suojaus vähentää sivureaktioden määrää 6

7 Sivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa Fmoc kemiassa arginiinin suojaukseen käytetään BC suojausta tai aryylisulfonyylejä (esim. MC = 2,2,5,7,8 pentamethylchroman 6 sufonyl), jotka voidaan poistaa TFA:lla tai trimetyylisilyylibromdilla (TMSBr): Sivuryhmien suojaus Fmoc kemiassa Lysiini: Kysteiini: 7

8 Sivuryhmien suojaus Fmoc kemiassa Histidiini: Seriini, treoniini ja tyrosiini: Sivuryhmien suojaus Fmoc kemiassa Asparagiini ja glutamiinihappo H Aspartic acid TFA Asp(tBu) L-aspartic acid 4-tert-butyl ester Glu(tBu) 8

9 eptidit lääkeaineina Aivolisäkkeen takalohko tuottaa peptidihormoneja mm. vasopressiinia ja oksitosiinia. Siklosporiini lisää kudossiirrännäisten pysyvyyttä. Siklosporiinia käytetään myös nivelreuman ja vaikean psoriaasin hoidossa. Monet ACE-estäjät ovat peptidirakenteisia, esim. enalapriili Kirjallisuutta Houben-Weyl Weyl Methods of rganic Chemistry. Synthesis of eptides and eptidomimetics; M. Goodman, A. Felix, L. ; M. Moroder and C. Toniolo Ed.; Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 2001; Vols. E22ad. Y. kada, Synthesis of eptides by Solution Methods. Curr. rg. Chem. 2001, 5, 1 S. Aimoto, Contemporary methods for peptide and protein synthesis. Curr. rg. Chem. 2001, 5, 45 M. A. Walker, rotein synthesis by chemical ligation of unprotected peptides in aqueous solution. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1069 Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, Chemical Approaches to the Synthesis of eptides and roteins.; CRC: Boca Raton, Florida,