Saimaannorppanaaraiden ( Phoca hispida saimensis)

Saimaannorppanaaraiden (Phoca hispida saimensis) yksilöntunnistus ja pesäpaikkauskollisuuden selvittäminen geneettisin menetelmin pesäpaikoilta kerätyistä istukkanäytteistä Hanna Buuri Pro gradu tutkimus Oulun yliopisto Biologian laitos Elokuu 2013

Käytetyt lyhenteet A alleelien lukumäärä C Celcius-aste DNA F IS H H e H o HW ka deoksiribonukleiinihappo sukusiitoskerroin heterotsygotia odotettu heterotsygotia havaittu heterotsygotia Hardy-Weinberg keskiarvo µl mikrolitra PCR WWF polymeraasiketjureaktio (Polymerase Chain Reaction) Maailman Luonnon Säätiö (World Wide Fund for Nature) 1

Sisällys Käytetyt lyhenteet... 1 1. Johdanto... 4 1.1. Geneettisten menetelmien käyttö uhanalaisten lajien seurannassa... 4 1.2. Mikrosatelliitit... 6 1.2.1. Mikrosatelliittianalyysien ongelmat... 6 1.3. Saimaannorppa... 7 1.3.1. Saimaannorppakannan kehitys ja nykyinen levinneisyys... 7 1.3.2. Saimaannorpan populaation tämänhetkinen tila ja suojelu... 9 1.3.3. Saimaannorpan pesäpaikkojen käyttö... 11 1.3.4. Saimaannorpan istukan rakenne ja muodostuminen... 13 1.4. Saimaannorpan geneettinen monimuotoisuus ja siihen vaikuttavat tekijät... 15 1.4.1. Geneettinen muuntelu... 15 1.4.2. Migraatio, liikkuminen ja sukusiitos... 16 1.5. Tutkimuksen tarkoitus... 17 2. Tutkimusmateriaali ja menetelmät... 19 2.1. Tutkimusmateriaali... 19 2.2. DNA:n eristäminen näytteistä... 21 2.3. Polymeraasiketjureaktio... 21 2.3.1. Tutkitut lokukset... 22 2.3.2. PCR-seos ja tutkimuksessa käytetyt PCR-ohjelmat... 22 2.4. Agaroosigeelielektroforeesi... 23 2.5. ABI-fragmenttianalysointi... 24 2.6. Genotyyppiaineiston analysointi... 24 2.6.1. Genotyyppiaineiston tarkastaminen... 24 2.6.2. Emon ja kuutin alleelit... 25 2.6.3. Kytkentätasapaino... 26 2.6.4. Hardy-Weinbergin tasapaino, sukusiitoskerroin ja geneettinen monimuotoisuus... 26 2.6.5. Sisar- ja sisarpuoliparit ja yksilöntunnistuksen todennäköisyys... 27 3. Tulokset... 28 3.1. Emon ja kuutin alleelit... 28 3.2. Genotyyppiaineiston tarkastaminen... 29 3.3. Hardy-Weinbergin tasapaino, kytkentätasapaino, sukusiitoskerroin ja geneettinen monimuotoisuus. 30 2

3.4. Sisar- ja puolisisarparit ja yksilöntunnistuksen todennäköisyys... 31 4. Pohdinta... 33 4.1 Tutkimuksen epävarmuustekijät ja menetelmän kehittäminen... 33 4.2 Emon ja kuutin alleelit... 34 4.3 Genotyyppiaineiston tarkastaminen ja kytkentätasapaino... 34 4.4 Hardy-Weinbergin tasapaino, sukusiitoskerroin ja geneettinen monimuotoisuus... 35 4.5 Sisar- ja puolisisarparit ja yksilöntunnistuksen todennäköisyys... 36 4.6 Mahdolliset jatkotutkimukset... 36 5. Yhteenveto... 37 6. Kiitokset... 38 7. Lähteet... 39 8. Liitteet... 45 3

1. Johdanto 1.1. Geneettisten menetelmien käyttö uhanalaisten lajien seurannassa Geneettisiä menetelmiä käytetään yhä enemmän uhanalaisten lajien seurannassa. Nämä menetelmät antavat sellaistakin tietoa, mitä ei aina voida muilla menetelmillä saada. Geneettiset menetelmät mahdollistavat muun muassa laajan ekologisen ja evolutiivisen tiedon saamisen ja maksavat silti vähemmän sekä ovat luotettavampia ja herkempiä kuin tavanomaiset seurantamenetelmät (Schwartz ym. 2006). Uhanalaisilla lajeilla etenkin yksilöiden lukumäärä voi olla vaikea määrittää. Pyynti-merkintäuudelleenpyynti on usein käytetty menetelmä lajien yksilömäärän selvittämisessä. Menetelmä ei kuitenkaan ole aina sopiva etenkään uhanalaisille lajeille, sillä se vaatii eläimen pyytämistä, merkitsemistä, vapaaksipäästämistä ja uudelleenpyyntiä. Näin ollen menetelmä vie paljon aikaa ja resursseja sekä saattaa häiritä ja jopa vahingoittaa eläintä. Noninvasiiviset näytteet ovat eläimen jälkeensä jättämää materiaalia, josta on mahdollista eristää DNA:ta (esim, karvat ja ulosteet). Tällaisten näytteiden avulla voidaan geneettisin menetelmin tunnistaa yksilöitä ja voidaan välttää tutkittavan eläimen pyyntiä ja merkitsemistä (Schwartz ym. 2006, Barbosa ym. 2013). Noninvasiivinen genettiikka yhdistää kenttä-, laboratorio- sekä analyyttisiä tekniikoita, jotka mahdollistavat populaatioiden tutkimisen ilman eläimen kiinniottoa tai edes havaitsemista (Broquet ym. 2007). Noninvasiiviset näytteet mahdollistavat siis tehokkaan ja häiriöttömän tavan seurata kannan runsautta. Noninvasiivinen runsauden määrittäminen soveltuu etenkin harvinaisille tai vaarallisille lajeille tai lajeille, joiden pyytäminen aiheuttaa runsaasti kuluja. Noninvasiivisia geneettisiä menetelmiä on käytetty apuna monien lajien biologisessa, ekologisessa ja suojelututkimuksessa (Waits & Paetkau 2005, Janêca ym. 2011). Myös geneettistä muuntelua, efektiivistä populaatiokokoa sekä populaatiorakennetta ja migraatiota voidaan selvittää geneettisten menetelmien avulla (Schwartz ym. 2006). Noninvasiivisia näytteitä on käytetty laajasti geneettisessä seurannassa etenkin maalajeilla. Vesiekosysteemeissä noninvasiivset näytteet kuten ulosteet tai karvat ovat heikommin saatavilla. Täysin vesielämään sopeutuneiden lajien kohdalla näytteiden keruu on hankalaa ja vaatii usein kerääjän suoraa kontaktia lajiin. Merinisäkkäiden näytteenkeruussa on myös logistisia ja kustannuksellisia ongelmia. Lisäksi merien voimakas vuorovesi-ilmiö sekä korkea suolapitoisuus voivat hankaloittaa näytteiden säilymistä ja keräämistä (Foote ym. 2012). Geneettisten menetelmien 4

avulla voidaan tutkia myös esimerkiksi eläinten eloonjäämistä, taudinaiheuttajia tai loisia (Schwartz ym. 2006). Tässä tutkimuksessa käytetään noninvasiivisina näytteinä uhanalaisen saimaannorpan pesäpaikoilta kerättyjä istukoita. Geneettisiä menetelmiä on hyödynnetty esimerkiksi susipopulaatioiden (Canis lupus) runsaustutkimuksessa. Sudet ovat vaikeasti kiinnisaatavia eläimiä ja niistä on hankala saada suoraan tietoa. Noninvasiivinen tutkimus suoritettiin raadoista otetuista kudosnäytteistä sekä ulosteista ja se on tuottanut susilla hyviä tuloksia (Fabri ym. 2012). Uhanalaisen havaijinhylkeen (Monachus schauinslandi) tutkimuksessa käytettiin mikrosatelliittilokuksia populaatiorakenteen selvittämiseksi. Tutkimuksessa käytettiin kudosnäytteitä, jotka otettiin hylkeen räpylöistä merkitsemisen yhteydessä (Kretzmann ym. 2001). Myös kansallispuistossa eläviä simpansseja (Pan troglodytes troglodytes) on tutkittu geneettisin menetelmin. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan simppanssien lukumäärää ja levinneisyyttä kansallispuiston alueella ulostenäytteiden avulla (Arandjelovic ym. 2011). Geneettisessä seurannassa on myös ongelmia. Ongelmia aiheuttaa etenkin noninvasiivisten näytteiden heikkolaatuinen ja kontaminoitunut DNA sekä pienet DNA-pitoisuudet. Näistä ongelmista kerrotaan lisää mikrosatelliittianalyysien ongelmat kappaleessa. Ongelmat johtavat usein genotyypitysvirheisiin, jotka voivat vaikuttaa muun muassa yksilöntunnistukseen, vanhemmuusanalyyseihin sekä runsaustutkimuksiin. Noninvasiivisissa tutkimuksissa genotyypitysvirheet saattavat johtaa suureenkiin kannan runsauden yliarvioon. Koska noninvasiiviset näytteet ovat virhealttiita vähäisen ja heikkolaatuisen DNA:n vuoksi, mahdolliset virheet tulisi ottaa huomioon jo tutkimuksen suunnitteluvaiheessa. On tärkeää tarkistaa, että tavoitteeseen vaadittavat genotyypitykset ovat realistisia näytelaatuun nähden (Pompanon ym. 2005). Mahdollisen pilottitutkimuksen suorittaminen voi auttaa genotyypitysvirheiden rajoittamisessa. Pilottitutkimuksella arvioidaan teoreettista genotyypitysvirheastetta, jota voidaan käyttää hyväksi itse tutkimuksessa. Tällöin voidaan arvioida kuinka monesti kukin näyte tulee monistaa, ennenkuin genotyyppi voidaan tietyissä lokuksissa hyväksyä (Pompanon ym. 2005, Taberlet ym. 1999). 5

1.2. Mikrosatelliitit Mikrosatelliitit ovat DNA:n lyhyitä toistojaksoja ja niiden yhden toiston pituus on 1-6 emästä (Chistiakov ym. 2006). Mikrosatelliitteja esiintyy sekä prokaryoottien, että eukaryoottien genomeissa (Bruford ym. 1996) ja sekä genomin koodaavilla, että ei-koodaavilla alueilla (Dokholyan ym. 2000). Yleinen oletus on, että mikrosatelliitteja esintyy suhteellisen tasaisesti genomissa (Li ym. 2002). Mikrosatelliittien lokuksissa on yleensä useita alleeleja, minkä vuoksi niitä voidaan hyödyntää muunmuassa yksilöiden geneettisten sukulaisuussuhteiden selvityksessä (Jarne & Ladoga 1996). Mikrosatelliittien yhteisvallitseva periytyminen, runsaus genomeissa, suuri muuntelevuus, suhteellisen pieni koko ja nopeat määritysmenetelmät (esim. PCR) mahdollistavat niiden laajan käytön populaatiogenetiikassa (Schlötterer 2000, Buschiazzo & Gemmel 2006, Chistiakov ym. 2006). Pienen kokonsa vuoksi mikrosatelliitit säilyvät vanhoissakin näytteissä käyttökelpoisina (Adams 2003). 1.2.1. Mikrosatelliittianalyysien ongelmat Mikrosatelliittianalyyseissa esiintyy niiden monista hyvistä ominaisuuksista huolimatta myös ongelmia. PCR:ssä joudutaan usein käyttämään jonkin lähisukuisen lajin mikrosatelliittilokuksia, koska tutkittavalle lajille ei ole kehitetty omia mikrosatelliittilokuksia. Sukulaislajin mikrosatelliittilokukset eivät kuitenkaan aina toimi halutulla tavalla, sillä lokuksen viereisellä alueella voi olla tapahtunut mutaatio, jolloin aluke ei kiinnity kunnolla. Tämä on usein sitä yleisempää, mitä kaukaisempaa sukua lajit ovat toisilleen (Chapuis & Estoup 2007). Lisäksi toiselta lajilta lainatussa mikrosatelliittilokuksessa voi olla vähemmän muuntelua tutkimuslajin kohdalla verrattuna lajiin, jolle lokus on alun perin kehitetty (Ellegren ym. 1997). Myös väärin tulkitut alleelit voivat osoittautua ongelmalliseksi. Tutkijan tulisi tarkistaa tietokoneen tekemä genotyypitys manuaalisesti, jolloin luotettavuus kasvaisi. Tutkijan tarkistus on kuitenkin aina enemmän tai vähemmän subjektiivista, joten tämänkin jälkeen aineistoon voi jäädä väärin tulkittuja alleeleja. Etenkin huonolaatuisten näytteiden kohdalla yksittäisiä alleeleja voi jäädä puuttumaan (allelic dropout), jolloin toinen heterotsygootin alleeleista jää PCR:ssä monistumatta ja se tulkitaan väärin homotsygootiksi (Bonin ym. 2004). PCR:ssä voi myös tapahtua virheitä, jotka johtavat niin sanottuihin stutter bandeihin eli ylimääräisiin piikkeihin. Tällaiset piikit edeltävät 6

usein todellista ja korkeinta piikkiä (Schlötterer 2004). Stutter bandit voivat aiheuttaa väärän piikin valintaa (van Treuren ym. 2010) sekä hetero- ja homotsygoottien tunnistaminen vaikeutumista (Shinde ym. 2003). Noninvasiivisten näytteiden DNA on usein heikkolaatuista, DNA-pitoisuudet ovat pieniä ja DNA voi olla kontaminoitunutta. Mikrosatelliittianalyysit ovat herkkiä kaikille näille ongelmille, mikä johtaa usein monistumis- tai genotyypitysvirheisiin (Piggot & Taylor 2003). DNA:n vähäinen määrä ja heikko laatu aiheuttavat alleelien putoamista (allelic dropout) ja alleelien väärintulkintaa. Myös muuntelu DNA-sekvenssissä voi olla syynä virheisiin. Mikäli mutaatio tapahtuu markkerin lähellä, alleelin monistuminen voi epäonnistua. Lisäksi tutkijan tekemät virheet, etenkin väärin tulkitut alleelit ja alleelien putoaminen, aiheuttavat genotyypitysongelmia (Pompanon ym. 2005). 1.3. Saimaannorppa 1.3.1. Saimaannorppakannan kehitys ja nykyinen levinneisyys Saimaannorppa (Phoca hispida saimensis, esitetty kuvassa 1.1) on norpan (Phoca hispida) alalaji ja sen isolaatiohistoria on hyvin tunnettu. Saimaannorppa jäi eristyksiin muista lajitovereistaan viimeisimmällä jääkaudella, kun yksilöitä päätyi maankohoamisen seurauksena syntyneisiin järvialtaisiin (Hyvärinen & Nieminen 1990). Saimaannorppa on elänyt Saimaassa täydellisessä isolaatiossa ainakin 9500 vuotta. Tänä aikana se on kehittynyt niin morfologisesti kuin ekologisestikin omaksi selvästi erotettavaksi alalajikseen (Hyvärinen & Nieminen 1990). Kuva 1.1 Saimaannorppa makuukivellään. 7

Saimaannorpan populaatiokoko on oletettavasti vaihdellut runsaasti sinä aikana kun se on asuttanut Saimaata. Saimaannorpan populaatiokoko putosi 1900-luvulla noin 1000 yksilöstä (Kokko ym. 1998) noin 130 150 yksilöön 1980-luvun loppuun mennessä (Sipilä ym. 1990). Pudotusta voidaan pitää suurena, sillä vielä 1970-luvulla populaatiokoon arveltiin olevan 400 yksilön luokkaa (Hyvärinen ym. 1998). Saimaannorpan populaatiokoon todettiin kasvaneen noin 220 250 yksilöön 1990-luvun alussa (Sipilä 2003). Kannan koon on arvioitu olleen 100 1000 yksilöä 1800- ja 1900- luvun vaihteessa (Kokko ym. 1998). Kuvassa 1.2 on esitetty saimaannorppakannan yksilömäärät vuosina 1990-2012. Kuvasta nähdään, että kanta on kasvanut 1990-luvulta 2000-luvun alkuun saakka. Tämän jälkeen kannan kasvu on tasaantunut ja lähtenyt jälleen nousuun 2010-luvulla. Vuonna 2012 saimaannorppakanta ylitti 300 yksilön rajan. Kuva osoittaa myös selkeästi kuinka norppakanta on kasvanut alle 200 yksilöstä reiluun 300 yksilöön aikavälillä 1990 2012. 350 300 250 200 150 Kanta 100 50 0 1990 1995 2000 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Kuva 1.2 Saimaannorppakannan kehitys. Kuva perustuu Metsähallituksen julkaisemiin arvioihin saimaannorpan talvikannasta (Metsähallitus 2013b). 8

Saimaannorpan levinneisyys ja nykyiset kalastusrajoitusalueet on esitetty kuvassa 1.3. Kuvasta, nähdään, että norppa asuttaa lähes koko Saimaan. Nykyiset kalastusrajoitukset eivät kuitenkaan kata koko norpan levinneisyysaluetta. Kuva 1.3 Saimaannorpan levinneisyysalue. Kartassa mustalla norpan nykyinen levinneisyysalue perustuen pesälaskentoihin ja aikuisten norppien arvioituihin elinpiireihin. Tummanharmaat alueet kuvaavat nykyistä kalastusrajoitusaluetta (Niemi ym. 2012). 1.3.2. Saimaannorpan populaation tämänhetkinen tila ja suojelu Metsähallituksen arvion mukaan vuoden 2012 talvena norppia oli noin 310. Kannassa arvioidaan olevan noin 85 synnytyskykyistä naarasta ja kuutteja syntyi vuonna 2012 noin 60 kappaletta. Vuoden 2011 aikana norppakanta kasvoi noin 20 yksilöllä. Norppakanta on ollut kasvussa yhteensä kolmena peräkkäisenä vuotena (2010, 2011 ja 2012, kts. kuva 1.2). Kannan kasvua ovat edesauttaneet laajennetut verkkokalastuksen rajoitukset sekä talvien riittävät kinokset, jotka mahdollistavat onnistuneen pesinnän (Metsähallitus 2013b). 9

Kannan suurimpia uhkia ovat kalanpyydykset, ilmaston lämpeneminen, kannan pieni koko ja hajanaisuus sekä häirintä etenkin lisääntymisaikana (Metsähallitus 2013b). Kuvasta 1.4 nähdään kalapyydyksiin kuolleiden norppien lukumäärä eri kuukausina. Kuutit syntyvät helmikuun lopulla ja ensi kuukaudet ne viettävät turvassa pesässä. Kuutit vieroitetaan huhtikuun lopulla ja näin ollen touko- ja kesäkuussa alle 1-vuotiaiden kuolleisuus on suurimmillaan (Metsähallitus 2013a). 14 12 10 8 6 4 alle 1-vuotiaat yli 1-vuotiaat 2 0 T H M H T K H E S L M J Kuva 1.4 Kalapyydyksiin kuolleiden alle ja yli 1-vuotiaiden norppien keskimääräiset lukumäärät eri kuukausina vuosina 2000-2009. Kuva on laadittu Metsähallituksen julkaisemien tietojen perusteella (Metsähallitus 2013a). Populaatio on edelleen hyvin pieni ja pienet populaatiot ovat riskialttiimpia sukupuutoille (Palo ym. 2003). Tämän lisäksi populaatio on pirstoutunut osapopulaatioihin, jolloin myös satunnaistekijät muodostavat kasvavan sukupuuttoriskin. Joillakin lisääntymisalueilla norppia elää ainoastaan noin 20 yksilöä ja niistä lisääntyviä naaraita on vain muutamia (Sipilä ym. 2009). Saimaannorpan suojelustrategian tavoitteena on 400 yksilön kanta vuoteen 2025 mennessä. Tätä voidaan pitää pienimpänä elinkykyisenä kantana, johon sattumatekijät eivät enää voimakkaasti vaikuttaisi (Ympäristöministeriö 2011). Tehokkain suojelutoimi norpan pelastamiseksi olisi turvata kuuttien selviytyminen aikuisikään saakka, tähän pyritään monin eri keinoin. Vapaaehtoiset kalastusrajoitukset ovat vähentäneet tehokkaasti norppien kalanpyydyskuolleisuutta 1980-luvulta alkaen. Rajoituksia voi tulla myös suoraan viranomaisilta (Auvinen ym. 2005). Verkkokalastusta on rajoitettu suurilla pesimäalueilla huhtikuun puolivälistä kesäkuun loppuun, jolloin kuutit itsenäistyvät (Niemi ym. 2012). Verkkokalastuksen rajoitukset on saavutettu yhteistyöllä 10

paikallisten lakisääteisten kalastusosakuntien kanssa joihin kuuluu alueen vakituisia asukkaita (Bell ym. 2008). Suojelussa pyritään säilyttämään norpan lisääntymisalueet minimirajoituksilla (Sipilä 1991). Myös pesäpaikkojen suojelu, vedenpinnan varovainen säännöstely ja ihmistoiminnan aiheuttaman häiriön minimointi ovat tehokkaita keinoja kuuttien auttamiseksi (Kokko ym. 1998). Pesäpaikkojen suojeluun liittyy erityisesti häirinnän minimointi. Nykyään suunnitteluviranomaiset rajoittavat rantarakentamista Saimaalla alueille, jotka ovat suojelubiologien mukaan kriittisiä pesimäalueita (Bell ym. 2008). Norppaa on suojeltu myös perustamalla suojelualueita Linnansaareen ja Kolovedelle (Laita 2005). Uusien suojelualueiden muodostaminen on vielä kesken. Koloveden alueen pesimäsaarilla ja rannoilla on talviaikainen maihinnousukielto. Tällä pyritään turvaamaan norpan lisääntymistä (Sipilä ym. 2009). Populaation kannalta olisi myös tärkeää säilyttää yhteys kaikkien osapopulaatioiden välillä (Palo 2003). 1.3.3. Saimaannorpan pesäpaikkojen käyttö Saimaa on yleensä jään peitossa marraskuun lopulta toukokuun alkuun. Saimaanorpan lisääntyminen ajoittuu tälle ajalle (helmi- maaliskuu) (Rautio ym. 2009). Norpalla on tietyt vaatimukset pesimäalueelle; se ei todennäköisesti lisäänny häirityllä alueella, vaikka alue muuten olisikin norpalle optimaalinen (Kokko ym. 1998). Naaraat pitävät joskus myös välivuosia synnytyksestä (Hyvärinen ym. 2004). Kuutit syntyvät lumenalaisessa pesässä helmikuun lopulla tai maaliskuun alussa. Pesät sijaitsevat lumikinoksissa, aina jään päällä ja usein rannan läheisyydessä. Kinokset ovat siis äärimmäisen tärkeitä pesinnän onnistumisen kannalta (Sipilä 2003). Saimaalla suurimmat lumikinokset muodostuvat Saimaan lounais- ja koillisrannoille alkutalvella vallitsevien lounaistuulten vuoksi. Pesänrakennuksessa norppa suosii koilliskinoksia, sillä se sulavat lounaskinoksia myöhemmin (Laita 2005). Pesä toimii norpalle paitsi imetyspaikkana, myös suojana, lämmönlähteenä ja lepopaikkana. Norpalla voi olla lisäksi vielä niin kutsuttu pakopesä, jonne se voi vaaran uhatessa piiloutua. Norppa voi käyttää yhden talven aikana 1-4 eri pesää, (Sipilä 2003) jotka voidaan jakaa poikaspesiin ja makuupesiin. Norppa synnyttää ja imettää kuuttia suurissa poikaspesissä, joissa voi olla useita sivukäytäviä. Poikaspesien läheisyydessä on usein myös vaihtopesä, jonne emo voi siirtyä imettämään kuuttiaan, mikäli alkuperäiselle pesälle tapahtuu jotakin (Hyvärinen ym. 2004). 11

Makuupesät ovat uroksia ja ei-synnyttäviä naaraita varten, ne ovat poikaspesiä pienempikokoisia (Laita 2005). Norppaa pidetään paikkauskollisena, sillä sen elinpiiri on yleensä suhteellisen pieni ja aikuiset norpat liikkuvat usein vain muutaman kilometrin säteellä pesästään. Tämä on todettu monissa telemetriatutkimuksissa (Hyvärinen ym. 1995, Kunnasranta 2001, Koskela ym. 2002, Sipilä 2003) sekä mitokondrioiden DNA:n geneettiseen muunteluun perustuvassa tutkimuksessa (Valtonen ym. 2012). Saimaan sokkeloinen rakenne ja järven nopea jäätyminen tukevat paikkauskollisuutta. Norpan on turvallisempaa pysyä samoilla seuduilla, kuin lähteä etsimään uutta pesimäpaikkaa. Saimaa jäätyy käytännössä samaan aikaan kaikkialla, joten norpan ei tarvitse vaeltaa ensin jäätyvän alueen perässä (Koskela ym. 2002). Saimaannorpan oletetaan olevan myös pesäpaikkauskollinen, sillä syvimmät kinokset muodostuvat vuodesta toiseen samoille rannoille (Sipilä 1990) ja pesiä löydetään peräkkäisinä vuosina lähes samoilta paikoilta (Helle ym. 1984). 12

1.3.4. Saimaannorpan istukan rakenne ja muodostuminen Istukka on nisäkkään elimistä luultavasti kaikista muuntelevin. Sen rakenne ja muoto voivat vaihdella suuresti lajista riippuen. Myös napanuoran pituus vaihtelee lajeittain. Tämän vuoksi yhden lajin istukan rakenteen tunteminen ei välttämättä anna tietoa toisen lajin istukasta. (Placentation 2013). Kuvassa 1.5 on esitetty saimaannorpan istukka ja kuvassa 1.6 yleinen kaavakuva istukasta. Kuva 1.5 Saimaannorpan istukka. Kuva 1.6 Kaavakuva istukasta (Reproduction 2013). Itä-Suomen yliopiston saimaannorppatutkimus. Hylkeen istukan muodostumista edeltää sikiökalvojen kehittyminen. Vesikalvo on kalvoista sisin ja se muodostaa vesikalvopussin, jonka sisällä alkio on. Vesikalvopussin uloimmat solut muodostavat suonikalvon. Suonikalvo sulautuu rakkokalvoon, jolloin sikiön puoleiseen osaan muodostuu ravitsemuskalvo. Ravitsemuskalvosta muodostuu istukan sikiön puoleinen osa. Istukan 13

emonpuoleinen osa muodostuu kohdun seinämän limakalvosta (Female Reproductive Systems 2013). Hylkeillä suonikalvo ja istukka ovat kiinnityneet löysästi kohdun seinämään (van den Broek 1904). Istukassa on sekä emon, että poikasen kudosta ja kudokset ovat tiiviisti yhteydessä toisiinsa. Tämä on tärkeää, jotta ravinto ja muut tärkeät aineet siirtyvät tehokkaasti emon verenkierrosta sikiön verenkiertoon. Istukka estää myös bakteerien pääsyn emosta sikiöön ja syntetisoi hormoneja. Napanuora koostuu mesodermista ja verisuonista ja se yhdistää istukan sikiön vatsapuoleen (Female Reproductive Systems 2013). Nisäkkäillä esiintyy kolmen tyyppisiä istukoita; suonikalvoistukka, ruskuaispussi-istukka ja ravitsemuskalvoistukka. Viimeisin istukkatyyppi on kaikista kehittynein ja se on kaikkien merinisäkkäiden, myös saimaannorpan istukkatyyppi. Merinisäkkäillä istukka on muodoltaan joko hajaistukka tai vyöistukka. Hajaistukkaa esiintyy ainoastaan valailla, kaikilla muilla merinisäkkäillä on vyöistukka (Female Reproductive Systems 2013). Vyöistukka ympäröi sikiötä yhtenäisenä tai epäyhtenäisenä vyönä. Hylkeillä vyöistukka on yhtenäinen ja se sijaitsee suurinpiirtein keskellä vesikalvopussia (kts. kuva 1.7). Vyöistukkaa esiintyy hylkeiden lisäksi esimerkiksi koirilla ja kissoilla (van den Broek 1904). Hylkeillä (Phocida) istukan rakenne on kuitenkin melko samanlainen. Kirjohylkeellä (Phoca vitulina), (van den Broek 1904) krillihylkeellä (Lobodon carcinophaga) ja leopardihylkeellä (Hydrurga leptonyx) on kaikilla samanlainen istukkatyyppi; ravitsemuskalvoistukka. Krillihylkeen ja leopardihylkeen istukoita vertaileva tutkimus havaitsi istukoiden hienorakenteiden olevan melko samanlaiset (Sinha & Erickson 1974). Kuva 1.7 Hylkeen vyöistukka (Female Reproductive Systems 2013). 14

Merinisäkkäillä istukan poistuessa synnytyksen jälkeisinä, osa istukan kohdunpuoleisesta emon kudoksesta irtoaa myös (Female Reproductive Systems 2013). Irronneen istukan molemmilla reunoilla on havaittavissa oranssia kiteymää, joka koostuu bilirubiinista (van den Broek 1904). 1.4. Saimaannorpan geneettinen monimuotoisuus ja siihen vaikuttavat tekijät 1.4.1. Geneettinen muuntelu Geneettinen muuntelu mahdollistaa populaation sopeutumisen muuttuviin ympäristöoloihin. Jos populaatiossa on vain vähän geneettistä muuntelua, sen kyky sopeutua mahdollisiin ympäristönmuutoksiin on heikko. Geneettiseen muunteluun vaikuttaa muun muassa migraatio, sukusiitos, valinta ja sattuma (Keller & Waller 2002). Vähäinen muuntelu voi johtaa myös heikentyneeseen vastustuskykyyn monia taudinaiheuttajia ja loisia vastaan (Lacy 1997). Mikäli populaation yksilöiden välillä ei ole suurta muuntelua, voi kohtalokas ympäristönmuutos tuhota koko kannan. Populaation elinvoimaisuuden kannalta muuntelun määrä on siis tärkeää. Saimaannorpalla perinnöllisen muuntelun määrä on vähentynyt sinä aikana, jonka se on elänyt Saimaassa eristyksissä merellisistä norpista. Saimaannorpat eroavat toisistaan geneettisesti selkeästi vähemmän verrattuna itämerennorppiin, joilla muuntelu on suurempaa. Pohjoisen jäämeren ja Itämeren norppiin verrattuna saimaannorpan muuntelun monimuotoisuus on vähentynyt 69 prosentilla. Muuntelun väheneminen on luultavasti tapahtunut hitaasti isolaatiohistorian aikana (Palo ym. 2003). Mikäli saimaannorpan populaatiokoko olisi ollut vuosien saatossa vakio, olisi mahdollista, että geneettinen muuntelu olisi säilynyt merinorppien tasolla. Saimaannorpan kanta on kuitenkin kokenut useita pullonkaulavaiheita, jotka ovat karsineet populaation geneettistä muuntelua (Hyvärinen ym. 2004). Pullonkaulavaihe kuvaa tilannetta, jossa populaatio pienenee äkillisesti ja jäljelle jäävän populaation geenialleelit ovat sattuman määrittelemiä. Pullonkaulavaiheet vaikuttavat usein monella tapaa lajin geneettiseen muunteluun. (Bacon ym. 1999). Geneettisen muuntelun vähenemiseen on pullonkaulavaiheiden lisäksi voinut vaikuttaa myös alkuperäisen eristyksiin jääneen pienen kannan geenit (Palo ym. 2003). Kun vain pieni osa alkuperäisestä kannasta muodostaa uuden populaation, tulee tähän populaatioon edustetuksi vain perustajayksilöiden geenit, 15

jolloin kannan geenipooli voi olla pienentynyt ja erilainen verrattuna alkuperäiseen kantaan. Tällöin kyseessä on perustajavaikutus (Wessel ym. 2013). Geneettisen muuntelun vähentymisestä huolimatta saimaannorppaa voidaan edelleen pitää elinvoimaisena ja terveenä alalajina, joka lisääntyy onnistuneesti. Näin ollen mahdollisen sukupuuton kohdatessa populaation, syinä voidaan ennemmin pitää ympäristönmuutoksia, kuin geneettisiä ongelmia (Palo ym. 2003). 1.4.2. Migraatio, liikkuminen ja sukusiitos Migraatiolla tarkoitetaan populaation yksilöiden liikkumista alueelta toiselle tai populaatiosta toiseen. Migraatio ylläpitää geneettistä muuntelua ja se onkin tästä syystä välttämätöntä osapopulaatioiden selviämisen kannalta (Keller & Waller 2002). Saimaannorpalla etenkin naaraiden migraatio näyttäisi olevan rajoittunutta. Fyysiset esteet tai etäisyydet eivät estä populaation migraatiota Saimaalla. Järvi on kuitenkin rakenteeltaan sokkeloinen ja tämä voi rajoittaa eri lisääntymisalueiden välistä migraatiota (Valtonen ym. 2012). Saimaannorpan liikkumista on tutkittu muunmuassa radiolähettimien avulla. Aiempien tutkimusten perusteella kuutit näyttäisivät liikkuvat laajemmalla alueella kuin aikuiset norpat (Kunnasranta 2001, Niemi ym. 2012). Radiolähetintutkimusten perusteella aikuiset norpat liikkuvat tyypillisesti vain muutaman kilometrin säteellä (Kunnasranta 2001), kun taas kuutit voivat liikkua jopa 15 kilometriä päivässä ja niitä tavataan jopa 25 kilometrin päässä synnyinpaikastaan (Niemi ym. 2012). Saimaannorpan liikkumista pidetään kuitenkin vähäisenä mereisiin hylkeisiin verrattuna (Koskela ym. 2002). Saimaannorpan vähäinen liikkuvuus viittaa vahvasti paikkauskollisuuteen. Sukusiitoksella tarkoitetaan tilannetta, jossa keskenään pariutuvat yksilöt ovat keskenään enemmän sukua toisilleen kuin sattumanvaraisesti populaatiosta valitut yksilöt. Yksilöä voidaan pitää sukusiittoisena, mikäli sen vanhemmat ovat läheisempää sukua toisilleen kuin kaksi sattumanvaraisesti valittua yksilöä. Sukusiitos johtaa heterotsygoottien määrän vähenemiseen ja homotsygoottien määrän kasvamiseen populaatiossa. Sukusiitosta voidaan mitata sukusiitoskertoimella F IS. (Keller & Waller 2002). Pienissä populaatioissa sukusiitos voi johtaa kelpoisuuden (fitness) vähenemiseen. Kauan pieninä olleissa populaatioissa saattaa kuitenkin esiintyä vähemmän haitallisia alleeleja ja näin ollen tulevien pullonkaulavaiheiden geneettiset 16

seuraukset voivat olla pienempiä (Hedrick 1994). Pienissä populaatioissa sukusiitosta on vaikea välttää. Sukusiitosheikkous tarkoittaa kelpoisuuden tai elinkyvyn heikkenemistä sukusiitoksen seurauksena. Sukusiitosheikkous voi kohdistua joko yksilöön, tai koko populaatioon ja se voi johtaa pienentyneeseen populaatiokokoon ja jopa sukupuuttoon (Hedrick 2000). Saimaannorpalla sukusiitosheikkoutta ei ole ainakaan vielä havaittavissa yksilö- tai populaatiotasolla (Palo ym. 2003), mutta asiaa on tutkittu vasta vähän (Valtonen ym. 2012). 1.5. Tutkimuksen tarkoitus Tämän tutkimuksen ensisijainen tarkoitus on selvittää istukoiden sopivuutta saimaannorpan populaatiogeneettisiin tutkimuksiin. Tässä työssä käytetyt istukat toimitti Itä-Suomen yliopiston saimaannorppatutkimus. Tällaisia tutkimuksia ei ole ennen tehty saimaannorpalla eikä vastaavanlaista tutkimusta ole tehty muillakaan nisäkkäillä. Monilla nisäkkäillä on tapana syödä synnytyksen jälkeiset, istukka mukaan lukien, tai merinisäkkäiden tapauksessa istukat uppoavat liian syvälle, eikä niitä sen vuoksi voida hyödyntää tutkimuksissa. Istukoiden käyttäminen tässä tutkimuksessa antaa ainutlaatuisen mahdollisuuden saada eristettyä yhdestä näytteestä kahden eri yksilön DNA:t. Saimaa tarjoaa ihanteelliset olosuhteet norpan istukkatutkimukselle. Saimaannorppa tekee pesänsä usein rannan läheisyyteen, joten istukan talteenkerääminen onnistuu hyvin joko kahlaamalla tai sukeltamalla. Pro gradu tutkimukseni tarkoitus on myös selvittää saimaannorppanaaraiden pesäpaikkojen käyttöä geneettisen yksilöntunnistuksen avulla. Yksilöntunnistus tapahtuu saimaannorpan istukkanäytteistä. Irtoamisen yhteydessä istukkaan jää todennäköisesti myös emon kudosta, jolloin synnyttäneet naaraat voidaan mahdollisesti tunnistaa istukoista mikrosatelliittimarkkerien avulla. Kun näytteitä on kerätty samoilta paikoilta eri vuosina, voidaan niiden perusteella mahdollisesti selvittää naaraiden pesäpaikkauskollisuutta, liikkumista ja lisääntymismenestystä. Mikäli samoilta pesäpaikoilta löytyy eri vuosina saman naaraan istukka, voidaan puhua pesäpaikkauskollisuudesta. Emoyksilöiden lisäksi istukkatutkimuksella saatetaan saada tietoa myös kuuteista, esimerkiksi tietyn yksilön synnyinpaikka voidaan mahdollisesti varmistaa. Mikäli istukoista saadaan selville kuutin genotyyppi, voidaan sitä verrata esimerkiksi kuolleena löydetyn yksilön genotyyppiin. Mikäli yksilöt osoittautuvat samaksi, saadaan selville kyseisen yksilön synnyinpaikka ja tietoa sen dispersaalista, eli siirtymisestä syntymäpaikasta toiseen paikkaan. 17

Tutkimuksessa on kolme merkittävää tutkimuskysymystä: I) Saadaanko saimaannorpan istukasta eristettyä kuutin ja emon DNA:ta ja saadaanko niistä tehtyä toistettavasti yksilöiden mikrosatelliittigenotyypitys? II) Ovatko istukan eri kohdista tyypitetyt mikrosatelliittigenotyypit erilaisia ja mitkä näytteenottokohdat edustavat emoa ja mitkä kuuttia? III) Mikäli emon genotyypitys istukasta on mahdollista, tukevatko eri vuosina genotyypitettyjen istukoiden keräyspaikat teoriaa saimaannorppanaaraiden pesäpaikkauskollisuudesta? Oletuksena on, että saimaannorppanaarailla esiintyy pesäpaikkauskollisuutta. Tästä on jo tietoa koskien yksittäistapauksia (Helle ym. 1984, Sipilä 1990), mutta tieto ei ole vielä yleistettävissä. 18

2. Tutkimusmateriaali ja menetelmät 2.1. Tutkimusmateriaali Tutkimusmateriaalini koostui yhteensä 64 istukasta, jotka kaikki on kerätty 2000-luvulla. Istukoiden keruupaikat eri vuosina on esitetty kuvassa 2.1. Istukat kerättiin jäidenlähdön jälkeen, yleensä toukokuussa. Saimaannorppa synnyttää helmi-maaliskuussa eli istukka oli kerennyt olla järvenpohjassa 2-3 kuukautta ennen keräystä. Tällä oli vaikutusta istukkanäytteiden laatuun, sillä istukka mätänee helposti lämpenevässä vedessä. Istukoiden tehostettu kerääminen tapahtui Haukiveden ja Pihlajaveden alueilla vuosina 2009-2011. Nämä alueet ovat saimaannorpan keskeistä lisääntymisaluetta. Tehostetulla keräyksellä pyrittiin havaitsemaan sellaiset naaraat, jotka mahdollisesti pesivät peräkkäisinä vuosina samassa paikassa. Geneettiset analyysit suoritettiin niillä istukoilla, joista saatiin puhdas kuutin genotyyppi (kts. luku 2.6.2). Näitä istukoita oli yhteensä 55 kappaletta. Kuva 2.1. Istukoiden keruupaikat. Kartassa istukoiden keruupaikat on merkitty eri vuosina eri värein. 19

Jokaisesta istukasta pyrittiin mahdollisuuksien mukaan ottamaan neljä näytettä, joita kuvattiin kirjaimilla A-D; emonpuoleisesta osasta, joka on kohtua vasten (A), kuutinpuoleinen osasta (B), napanuorasta/suonesta (C) ja oranssista kiteymästä (D). Tuoreista istukoista otettiin lisäksi verinäyte (E). Oranssi kiteymä on verenkiertoperäistä jätettä, joka on kiteytynyt istukan pinnalle (van den Broek 1904). Reilusti yli puolessa C-näytteissä näytteenottokohta oli suoni tai suonikimppu, ei napanuora. Näissä tapauksissa napanuoraa ei ollut enää jäljellä tai se on ollut pilaantunut. Myöhemmin tekstissä näytteenottokohtaan C viitataan napanuoran kohtana. Näytteenottokohdista emonpuoleisen osan oletettiin edustavan emon kudosta, josta saataisiin puhdas emon DNA ja kuutinpuoleisen osan vastaavasti kuutin kudosta, josta saataisiin puhdas kuutin DNA. Näytteenotto istukan eri kohdista ei välttämättä eri kudoskerrosten ohuuden ja istukan laadun vuoksi onnistunut täydellisesti, minkä vuoksi joissain tapauksissa näytteeseen saattoi päätyä myös kudosta muistakin kuin halutusta kohdasta. Itä-Suomen yliopiston saimaannorppatutkimus toimitti istukkanäytteet Ouluun. Näytteitä oli yhteensä 244 kappaletta ja ne olivat kaikki sokkokoodattuja, joten laboratoriotöiden edetessä ei ollut tietoa mikä näyte on mistäkin istukasta. Näytteet olivat laadultaan erilaisia ja ne luokiteltiin kuuteen eri laatuluokkaan (taulukko 2.1). Noninvasiivisten näytteiden laatu on usein heikko ja tämä saattaa vaikuttaa genotyypitystuloksiin ja ilmenee genotyypitysvirheinä (Piggot & Taylor 2003). Taulukko 2.1 Istukkanäytteiden laatu. Laatuluokitus Määrä Tuore 10 Tuoreehko 42 Hieman mätä 22 Melko mätä 88 Mätä 69 Erittäin mätä 13 Yhteensä 224 Tutkimusmateriaaliin kuului lisäksi neljän kuutin genotyypitystiedot, joita käytettiin kontrollina istukkagenotyypityksessä. Kuuttien genotyypitettävät näytteet saatiin Itä-Suomen yliopiston saimaannorppatutkimuksen kudospankista. Emoista ei ollut saatavilla genotyypitystietoa. 20

2.2. DNA:n eristäminen näytteistä Istukkanäytteiden DNA eristettiin DNeasy Tissue eristyskitillä (Qiagen) Purification of Total DNA from Animal Tissues ohjeiden mukaisesti (DNeasy Tissue Handbook, March 2004). Jotta mahdolliset eristyksen aikana tapahtuneet kontaminaatiot havaittaisiin, tehtiin eristykset sarjoissa, joissa oli mukana aina vähintään yksi ilman kudosta oleva negatiivinen kontrolli. 2.3. Polymeraasiketjureaktio Polymeraasiketjureaktiolla (PCR) voidaan monistaa tutkittavan DNA-jakson määrää eksponentiaalisesti. Näin monistaminen onnistuu pienestäkin DNA-määrästä. Tässä tutkimuksessa DNA-jaksona käytetään mikrosatelliittilokuksen toistojaksoa, joka rajataan PCR:ssä molemmista päistä kahdella alukkeella, joiden emäsjärjestys on tunnettu. Monistuminen perustuu lämpötilan muutoksiin. PCR-seosta lämmittämällä saadaan alkuperäinen kaksijuosteinen DNA denaturoitumaan. Seoksen jäähdyttäminen saa alukkeet kiinnittymään nyt yksijuosteisiin molekyyleihin. Kun seosta kuumennetaan uudelleen sopivaan lämpötilaan, alkaa tietty DNApolymeraasi syntetisoida alukkeiden väliin jäävästä jaksosta uusia kopioita. Moneen kertaan toistettuna, synteesi tuottaa runsaasti DNA:ta (Tirri ym. 2006). 21

2.3.1. Tutkitut lokukset Tässä tutkimuksessa tutkittiin 11 polymorfista autosomaalista mikrosatelliittilokusta, jotka olivat kaikki dinukleotiditoistoja. Lokuksista seitsemän on alun perin kehitetty harmaahylkeelle (Halichoerus grypus), kolme kirjohylkeelle (Phoca vitulina) ja yksi leopardihylkeelle (Hydruga leptonyx). Lokukset on esitetty taulukossa 2.2. Taulukko 2.2 Käytetyt lokukset, alkuperäislaji, alukkeet, forward-alukkeen leima sekä lokusten kirjallisuuslähteet. Lokus Alkuperäislaji Forward-aluke, F & Reverse-aluke, R Leima Lähde Hg3.6 harmaahylje F: AGATCACATTCTTTTTATGGCTG R: GATTGGATAAAGAAGATGTAGGG Hg4.2 harmaahylje F: AATCGAAATGCTGAGCCTCC R: TGATTTGACTTCCCTTCCCTG Hg6.1 harmaahylje F: TGCACCAGAGCCTAAGCAGACTG R: CCACCAGCCAGTTCACCCAG Hg8.9 harmaahylje F: TGTTAACTATCTGGCACAGAGTAAG R:TTTCCTATGGGTTCTACTCTCAG Hg8.10 harmaahylje F: AATTCTGAAGCAGCCCAAG R: GAATTCTTTTCTAGCATAGGTTG Hgdii harmaahylje F: ACCTGCCATAGTGCTCATC R: AGGACTCCTGCCACGAGAA SGPv9 kirjohylje F: TAGTGTTTGGAAATGAGTTGGC R: CTGATCCTTGTGAATCCCAGC SGPv10 kirjohylje F: TTCACTTAAGCATAATTCCCTC R: TCATGAATTGGTATTAGACAAG SGPv11 kirjohylje F: GTGCTGGTGAATTAGCCCATTATAAG R: GTGCTGGTGAATTAGCCCATTATAAG SGPv16 kirjohylje F: TCTGAGAGATTCAGAGTAACCTTC R: AGCTAGTGTTAATGATGGTGTG Hl15 leopardihylje F: CATCTTGTAGTGCCAAAAAC R: ATCTTTCAGTTGACCCTTTC PET Allen ym. 1995 NED Allen ym. 1995 PET Allen ym. 1995 FAM Allen ym. 1995 VIC Allen ym. 1995 NED Allen ym. 1995 VIC Goodman 1997 VIC Goodman 1997 FAM Goodman 1997 & Gemmel ym. 1997 FAM Goodman 1995 NED Davis ym. 2002 & Twiss ym. 2006 2.3.2. PCR-seos ja tutkimuksessa käytetyt PCR-ohjelmat PCR-seokset valmistettiin 10 μl tilavuuteen, ja ne sisälsivät 1x PCR-puskuriliuosta (10x PCR Buffer II, Applied Biosystems), 1,75 mm MgCl 2 :a (Applied Biosystems), 1 mg/ml BSA:ta, 200 µm kutakin dntp-tä 0,4 µm kumpaakin aluketta, 0,6 U DNA-polymeraasientsyymiä (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) ja 1µ templaattia. 22

PCR-sarjoissa oli mukana myös yksi kontrolli, jossa templaatti-dna korvattiin vedellä mahdollisen kontaminaation havaitsemiseksi. PCR-seosten pipetoinnit suoritettiin jäähauteessa. Käytetyt PCRohjelmat on esitetty taulukossa 2.3. Vaiheiden 2-4 sykliä toistettiin 45 kertaa lokuksella Hg8.9, 43 kertaa lokuksilla Hl15 ja SGPv16 ja kaikilla muilla lokuksilla syklien määrä oli 40. Alukkeiden sitoutumislämpötila (annealing temperature) oli 51 C lokuksessa SGPv16, 53 C lokuksissa Hl15 ja Hg8.10, 55 C lokuksilla SGPv10 ja SGPv11, 58 C lokuksilla Hg3.6, Hg6.1, Hg8.9 ja Hgdii, 60 C lokuksessa SGPv9 sekä 61 C lokuksessa Hg4.2. Taulukko 2.3 Tutkimuksessa käytetyt PCR-ohjelmat. PCR-vaihe Lämpötila Kesto 1. Alkudenaturaatio 95 C 10 min 2. Denaturaatio 95 C 30 s 3. Alukkeiden sitoutuminen 51-61 C 30 s 4. Synteesi 72 C 1 min 5. Loppusynteesi 72 C 10 min 6. Jäähdytys 4 C 2.4. Agaroosigeelielektroforeesi PCR-reaktioiden onnistumista tarkasteltiin agaroosigeelielektroforeesilla. Menetelmä perustuu sähkövirtaan, joka mahdollistaa nukleiinihappojen erottelun niiden koon perusteella. Näytteen koko voidaan määrittää vertaamalla sitä ajossa mukana olevaan molekyylikokostandardiin (100 bp DNA Ladder, New England BioLabs). Agaroosigeeli valmistettiin liuottamalla 2 grammaa agaroosijauhetta (Fermentas) 100 millilitraan 0,5x TBE puskuria. Seosta kuumenettiin mikroaaltouunissa liukenemisen tehostamiseksi. Kuumentamisen jälkeen seos jäähdytettiin vesihanan alla 60 ºC:een, minkä jälkeen siihen lisättiin 2,5 μl etidiumbromidia jokaista 100 ml:aa kohden. Seos valettiin ajokelkkaan, jossa oli näytekaivomuotit. Geelin jähmettymisen jälkeen muotit poistettiin ja kelkka siirretiin ajolaitteeseen, joka sisälsi 0,5 x TBE-puskuriliuosta. Geelin kaivoihin pipetoitiin 3 μl PCR-tuotetta, johon oli sekoitettu 1 μl latauspuskuria. Geelirivien ensimmäisiin kaivoihin pipetoitiin 3 μl molekyylikokostandardia (100 bp DNA ladder, New England BioLabs) sekoitettuna 1 μl:aan latauspuskuria. Tämän jälkeen geeliä ajettiin ajolaitteessa 23

100 V:n jännitteellä noin tunnin ajan. Ajon tuloksia tarkasteltiin ultraviolettivalo-pöydällä, sillä etidiumbromidi fluoresoi UV-valossa. PCR-reaktion onnistuminen varmistettiin oikean kokoisesta juovasta geelillä. 2.5. ABI-fragmenttianalysointi ABI-fragmenttianalyysiä käytettiin yksilöiden mikrosatelliittialleelien tarkkojen pituuksien selvittämiseen. Tämä toteutettiin ABI PRISM 3730 DNA Analyzer laitteistolla (Applied Biosystems). Alukeparien Forward-alukkeet oli leimattu fluerisoivalla leimalla (ks. taulukko 2.2) alleelien koon selvittämiseksi ABI-fragmenttianalyysissä. Ajoa varten PCR-tuotteet laimennettiin steriilillä vedellä. Lokusten Hg3.6, Hg4.4, Hg6.1, Hgdii, SGPv10 ja SGPv11 PCR-tuotteet laimennettiin suhteessa 1:25, jolloin näytettä oli 1 μl ja steriiliä vettä 25 μl. Lokuksissa Hg8.9, SGPv16 ja Hg8.10 laimennossuhde oli 1:4,1, Lokuksessa Hl15 1:7 ja lokuksessa SGPv9 2:49. ABI-fragmenttianalyysin ajoseokseen pipetoitiin 2 µl PCR-laimennosta, 7,9 µl formamidia (Hi- Di Formamide, Applied Biosystems) ja 0,1 µl LIZ-kokostandardia (GeneScan -500 LIZ Size Standard, Applied Biosystems). Pipetoinnit suoritettiin jäähauteessa. ABI-fragmenttianalyysin tuloksia tulkittiin GeneMapper-ohjelmalla (GeneMapper Software, versio 4.0, Applied Biosystems), jonka avulla näytteet genotyypitettiin. Mikäli mikrosatelliittikäyrät olivat liian voimakkaita tai heikkoja, tehtiin joistakin PCR-tuotteista vahvemmat tai laimeammat laimennokset ja ne ladattiin uudelleen ABI:lle. 2.6. Genotyyppiaineiston analysointi 2.6.1. Genotyyppiaineiston tarkastaminen Genotyypitykset tehtiin aluksi automatisoidusti Genemapper-ohjelmalla, jonka jälkeen ohjelman tekemät genotyypitykset tarkastettiin ja mahdollisesti editoitiin silmämääräisesti. Näytteet olivat vielä tässä vaiheessa sokkokoodattuja. Kaikki näytteet genotyypitettiin yhden kerran. Näytteiden elektrofenorgammeissa oli nähtävissä viitteitä siitä, että joissakin näytteissä oli DNA:ta kahdesta eri yksilöstä. Esimerkiksi joidenkin näytteiden kohdalla tietyssä lokuksessa oli monistunut kolme eri alleelia. Joissakin näytteissä heterotsygoottisen lokuksen lyhyempi alleeli oli monistunut pitempää alleelia selvästi heikommin, mikä on epätavallista, sillä normaalisti lyhyempi alleeli 24

monistuu PCR:ssä tehokkaammin kuin pitempi alleeli. Tilanne jossa lyhyempi alleeli monistuu pitempää heikommin, voi syntyä kolmella tavalla: 1. Näyte sisältää DNA:ta yhdestä yksilöstä, mutta lyhyempi alleeli monistuu pitempää alleelia huonommin jostain kemiallisesta syystä., 2. Näyte sisältää kahden yksilön DNA:ta. Toinen yksilö on heterotsygootti ja toinen yksilö on homotsygootti pitemmän alleelin suhteen., 3. Näyte sisältää kahden yksilön DNA:ta, mutta eri mittasuhteissa. Kumpikin yksilö on homotsygootti. Lyhyemmän alleelin omaavan yksilön DNA:ta on näytteessä selvästi vähemmän kuin pidemmän alleelin yksilön omaavan DNA:ta. Elektrofenogrammeja läpi käytäessä kaikki sellaiset alleelit, joissa oli epäilys, että ne saattavat olla peräisin useammasta kuin yhdestä yksilöstä, merkittiin kysymysmerkillä. Myös kaikki epäselvät alleelit merkittiin kysymysmerkillä. Valmiista genotyyppiaineistosta selvitettiin kolmen tai useamman alleelin sekä epäselvien genotyyppien määriä näytteenottokohdittain. Epäselvällä genotyypillä tarkoitetaan tilannetta, jossa määritetty alleeli vaikuttaa epävarmalta. Tällöin myös määritetty genotyyppi on epävarma. Kolmen tai usemman alleelin kohdille, sekä epäselville alleeleille laskettiin prosenttiosuudet kussakin näytteenottokohdassa. Näin pyrittiin selvittämään, onko jossakin tietyssä näytteenottokohdassa enemmän mahdollista kahden yksilön DNA:n sekoittumista kuin muissa. Näin saatiin tietoa myös kunkin näytteenottokohdan luotettavuudesta. Nämä asiat testattiin myös khiin neliö-testillä. 2.6.2. Emon ja kuutin alleelit Genotyypityksen hankaluuden vuoksi oli tutkimuksen kannalta tärkeää määrittää, mitkä alleelit kuuluivat emolle ja mitkä kuutille. Tämän avulla selvitettiin voidaanko kuutin genotyyppi saada selville ja mikä näytteenottokohta antaa kuutin genotyypin luotettavimmin (kts. tulokset, kappale 3.1). Tätä varten neljä kuollutta kuuttia genotyypitettiin ja saatuja tuloksia verrattiin samalta pesäpaikalta kerättyjen istukoiden eri näytteenottokohtiin. Kaikki alla esitetyt analyysit on tehty nimenomaan tuloksiksi saaduilla kuuttigenotyypeillä. Kuuttigenotyypityksiä oli yhteensä 55 kappaletta. 25

2.6.3. Kytkentätasapaino Kytkentätasapaino on tilanne, jossa alleelit periytyvät toisistaan riippumatta, kytkentäepätasapaino taas tarkoittaa tilannetta, jossa eri lokusten tietyt alleelit periytyvät sattumanvaraisuutta useammin yhdessä. Kytkentä lokusten välillä voi johtua muunmuassa lokusten lähekkäisestä sijainnista, sukusiitoksesta tai valinnasta. Tässä tutkimuksessa käytettyjen lokusten kytkentää tutkittiin GENEPOP-ohjelmalla (versio 4.0.10., Raymond & Rousset 1995, Rousset 2008). Ohjelma käyttää Raymondin ja Roussetin (1995) Markovin ketjualgoritmia tehdessään uskottavuusosamäärätestit ja luo myös kontingenssitaulukot jokaiselle lokusparille. Lisäksi ohjelma laskee kytkentäepätasapainon lokuksille koko aineistossa. Seuraavia Markovin ketjun parametrejä käytettiin analyyseissä: dememorization number = 1000, number of batches = 100, number of iterations per batch = 10000. 2.6.4. Hardy-Weinbergin tasapaino, sukusiitoskerroin ja geneettinen monimuotoisuus Riittävän suuren ja sattumanvaraisesti pariutuvan populaation alleeli- ja genotyyppifrekvenssien oletetaan noudattavan Hardy-Weinbergin tasapainoa. Mahdolliset poikkeamat tästä tasapainosta voivat johtua esimerkiksi populaation pirstoutumisesta, pullonkaulasta tai geneettisestä ajautumisesta. HW-tasapainon selvittämisellä saadaan tietoa populaatioon vaikuttavista evolutiivisista tekijöistä. Aineiston HW-tasapainoa tutkittiin GENEPOP-ohjelmalla (versio 4.0.10, Raymond & Rousset 1995, Rousset 2008). Testaamiseen käytettiin tarkkaa HW-testiä (todennäköisyystesti). Markovin ketju-algoritmia käytettiin harhattomien p-arvojen arvioimiseen. Analyyseissä käytettiin seuraavia Markovin ketjun perametrejä: dememorization number = 1000, number of batches = 1000, number of iterations per batch = 10000. Sukusiitoksen määrää aineistossa selvitettiin GENETIX-ohjelman avulla (versio 4.03, Belkhir ym. 2004). Ohjelma laskee sukusiitoskertoimen (F IS ) ja sen 95 % vaihteluvälin ja tuhannella bootstraptoistolla. Sukusiitoskertoimen positiivinen arvo ilmaisee homotsygoottien ja negatiivinen heterotsygoottien ylimäärää populaatiossa. Geneettisen muuntelun määrää tutkittiin laskemalla aineistolle odotettu ja havaittu heterotsygotia GENETIX-ohjelman avulla (versio 4.03, Belkhir ym. 2004). Lisäksi havaittujen alleelien lukumäärä määritettiin Fstat-ohjelmalla (versio 2.9.3.2, Goudet 1995). 26

2.6.5. Sisar- ja sisarpuoliparit ja yksilöntunnistuksen todennäköisyys Aineisto sisältää istukoita kolmen vuoden ajalta, joten sisar- tai sisarpuoliparit saattavat olla mahdollisia. Lisäksi aineistossa on mukana vuonna 2009 syntyneiden kuuttikaksosten istukat, joita voidaan käyttää kontrollina sisaruuden määrityksessä. Sisaruussuhteet määritettiin Colonyohjelmalla (versio 2.0.3.5, Jones & Wang 2010) joka määrittää sekä täys-, että puolisisaret. Aineistolle laskettiin myös yksilöntunnistuksen todennäköisyys GenAlEx-ohjelmalla (versio 6.5, Peakall & Smouse 2006, Peakall & Smouse 2012). Näin saatiin todennäköisyys sille, että populaatiosta genotyypitetyt kaksi yksilöä omaisivat sattumalta saman genotyypin. Tämän tiedon avulla voidaan tehdä päätelmiä yksilöntunnistuksen luotettavuudesta tässä tutkimuksessa. 27

3. Tulokset 3.1. Emon ja kuutin alleelit Taulukosta 3.1 nähdään kunkin neljän yksilön genotyypitysten täydelliset vastaavuudet istukan genotyypityksiin kussakin näytteenottokohdassa 11:ssa käytetyssä lokuksessa. Taulukosta voidaan havaita, että napanuoran kohdassa kolmen yksilön genotyypit vastasivat täysin istukasta saatua genotyyppiä jokaisessa 11 lokuksessa ja neljäskin yksilö vastasi istukan genotyyppiä täysin yhdeksässä lokuksessa. Toisessa jäljelle jääneistä lokuksista näyte gonotyypitettiin homotsygootiksi kuutin ollessa heterotsygootti ja toisessa genotyypitys oli sama kuin kuutilla, mutta toinen alleeleista oli epävarmaksi tulkittu (kts. liite II). Huonoimmat vastaavuudet esiintyvät oranssissa kiteymässä. Tulosten pohjalta voitiin päätellä, että kuutin genotyyppi saadaan parhaiten istukan näytteenottokohdasta C eli napanuoran kohdasta. Liitteessä I on esitetty istukan numero 87 näytteenottokohtien ja samasta pesästä löytyneen kuutin elektroferogrammien vertailu lokuksittain. Liitteestä nähdään hyvin C-näytteenottokohdan hyvät vastaavuudet kuuttiin verrattuna. Liitteessä II on lisäksi eriteltynä jokaisen neljän yksilön genotyypitykset verrattuna vastaavien istukoiden genotyypityksiin. Taulukko 3.1 Neljän kuutin genotyypitysten vastaavudet istukan genotyypityksiin kussakin näytteenottokohdassa 11:ssa käytetyssä lokuksessa. Näytteenottokohta Emonpuoleinen Kuutinpuoleinen Napanuoran kohta Oranssi kiteymä osa osa Yksilö 1 7 6 11 3 Yksilö 2 8 11 11 4 Yksilö 3 5 5 9 7 Yksilö 4 8 7 11 2 Istukkan napanuoran kohdasta saadaan luotettavasti selville kuutin genotyyppi. Istukkaa voidaan siis käyttää kuutin genotyypin saamiseksi ja sen pohjalta selvittää esimerkiksi kuolleena tavatun yksilön syntymäpaikka vertaamalla kuolleen yksilön genotyyppiä istukan genotyyppiin. Emoista ei ollut saatavilla kontrolliyksilöitä, joten emojen alleeleista ei saatu luotettavaa tietoa. Tässä tutkimuksessa emon DNA:ta ei siis saatu eristettynä puhtaana, joten pesäpaikkauskollisuuden määrittäminen näillä menetelmillä ei onnistu. Myöskään sopivaa näytteenottokohtaa, joka antaisi emon puhtaan DNA:n, ei löydetty. 28

Hardy-Weinbergin tasapainosta eteenpäin kaikki alla esitetyt tulokset on saatu käyttämällä ainoastaan napanuoran kohdan aineistoa. 3.2. Genotyyppiaineiston tarkastaminen Taulukoista 3.2 ja 3.3 nähdään tulokset useiden alleelien ja epäselvien genotyypitysten kohdalta. Taulukoissa esitellään epäselvät genotyypitykset/useat alleelit, genotyypitysten kokonaismäärät sekä prosenttiosuudet kullekin näytteenottokohdalle. Taulukko 3.2 Useiden alleelien määrät ja prosenttiosuudet näytteenottokohdittain. Useita alleeleja Kaikki genotyypitykset Prosenttiosuus Emonpuoleinen osa 23 657 3,5% Kuutinpuoleinen osa 12 726 1,7% Napanuoran kohta 6 671 0,9% Oranssi kiteymä 12 627 1,9% Verinäyte 0 44 0% Taulukko 3.3 Epäselvien genotyypitysten määrät ja prosenttiosuudet näytteenottokohdittain. Epäselvät genotyypitykset Kaikki genotyypitykset Prosenttiosuus Emonpuoleinen osa 135 657 20,5% Kuutinpuoleinen osa 87 726 12% Napanuoran kohta 43 671 6,4% Oranssi kiteymä 101 627 16,1% Verinäyte 5 44 11,4% Edellisissä taulukoissa olevat tiedot testattiin myös khiin neliö-testillä. Testissä määritetään khiin neliö-todennäköisyysjakaumasta p-arvo, joka kertoo kuinka todennäköisesti saadaan havaitun suuruinen tai vielä suurempi khiin neliö-testimuuttujan arvo ilman eroa tai riippuvuutta perusjoukossa. Mitä pienempi p-arvo on, sitä enemmän eron tai riippuvuuden yleistäminen perusjoukkoon saa tukea. Alle 0,05 (5%) suuruista p-arvoa voidaan pitää tilastollisesti merkittävänä perusjoukossa olevan eron tai riippuvuuden osoittajana. Tätä suuremmat p-arvot viittaavat yleensä otantavirheeseen (Mantel 1963). Khiin neliö-testin tulokset on esitetty taulukossa 3.4. Näytteenottokohdat on merkitty kirjaimin A-E; A = emonpuoleinen osa, B = kuutinpuoleinen osa, C = napanuoran kohta, D = oranssi kiteymä ja E = verinäyte. 29

Taulukko 3.4 Khiin neliö-testin tulokset näytteenottokohdittain. Havaitut lukumäärät A B C D E Yhteensä Selvät genotyypitykset 4 19 31 6 0 60 Yli 2 alleelia 15 5 4 8 0 32 Muuten epäselvät genotypitykset 40 42 26 43 4 155 Yhteensä 59 66 61 57 4 247 Odotetut lukumäärät A B C D E Yhteensä Selvät genotyypitykset 14,3 16,0 14,8 13,8 1,0 60 Yli 2 alleelia 7,6 8,6 7,9 7,4 0,5 32 Muuten epäselvät genotypitykset 37,0 41,4 38,3 35,8 2,5 155 Yhteensä 59 66 61 57 4 247 χ2 = 48,67, df = 8, p = 0,000 Taulukoista voidaan havaita, ettei epäselviä genotyypityksiä tai useita alleeleja tule yhtä paljon suhteessa näytemäärään kussakin näytteenottokohdassa. 3.3. Hardy-Weinbergin tasapaino, kytkentätasapaino, sukusiitoskerroin ja geneettinen monimuotoisuus Aineiston ei havaittu noudattavan Hardy-Weinbergin tasapainoa (χ2 = 39,71, df = 18,00, p = 0,0023). Kytkentäepätasapainoa havaittiin lokusten Hg8.9 ja Hl15 (p 0,01), Hl15 ja SGPv9 (p 0,03) sekä SGPv16 ja SGPv9 (p 0,01) välillä. Aineistolle suoritettiin Ŝidák-korjaus (Ŝidák 1968, 1971), joka korjaa p-arvot vastaamaan alkuperäistä tilastollista merkitsevyystasoa (0,05) monivertailuja tehtäessä. Korjauksen jälkeen minkään lokusparin välillä ei esiintynyt enää merkittävää kytkentäepätasapainoa. Taulukosta 3.5 nähdään aineiston odotetut ja havaitut heterotsygotiat, alleelien lukumäärät sekä sukusiitoskertoimet lokuksittain. Koko aineistossa odotettu heterotsygotia oli korkeampi kuin havaittu heterotsygotia. Sukusiitoskerroin oli koko aineistossa lievästi positiivinen, mutta arvo ei kuitenkaan ole tilastollisesti merkitsevä. Alleelien lukumäärä vaihteli yhdestä alleelista kymmeneen alleeliin. Eniten alleeleja havaittiin lokuksessa Hl15 (10 kpl) ja vähiten lokuksessa Hg6.1 (1 kpl). 30