Juha Kere ÄYRÄPÄÄN LUENTO 2011 Perimän lukemisesta luetun ymmärtämiseen Lääketieteen tutkimusmenetelmät ovat kehittyneet nopeasti viime vuosikymmeninä, ja yhä kiihtyvä kehitys näyttää jatkuvan vailla merkkiä vauhdin taittumisesta. Erityisesti geeneihin ja ihmisen perimään, genomiin, kohdistunut tutkimus on räjähdysmäisessä kasvussa. Milloinkaan ennen ei tietokantoihin ole ladattu yhtä paljon uutta DNA-sekvenssitietoa kuin tällä viikolla, ja ensi viikolla tehdään jälleen uusi ennätys. Esimerkiksi nopeasta kehityksestä käy tutkimuksemme, jossa etsimme anhidroottisen ektodermaalisen dysplasian (EDA) geeniä 1990-luvun alkupuolella. Tuolloin perimää ei tietysti vielä tunnettu, vaan geenin etsintään kuului useita työläitä vaiheita kiinnostavan kromosomialueen kartoittamiseksi ja koodaavien alueiden löytämiseksi. Aloitimme hankkeen vuonna 1991 ja saatoimme lopulta julkistaa geenilöydöksen vuonna 1996 koko työ kesti siis noin viisi vuotta (Kere ym. 1996). Nykyisin samaan tavoitteeseen pääsemiseksi riittäisi noin kahden viikon työ ja se perustuisi koko perimän kaikkien geenien (eksomin) suoraan DNA-sekvensoitiin 5 10 potilaalta (kuva 1). Genomitutkimuksen vuosikymmenet Viimeksi kuluneita paria vuosikymmentä voidaan hyvällä syyllä kutsua genomitutkimuksen vuosikymmeniksi (kuva 2). 1990-luvun alkaessa ihmisen koko perimän sekvensointiin pyrkinyt kansainvälinen projekti Human Genome Project käynnistyi, koko ihmisen perimän kattava geneettinen kytkentäkartta oli saatu valmiiksi, ja geenikytkentä yleistyi EDA-geenin löytäminen Näin se tapahtui 1991: Kromosomikävely YAC-kloonien avulla, CpG-saarekkeiden paikantaminen 1993: CpG-saarekkeiden kloonaus, oikean saarekkeen tunnistaminen 1995: Ensimmäinen cdna-kloonin tunnistaminen, geenin rakenteen selvitys 1996: Mutaatioiden tunnistus Kuinka se tehtäisiin nykyään Päivä 1: 5 10 potilasnäytteen valinta Päivä 2: Eksomin sekvensointi alkaa Päivä 14: Mutaatioiden listaus kaikkien potilaiden kaikista geeneistä, kaikille yhteisen mutatoituneen geenin tunnistus Kuvassa kolmentoista kuukauden ikäinen poika, jolla on EDA. Hänellä on harvat, ohuet hiukset, kulmakarvat puuttuvat, silmänaluset tummat, eteenpäin työntyvä otsa ja kuiva iho. Hampaat ovat puhkeamatta. (Kere ym. Nat Genet 1996;13:409) Kuva 1. Anhidroottisen ektodermaalisen dysplasian (EDA) geenin tutkimusmenetelmien kehitys. 1607 = Toimitus suosittelee erityisesti opiskelijoille Duodecim 2011;127:1607 11
ÄYRÄPÄÄN LUENTO 2011 1608 Genomitutkimuksen vuosikymmenet 1990-luku Human Genome Project Koko perimän kattava kytkentäkartta Monogeenisten sairauksien geenipaikannus ja geenien kloonaus 2000-luku Ihmisen perimä sekvensoitiin (emäsjärjestys selvitettiin) Geenipaikannus monitekijäisissä sairauksissa (astma ym.) HapMap-projekti ja genominlaajuiset assosiaatiotutkimukset Mikrosirutekniikat (SNP:t ja geenien ilmentymisen mittaus) 2010-luku Satoja genominlaajuisia assosiaatiotutkimuksia toteutettu Suurimittakaavaisen DNA-sekvensoinnin kehittäminen Yksilöllinen perimän sekvensointi, 1 000 Genomes Project Geenien toiminnan tutkimus, solun säätelyverkot Kuva 2. Genomitutkimuksen vuosikymmenet. menetelmäksi paikantaa ja lopulta tunnistaa tautigeenejä yhden geenin aiheuttamissa (monogeenisissa) sairauksissa. Suomessa ensimmäiset geenipaikannukset suomalaisen tautiperinnön taudeissa tehtiin jo 1990: diastrofinen dysplasia Albert de la Chapellen laboratoriossa ja juveniili neuronaalinen seroidilipofuskinoosi Leena Palotien laboratoriossa. 2000-luvun alkupuolella koko ihmisperimän sekvenssi julkaistiin. Geenipaikannusta yritettiin myös lukuisissa monitekijäisissä sairauksissa, jotka johtuvat osittain sekä geenien että ympäristön vaikutuksista. Tässä onnistuttiin kuitenkin vain rajallisesti. 2000-luvun alussa käynnistettiin HapMap-projekti, jossa pyrittiin luetteloimaan mahdollisimman monta ihmisväestöissä tavallista monimuotoista (polymorfista) kohtaa ja selvittämään niiden avulla perimän hienorakennetta. Tuolloin kehitettiin myös mikrosiruihin perustuvat genotyyppausmenetelmät, jotka suurelta osin pohjautuivat HapMap-projektin tuloksiin. 2010-luvulle tultaessa genominlaajuisista assosiaatiotutkimuksista on tullut uusi menestystarina monitekijäisten tautien geenivaikutusten tunnistamisessa (www.genome.gov/ GWAStudies). Kehityksen edetessä myös mikrosirumenetelmät ovat kuitenkin vähitellen korvautumassa uuden sukupolven DNA-sekvensointitekniikoilla. Ne ovat mahdollistaneet myös nopean, noin viikossa yhdellä laitteella tapahtuvan yksilöllisen perimän sekvensoinnin. Tutkimuksen painopiste on vähitellen siirtymässä yksittäisten geenivaikutusten tunnistamisesta geeniverkkojen toiminnan ymmärtämiseen. Odottamaton ilmiö: selittämätön periytyminen Tutkimus ei ole edennyt aivan yllätyksittä. Yksi suurimmista ja edelleen selittämättömistä havainnoista on ollut se, että toisin kuin odotettiin, koko perinnöllisyyden osuutta ei olekaan voitu helposti paikantaa perimään genominlaajuisten assosiaatiotutkimusten avulla. Esimerkiksi tästä sopii pituuskasvun geenitutkimus. Aikuispituus on voimakkaasti perinnöllinen ominaisuus: siinä perinnöllisyyden osuuden on kaksos- ja perhetutkimusten avulla arvioitu olevan 80 90 %. Juuri tästä syystä kasvukäyrien ja vanhempien pituustietojen avulla on mahdollista ennustaa lapsen loppupituus senttimetrien tarkkuudella. Pituuskasvun säätelyn on myös kauan otaksuttu määräytyvän useiden, jopa kymmenien ellei satojen, geenien perusteella. Niiden kaikkien tunnistamiseksi on viime vuosina julkaistu monia usean kymmenen tuhannen osanottajan genominlaajuisia geenitutkimuksia, joiden pohjalta on jo onnistuttu paikantamaan toista sataa pituuskasvuun vaikuttavaa geeniä. Kunkin geenin vaikutus on yksinään vähäinen, mutta yhteen laskienkin kaikkien tunnistettujen geenien vaikutus jää kauas odotetusta, ehkä vain noin puoleen perinnöllisyyden odotetusta kokonaisosuudesta. Vaikka tiedämme, että ilmiasussa näkyvä ominaisuus on perinnöllinen ja riippuu monesta geenistä, jotka kaikki sijaitsevat perimässä, emme onnistukaan nykyodotusten mukaisesti löytämään niitä kaikkia. Tämä piilossa oleva periytyvyys on johtanut uuden käsitteen syntyyn. Nyt puhutaan perimän pimeästä aineesta (dark matter of inheritance), selittämättömästä periytymisestä. Kosmologinen käsitelaina viittaa tietysti J. Kere
avaruudessa esiintyviin valtaviin massakeskittymiin, joiden luonne on yhä tuntematon. Näyttää siis siltä, että osaa periytyvyydestä ei voidakaan helposti selittää millään perimän monimuotoisilla kohdilla. Toistaiseksi esitetään vain hypoteeseja tämän periytymismekanismin luonteesta. Näihin malleihin kuuluvat muun muassa ympäristötekijöiden aiheuttamat yhteisvaikutukset, niin sanotut epigeneettiset muutokset, ja tavallisten allee lien aiheuttamat yhteisvaikutukset varsinaisten riskimuotojen kanssa. Tutkimusta siis tarvitaan jopa perinnöllisyyden kaikkien perusmekanismien ymmärtämiseksi. Yhä lisää DNA-sekvenssiä DNA:n sekvensoinitekniikoiden kehitys on vailla vertailukohtaa teknologiassa. 2000-luvun ensimmäisellä vuosikymmenellä sekvensoinnin hinta luettua emästä kohti on laskenut jopa kymmentuhatkertaisesti. Muutos perustuu uuden sukupolven sekvensointitekniikoiden kehittämiseen. Kun tyypillinen kapillaarisekvensointilaite joita käytettiin satoja, kun ihmisgenomi alun perin sekvensoitiin ensimmäisen kerran tuotti parhaimmillaan yhdellä ajokerralla noin 100 000 emäksen verran sekvenssiä, tuottaa yksi tyypillinen nykyaikainen laite noin 100 000 000 000 emästä eli noin 30 kertaa ihmisgenomin verran. Laitteiden yleistyminen lukuisiin tutkimuslaboratorioihin on samalla johtanut siihen, että tietokantoihin tallennettavan DNA-sekvenssin määrä on kasvamassa räjähdysmäisesti. Bioinformatiikkaa osaaville tutkijoille on kasvava kysyntä. DNA-sekvensointia käytetään nykyisin myös moniin muihin sovelluksiin kuin vain perimän rakenteen selvittämiseen. Esimerkiksi geenien ilmentymisen tutkimisessa cdnamolekyylien suora sekvensointi on nopeasti syrjäyttämässä mikrosiruperustaiset menetelmät. Suoralla sekvensoinnilla on monia etuja: Menetelmä ei ole riippuvainen koettimien suunnittelusta, vaan kaikki cdna-molekyylit ovat sekvensoinnin kohteina. Sekvenssin perusteella ilmentyvä geeni on tarkemmin tunnistettavissa kuin hybridisaatioperustaisissa mikrosiruanalyyseissa. Lisäksi lukumäärältään harvinaisetkin cdna-molekyylit on mahdollista havaita, toisin kuin valosignaaliin perustuvissa mikrosirutekniikoissa. Menetelmä on erittäin toistettava ja kvantitatiivinen, kun valosignaalin mittauksen asemesta voidaan suoraan vertailla toisiinsa kunkin geenin transkriptien lukumääriä kymmenien miljoonien tunnistettujen transkriptien joukossa. Lisäksi cdna:n suoralla sekvensoinnilla voidaan kerätä tietoa geenien vaihtoehtoisesta silmukoinnista ja promoottorikohdista. Uudet sekvensointitavat ovat myös erittäin herkkiä. On julkaistu menetelmiä jopa yksittäisten solujen transkriptomin tutkimiseen, ja olemme omassa laboratoriossamme toistaneet onnistuneesti tällaisen menetelmän toimivuuden. Tarkennamme aiempia mikrosirututkimuksiamme (Zhang ym. 2009) ja sovellamme yksittäisten solujen ilmentämien geenien sekvensointia muun muas sa sen ymmärtämiseen, miten ihmisalkio kehittyy ensimmäisen viiden vuorokauden aikana ennen implantaatiota munasolusta blastokystivaiheeseen. Mitkä geenit säätelevät koko varhaiskehitysohjelman käynnistämistä? Tutkimus etenee yhä enemmän geenien toiminnan, geenien välisten säätelyverkkojen ja niin sanotun systeemibiologian suuntaan. Nykyisin on hyvin perusteltua puhua paitsi valkuaisaineiden välisistä vaikutuksista, myös suoraan geenien välisestä säätelystä, sillä tiedämme nyt suuren osan RNA-molekyyleista olevan ei-koodaavia ja vaikuttavan suoraan muiden geenien toimintaan. Samoin voimme yhdistää aiemmin täysin erillisiä tutkimusalueita: tutkimme nyt geeneissä olevan monimuotoisuuden vaikutusta aivotoimintoihin yhdistämällä genotyypityksen toiminnalliseen aivokuvantamiseen. Aiemmin löysimme ensimmäiset tunnetut lukihäiriölle altistavat geenit (Taipale ym. 2003, Hannula-Jouppi ym. 2005, Schumacher ym. 2006) ja nyt olemme edenneet tutkimaan sitä, miten ne ja muut geenit vaikuttavat aivojen biokemiaan ja neurobiologiaan ja miten esimerkiksi aivojen eri alueiden aktivaatio näkyy toiminnallisessa magneettikuvauksessa koehenkilöiden suorittaessa muistitehtäviä (Söderqvist ym. 2010). 1609 Perimän lukemisesta luetun ymmärtämiseen
ÄYRÄPÄÄN LUENTO 2011 1610 Mitä hyötyä geenitutkimuksesta on lääkärille? Geenitutkimus tai ehkä pikemminkin geenitutkijat ovat luvanneet paljon tulevaisuuden lääketieteelle. Usein kuitenkin sanotaan lupaus ten jääneen vaille katetta. Näin arvioitaessa syyllistytään kuitenkin helposti mittakaavavirheeseen. Suuret muutokset eivät tapahdu hetkessä, vaan on maltettava odottaa, että uusi tieto ehtii vaikuttaa läpi koko järjestelmän. Tähän mennessä geenitutkimustulokset ovat täsmentäneet monien harvinaisten perinnöllisten sairauksien diagnostiikkaa, esimerkkeinä kaikki suomalaisen tautiperinnön sairaudet, kystinen fibroosi, Duchennen lihasdystrofia, fragiili X -oireyhtymä (särö-x-oireyhtymä) ja monet periytyvät syövät. Kliinisessä käytössä on yksi lääke, jonka keksintöhistoria on kokonaisuudessaan geenitutkimukseen nojaava: imatinibi, jolla hoidetaan kroonista myelooista leukemiaa (KML). KML:ssä havaittiin aikanaan erikoinen markkerikromosomi, Philadelphia-kromosomi, jonka sittemmin oivallettiin johtuvan kromosomien 9 ja 22 translokaatiosta. Kromosomikatkoskohdat paikannettiin geenitekniikan menetelmin ja paikkaa vaihtaneiden kromosomien yhteenliittymisen osoitettiin tuottavan muuttuneen BCR/ABL-tyrosiinikinaasigeenin, joka sääteli patologisesti solujen kasvua. Philadelphia-kromosomi havaittiin vuonna 1960, kromosomien 9 ja 22 translokaatio tunnistettiin 1973, ja osallisina olevat geenit 1982. Sopiva tyrosiinikinaasin estäjä löytyi 2001, ja lääkkeeksi imatinibi hyväksyttiin vielä samana vuonna. Aika perushavainnosta lääkkeeksi vei siis yli 40 vuotta tai geenihavainnosta laskettuna vajaat 20 vuotta. Olennaista mielestäni on, että samantapaisia geenihavaintoja on tiedossamme nyt jo kymmenittäin, ja ne voivat toimia uuden lääkekehityksen kohteina. Esimerkiksi G-proteiinireseptorien geenejä on perimässämme noin 400, ja niistä edelleen suurin osa on fysiologiselta toiminnaltaan tuntemattomia. Yksi vasta hiljattain tunnistetuista on NPSR1, jonka kuvasimme alun perin astman alttiusgeeninä. Nykyisin se on tunnettu uuden neuropeptidin, neuropeptidi S:n, reseptorina (Laitinen ym. 2004). Tutkimus on etenemässä rinnakkain NPS-agonistien ja antagonistien löytämiseksi ja kaikkien tämän signalointijärjestelmän fysiologisten tehtävien tunnistamiseksi. Apteekissa saatavilla olevista lääkeaineista jopa joka toisen on sanottu vaikuttavan erilaisten tunnettujen G-proteiinireseptorien kautta. Monet G-proteiinireseptorigeenit odottavat vielä lääketieteellisiä sovelluksia. Tautien väestöseulontaan toistaiseksi löydetyistä alttiusgeeneistä ei ainakaan vielä ole. Tunnetut geenit ovat riskivaikutuksiltaan heikkoja, ja huomattava osa tautien periytyvästä osuudesta on yhä näkymättömissä. Vaikka kaupalliset toimijat ovat nopeasti aistineet markkinaraon jopa genominlaajuisille kartoituksille, olemme tulosten tulkinnassa vielä liian aikaisessa vaiheessa voidaksemme pitää tulkintoja muuta kuin lähinnä viihteellisinä. Tulevaisuudennäkymiä Tulevaisuudessa voidaan kuitenkin odottaa, että jopa genominlaajuinen yksilöllinen DNAsekvensointi on riittävän halpaa ja samalla kertyvät tulokset helpottavat niiden kliinistä tulkintaa (kuva 3). Vuoden 2011 alkaessa perimänlaajuisen yksilöllisen sekvensoinnin reagenssikulut ovat noin 10 000 euroa, mut- Hinta/genomi 100 k 10 k 1 k 0,1 k Diagnostinen hyöty 2010 201X 20XX Aika Suuri Pieni Kuva 3. Tulevaisuudessa voidaan odottaa, että jopa genominlaajuinen yksilöllinen DNA-sekvensointi on riittävän halpaa ja samalla kertyvät tulokset helpottavat niiden kliinistä tulkintaa. J. Kere
ta kesään mennessä se oli laskenut alle 4 000 euron, eikä 1 000 euron hinta ole enää kovin monen vuoden päässä. Jossain vaiheessa saavutamme pisteen, jossa kliininen käyttö tulee mielekkääksi, alkaen ehkä syöpätaudeista. DNA-tutkimukset tulevat osaksi laboratoriotutkimuksia, ja käytämme sitten niitä yhdessä perinteisempien verinäytteistä tehtävien proteiini- ja metaboliittimittauksien kanssa. Samaan aikaan koemme lääkekehityksen renessanssin, joka perustuu imatinibin tapaan molekylaaristen mekanismien tarkkaan tuntemukseen. Tulevan 50 vuoden kehitys on varmasti hämmästyttävämpi kuin viimeksi kuluneen 50 vuoden kehitys on ollut. JUHA KERE, professori Karolinska Institutet,institutionen för biovetenskaper och näringslära Hälsovägen 7, 14183 Huddinge, Ruotsi ja Helsingin yliopisto ja Folkhälsans Genetiska Institut Sidonnaisuudet Ei sidonnaisuuksia KIRJALLISUUTTA Hannula-Jouppi K, Kaminen-Ahola N, Taipale M, ym. The axon guidance receptor gene ROBO1 is a candidate gene for developmental dyslexia. PLoS Genetics 2005;1:e50. Kere J, Srivastava AK, Montonen O, ym. X-linked anhidrotic (hypohidrotic) ectodermal dysplasia is caused by mutation in a novel transmembrane protein. Nature Genet 1996;13:409 16. Laitinen T, Polvi A, Rydman P, ym. Characterization of a common susceptibility locus for asthma-related traits. Science 2004;304:300 4. Schumacher J, Anthoni H, Dahdouh F, ym. Strong genetic evidence of DCDC2 as a susceptibility gene for dyslexia. Am J Hum Genet 2006;78:52 62. Söderqvist S, McNab F, Peyrard-Janvid M, ym. The SNAP25 gene is linked to working memory capacity and maturation of the posterior cingulate cortex during childhood. Biol Psychiatry 2010; 68:1120 5. Taipale M, Kaminen N, Nopola-Hemmi J, ym. A candidate gene for developmental dyslexia encodes a nuclear tetratricopeptide repeat domain protein dynamically regulated in brain. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:11553 8. Zhang P, Zucchelli M, Bruce S, ym. Transcriptome profiling of human preimplantation development. PLoS One 2009;4:e7844. 1611