TYYPIN II TRANSMEMBRAANISTEN SERIINIPROTE- AASIEN HEPSIININ JA TMPRSS3:N MATALA ILMENTY- MINEN ON YHTEYDESSÄ HUONOON RINTASYÖVÄN EN- NUSTEESEEN

TYYPIN II TRANSMEMBRAANISTEN SERIINIPROTE- AASIEN HEPSIININ JA TMPRSS3:N MATALA ILMENTY- MINEN ON YHTEYDESSÄ HUONOON RINTASYÖVÄN EN- NUSTEESEEN Mikko Pelkonen Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos / Kliininen patologia ja oikeuslääketiede Toukokuu 2016

2 Tämä on suomenkielinen raportti BMC Cancer -lehdessä 27.5.2015 julkaistusta artikkelista: Low expression levels of hepsin and TMPRSS3 are associated with poor breast cancer survival BMC Cancer, 2015, Volume 15, Number 1, Page 1 Mikko Pelkonen, Kaisa Luostari, Maria Tengström, Hermanni Ahonen, Bozena Berdel, Vesa Kataja, Ylermi Soini, Veli-Matti Kosma, Arto Mannermaa

3 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta [Tiivistelmä] Lääketieteen laitos Lääketieteen koulutusohjelma PELKONEN, MIKKO: Tyypin II transmembraanisten seriiniproteaasien hepsiinin ja TMPRSS3:n matala ilmentyminen on yhteydessä huonoon rintasyövän ennusteeseen Opinnäytetutkielma, 40 sivua Tutkielman ohjaajat: apulaisprofessori Arto Mannermaa ja FM Kaisa Luostari Toukokuu 2016 Hepsiini (TMPRSS1) ja TMPRSS3 ovat tyypin II transmembraanisia seriiniproteaaseja (TTSP), joilla on merkitystä syövän etenemisessä. TTSP:t voivat muokata solunulkoista väliainetta, ja niiden säätelyn häiriintyessä ne voivat edistää syöpäkasvainten kehitystä ja syöpäsolujen metastasointia vaurioittamalla tyvikalvoa ja solunulkoisen väliaineen molekyylejä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin hepsiinin ja TMPRSS3:n mrna- ja proteiini-ilmentymistasojen yhteyttä rintasyövän kliinisiin muuttujiin ja elinaikaan. Tutkimme immunohistokemiallisen värjäytymisen avulla hepsiinin ilmentymistä 372 rintasyöpänäytteessä ja TMPRSS3:n ilmentymistä 373 rintasyöpänäytteessä. TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen määritettiin 125 invasiivisessa ja 16 hyvänlaatuisessa rintakasvaimessa ja TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen 167 invasiivisessa ja 23 hyvänlaatuisessa rintakasvaimessa. Geeni- ja proteiini-ilmentymistasoja verrattiin rintasyövän kliinisiin muuttujiin ja rintasyöpäspesifiin eloonjääntiin. Matala TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen oli itsenäinen huonon rintasyövän ennusteen riskitekijä 20 seurantavuoden aikana (TMPRSS1, P = 0,023; HR, 2,065; 95 % CI, 1,106 3,856; TMPRSS3, P = 0,013; HR, 2,106; 95 % CI, 1,167 3,800). Tutkittujen geenien matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen oli yhteydessä huonompaan eloonjääntiin korkeaan ilmentymiseen verrattuna (log rank P-arvot 0,015 0,042). Matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen oli myös itsenäinen huonon ennusteen riskitekijä sädehoidettujen rintasyöpäpotilaiden keskuudessa (P = 0,034; HR, 2,344; 95 % CI, 1,065 5,160). Molempien geenien matala mrna- ja proteiini-ilmentymistaso oli yhteydessä gradus III -rintasyöpäkasvaimiin, suureen kasvaimen kokoon ja etäpesäkkeiden ilmaantumiseen. Tutkimuksemme tulokset osoittavat, että hepsiinillä ja TMPRSS3:lla on mahdollisesti samankaltaisia biologisia vaikutuksia rintasyövän molekyylitason patologiassa. Hepsiinin ja TMPRSS3:n matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen viittaa huonoon rintasyöpäspesifiin eloonjääntiin.

4 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences [Abstract] School of Medicine Medicine PELKONEN, MIKKO: Low expression levels of hepsin and TMPRSS3 are associated with poor breast cancer survival Thesis, 40 pages Tutors: Associate Professor Arto Mannermaa and MSc Kaisa Luostari May 2016 Hepsin, (also called TMPRSS1) and TMPRSS3 are type II transmembrane serine proteases (TTSPs) that are involved in cancer progression. TTSPs can remodel extracellular matrix (ECM) and, when dysregulated, promote tumor progression and metastasis by inducing defects in basement membrane and ECM molecules. This study investigated whether the gene and protein expression levels of these TTSPs were associated with breast cancer characteristics or survival. Immunohistochemical staining was used to evaluate hepsin levels in 372 breast cancer samples and TMPRSS3 levels in 373 samples. TMPRSS1 mrna expression was determined in 125 invasive and 16 benign breast tumor samples, and TMPRSS3 mrna expression was determined in 167 invasive and 23 benign breast tumor samples. The gene and protein expression levels were analyzed for associations with breast cancer-specific survival and clinicopathological parameters. Low TMPRSS1 and TMPRSS3 mrna expression levels were independent prognostic factors for poor breast cancer survival during the 20-year follow-up (TMPRSS1, P = 0.023; HR, 2.065; 95 % CI, 1.106 3.856; TMPRSS3, P = 0.013; HR, 2.106; 95 % CI, 1.167 3.800). Low expression of the two genes at the mrna and protein levels associated with poorer survival compared to high levels (log rank P-values 0.015 0.042). Low TMPRSS1 mrna expression was also an independent marker of poor breast cancer prognosis in patients treated with radiotherapy (P = 0.034; HR, 2.344; 95% CI, 1.065-5.160). Grade III tumors, large tumor size, and metastasis were associated with low mrna and protein expression levels. The results suggest that the TTSPs hepsin and TMPRSS3 may have similar biological functions in the molecular pathology of breast cancer. Low mrna and protein expression levels of the studied TTSPs were prognostic markers of poor survival in breast cancer.

5 SISÄLLYS 1. JOHDANTO...6 2. AINEISTO JA MENETELMÄT...8 2.1 Potilasaineisto...8 2.2 RNA-eristys ja cdna-synteesi... 10 2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR... 10 2.4 Immunohistokemia... 11 2.5 Tilastoanalyysi... 13 3. TULOKSET... 14 3.1 Matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen on yhteydessä edenneeseen rintasyöpään... 14 3.2 Matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen liittyy huonoon rintasyövän elinajanennusteeseen... 18 3.3 Matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen sädehoidetuilla rintasyöpäpotilailla liittyy huonoon elinajanennusteeseen... 21 3.4 Matalan ilmentymisen mrna- ja proteiiniyhdistelmämuuttujat ovat yhteydessä huonoon rintasyövän elinajanennusteeseen... 24 3.5 Matalan TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n ilmentymisen ennusteellinen arvo rintasyövässä vahvistettiin julkisessa rintasyöpäaineistossa... 24 4. POHDINTA... 28 5. JOHTOPÄÄTÖKSET... 33 LÄHDELUETTELO... 34

6 1. JOHDANTO Rintasyöpä on maailmanlaajuisesti yleisin naisten syöpäsairaus ja etäpesäkkeitä lähettänyt rintasyöpä on sairastuneiden yleisin kuolinsyy [1]. Epiteelin ja solunulkoisen väliaineen eheys on keskeisessä asemassa solujen ja kudosten normaalin toiminnan kannalta. Solunulkoinen väliaine koostuu tyvikalvosta ja sidekudoksesta [2]. Solunulkoisen väliaineen hajotus ja uudelleenmuodostuminen sekä vauriot solujen välisten liitosten molekyyleissä vaikuttavat rintasyövän etenemiseen [3]. Tyypin II transmembraaniset seriiniproteaasit (TTSP:t) ovat suhteellisen uusi S1-luokan seriiniproteaasien alaryhmä ja ihmisillä TTSP-perheeseen kuuluu 17 proteaasia [4, 5]. TTSP:t ovat mukana normaalissa kudosten kehityksessä ja homeostaasin ylläpidossa, mutta myös useissa sairauksissa, kuten monissa syövissä. Useat TTSP:t ovat aiemmissa tutkimuksissa osoittautuneet mahdollisiksi syöpäkasvainten etenemisen biomarkkereiksi [6, 7]. TTSP:t ovat kalvoproteiineja, ja ne voivat hajottaa solunulkoista väliainetta sekä muokata solunsisäisiä ja solu-soluväliaineliitoksia. Häiriöt TTSP-ilmentymisessä on yhdistetty syövän esiasteiden kehittymiseen, syöpäkasvainten suurentuneeseen kokoon sekä etäpesäkkeiden muodostumista edistävään syöpäsolujen lisääntyneeseen invasiivisuuteen [8, 9]. Tutkimme kahden TTSP-perheen proteaasin, hepsiinin (koodaava geeni TMPRSS1) ja TMPRSS3:n (koodaava geeni TMPRSS3), mrna- ja proteiini-ilmentymistä rintasyövässä. Hepsiinin yli-ilmentymisen on aiemmin osoitettu olevan yhteydessä eturauhas-, munuais- ja munasarjasyöpiin [10-13]. Hepsiini-ilmentymisen on osoitettu olevan koholla myös rintasyöpänäytteissä yksittäisessä aiemmassa tutkimuksessa [14]. TMPRSS1:n yli-ilmentyminen mrna-tasolla on yhdistetty estrogeenireseptoripositiivisiin rintakasvaimiin [15], ja TMPRSS3:n yli-ilmentyminen on puolestaan yhdistetty haima- ja epiteliaalisiin munasarjasyöpiin [16, 17]. TMPRSS3-geenissä olevien, proteiinirakenteeseen vaikuttavien missense-mutaatioiden on osoitettu olevan yhteydessä periytyvään kuurouteen [18]. Hepsiini ja TMPRSS3 kuuluvat molemmat TTSP-perheen hepsin/tmprssalaryhmään ja niillä on samankaltaisia rakenteellisia ominaisuuksia [5, 6]. TTSP:t ankkuroituvat solukalvoon soluliman puoleisesta N-terminaalisesta päästään. Solunulkoisessa C-terminaalisessa päässä niillä on seriiniproteaasin sisältävä osa, jota ne tarvitsevat katalyyttistä aktiivisuutta varten [4, 7]. Hepsiinin ja TMPRSS3:n ajatellaan pystyvän aktivoimaan itsensä autokatalyyttisesti, mikä viittaa niiden mahdolliseen kykyyn toimia esimerkiksi solunulkoisen väliaineen hajottamiseen ja uudelleenmuodostumiseen johtavien proteolyysikaskadien

7 käynnistäjinä [19, 20]. Yli-ilmentynyt hepsiini aktivoi proteolyyttisiä reittejä ja vaikuttaa myös suoraan solujen välisiin ja solu-soluväliaineliitoksiin. Hepsiini voi esimerkiksi aktivoida hepatosyyttikasvutekijä (HGF) ja urokinaasi-tyyppinen plasminogeeniaktivaattori (upa) -välitteiset proteolyyttiset reitit johtaen solunulkoisen väliaineen hajotukseen [21-23]. Hepsiini itse voi myös suoraan ja spesifisesti pilkkoa laminiini-332:n (ln-332, aiemmin laminiini-5), joka on tärkeä tyvikalvon rakenteen eheydestä huolehtiva molekyyli [24]. Lisäksi rintasyövässä on aiemmin osoitettu, että LKB1-kasvunrajoitegeenin ilmentymisen estyessä hepsiinin toiminta häiriintyy, mikä puolestaan johtaa epiteelin ja tyvikalvon vaurioihin [25]. Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa tutkitaan TMPRSS3-geenin ilmentymistä kliinisessä rintasyöpäaineistossa sekä TMPRSS1- ja TMPRSS3-geenien ilmentymistasojen yhteyksiä rintasyöpäpotilaiden ennusteeseen. Ryhmämme tuoreessa julkaisussa osoitettiin, että TMPRSS3:n geenivariantit (SNP, single nucleotide polymorphism) rs3814903 ja rs11203200 ovat yhteydessä rintasyövän ennusteeseen [26]. Lisäksi TMPRSS1-geenin SNP:t rs12151195 ja rs12461158 olivat itsenäisiä lisääntyneen rintasyöpäkuolleisuuden riskitekijöitä [26]. Ryhmämme on aiemmin myös osoittanut, että TTSP-perheeseen kuuluvalla matriptaasilla (koodaava geeni ST14) on ennusteellista arvoa rintasyövässä [27], samoin kuin useilla TMPRSS6:n (koodaa matriptaasi-2:ta) geenivarianteilla [28]. Ryhmämme lupaavien aiempien tulosten perusteella halusimme tutkia, olisiko hepsiinin ja TMPRSS3:n ilmentymisellä yhteys rintasyöpään potilasaineistossamme. Yli-ilmentyneet hepsiini ja TMPRSS3 voivat mahdollisesti edistää rintasyöpäsolujen invasiivisuutta aiheuttamalla vaurioita tyvikalvoon, mikä lopulta johtaa kontrolloimattomaan solunulkoisen väliaineen hajoamiseen.

8 2. AINEISTO JA MENETELMÄT 2.1 Potilasaineisto Tässä tutkimuksessa käytetyt potilasnäytteet kuuluvat Kuopion rintasyöpäprojektiin, joka koostuu 497 mahdollisesta rintasyöpätapauksesta Pohjois-Savon alueelta. Potilaat ovat olleet hoidettavana Kuopion yliopistollisessa sairaalassa (KYS) vuosien 1990 ja 1995 välillä. Kaikki potilaat ovat kaukasialaisia. Tutkimuksella on Itä-Suomen yliopiston ja Kuopion yliopistollisen sairaalan tutkimuseettisen toimikunnan hyväksyntä. Kaikilta potilailta on saatu tutkimukseen osallistumisesta kirjallinen suostumus ja tutkimuksessa noudatettiin Helsingin julistuksen periaatteita. Seurantatiedot potilaista on koottu helmikuussa 2011. Taulukossa 1 esitetään rintanäytteiden kliinis-patologiset muuttujat ja potilaiden saamat liitännäishoidot. TAULUKKO 1. Rintasyöpäpotilaiden kliinis-patologiset tiedot TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen TMPRSS3:n mrna- ilmentyminen Hepsiinin/ TMPRSS1:n proteiini-ilmentyminen TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen Kliininen muuttuja n % n % n % n % Rintakasvaimen tyyppi Syöpä 125 88,7 167 87,9 372 100 373 100 Hyvänlaatuinen 16 11,3 23 12,1 Histologinen tyyppi Duktaalinen 89 63,2 118 62,1 236 63,5 237 63,5 Lobulaarinen 20 14,2 31 16,3 73 19,6 72 19,3 Muu karsinooma 16 11,3 18 9,5 63 16,9 64 17,2 Hyvänlaatuinen 16 11,3 23 12,1 Ikä toteamishetkellä <= 39 12 9,6 14 8,4 31 8,3 31 8,3 40 49 22 17,6 29 17,4 91 24,5 91 24,4 50 59 29 23,2 38 22,8 88 23,7 88 23,6 60 69 18 14,4 28 16,7 53 14,2 54 14,5 >= 70 44 35,2 58 34,7 109 29,3 109 29,2 Histologinen gradus I 24 19,2 28 16,8 87 23,4 88 23,6 II 51 40,8 74 44,3 162 43,6 161 43,2 III 48 38,4 60 35,9 105 28,2 106 28,4 NA 2 1,6 5 3,0 18 4,8 18 4,8

9 Kasvaimen koko T1 46 36,8 63 37,7 173 46,5 174 46,6 T2 64 51,2 84 50,3 160 43,0 160 42,9 T3 9 7,2 12 7,2 19 5,1 20 5,4 T4 6 4,8 8 4,8 15 4,0 15 4,0 NA 5 1,4 4 1,1 Kainaloimusolmukestatus Negatiivinen 71 56,8 87 52,1 197 53,0 198 53,1 Positiivinen 51 40,8 73 43,7 155 41,6 155 41,5 NA 3 2,4 7 4,2 20 5,4 20 5,4 Levinneisyysaste I 34 27,2 42 25,1 121 32,5 122 32,7 II 74 59,2 97 58,1 184 49,5 184 49,3 III 10 8,0 14 8,4 32 8,6 32 8,6 IV 4 3,2 7 4,2 13 3,5 13 3,5 NA 3 2,4 7 4,2 22 5,9 22 5,9 ER-status Negatiivinen 40 32,0 50 29,9 82 22,0 83 22,2 Positiivinen 83 66,4 111 66,5 270 72,6 270 72,4 NA 2 1,6 6 3,6 20 5,4 20 5,4 PR-status Negatiivinen 56 44,8 70 41,9 140 37,6 141 37,8 Positiivinen 67 53,6 91 54,5 212 57,0 211 56,6 NA 2 1,6 6 3,6 20 5,4 21 5,6 HER2-status Negatiivinen 99 79,2 130 77,8 299 80,4 299 80,2 Positiivinen 19 15,2 24 14,4 46 12,3 46 12,3 NA 7 5,6 13 7,8 27 7,3 28 7,5 ER/PR/HER2-status Kolmoisnegatiivinen 24 19,2 29 17,4 42 11,3 43 11,5 Ei-kolmoisnegatiivinen 94 75,2 122 73,0 289 77,7 288 77,2 NA 7 5,6 16 9,6 41 11,0 42 11,3 Sädehoito Kyllä 66 52,8 84 50,3 205 55,1 208 55,8 Ei 59 47,2 83 49,7 167 44,9 165 44,2 Solunsalpaajahoito Kyllä 18 14,4 26 15,6 69 18,5 69 18,5 Ei 107 85,6 141 84,4 303 81,5 304 81,5 Tamoksifeeni Kyllä 23 18,4 31 18,6 62 16,7 62 16,6 Ei 102 81,6 136 81,4 310 83,3 311 83,4 Elossaolo Elossa 38 30,4 52 31,2 149 40,1 149 39,9 Kuollut rintasyöpään 42 33,6 56 33,5 112 30,1 113 30,3 Kuollut, muu syy 45 36,0 59 35,3 111 29,8 111 29,8 NA, ei tiedossa

10 2.2 RNA-eristys ja cdna-synteesi RNA-eristys rintakudosnäytteistä ja cdna-synteesi on esitetty ryhmämme aiemmassa julkaisussa [27]. Pakastimessa säilötyistä kudosnäytteistä eristettiin RNA mirvana TM mirna Isolation Kitin (Life Technologies, Carlsbad, CA) avulla. cdna-synteesi toteutettiin High Capacity cdna Reverse Transcription Kit:in (Life Technologies) avulla. RNA-eristys ja cdna-synteesi toteutettiin reagenssien valmistajan ohjeiden mukaan. 2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR Kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR-menetelmällä (QPCR) tutkittiin Kuopion rintasyöpäprojektin näytteistä TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen 125 rintasyöpänäytteestä ja 16 hyvänlaatuisesta rintakudoskasvaimesta. TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen tutkittiin 167 rintasyöpänäytteestä ja 23 hyvänlaatuisesta rintakudoskasvaimesta. QPCR-menetelmässä käytettiin spesifisiä, kaupallisesti valmistettuja TaqMan-alukkeita [TMPRSS1: #Hs01056332_m1 ja TMPRSS3: #Hs00225161_m1, TaqMan Gene Expression Assays (Life Technologies)] valmistajan ohjeiden mukaan. Endogeenisenä kontrollina PCR-ajoissa käytettiin PPIA-geeniä (peptidylprolyl isomerase A, cyclophilin A)[Human Cyc Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (20X), Life Technologies][29]. Alukkeet yhdistettiin PCRajoja varten Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mixin (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kanssa. Tässä tutkimuksessa käytimme Mx3000P real-time PCR -laitetta ja MxPro- Mx3000P v4.10 -ohjelmistoa (Agilent Technologies) valmistajan ohjeistuksen mukaan. PCR-ajoissa ensimmäinen monistuskierros kesti 3 minuuttia +95 C:ssa ja sen jälkeen oli 45 55 kierrosta 20 sekuntia +95 C:ssa ja 30 sekuntia +60 C:ssa. Tutkittavien geenien ja kontrolligeenin alukkeet olivat samassa PCR-reaktiossa. Jokaisesta näytteestä analysoitiin kolme rinnakkaisnäytettä, jotka pipetoitiin 96-kuoppalevyille. Näytteestä riippuen cdna:n lopullinen määrä vaihteli 2 75 ng:n välillä 20 µl:n kokonaistilavuudessa kuoppaa kohden. Jokainen kuoppalevy sisälsi myös näytteet standardisuoraa varten. Standardisuoran laimennossarja tehtiin viidestä sattumanvaraisesti valitusta rintasyöpäprojektin näytteen cdna:sta. Vertaamalla tutkittavan geenin koodaamien mrna-molekyylien määrää PPIA-geenin koodaamien tuotteiden määrään saimme määritettyä tutkittavien geenien suhteellisen ilmentymisen jokaisessa näytteessä.

11 2.4 Immunohistokemia Hepsiinin immunohistokemiallinen värjäytyminen analysoitiin 372 rintasyöpänäytteessä ja TMPRSS3:n värjäytyminen 373 rintasyöpänäytteessä. TMA-monikudosblokeista (TMA, tissue microarray) otettiin 4 μm:n paksuiset leikkeet, jotka värjättiin immunohistokemiallisesti. Jokaista potilastapausta kohden tutkittiin kolme näyteleikettä. TMA-blokit valmistettiin manuaalisesti erikoisvalmisteisella laitteella (Beecher Instruments, Silver Spring, MD). Parafiinin poiston ja rehydraation jälkeen TMPRSS3:n analyysiä varten leikkeitä lämmitettiin 3 5 minuuttia mikroaaltouunissa sitraattipohjaisessa puskuriliuoksessa (ph 6,0). Hepsiinin analyysiä varten leikkeitä ei lämmitetty. Näyteleikkeitä liotettiin 5-prosenttisessa vetyperoksidissa endogeenisen peroksidaasin vaikutuksen estämiseksi. Epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi leikkeitä inkuboitiin 35 minuuttia huoneenlämmössä PBS-liuoksessa, joka sisälsi 1,5 % normaalia seerumia. Tämän jälkeen leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 C:ssa yhdessä kanin polyklonaalisten hepsiinin vasta-aineen (LS-C24203/28374; LifeSpan BioSciences, Seattle, WA) tai TMPRSS3:n vasta-aineen kanssa (NBP1-19582; Novus Biologicals, Littleton, CO) 1:250 laimennoksessa. Sitten leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 35 minuutin ajan ja sen jälkeen avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksin kanssa 45 minuutin ajan [Vectastain Elite ABC Kit (anti-rabbit IgG); Vector Laboratories, Burlingame, CA]. Näyteleikkeet pestiin PBS-liuoksella jokaisen työvaiheen jälkeen. Värjäytymistä varten leikkeet käsiteltiin diaminobentsidiini-tetrahydrokloridiliuoksella (DAB; Sigma, St. Louis, MO) ja Mayerin hematoksyliinillä. Lopuksi näyteleikkeet suljettiin peitinlasin alle Depexin avulla (BDH, Poole, UK). Negatiivisia kontrollinäytteitä varten primaarinen vasta-aine jätettiin pois värjäysprosessista. Kaksi tutkijaa analysoi valomikroskoopilla hepsiinin ja TMPRSS3:n värjäytymisen epiteliaalisten kasvainsolujen solulimassa kokeneen patologin valvonnassa. Värjäytymisen voimakkuus ja yleisyys pisteytettiin (0, negatiivinen; 1, heikko; 2, kohtalainen; 3, voimakas; kuva 1A D). Jokaista potilastapausta kohden analysoitiin kolme värjättyä näyteleikettä. Kasvainnäytteet jaettiin matalan ja korkean ilmentymisen ryhmiin värjäytymispisteiden mediaaniarvon mukaan.

12 A B C D KUVA 1. Hepsiinin ja TMPRSS3:n immunohistokemiallinen värjäytyminen invasiivisissa, duktaalisissa rintasyöpänäytteissä. Epiteliaalisten kasvainsolujen soluliman värjäytyminen: A, hepsiinin heikko värjäytyminen; B, hepsiinin voimakas värjäytyminen; C, TMPRSS3:n heikko värjäytyminen; D, TMPRSS3:n voimakas värjäytyminen. Kaikissa kuvissa 400-kertainen suurennus.

13 2.5 Tilastoanalyysi Tilastoanalyysit tehtiin IBM SPSS Statistics 19 -ohjelmistolla (IBM Corporation, Armonk, NY). Mann-Whitneyn U-testin ja Kruskal-Wallisin testin avulla tutkittiin yhteyksiä jatkuvien mrna:n ilmentymisarvojen ja kliinisten muuttujien välillä. Fisherin tarkkaa testiä käytettiin proteiini-ilmentymistulosten ja kliinisten muuttujien välisten yhteyksien analysoinnissa. Logistisen regressioanalyysin avulla saatiin vetosuhdearvot (OR, odds ratio) ja 95 %:n luottamusvälit (95 % CI, confidence interval) tilastollisesti merkitseville ilmentymistulosten ja kliinisten muuttujien välisille yhteyksille. Elinaika-analyyseissä käytettiin Kaplan-Meierin menetelmää yksimuuttuja-analyyseissä ja Coxin regressiomallia monimuuttuja-analyyseissä. Coxin regressiomallissa muuttujina oli ilmentymistulosten lisäksi rintasyöpäkasvaimen histologinen erilaistumisaste eli gradus, kasvaimen koko, histologinen tyyppi, imusolmukestatus sekä kasvaimen estrogeeni- ja progesteronireseptoristatus (ER ja PR). Myös annettuja liitännäishoitoja käytettiin muuttujina potilaan saamiin hoitoihin liittyvissä analyyseissä. Teimme monimuuttuja-analyysejä varten erilliset mrna- ja proteiiniyhdistelmämuuttujat, jotka muodostettiin siten, että kaikki potilastapaukset, joihin liittyi matala molempien tutkittujen geenien ilmentyminen, muodostivat matalan ilmentymistason yhdistelmämuuttujan. Kaikki muut potilastapaukset muodostivat vertailuryhmän. Tilastoanalyyseissä pidettiin merkitsevinä tuloksia, joissa P-arvo oli 0,05 tai sen alle. Käytimme Kaplan-Meierin menetelmään pohjautuvaa julkisesti saatavilla olevaa analyysityökalua vahvistamaan tuloksemme TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n merkityksestä rintasyövän ennusteeseen vaikuttavina biomarkkereina [30]. Työkalu perustuu laajoihin, kansainvälisiin rintasyöpäaineistoihin, ja samoin kuin tutkimuksessamme, on siinäkin potilastapaukset jaettu kahteen ryhmään geeni-ilmentymistulosten mediaaniarvojen perusteella [30].

14 3. TULOKSET 3.1 Matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen on yhteydessä edenneeseen rintasyöpään Taulukossa 2 esitetään TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentymisen ja kliinisten muuttujien väliset tilastollisesti merkitsevät tulokset ja taulukossa 3 esitetään vastaavasti tulokset hepsiinin ja TMPRSS3:n proteiini-ilmentymisen suhteen. TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentymistaso oli korkea hyvin erilaistuneissa (gradus I) rintasyöpäkasvaimissa verrattuna hyvänlaatuisiin rintakasvaimiin (taulukko 2, kuva 2A-B). Huonosti erilaistuneissa (gradus III) kasvaimissa molempien geenien mrna-ilmentymistaso oli matala (TMPRSS1: P = 0,000015 ja TMPRSS3: P = 0,0002; Kruskal-Wallisin testi; taulukko 2; kuva 2A B). Vastaavasti hepsiinin ja TMPRSS3:n matala proteiini-ilmentyminen liittyi huonosti erilaistuneisiin kasvaimiin (hepsiini: P = 0,00009; OR, 3,289; 95 % CI, 1,811 5,973 ja TMPRSS3: P = 0,0000002; OR, 5,006; 95 % CI, 2,721 9,209; taulukko 3). Taulukoissa 2 ja 3 esitetyt tulokset osoittavat, että mrna- ja proteiini-ilmentymistasot ovat korkeat hyvin erilaistuneissa kasvaimissa ja matalat huonosti erilaistuneissa kasvaimissa. Matala hepsiinin ja TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen liittyy levinneisyysasteisiin III ja IV (hepsiini: P = 0,005; OR, 2,757; 95 % CI, 1,354 5,611 ja TMPRSS3: P = 0,028; OR, 2,176; 95 % CI, 1,086 4,361) ja matala hepsiinin ilmentyminen liittyy suurempaan kasvaimen kokoon (T3 ja T4; P = 0,034; OR, 2,266; 95 % CI, 1,065 4,82). Matala TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen on yhteydessä negatiiviseen ER- ja PRstatukseen sekä epidermaalisen kasvutekijäreseptori 2:n yli-ilmentymiseen eli HER2-positiivisuuteen (taulukko 2). Matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen on yhteydessä myös kolmoisnegatiivisiin kasvaimiin (taulukko 2). Lisäksi osoitimme, että matala hepsiinin proteiini-ilmentyminen on yhteydessä positiiviseen kainaloimusolmukestatukseen ja matala TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen negatiiviseen PR-statukseen ja kolmoisnegatiivisiin kasvaimiin (taulukko 3).

15 TAULUKKO 2. Tilastollisesti merkitsevät yhteydet mrna-ilmentymisen ja kliinisten muuttujien välillä TMPRSS1-ilmentyminen a TMPRSS3-ilmentyminen a Kliininen muuttuja n (%) P Mediaani / IQR n (%) P Mediaani / IQR Rintakasvaimen tyyppi 0,002 NS Hyvänlaatuinen 16 (11,3) 0,27 / 0,57 23 (12,1) 0,98 / 0,56 Syöpä 125 (88,7) 0,96 / 2,10 167 (87,9) 0,92 / 1,74 Histologinen gradus 0,000015 0,0002 I 24 (19,5) 0,000007 b 2,03 / 2,74 28 (17,3) 0,016 b 1,76 / 2,80 II 51 (41,5) NS c 1,67 / 2,41 74 (45,7) NS c 1,29 / 2,03 III 48 (39,0) 0,000004 d 0,55 / 0,88 60 (37,0) 0,0001 d 0,55 / 0,84 ER-status 0,000003 0,0027 Negatiivinen 40 (32,5) 0,45 / 0,84 50 (31,1) 0,55 / 0,84 Positiivinen 83 (67,5) 1,67 / 2,44 111 (68,9) 1,24 / 2,34 PR-status 0,001 0,0076 Negatiivinen 56 (45,5) 0,59 / 1,39 70 (43,5) 0,67 / 1,21 Positiivinen 67 (54,5) 1,53 / 2,57 91 (56,5) 1,32 / 2,41 HER2-status 0,001 0,017 Negatiivinen 99 (83,9) 1,12 / 2,25 130 (84,4) 1,08 / 2,46 Positiivinen 19 (16,1) 0,35 / 0,75 24 (15,6) 0,58 / 0,89 ER/PR/HER2-status 0,001 NS Kolmoisnegatiivinen 24 (20,3) 0,49 / 0,98 29 (19,2) 0,69 / 1,86 Ei-kolmoisnegatiivinen 94 (79,7) 1,12 / 2,33 122 (80,8) 1,09 / 1,81 IQR, interkvartaaliväli; NS, ei-merkitsevä a Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin kahden muuttujan ryhmille ja Kruskal-Wallisin testiä useamman muuttujan ryhmille. b P-arvo verrattaessa mrna-ilmentymistä hyvänlaatuisten ja gradus I -kasvainten välillä. c P-arvo verrattaessa mrna-ilmentymistä gradus I ja gradus II -kasvainten välillä. d P-arvo verrattaessa mrna-ilmentymistä gradus I ja gradus III -kasvainten välillä.

TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen 16 A * * n = 24 n = 51 n = 48 n = 16 Hyvänlaatuinen Gradus I Gradus II Gradus III B * * n = 60 n = 28 n = 74 n = 23 Hyvänlaatuinen Gradus I Gradus II Gradus III KUVA 2. TMPRSS1:n (A) ja TMPRSS3:n (B) mrna-ilmentymistasot hyvänlaatuisissa rintakasvaimissa ja rintasyöpäkasvaimissa lajiteltuna histologisen erilaistumisasteen mukaan. Hyvänlaatuisissa kasvaimissa ilmentymitaso on matalampi gradus I -kasvaimiin verrattuna. Erilaistumiaste on kääntäen verrannollinen tutkittuihin mrna-tasoihin. Gradus I kasvaimissa erilaistumiaste on hyvä ja gradus III kasvaimissa huono. *P < 0,005.

17 TAULUKKO 3. Tilastollisesti merkitsevät yhteydet proteiini-ilmentymisen ja kliinisten muuttujien välillä Kliininen muuttuja (%) Matala Proteiini-ilmentyminen a Kohtalainen/ korkea, Ref. P b OR (95 % CI) c Hepsiini Histologinen gradus 0,0004 b I 28 (32,2) 59 (67,8) Ref. II 76 (46,9) 86 (53,1) 0,025 1,862 (1,079 3,213) III 64 (61,0) 41 (39,0) 0,00009 3,289 (1,811 5,973) Levinneisyysaste 0,015 b I 48 (39,7) 73 (60,3) Ref. II 91 (49,5) 93 (50,5) 0,094 1,488 (0,935 2,369) III, IV 29 (64,4) 16 (35,6) 0,005 2,757 (1,354 5,611) Kasvaimen koko 0,025 b T1 72 (41,6) 101 (58,4) Ref. T2 86 (53,8) 74 (46,2) 0,027 1,630 (1,057 2,515) T3, T4 21 (61,8) 13 (38,2) 0,034 2,266 (1,065 4,821) Kainaloimusolmukestatus 0,010 b Negatiivinen 82 (41,6) 115 (58,4) Ref. Positiivinen 86 (55,5) 69 (44,5) 0,010 1,748 (1,143 2,674) TMPRSS3 Histologinen gradus 0,0000008 b I 29 (33,0) 59 (67,0) Ref. II 85 (52,8) 76 (47,2) 0,002 2,341 (1,364 4,018) III 75 (70,8) 31 (29,2) 0,0000002 5,006 (2,721 9,209) Levinneisyysaste 0,007 b I 51 (41,8) 71 (58,2) Ref. II 109 (59,2) 75 (40,8) 0,002 2,109 (1,328 3,348) III, IV 27 (60,0) 18 (40,0) 0,028 2,176 (1,086 4,361) Kasvaimen koko 0,002 b T1 79 (45,4) 95 (54,6) Ref. T2 102 (63,8) 58 (36,2) 0,00083 2,115 (1,363 3,281) T3, T4 16 (45,7) 19 (54,3) 0,973 1,013 (0,489 2,099) PR-status 0,022 b Negatiivinen 87 (61,7) 54 (38,3) 0,017 1,679 (1,098 2,568) Positiivinen 103 (48,8) 108 (51,2) Ref. ER/PR/HER2-status 0,022 b Kolmoisnegatiivinen 30 (69,8) 13 (30,2) 0,022 2,244 (1,125 4,477) Ei-kolmoisnegatiivinen 146 (50,7) 142 (49,3) Ref. Histologinen tyyppi 0,060 b Duktaalinen 131 (55,3) 106 (44,7) 0,031 1,760 (1,053 2,942)

18 Lobulaarinen 43 (59,7) 29 (40,3) 0,024 2,112 (1,105 4,037) Muu karsinooma 26 (40,6) 38 (59,4) Ref. NS, ei-merkitsevä; Ref., vertailuryhmä logistisessa regressioanalyysissä a Proteiini-ilmentymisen mediaaniarvoa käytettiin tilastoanalyyseissä. b P-arvo Fisherin tarkassa testissä. Muut P-arvot saatiin logistisesta regressioanalyysistä. c OR ja 95 % CI -arvot logistisessa regressioanalyysissä. 3.2 Matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen liittyy huonoon rintasyövän elinajanennusteeseen Tutkittujen geenien mrna- ja proteiini-ilmentymistasoilla oli ennusteellista arvoa tämän tutkimuksen rintasyöpäpotilaiden elinajanennusteen suhteen 20 vuoden seuranta-aikana. Kaplan-Meierin elinaika-analyysissä osoitimme, että molempien tutkittujen geenien matala ilmentyminen oli yhteydessä huonompaan rintasyöpäspesifiin ennusteeseen (TMPRSS1: log rank, P = 0,042; kuva 3A ja TMPRSS3: log rank, P = 0,015; kuva 3B). Samoin matala TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen (log rank, P = 0,028; kuva 3D) liittyi huonompaan ennusteeseen 20 vuoden seuranta-aikana verrattuna korkeaan ilmentymistasoon. Matala hepsiinin proteiini-ilmentyminen (log rank, P = 0,035, kuva 3C) oli yhteydessä huonompaan rintasyöpäspesifiin ennusteeseen 10 seurantavuoden aikana, muttei enää 20 vuoden seu-rannassa (P = 0,315, kuva 3C). Coxin monimuuttuja-analyysissä osoitimme, että matala TMPRSS1:n (P = 0,023; HR, 2,065; 95 % CI, 1,106 3,856; taulukko 4; kuva 4A) ja TMPRSS3:n (P = 0,013; HR, 2,106; 95 % CI, 1,167 3,800; taulukko 4; kuva 4B) mrna-ilmentyminen ovat itsenäisiä tekijöitä huonon rintasyövän elinajanennusteen kannalta. TMPRSS1:n monimuuttujaanalyysissä kliinis-patologista muuttujista itsenäisiä huonoon ennusteeseen vaikuttavia tekijöitä olivat myös positiivinen kainaloimusolmukestatus ja iso tuumorin koko (T3, T4). Vastaavasti edellä mainittujen muuttujien lisäksi TMPRSS3:n monimuuttuja-analyysissä itsenäisinä huonon ennusteen tekijöinä säilyivät ER-negatiivinen status ja lobulaarinen histologia. Molempien tutkittujen geenien monimuuttuja-analyyseissä positiivinen kainaloimusolmukestatus ja iso tuumorin koko olivat matalaa mrna-tasoa tilastollisesti merkitsevämpiä huonon ennusteen riskitekijöitä.

Elinajanodote Elinajanodote Elinajanodote Elinajanodote 19 TMPRSS1 Korkea ilmentyminen (n = 63) Korkea ilmentyminen (n = 83) TMPRSS3 Matala ilmentyminen (n = 62) Matala ilmentyminen (n = 84) P (Log rank) = 0,042 A P (Log rank) = 0,015 B Seuranta-aika (vuotta) Seuranta-aika Elinaika (vuotta) (vuotta) Korkea ilmentyminen (n = 193) Hepsiini Korkea ilmentyminen (n = 173) TMPRSS3 Matala ilmentyminen (n = 179) Matala ilmentyminen (n = 200) P (Log rank) = 0,315 P (Log rank) = 0,035 (10 vuoden seuranta) C P (Log rank) = 0,028 D Seuranta-aika Elinaika (vuotta) (vuotta) Seuranta-aika Elinaika (vuotta) (vuotta) KUVA 3. Kaplan-Meierin elinaika-analyysi tutkittujen mrna- ja proteiini-ilmentymistasojen suhteen. Potilaat jaettiin korkean ja matalan ilmentymisen ryhmiin mediaaniarvojen mukaan. TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen (A, seuranta-ajan mediaani 9,84 vuotta), TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen (B, seuranta-ajan mediaani 9,54 vuotta), hepsiinin proteiini-ilmentyminen (C, seuranta-ajan mediaani 11,05 vuotta) ja TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen (D, seuranta-ajan mediaani 10,94 vuotta).

20 TAULUKKO 4. Coxin monimuuttuja-analyysit kliinisten muuttujien, mrna- ja proteiini-ilmentymisen ja elinajan suhteen Muuttuja B (SE) Wald HR (95 % CI) P TMPRSS1:n mrna-ilmentymisen Coxin monimuuttuja-analyysi Kainaloimusolmukestatus Negatiivinen Ref. Positiivinen 0,786 (0,339) 5,369 2,194 (1,129 4,265) 0,020 Kasvaimen koko T1 Ref. T2 0,678 (0,421) 2,597 1,970 (0,864 4,492) 0,107 T3, T4 1,385 (0,504) 7,563 3,997 (1,489 10,729) 0,006 TMPRSS1-ilmentyminen* Matala 0,725 (0,318) 5,187 2,065 (1,106 3,856) 0,023 Korkea Ref. TMPRSS3:n mrna-ilmentymisen Coxin monimuuttuja-analyysi Kainaloimusolmukestatus Negatiivinen Ref. Positiivinen 1,091 (0,320) 11,596 2,976 (1,589 5,575) 0,001 Kasvaimen koko T1 Ref. T2 0,317 (0,373) 0,769 1,386 (0,668 2,874) 0,380 T3, T4 1,256 (0,452) 7,720 3,511 (1,448 8,516) 0,005 TMPRSS3-ilmentyminen* Matala 0,745 (0,301) 6,111 2,106 (1,167 3,800) 0,013 Korkea Ref. Histologinen tyyppi Duktaalinen 0,472 (0,551) 0,734 1,603 (0,545 4,715) 0,391 Lobulaarinen 1,501 (0,589) 6,497 4,487 (1,415 14,231) 0,011 Muu karsinooma Ref. ER-status Negatiivinen 0,628 (0,310) 4,109 1,873 (1,021 3,437) 0,043 Positiivinen Ref. TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmämuuttujan Coxin analyysi Yhdistetty mrna-ilmentyminen Matala 0,909 (0,325) 7,803 2,482 (1,312 4,698) 0,005 Muut Ref. Kainaloimusolmukestatus Negatiivinen Ref. Positiivinen 0,975 (0,360) 7,327 2,650 (1,309 5,368) 0,007 Kasvaimen koko T1 Ref. T2 0,481 (0,433) 1,233 1,617 (0,692 3,779) 0,267 T3, T4 1,281 (0,505) 6,427 3,600 (1,337 9,691) 0,011

21 Hepsiini-TMPRSS3-yhdistelmämuuttujan Coxin analyysi Kainaloimusolmukestatus Negatiivinen Ref. Positiivinen 0,905 (0,227) 15,942 2,473 (1,586 3,857) 0,00007 Kasvaimen koko T1 Ref. T2 0,176 (0,235) 0,559 1,192 (0,752 1,888) 0,455 T3, T4 0,891 (0,321) 7,696 2,438 (1,299 4,576) 0,006 Histologinen tyyppi Ductal 0,255 (0,322) 0,628 1,291 (0,687 2,426) 0,428 Lobulaarinen 0,903 (0,343) 6,909 2,466 (1,258 4,834) 0,009 Muu karsinooma Ref. Histologinen gradus I Ref. II 0,711 (0,290) 6,025 2,036 (1,154 3,591) 0,014 III 0,532 (0,337) 2,493 1,702 (0,880 3,294) 0,114 Yhdistetty proteiini-ilmentyminen Matala 0,432 (0,214) 4,087 1,541 (1,013 2,342) 0,043 Muut Ref. Huomautus: analyyseissä mukana histologinen gradus, histologinen tyyppi, kasvaimen koko, kainaloimusolmukestatus, ER- ja PR-status. B (SE), B-regressiokerroin ja keskivirhe; Wald, Wald-testisuure; HR (95 % CI), rintasyöpäkuoleman riskisuhde 95 %:n luottamusvälillä; Ref., vertailuryhmä Coxin regressioanalyysissä *Ilmentymisen mediaaniarvoa käytettiin tilastoanalyyseissä. Matalan ilmentymisen yhdistelmämuuttuja sisälsi kaikki potilastapaukset, joihin liittyi matala molempien tutkittujen geenien ilmentyminen. 3.3 Matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen sädehoidetuilla rintasyöpäpotilailla liittyy huonoon elinajanennusteeseen Tutkimme seuraavaksi yhteyksiä ilmentymistasojen ja elinajanennusteen välillä sen mukaan, mitä rintasyövän liitännäishoitoja potilaat olivat saaneet. Käytimme Kaplan-Meierin yksimuuttuja-analyysiä ja Coxin monimuuttuja-analyysiä. Elinajan suhteen analysoimme erikseen kokonaisennusteen ja rintasyöpäspesifisen ennusteen. Sädehoidetuilla potilailla matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen oli yhteydessä huonoon rintasyöpäspesifiin ennusteeseen (log rank, P = 0,030; Coxin regressioanalyysi, P = 0,034; HR, 2,344; 95 % CI, 1,065 5,160; kuva 5A) ja huonoon kokonaiselinajanennusteeseen (log rank, P = 0,006; Coxin regressioanalyysi, P = 0,007; HR, 2,392; 95 % CI, 1,276 4,484; kuva 5B). TMPRSS1:n ilmentymistasolla ei ollut merkitystä elinajan suhteen niillä potilailla, jotka eivät olleet saaneet sädehoitoa. Lisäksi osoitimme Kaplan-Meirin analyysissä, että solunsalpaajahoitoa saa-

Elinajanodote Elinajanodote Elinajanodote Elinajanodote 22 Korkea ilmentyminen (n = 61) TMPRSS1 Korkea ilmentyminen (n = 80) TMPRSS3 Matala ilmentyminen (n = 61) HR, 2,065; 95% CI, 1,106-3,856 Matala ilmentyminen (n = 79) HR, 2,106; 95% CI, 1,167-3,800 P = 0,023 B (SE) = 0,725 (0,318) A P = 0,013 B (SE) = 0,745 (0,301) B Seuranta-aika (vuotta) Seuranta-aika (vuotta) TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmä Hepsiini-TMPRSS3-yhdistelmä Muut (n = 79) Muut (n = 244) Yhdistetty matala ilmentyminen (n = 41) HR, 2,482; 95% CI, 1,312-4,698 P = 0,005 B (SE) = 0,909 (0,325) C Yhdistetty matala Ilmentyminen (n = 100) HR, 1,541; 95% CI, 1,013-2,342 P = 0,043 B (SE) = 0,432 (0,214) D Seuranta-aika (vuotta) Seuranta-aika (vuotta) KUVA 4. Coxin monimuutuja-analyysi tutkittujen mrna- ja proteiini-ilmentymistasojen sekä elinajan suhteen. Potilaat jaettiin korkean ja matalan ilmentymisen ryhmiin mediaaniarvojen mukaan (koskee kuvia A ja B). TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen (A, seuranta-ajan mediaani 9,79 vuotta), TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen (B, seuranta-ajan mediaani 9,51 vuotta), TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmämuuttujan (C, seuranta-ajan mediaani 9,79 vuotta) ja hepsiini-tmprss3-yhdistelmämuuttujan ilmentyminen (D, seuranta-ajan mediaani 11,05 vuotta). Muuttujina analyyseissä oli ilmentymistulosten lisäksi gradus, kasvaimen koko, histologinen tyyppi, imusolmukestatus sekä kasvaimen hormonireseptoristatukset.

Elinajanodote Elinajanodote 23 TMPRSS1 Korkea ilmentyminen (n = 31) TMPRSS1 Korkea ilmentyminen (n = 31) Matala ilmentyminen (n = 35) HR, 2,344; 95% CI, 1,065-5,160 Matala ilmentyminen (n = 35) HR, 2,392; 95% CI, 1,276-4,484 P = 0,034 B (SE) = 0,852 (0,403) A P = 0,007 B (SE) = 0,872 (0,321) B Rintsyöpäspesifinen seuranta-aika (vuotta) Kokonaisseuranta-aika (vuotta) KUVA 5. Matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen sädehoidetuilla rintasyöpäpotilailla oli yhteydessä huonoon elinajanennusteeseen Coxin monimuuttuja-analyysissä. Rintasyöpäspesifinen eloonjäänti (A) ja kokonaiseloonjäänti (B) TMPRSS1:n mrna-ilmentymisen suhteen sädehoidetuilla rintasyöpäpotilailla. Analyysimuuttujina oli ilmentymistulosten lisäksi potilaan ikä, annetut hormonaaliset hoidot ja mahdollinen sädehoito, gradus, levinneisyysaste, kasvaimen koko, histologinen tyyppi, imusolmukestatus sekä kasvaimen hormonireseptoristatukset. neiden potilaiden joukossa matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen oli yhteydessä huonoon rintasyöpäspesifiin ennusteeseen (log rank, P = 0,028) ja huonoon kokonaisennusteeseen (log rank, P = 0,028). Kun hoitotiedot yhdistettiin elinaika-analyyseihin, oli matala TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen yhteydessä huonoon rintasyöpäspesifiin elinajanennusteeseen (log rank, P = 0.,39) kaikkien hoidettujen potilaiden joukossa. Se säilyi myös itsenäisenä tekijänä ennustaen rintasyövän todennäköisempää uusiutumista (log rank, P = 0,023; Coxin regressioanalyysi, P = 0,021; HR, 1,831; 95 % CI, 1,094 3,063). Matala TMPRSS3:n proteiiniilmentyminen ennusti myös todennäköisempää uusiutumista (log rank, P = 0,011; Coxin regressioanalyysi, P = 0,031; HR, 1,520; 95 % CI, 1,040 2,221) verrattuna korkeaan ilmentymistasoon. Emme löytäneet merkitseviä tuloksia TMPRSS3:n ilmentymisen suhteen, kun potilaat jaettiin eri ryhmiin saamiensa hoitojen mukaan.

24 3.4 Matalan ilmentymisen mrna- ja proteiiniyhdistelmämuuttujat ovat yhteydessä huonoon rintasyövän elinajanennusteeseen Analysoidessamme mrna- ja proteiini-ilmentymistasojen välisiä yhteyksiä käytimme apuna Spearmanin järjestyskorrelaatiokerrointa. TMPRSS1:n ilmentymistasot ovat yhteydessä hepsiinin ilmentymistasojen kanssa (r = 0,18; P = 0,05; n = 112). Myös TMPRSS3:n mrna-tasot ovat yhteydessä TMPRSS3:n proteiinitasojen kanssa (r = 0,24; P = 0,04; n = 147). Lisäksi TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-tasot (r = 0,39; P = 0,000007; n = 123) sekä hepsiinin ja TMPRSS3:n proteiinitasot (r = 0,27; P = 0,0000001; n = 371) ovat yhteydessä toisiinsa. Näiden tulosten perusteella päätimme käyttää tilastoanalyyseissä myös TMPRSS1-TMPRSS3- ja hepsiini-tmprss3-yhdistelmämuuttujia. Kaplan-Meierin elinaika-analyysissä sekä matalan tason mrna-yhdistelmämuuttuja (log rank, P = 0,013; kuva 6A) että matalan tason proteiiniyhdistelmämuuttuja (log rank, P = 0,001; kuva 6B) olivat yhteydessä huonompaan rintasyövän ennusteeseen vertailuryhmiin nähden. Molemmat matalan ilmentymisen yhdistelmämuuttujat olivat yhteydessä myös todennäköisempään etäpesäkkeiden ilmaantumiseen (kuvat 6C D). Matalan tason mrna-yhdistelmämuuttuja (P = 0,005; HR, 2,482; 95 % CI, 1,312 4,698; taulukko 4; kuva 4C) ja matalan tason proteiiniyhdistelmämuuttuja (P = 0,043; HR, 1,541; 95 % CI, 1,013 2,342; taulukko 4; kuva 4D) säilyivät molemmat itsenäisinä elinaikaan vaikuttavina riskitekijöinä Coxin monimuuttuja-analyysissä. Nämä tulokset osoittavat, että hepsiinin ja TMPRSS3:n ilmentymistasot korreloivat TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmetymistasoja. Lisäksi TMPRSS1:n, TMPRSS3:n, hepsiinin ja TMPRSS3:n matala ilmentyminen ennustaa rintasyövän lisääntynyttä aggressiivisuutta ja lyhyempää elinaikaa. 3.5 Matalan TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n ilmentymisen ennusteellinen arvo rintasyövässä vahvistettiin julkisessa rintasyöpäaineistossa Verkossa julkisesti saatavilla oleva Kaplan-Meierin elinaika-analyysi tuki tuloksiamme laajassa rintasyöpäaineistossa. Siinä matala TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n ilmentyminen oli yhteydessä lyhempään uusiutumisvapaaseen elinaikaan (TMPRSS1: log rank, P = 0; HR, 0,61; 95 % CI, 0,55 0,69; n = 3554; kuva 7A ja TMPRSS3: log rank, P = 3,8e-10; HR, 0,66; 95 % CI, 0,58 0,73; n = 3554; kuva 7B), kokonaiselinaikaan (TMPRSS1: log rank, P = 0,0083;

Metastaasivapaa elossaolo Metastaasivapaa elossaolo Elinajanodote Elinajanodote 25 A TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmä B Hepsiini-TMPRSS3-yhdistelmä Muut (n = 81) Muut (n = 262) Yhdistetty matala ilmentyminen (n = 42) Yhdistetty matala ilmentyminen (n = 109) P (Log rank) = 0,013 P (Log rank) = 0,001 C Seuranta-aika (vuotta) TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmä D Seuranta-aika (vuotta) Hepsiini-TMPRSS3-yhdistelmä Muut (n = 80) Muut (n = 260) Yhdistetty matala ilmentyminen (n = 42) Yhdistetty matala ilmentyminen (n = 108) P (Log rank) = 0,049 P (Log rank) = 0,001 Metastaasivapaa seuranta-aika (vuotta) Metastaasivapaa seuranta-aika (vuotta) KUVA 6. Coxin monimuutuja-analyysi tutkittujen mrna- ja proteiini-yhdistelmämuuttujien sekä elinajan suhteen. Matala TMPRSS1-TMPRSS3-yhdistelmämuuttujan (A, seuranta-ajan mediaani 9,84 vuotta; C, seuranta-ajan mediaani 7,96 vuotta) ja matala hepsiini-tmprss3-yhdistelmämuuttujan (B, seuranta-ajan mediaani 10,94 vuotta; D, seuranta-ajan mediaani 9,13 vuotta) ilmentymistaso oli yhteydessä huonoon rintasyövän ennusteeseen (A, B) ja todennäköisempään etäpesäkkeiden ilmaantumiseen (C, D).

26 A B C D E F KUVA 7. TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentymisen ennusteellinen arvo rintasyövässä vahvistettiin julkisessa rintasyöpäaineistossa. Kaplan-Meierin elinaika-analyysityökalun avulla tutkittuna matala TMPRSS1:n (A, C, E) ja TMPRSS3:n (B, D, F) ilmentyminen oli yhteydessä lyhempään uusiutumisvapaaseen elinaikaan (A, B), kokonaiselinaikaan (C, D) ja etäpesäkevapaaseen elinaikaan (E, F). Lähde: http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast.

27 HR, 0,73; 95 % CI, 0,57 0,92; n = 1117; kuva 7C ja TMPRSS3: log rank, P = 0,00005; HR, 0,58; 95 % CI, 0,46 0,74; n = 1117; kuva 7D) ja etäpesäkevapaaseen elinaikaan (TMPRSS1: log rank, P = 0,000099; HR, 0,67; 95 % CI, 0,55 0,82; n = 1609; kuva 7E ja TMPRSS3: log rank, P = 0,0000039; HR, 0,62; 95 % CI, 0,51 0,76; n = 1609; kuva 7F).

28 4. POHDINTA Tutkimuksessamme osoitamme ensimmäistä kertaa, että TMPRSS3:n muuttuneen ilmentymisen ja rintasyövän välillä on yhteys. Lisäksi tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa osoitetaan, että matalalla TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n ilmentymisellä on sekä mrna- että proteiinitasolla ennusteellista arvoa rintasyöpäpotilaiden elinajan suhteen. Hyvänlaatuisissa rintakasvainsoluissa TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentyminen oli yhdenmukaisesti matalatasoista. Syöpäsoluissa ilmentyminen oli yleisesti voimakkaampaa, mutta kasvainten välillä oli selkeästi enemmän vaihtelua. Tuloksemme kuitenkin osoittavat, että huolimatta tutkittujen geenien yli-ilmentymisestä hyvin erilaistuneissa syöpäkasvaimissa, ilmentymistasot selvästi laskevat kasvainten muuttuessa aggressiivisempaan suuntaan. Huonosti erilaistuneissa syöpäkasvaimissa molempien geenien ilmentyminen on heikkoa. Löysimme merkittäviä yhteyksiä rintasyövän kliinisten muuttujien ja tutkittujen geenien mrna- ja proteiiniilmentymisen välillä. Matala ilmentymistaso ennusti lyhempää jäljellä olevaa elinaikaa ja lisääntynyttä etäpesäkkeiden ilmaantumisen riskiä verrattuna korkeampaan ilmentymistasoon. Monimuuttuja-analyyseissä TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n matala mrna-ilmentyminen säilyi itsenäisenä rintasyövästä aiheutuvan kuoleman riskitekijänä. Tuloksemme ovat verrattavissa aiempiin tutkimuksiin, joissa on osoitettu TMPRSS1:n yli-ilmentyminen eri syövissä, kuten erityisesti eturauhassyövässä [10-14] ja TMPRSS3:n yli-ilmentyminen haima- ja munasarjasyövissä [16, 17]. Osoitimme aineistossamme, että hyvänlaatuisten kasvainten ja gradus I -syöpäkasvainten välillä oli mrna-ilmentymisessä merkittävä ero. Gradus I -syöpäkasvaimissa ilmentyminen oli selvästi voimakkaampaa. Tämä tulos tukee aiemmin esitettyä teoriaa hepsiinin roolista eturauhassyövän etenemisessä, ja onkin mahdollista, että hepsiinillä ja TMPRSS3:lla on merkitystä myös rintasyövän alkuvaiheen kehityksessä [31, 32]. Tutkimuksessamme hepsiinin ja TMPRSS3:n proteiini-ilmentyminen korreloi mrna-ilmentymisen kanssa. Näytteet, joissa soluliman proteiinivärjäytyminen oli voimakasta, olivat yhteydessä matalaan histologiseen gradukseen ja levinneisyysasteeseen. Heikosti värjäytyvät näytteet olivat yhteydessä kasvaimiin, joissa histologinen gradus oli III ja levinneisyysaste III tai IV. Lisäksi matala hepsiinin ilmentyminen oli yhteydessä taudin leviämiseen kainaloimusolmukkeisiin. Matala mrna-ilmentyminen liittyi kasvaimiin, jotka eivät ilmentäneet hormonireseptoreita, mutta olivat HER2-positiivisia. Tuloksemme osoittavat, että rintasyövän kliiniset muuttujat, jotka yleisesti ovat yhteydessä huonompaan ennusteeseen, ovat myös yhteydessä tutkittujen geenien matalaan ilmentymiseen [33, 34].

29 Elinaika-analyysien tulokset aineistossamme osoittavat, että tutkittujen geenien matala ilmentymien on positiivisen kainaloimusolmukestatuksen ja suuren kasvaimen koon (T3, T4) lisäksi itsenäinen rintasyövän ennusteeseen vaikuttava riskitekijä. Tuloksemme ovat yhtenevät verrattuna aiemmin julkaistuun tutkimukseen, jossa hepsiinin matalan ilmentymisen osoitettiin olevan yhteydessä huonoon eturauhassyövän ennusteeseen [35]. Samassa tutkimuksessa olematon tai matala hepsiinin proteiinivärjäytyminen oli tyypillistä hyvänlaatuisissa eturauhasnäytteissä ja hepsiinin voimakas värjäytyminen tyypillistä syöpänäytteissä. Voimakkainta värjäytyminen oli eturauhassyövän esiasteissa (HG-PIN). Syöpänäytteissä olematon tai matala hepsiinin värjäytyminen oli kuitenkin yhteydessä koholla olevaan eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA) arvoon radikaalin poistoleikkauksen jälkeen ja suureen kasvaimen kokoon, jotka molemmat liittyvät lyhempään jäljellä olevaan elinaikaan. Toisessa tutkimuksessa sitä vastoin on esitetty, että TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen on suoraan verrattavissa eturauhassyövän levinneisyysasteeseen [36]. Toisaalta, matalan TMPRSS1:n ilmentymisen on osoitettu olevan itsenäinen munuaissyövän huonon ennusteen riskitekijä [37]. Samassa tutkimuksessa esitettiin, että hepsiinillä voi olla merkitystä sekä syövän alkuvaiheessa että myöhemmässä kehityksessä. Munuaissyövässä on esitetty myös päinvastoin, että hepsiinin yli-ilmentyminen olisikin yhteydessä huonoon ennusteeseen [38]. Maksasyövässä matalan TMPRSS1:n mrna-ilmentymisen on osoitettu ennustavan lyhempää elinaikaa [39]. Edellä esitetyt tulokset muissa kuin rintasyövässä kuvaavat hyvin vaihtelua eri tutkimusten välillä, mutta joka tapauksessa monet niistä ovat yhtenevät tutkimuksemme tulosten kanssa. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n ilmentyminen on yhteydessä rintasyövän uusiutumiseen ja että TMPRSS3:n matala mrna- ja proteiini-ilmentyminen ennustaa itsenäisesti lisääntynyttä etäpesäkkeiden ilmaantumisen riskiä. Häiriintynyt TTSP-ilmentyminen on liitetty useissa epiteliaalisissa syövissä syöpäsolujen leviämiseen primaarikasvaimesta ja metastasointiin [6, 40]. Vasioukhin on esittänyt, että hepsiinin yli-ilmentyminen mahdollisesti edesauttaa etäpesäkkeiden alkuvaiheen kehitystä eturauhassyövässä edistämällä syöpäsolujen leviämistä primaarikasvaimesta [31]. Hänen olettamuksensa mukaan syöpäsolujen leviämisen jälkeen hepsiinillä ei olisi enää merkityksellistä roolia etäpesäkkeissä. Tutkimuksessamme metastasointi oli todennäköisempää niillä potilailla, joiden primaarikasvaimissa todettiin tutkittujen geenien matala ilmentymistaso. Tämä tulos tukee teoriaa, että etäpesäkkeitä muodostuu todennäköisemmin, kun kasvaimen

30 kehityksessä on saavutettu tietty taso ja se taso saavutetaan proteolyyttisten seriiniproteaasien lisääntyneen ilmentymisen avulla. Matala TMPRSS3:n mrna- ja proteiini-ilmentyminen oli itsenäinen todennäköisemmän uusiutumisen riskitekijä, kun paikalliset taudin uusiutumiset ja etäpesäkkeet analysoitiin yhdessä. Toisaalta Srikantan ym. ovat esittäneet eturauhasyövässä tehdyssä solulinjatutkimuksessa, että hepsiinin yli-ilmentymisellä voisi olla syöpäkasvaimen kehitystä hillitseviä vaikutuksia [41]. He havaitsivat tutkimuksessaan, että eksogeenisesti lisätty hepsiini heikensi metastaattisten eturauhassyöpäsolujen kasvuominaisuuksia. MDA-MB-231- ja HER18-rintasyöpäsolulinjoissa tehdyssä tutkimuksessa puolestaan on osoitettu, että matala hepsiinin ilmentymistaso vähentää solujen elinkykyisyyttä ja pesäkkeiden muodostamista [14]. Wittig-Blaich ym. ovat osoittaneet solulinjatutkimuksessa, että eturauhassyövässä lisääntyneen hepsiinin ilmentymisen vaikutukset solutasolla riippuvat solun mikroympäristöstä [42]. He esittävät, että hepsiinin yli-ilmentymisen tulee olla alueellisesti ja ajallisesti rajattua syöpäkasvainten ja etäpesäkkeiden tehokasta kehitystä varten. Yhteenvetona aiemmin julkaistut tulokset tukevat teoriaa, että syövän kehitysvaiheesta riippuen hepsiinin ilmentyminen voi joko edistää tai vaimentaa syöpäkasvainten ja etäpesäkkeiden kehitystä. TTSP-perheen proteaasit sijaitsevat solujen pinnalla ja ne ovat proteolyyttisesti aktiivisia. Tähän ominaisuuteen perustuen ne voivat mahdollisesti edistää syöpäsolujen leviämistä primaarikasvainten ulkopuolelle. Hepsiinin useita substraatteja, kuten HGF ja upa, on yhdistetty epiteliaalisten syöpien kehitykseen. Hepsiini ja toinen TTSP-perheen proteaasi, matriptaasi, muuttavat tehokkaasti inaktiivisen pro-hgf:n biologisesti aktiiviseksi HGF:ksi, mikä edelleen aktivoi HGF-reseptori c-metin [21, 22]. Tämä johtaa tyvikalvon epäjärjestykseen ja vaurioihin. Hepsiinin poikkeavan yli-ilmentymisen aiheuttama HGF/c- Met-signalointireitin epänormaali aktivaatio voi mahdollisesti edistää syövän kehitystä. Lisäksi hepsiini muuttaa tehokkaasti pro-upa:a aktiiviseksi upa:ksi, mikä edelleen pilkkoo plasminogeenia plasmiiniksi, mikä johtaa solunulkoisen väliaineen hajottamisen alkamiseen [23]. Hepsiini edistää mahdollisesti syövän kehitystä ja etäpesäkkeiden muodostusta myös vaurioittamalla soluväliliitoksia. Miao ym. ovat osoittaneet solulinjatutkimuksessa ihmisen ja hiiren munasarjasyövässä, että hepsiinin yli-ilmentyminen edistää munasarjasyövän kehitystä desmosomeihin kohdistuvilla solukalvovaikutuksilla [43]. Tutkimuksessaan he esittivät immunofluoresenssin avulla, että soluliman lisäksi hepsiini sijoittuu desmosomien yhteyteen soluväliliitoksissa ja että hepsiinin solukalvopaikallistumista varten desmosomien tulee olla ehjiä. Heidän tuloksiaan mukaillen Partanen ym. ovat osoittaneet, että hepsiini

31 osittain sijoittuu desmosomin rakenneproteiinin desmoplakiinin yhteyteen ja rintasyövässä tämä yhteispaikallistuminen loppuu lkb1:n ilmentymisen loputtua [25]. Juuri lkb1:n menetys aiheuttaa hepsiinin siirtymisen desmosomeista solulimaan. Edellä mainitut aiemmin julkaistut tulokset viittaavat siihen, että hepsiinin yli-ilmentymisellä ja uudelleen paikallistumisella voi olla keskeinen rooli tyvikalvon hajoamisprosessin aloituksessa ja syöpäsolujen leviämisessä. Tutkimustulostemme analysointia rajoittaa se, että TMPRSS3:n ilmentymistä syövässä on tutkittu selvästi vähemmän kuin TMPRSS1:n ilmentymistä. Tulevaisuudessa olisi tärkeää tutkia tarkemmin TMPRSS3:n biologista roolia syövän kehityksessä. Joka tapauksessa tutkimuksemme osoittaa kliinisessä rintasyöpäaineistossa, että TMPRSS3 on uskottava rintasyövän ennusteellinen biomarkkeri. Aiemmin julkaistussa tutkimuksessa on esitetty, että hepsiinin yli-ilmentyminen rintasyövässä on yhteydessä positiiviseen kainaloimusolmukestatukseen ja levinneisyysasteeseen [14]. Löydös on päinvastainen tuloksiimme verrattuna, mutta aiemmassa tutkimuksessa ei ole tehty eloonjäämisanalyysejä ja tutkimusmenetelmät ovat olleet erilaiset. Lisäksi tuloksemme tutkittujen geenien ennusteellisesta vaikutuksesta vahvistettiin laajassa kansainvälisessä rintasyöpäaineistossa verkkotyökalun avulla [30]. Tutkimusasetelmaamme vastaten myös siinä aineistossa potilaat oli jaettu kahteen ryhmään TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n mrna-ilmentymisen mediaaniarvon mukaan. Verkkotyökalun avulla saaduissa Kaplan-Meierin elinaika-analyyseissä molempien tutkittujen geenien matala ilmentyminen liittyi selvästi huonompaan uusiutumisvapaaseen elinaikaan, kokonaiselinaikaan ja etäpesäkevapaaseen elinaikaan [30]. Yhteenvetona verkkoaineistossa rintasyövän ennuste TMPRSS1:n ja TMPRSS3:n suhteen oli täysin samanlainen kuin tutkimuksessamme. Kun yhdistimme hoitotiedot monimuuttuja-analyyseihin, säilyi matala TMPRSS1:n mrna-ilmentyminen itsenäisenä huonon ennusteen riskitekijänä sädehoidettujen potilaiden keskuudessa. Haluamme korostaa, että matala TMPRSS1 säilyi ainoana merkittävänä ennusteeseen vaikuttavana riskitekijänä näissä analyyseissä. Emme siis saaneet tilastollisesti merkitseviä tuloksia potilasjoukossa, jotka eivät saaneet mitään liitännäishoitoja. Kun TMPRSS1:n ilmentymistaso on korkea ja epiteeli vielä melko vahingoittumaton, voi säteilyn aikaansaama solukuolleisuus olla hyvinkin voimakasta rintasyöpäsoluissa. Vaikuttaakin siltä, että kun TMPRSS1-ilmentyminen on matalaa ja epiteelin rakenne jo valmiiksi vaurioitunut, niin myös jäljellä olevat rintasyöpäsolut ovat vastustuskykyisempiä säteilylle.