Gli2-transkriptiofaktorin merkitys kallon ja kasvojen luiden kehityksessä esitutkimus hiirimallin avulla

Gli2-transkriptiofaktorin merkitys kallon ja kasvojen luiden kehityksessä esitutkimus hiirimallin avulla Laura Maidell-Hjort, HLK Helsinki 11.4.2016 Tutkielma laura.maidell@helsinki.fi Ohjaaja: Prof. David Rice HELSINGIN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta

i HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Lääketieteellinen tiedekunta Laitos Institution Department Suu- ja leukasairauksien osasto Tekijä Författare Author Laura Maidell-Hjort Työn nimi Arbetets titel Title Gli2-transkriptiofaktorin merkitys kallon ja kasvojen luiden kehityksessä esitutkimus hiirimallin avulla Oppiaine Läroämne Subject Ortodontia Työn laji Arbetets art Level Tutkielma Aika Datum Month and year 11.4.2016 Sivumäärä -Sidoantal - Number of pages 26 Tiivistelmä Referat Abstract Osa kallon ja kasvojen luista kehittyy elimistön kannalta ainutlaatuisella tavalla intramembranoottisesti suoraan mesenkyymistä. Siten osteoblastien erilaistumista säätelevien geenien mutaatiot tulevat usein selkeästi esiin kallon ja kasvojen alueen kehityshäiriöinä. Gli2 on Hedgehog-signaalireitin transkriptioaktivaattori, jonka tiedetään vaikuttavan osteoblastien erilaistumiseen. Sen mutaatiot aiheuttavat pään alueella erityisesti keskiviivadefektejä kuten holoprosenkefaliaa ja siihen liittyvää fenotyyppiä. Kuitenkin Gli2:n merkityksestä kallon luiden kehittymiseen ja muodon määräytymiseen tiedetään varsin vähän. Tutkielma koostuu kirjallisuuskatsauksesta sekä pilottitutkimuksesta, jossa kuvataan Gli2-poistogeenisten hiirten alizarin red -värjättyjen kallojen ja kasvojen luiden morfologiaa, ja täten pyritään selvittämään Gli2:n merkitystä näiden luiden kehityksessä. Hiirillä havaitaan muun muassa luukudoksen kehityksen viivästymistä sekä etenkin kuonon ja otsan alueella synostoottisia luusaumoja sekä suulakihalkioita. Kallon ja kasvojen luuston kehityksen ymmärtäminen on välttämätöntä suulakihalkioiden ja kraniosynostoosien tutkimuksen ja hoitojen kehittämisen kannalta. (121 sanaa) Avainsanat Nyckelord Keywords Gli2; osteoblast; craniofacial development; morphogenesis; skull; Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Helda Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information

ii Sisällys 1 Johdanto... 1 2 Kallon kehitys... 2 2.1 Luutumistavat... 3 2.2 Sutuurat ja synkondroosit... 5 2.3. Solusignalointi kallon ja kasvojen luiden kehityksessä... 6 2.4 Gli2 -geeni... 9 3 Tavoitteet ja hypoteesi... 13 4 Tutkimusaineisto ja menetelmät... 14 4.1 Hiiret... 14 4.2 Kallojen kuvaaminen ja mittaus... 14 5 Tulokset... 16 5.1 Pieni ja pyöreä kallo... 17 5.2 Nenäluiden epämuodostumat... 17 5.3 Kapeat yläkasvot... 18 5.4 Premaxilla-luiden yhtyminen ja suulaen epänormaali kehittyminen... 19 5.5 Ylempien keskikasvojen retruusio... 20 6 Johtopäätökset... 20 6.1 Gli2:n roolista osteogeneesissä... 20 6.2 Gli2:n rooli sutuuroiden kehityksessä... 21 6.3 Gli2:n rooli suulaen kehityksessä... 22 6.4 Tutkimuksen rajoitukset ja tarkennusehdotuksia... 22 6.5 Tutkimuksen merkitys... 22 Lähteet... 24

1 1 Johdanto Sikiöaikana alkava kallon ja kasvojen luiden kehitys jatkuu pitkälle aikuisuuteen. Se on jo pelkästään molekyylibiologian, genetiikan ja kehitysbiologian kannalta varsin monimutkainen tapahtumaketju, joten yksiselitteisesti ja helposti ei voida kuvailla näiden luiden kehityshäiriöiden syntyä. Kuitenkin kallon ja kasvojen luiden kehityshäiriöiden syntymekanismien ymmärtäminen on oleellista niiden ennaltaehkäisyn, tutkimisen ja ennen kaikkea regeneratiivisen hoidon kannalta. Yleisimpiin kallon ja kasvojen luiden kehityshäiriöihin lukeutuvat muiden muassa suulakihalkiot sekä kraniosynostoosit, joissa kallon kahden tai useamman vastakkaisen luun reunat ovat ennenaikaisesti luutuneet yhteen. Huuli- ja suulakihalkiotapauksia on vuosittain noin 120 ja vastaavasti kallon kehityshäiriöitä tavataan Suomessa noin 50-70 vastasyntyneellä vuosittain. Tiedetään, että mutaatiot luusolujen erilaistumista säätelevissä geeneissä ilmenevät usein selkeästi kallon ja kasvojen luiden alueella, sillä niiden kehitysreitti muun kehon luustoon nähden on erilainen. Gli2 on eräs osteoblastisolujen erilaistumista aktivoiva geeni. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on lisätä kallon ja kasvojen luiden kehitystä selittävää tietoa selvittämällä, millainen merkitys Gli2-geenillä on edellä mainittujen luiden kehityksessä, sekä kuvailla epämuodostumia, joita kyseisen geenin puutos aiheuttaa. Tutkimus tehtiin Gli2- poistogeenisten hiiren sikiöiden kallojen ja kasvojen luiden muotoa sekä suhteita tarkastelemalla. GLI2 (ihmisen) ja Gli2 (muun eläimen) geenien vaikutusta kehitykseen ja kasvuun on tutkittu runsaasti. Koska Gli2 on oleellinen tekijä Sonic hedgehog solusignaalireitillä, havaitaan sen vaikutuksia lähes kaikkialla nisäkäsyksilöissä, ja tutkimuksissa onkin raportoitu laaja-alaisia kehityshäiriöitä Gli2-geenin poistoon tai mutaatioihin liittyen. Toisaalta suoraan kallon ja kasvojen luiden kehitykseen ja muodon määräytymiseen liittyen aiheesta ei löydy juurikaan tutkimustietoa hiirimalleilla tehtynä.

2 2 Kallon kehitys Pään luut voidaan jakaa kuuluvaksi neurokraniumiin ja viskerokraniumiin. Viskerokranium käsittää luut, joista muodostuvat kasvot sekä ruuansulatuskanavan ja hengitysteiden ylimmät osat. Neurokranium puolestaan ympäröi aivoja ja täten suojaa sekä tukee niitä. Neurokraniumin rakenteiksi voidaan laskea kuuluvan kallonpohja, kallon peitinluut ja sensoriset kapselit. (1) Neurokraniumin eli kallon luita on kahdeksan kappaletta: otsaluu (Os frontale), takaraivoluu (Os occipitale), kitaluu (Os sphenoidale), seulaluu (Os ethmoidale) sekä kaksi päälakiluuta (Os parietale) ja kaksi ohimoluuta (Os temporale). Kaikki edellä mainitut ovat peitinluiden lisäksi osallisina myös kallonpohjan muodostamisessa. Kasvojen luita viskerokraniumissa on neljätoista: kaksi nenäluuta (Os nasale), yläleukaluuta (Maxilla), kyynelluuta (Os lacrimale), poskiluuta (Os zycomaticum), suulakiluuta (Os palatinum), alempaa nenäkuorikkoa (Concha nasalis inferior) sekä yksi vannasluu (Vomer) ja alaleukaluu (Mandibula). (Kuva 1) Kuva 1. Täysikasvuisen ihmiskallon luut lukuun ottamatta suulakiluuta. Otsa- ja nenäluiden välillä on havainnollistettu valmiiksi kehittynyt sutuura.

3 2.1 Luutumistavat Kallon ja kasvojen eri luiden kehitys tapahtuu kahta kehitysreittiä pitkin: endokondraaliset luut kehittyvät rustomallin perusteella (lähinnä kallonpohja) ja membranoottiset luut suoraan mesenkyymistä (kallossa suurin osa peitinluista ja useimmat kasvojen luut). Sikiöaikainen kallonkehitys alkaa endokondraalisten luiden kehittymisellä, ja intramembranoottisten luiden kehitys käynnistyy myöhemmin kallonpohjan reunoilta. Pään luiden kehitys ei pääty sikiöaikana, vaan luiden väliset fontanellit, sutuurat ja synkondroosit sallivat normaalitilanteessa kallon muokkautumisen syntymisen aikana sekä aivojen kasvun postnataalisesti. Lisäksi luut kasvavat appositionaalisesti paksuutta ja resorboituvat siten, että kasvu pysyy normaalitilanteessa tasapainossa. (2) 2.1.1 Endokondraalinen luutuminen Endokondraalisen luutumisen lähtökohtana ovat kondrosyytit (rustoa muodostavia soluja), osteoblastit (luuta muodostavia soluja) ja osteoklastit (luuta resorboivia soluja). Kallonpohjan takaraivo-osan luutumiseen osallistuvat kondrosyytit ovat lähtöisin paraksiaalisesta mesodermistä ja muilta osin hermostopienan soluista. Osteoblastit erilaistuvat mesenkymaalisista kantasoluista ja osteoklastit hematopoieettisesta kantasolulinjasta. (1) Endokondraalista luutumista voidaan kutsua välilliseksi luutumiseksi, sillä mesenkymaaliset solut erilaistuvat ensin kondrosyyteiksi. Nämä jakaantuvat, kasvavat hypertrofisiksi ja alkavat erittää ruston väliainetta, pääsääntöisesti II-tyypin kollageenia. Rustokudoksesta muodostuu tulevan luun muotoinen malli. Kun rusto kalkkeutuu, kuolevat kondrosyytit apoptoottisesti ja kudos vaskularisoituu. Mesenkyymistä erilaistuvat osteoblastit muodostavat tilalle luuta. Osteoblastien ja osteoklastien vuorovaikutuksen seurauksena luun rakenne kypsyy lopulliseen muotoonsa. (3) Luun myöhempi kasvu edellyttää edellä mainittujen luuta muokkaavien solujen osallistumista remodellaatioon.

4 2.1.2. Intramembranoottinen luutuminen Kallon ja kasvojen luut ovat intramembranoottisen luutumisen suhteen ainutlaatuinen osa elimistöä: vain osa kallon peitinluista ja kasvojen luista sekä solisluut kehittyvät suoraan hermostopienan ektodermaalisesta mesenkyymistä sekä mesodermistä ilman rustoista mallia. Intramembranoottisen luutumisen pääsolut ovat luuta muodostavat osteoblastit ja resorboivat osteoklastit. (2) Intramembranoottinen luutuminen alkaa hermostopienan solujen vaeltamisella frontonasaaliulokkeen alueelle, jossa ne muuttuvat ektodermaalisesta mesenkymaaliseksi solukoksi. Näiden solujen proliferaatio aloittaa ensimmäisten mesenkyymitiivistymien kehittymisen otsa- ja nenäluun osalta supraorbitaalialueella. (4) Tämän jälkeen sidekudostiivistymät vaskularisoituvat ja mesenkyymisolukko erilaistuu preosteoblastivaiheen kautta osteoblasteiksi. Kasvojen luut siis alkavat kehittyä sikiökautisten kasvoulokkeiden mesenkyymitiivistymistä ja kallon peitinluut kehittyvät aivojen kovakalvon ja ihon välisessä mesenkyymikäytävässä. (2) Kallon peitinluiden ja kasvojen luiden mineralisoituminen alkaa, kun osteoblastien erittämä luun väliaine on tuotettu koko kyseisten luiden alueelle. Mineralisaatio alkaa supraorbitaalialueelta otsa- ja nenäluista ja etenee säteittäin kraniaali- ja dorsaalisuuntaan. (4) Intramembranoottisesti kasvava luu paksuuntuu sekä luuytimen että periostin pinnalla. Luiden muoto ja koko määräytyvät pitkälti ympäröivien kudosten säätelemänä. Esimerkiksi Meckelin rusto ohjaa alaleukaluun kehitystä, hampaan aihe indusoi alveoliharjanteen kehittymisen ja aivojen kovakalvo on vuorovaikutuksessa kallon peitinluiden kanssa niiden kehittyessä. Kasvojen luuston kasvuun vaikuttaa myös puremalihasten aktiviteetti. Lopullisen muodon saavuttaminen riippuu osteoblastien ja osteoklastien suhteesta sekä niiden välisestä kommunikaatiosta. (2), (3)

5 Kun kahden intramembranoottisesti kehittyvän luun kasvureunat kohtaavat, väliin jää mesenkyymisutuura. Sutuuran molemminpuolinen luukehitys jatkuu vielä syntymän jälkeen pitkälle yksilön aikuisuuteen, kunnes liitos luutuu kiinni. (4) 2.2 Sutuurat ja synkondroosit Kallon ja kasvojen luiden kehitys ei pääty sikiöaikana. Kallon peitinluiden ja kasvojen luiden osalta vastasyntyneellä luiden saumoissa on aukkoja, jotka ovat sidekudoksen peittämiä, luutumattomia fontanelleja, jotka mahdollistavat alatiesyntymän aikaisen kallon muovautumisen. (2) Kun kahden luun reunat kasvavat lähes kiinni toisiinsa, syntyy luuliitos, sutuura, joka kehittyy 20-30 ikävuoteen saakka ennen luutumistaan umpeen. (5) Lapsen kallon peitinluiden avoimet sutuurat mahdollistavat aivokudoksen kasvun ja kallon suhteiden muovautumisen kasvun vaiheissa. Kuitenkin jo kaksivuotiaalla lapsella aivojen koko on 80% aikuisen yksilön aivoihin nähden, joten valtaosa pään luiden kasvusta tapahtuu ensimmäisten elinvuosien aikana. (6) Sutuuroiden kasvukeskustehtävän lisäksi ne toimivat eräänlaisina sidekudosnivelinä, jotka pitävät kallon ja kasvojen luut yhdessä. (7) On havaittu, että sutuuroiden sikiöaikaista kehitystä ohjaa pääsääntöisesti aivojen kovakalvon ja intramembranoottisen luun välinen vuorovaikutus. Sen sijaan syntymän jälkeen sutuuroiden sulkeutuminen riippuu enenevissä määrin luureunojen keskinäisestä vuorovaikutuksesta. (8) Sutuuran mesenkyymillä ei ole itsenäistä kasvupotentiaalia, joten kallon ja kasvojen luiden kasvu tapahtuu vastakkaisten luiden reunoilla. (9) Endokondraalisesti kehittyvässä kallonpohjassa sutuuroita vastaavat rustoiset synkondroosit. Niissä rusto kasvaa kahteen suuntaan. Rakenne on verrattavissa putkiluun kahden epifyysilevyn yhdistämiseen. Se sallii täten kallonpohjan kasvun, muotoutumisen ja adaptoitumisen aivojen kasvuun. Synkondroosit kuitenkin luutuvat suhteellisen varhain alkaen neljän vuoden iästä. (2)

6 Sutuuroiden ja synkondroosien tunnetuimpia kehityshäiriöitä ovat huuli- ja suulakihalkiot sekä kraniosynostoosit, joissa edellä mainitut sutuurat ja synkondroosit luutuvat ennenaikaisesti kiinni. Tämä aiheuttaa kallonsisäisen paineen kasvun ja sen seurauksena kallon sekä kasvojen epämuodostumia luutuvista saumoista riippuen. Kraniosynostoosit voivat epämuodostumien lisäksi aiheuttaa neuropsykologisia kehityshäiriöitä ja vakavimmillaan ovat letaaleja. (10) 2.3. Solusignalointi kallon ja kasvojen luiden kehityksessä Kehityksellisiin tapahtumiin liittyy aina solujen vaellusta, liittymistä toisiinsa, jakautumista ja erilaistumista. Eri geeniperheet ja niistä muodostuvat solusignaalireitit ohjaavat edellä mainittuja solutoimintoja ja siten myös luiden kehitystapahtumia. Pään rakenteiden kehittymisessä aktiivisena on jopa 95% yksilön geeneistä. Kallon ja kasvojen rakenteiden sekä aivojen kehitykseen olennaisimmin liittyviä ja hyvin tunnettuja signalointiperheitä on useita. Tässä yhteydessä perehdytään neljään geneettisesti hyvin konservoituneeseen perheeseen: Hedgehog, Wnt, Tgfβ ja Fgf. (9) On huomattava, että minkään edellä mainitun signaaliperheen toiminta ei ole itsenäistä, vaan niiden vuorovaikutus ja yhteistyö luiden kehityksessä on monisyistä. 2.3.1 Hedgehog signalointi Nisäkkäillä Hedgehog-solusignaalireitin käynnistää joko Sonic hedgehog - (Shh), Indian hedgehog - (Ihh) tai Desert hedgehog (Dhh) proteiinin kiinnittyminen Patched reseptoriin, joka inaktivoituu ja täten sallii Smoothened-reseptorin aktivoitumisen. Smoothened puolestaan aktivoi soluliman transkriptiofaktoreita. Hedgehogsignaloinnin (Hh) tiedetään olevan tärkeässä roolissa useissa sikiönkehityksen vaiheissa. Se osallistuu solujen erilaistumiseen, jakautumiseen sekä selviytymiseen erilaisissa ympäristöissä. (9) Shh ja Ihh ovat luunmuodostuksen avainsäätelijöitä. Shh-signaalireitin tiedetään osallistuvan endokondraalisessa luutumisessa mesenkyymitiivistymien sijainnin ja muodon määrittämiseen. Ihh-signalointi puolestaan on välttämätöntä osteoblastien

7 erilaistumisessa. (11) Ihh:lla on lisäksi erityinen merkitys epifyysirustojen kasvun säätelyssä. (2) Hedgehog-signaloinnin määrällä on merkitystä pään ja kasvojen keskiviivarakenteiden muotoutumisessa. Hedgehog-signaloinnin vähentäminen aiheuttaa keskiviivahypoplasiaa, holoprosenkefaliaa, jossa kahta erillistä aivopuoliskoa ei kehity, vaan aivot jäävät yksilohkoiseksi rakenteeksi, sekä kyklopiaa eli yksisilmäisyyttä. Toisaalta Hedgehog-aktiivisuuden lisäämisen tiedetään aiheuttavan hypertelorismia ja frontonasaalia dysplasiaa. (7) Ihh-poistogeenisten hiirten suulakiluun muodostuminen on voimakkaasti häiriintynyt ja deleetioon liittyy myös suulakihalkioita. (12) 2.3.2 Wnt signalointi Wnt-signaalireitillä ligandi on vuorovaikutuksessa Frizzled-kalvoreseptorin kanssa, joka aktivoi Disheveled-välittäjän solulimassa. Tämä käynnistää erilaisia solunsisäisiä signaalikaskadeja, jotka eroavat toisistaan reitistä riippuen. (9) Wnt-signalointi on tärkeässä asemassa varhaisessa sikiönkehityksessä useissa kehitysprosesseissa kuten solukohtalon säätelyssä, alkion kaavoittumisessa ja elinten kehittymisessä. Näin ollen Wnt-reitin mutaatioiden seurauksena tavataan moninaisia kehityshäiriöitä. Luun kehityksen osalta on havaittu Wnt-signaalireitin inaktivoivien mutaatioiden yhteydessä luukudoksen hypoplasiaa ja pientä tiheyttä. Toisaalta vastaavat aktivoivat mutaatiot aiheuttavat normaalia suurempaa luun tiheyttä, osteopetroosia. Myös raajojen epämuodostumia tavataan. (11) Wnt-signaloinnilla tiedetään olevan tärkeä merkitys hermostopienan solujen proliferaatiossa ja siten aivojen, kallon ja kasvojen rakenteiden muodostumisessa. Wntsignalointi säätelee kasvojen ulokkeiden epiteelin fuusioitumista, joten sen häiriöt ovat usein osallisina kasvojen halkioissa. (7)

8 2.3.4 Tgfβ signalointi Tgfβ-perhe on erittäin laaja ja sisältää esimerkiksi luun kehityksessä välttämättömät Bmp:t (Bone morphogenetic protein). Ligandit sitoutuvat reseptori-seriini/treoniinikinaaseihin ja kuten muidenkin signaalireittien osalta, myös Tgfβ-reitin aktivaation lopputuleman tiedetään riippuvan solua ympäröivistä tekijöistä. Signaalireitillä on perustavanlaatuinen merkitys elinten kehityksessä, kantasolulinjojen erilaistumisessa, immuunipuolustuksessa ja syövän kehittymisessä. (9) Tgfβ2 vaikuttaa kallon luun kehityksessä osteoblastien ilmentämänä ja se indusoi mesenkymaalisia soluja erilaistumaan osteoblasteiksi. Toisaalta mesenkyymisolut ilmentävät Tgfβ3:a, jonka rooli on inhiboida kyseisten solujen erilaistumista. Näiden tekijöiden vuorovaikutus on oleellista sutuuroiden kehittymisessä ja muodostumisessa. (13) Bmp-2 kykenee indusoimaan mesenkyymin erilaistumisen luuta tuottaviksi soluiksi. Runx2 on Bmp-reitillä vaikuttava proteiini, joka estää endokondraalisessa luutumisprosessissa kondrosyyttien kypsymistä ja toimii luutumisen alkuvaiheessa merkittävänä kytkijänä mesenkyymin erilaistumisessa osteoblasteiksi. Myös intramembranoottisessa luutumisessa Runx2 on välttämätön tekijä ja RUNX2-geeniä inaktivoivien mutaatioiden yhteydessä tavataankin kehityshäiriöitä kuten kleidokraniaalista dysplasiaa. (9) Runx2-poistogeenisillä hiirillä luuta ei kehity lainkaan, mutta endokondraalisesti kehittyvän luuston tilalle muodostuu kuitenkin rustoinen tukiranka. (2) Vastaavasti Osx-poistogeenisillä hiirillä on tutkittu luun jäävän kehittymättä osteoblastien erilaistumisen inhibition vuoksi. (11) Msx2 toimii myös Bmp-reitillä transkriptiotekijänä. Tämän geenin liiallisen aktivaation on havaittu aiheuttavan kraniosynostooseja, kun puolestaan Msx1- tai Msx2- poistogeenisillä hiirillä kallon peitinluut kehittyvät vajavaisesti ja molempien geenien suhteen homotsygootteina otsaluut ja päälakiluut eivät lainkaan. (7) Alx4-geenin

9 mutaatiot vastaavat fenotyypiltään Msx2-mutaatioita. Foxc1-geenin merkityksen on toistaiseksi todettu olevan välttämätön vain hiiren kallon peitinluiden kehityksessä. (2) 2.3.5 Fgf signalointi Monimutkaiset tyrosiinikinaaseihin lukeutuvat Fgf-signaalireitit solussa aktivoivat MAPkinaaseja. Fgf-signaloinnilla on luun kehityksen osalta merkitystä osteoblastien erilaistumisen kiihdyttäjänä ja se osallistuu sekä endokondraaliseen että intramembranoottiseen luutumiseen. (13) Fgf-signalointi voi yliaktivoitua mutaation seurauksena esimerkiksi Fgf1-3 geeneissä tai muissa reittiin vaikuttavissa osissa kuten Msx2- tai Twist-geeneissä. Näiden geenien mutaatioiden tiedetään monesti esiintyvän kraniosynostoosien yhteydessä, jossa kallonpohjan, peitinluiden tai kasvojen luiden sutuurat sulkeutuvat liian varhain eikä aivojen kasvulle ole tarpeeksi tilaa. Tästä syntyy vaikutuksen alaisesta saumasta tai saumoista riippuen erilaisia kallon epämuodostumia. (2) Fgf-signaloinnilla on tärkeä rooli muun muassa luun, verisuonten ja aivojen kehityksessä. (9) Kallon ja kasvojen luiden sutuuroiden morfogeneesissä Fgf-signalointi on jatkuvassa vuorovaikutuksessa muiden osteogeenisten reittien kanssa, esimerkkeinä jo mainitut Msx2 ja Twist sekä Bmp ja muut Tgfβ-signaalireittien proteiinit. (11) Sutuuroiden kehityksessä tärkeässä roolissa ovat Tgfβ2- ja Tgfβ3 geenit, joista ensimmäistä ilmentävät osteoblastit kehittyvän luun reunoilla ja jälkimmäistä mesenkyymisolukko näiden luiden välissä. Tgfβ2 indusoi mesenkyymisolukkoa erilaistumaan osteoblasteiksi, kun vuorostaan Tgfβ3 inhiboi erilaistumista. (13) 2.4 Gli2 -geeni Gli2 on hyvin konservoitunut geeni erityisesti nisäkkäillä. Gli2 on sytoplasminen C2H2- tyyppinen sinkkisormitranskriptiotekijä, joka tarttuu DNA:n kaksoiskierteen suurempaan uurteeseen. Kyseinen proteiini konsentroituu erityisesti solujen primaarisiilioihin. Gli-perheen proteiinit (Gli1-3) toimivat Sonic hedgehog (Shh)

10 signaalireitin välittäjinä. Shh-reitillä Gli2 toimii Smoothened-kalvoproteiinin aktivoimana DNA-transkription suhteen pääsääntöisesti aktivaattorina. (14) 2.4.1 Gli2:n toiminta Hedgehog-signaalireitillä Hedgehog-proteiinit ovat solujen erittämiä signaalimolekyylejä, jotka toimivat paikallisina välittäjinä ja morfogeeneinä kehittyvissä kudoksissa. Hedgehog-välittäjät vaikuttavat Patched- (Ptc), Smoothened- (Smo) ja ihog-solukalvoproteiineihin, jotka käynnistävät solunsisäisen signaalikaskadin. Gli2 on sytoplasminen proteiini, joka edellä mainittujen proteiinien aktivoimana kulkeutuu tumaan ja toimii DNA:han sitouduttuaan pääsääntöisesti transkriptioaktivaattorina. (14) (Kuva 2) Hedgehog-signalointi kiihdyttää soluproliferaatiota ja siten sen liiallinen aktiivisuus voi johtaa kallon kehityksessä kraniosynostooseihin. (4) Toisaalta Smoothenedkalvoproteiinin inaktivoimisen ja siten Gli2:n vaimentamisen tiedetään aiheuttavan kehityshäiriöitä kuten kyklopiaa ja holoprosenkefaliaa. Lisäksi kaukasialaisessa aikuisväestössä yleisimmät syöpätyypit ovat tyvisolukarsinoomia ja myös niiden syntyyn vaikuttaa liiallinen Hedgehog-aktivaatio. (14)

11 Kuva 2. Hedgehog-solusignaalireitti ja Gli2:n sijainti reitillä. Kuva lainattu. (15) 2.4.2 Gli2:n merkitys osteoblastien erilaistumisessa Osteoblastien prekursorisolujen on havaittu ilmentävän pinnallaan Hedgehogsignaloinnin Ptc1- ja Smo-reseptoreita. Näiden välittämä signaalikaskadi saa Gli2:n aktivoimaan Bmp-2-geenin transkriptiota. Täten Gli2 indusoi osteoblastien erilaistumista aktivoimalla voimakkaasti Bmp-2 geenin ilmentymistä toimimalla sen suorana transkriptioaktivaattorina. Bmp-2 puolestaan on välttämätön tekijä osteoblastien erilaistumisessa. Toisaalta Gli2:lla on myös synergistinen vaikutus Bmp- 2:n kanssa, jolloin se vahvistaa Bmp:n vaikutusta luumatriksin muodostumisessa. Gli2 on Gli-perheen transkriptiotekijöistä ainoa, jolla on kyky vahvistaa Bmp:n vaikutusta. (16)

12 2.4.3 Gli2:n merkityksestä kallon kehityksessä hiirillä Gli2-transkriptiofaktori osana Hedgehog-signaalireittejä on merkittävä tekijä sikiönkehityksessä. Se osallistuu muun muassa tärkeässä roolissa hermostoputken dorsoventraalisen kaavoittumisen. (17) Geenin puuttuessa tavataankin säännöllisesti keskushermostollisia epämuodostumia kuten aiemmin mainittua, tyypillistä holoprosenkefaliaa tai holoprosenkefalian kaltaista fenotyyppiä, jossa erilliset aivopuoliskot jäävät jopa kokonaan kehittymättä ja aivot muodostuvat yksilohkoiseksi rakenteeksi. Toimiva Gli2-geeni on välttämätön normaalissa endokondraalisessa luun kehityksessä. Sillä on kriittinen rooli Ihh-signaalireitillä osteoblastien erilaistumisessa ja ruston vaskularisoitumisessa. (18) On havaittu, että epäkypsien kondrosyyttien määrä lisääntyy rustokudoksessa Gli2-poistogeenisillä hiirillä. Lisäksi mineralisoituneen ruston resorptio ja luun muodostus vähenevät huomattavasti. (19) Gli2-poistogeenisillä hiirillä havaitaan kallon luuston osalta monia epämuodostumia. E10,5:n ikäiset sikiöt ovat keskimääräistä pienikokoisempia ja pienipäisempiä. E14,5- päiväisillä sikiöillä kallon muoto on litistynyt, otsa- ja päälakiluiden muoto ei ole normaali ja kallon luutuminen on viivästynyt. Sekä ylä- että alainkisiivien puutokset ovat tyypillisiä ja alaleukaluun koko on keskimääräistä pienempi. Valtaosalla homotsygooteista Gli2 -/- -hiiristä vallitsevana fenotyyppinä on lisäksi suulakihalkio. (20) Gli2 -/- -hiirien inkisiivipuutosten ajatellaan liittyvän suoraan holoprosenkefalialöydöksiin. (21) Edellä mainittujen lisäksi Gli2-geenin puuttuminen aiheuttaa pään alueella keityshäiriöitä temporomandibulaarinivelessä (22) ja sisäkorvassa (23). Myös hypopituitarismi kuuluu yleisimpien Gli2-defektien kirjoon. (24)

13 2.4.4 GLI2:n merkityksestä sikiönkehityksessä ihmisillä Vaikeat GLI2-mutaatiot ihmisellä ovat usein letaaleja joko jo sikiöaikana tai viimeistään pian syntymän jälkeen. Ihmisillä pään alueen GLI2:een liittyvien kehityshäiriöiden kuvataan olevan samankaltaisia kuin hiirimalleillakin saadut tulokset, ja erilaisten fenotyyppien kirjo on suuri. Holoprosenkefalia tai holoprosenkefalian kaltaiset piirteet, keskikasvojen hypoplasia, hypotelorismi ja suulaki- sekä huulihalkiot ovat yleisiä löydöksiä. (25) Yksilöistä ja mutaatiovarianteista riippuen tavataan myös esimerkiksi silmän puutoksia, silmäkuopan kehityshäiriöitä sekä heminasaalia aplasiaa. (26) Äärimmillään holoprosenkefaliaan voi liittyä kyklopiaa ja proboscis, nenämäinen lisäke. (2), (27) 3 Tavoitteet ja hypoteesi Hh-signaloinnin tiedetään vaikuttavan luuston kehitykseen, joten kyseisten signaalireittien olennaisen transkriptiofaktorin puuttumisen voidaan olettaa estävän Hh-signalointia ja siten heikentävän sen vaikutuksia luun muodostuksessa. Lisäksi aiempien tutkimusten tulokset Gli2:n aiheuttamista kallon ja kasvojen luiden epämuodostumista sekä luuston kehityksen hidastumisesta vahvistavat edellistä olettamusta. Hypoteettisesti voidaan arvioida, että Gli2 -/- -hiirten kalloissa havaitaan vähintään keskiviivahypoplasiaa kasvojen alueella. Muitakin yleisesti holoprosenkefaliaan liittyviä piirteitä on odotettavissa. Lisäksi voidaan olettaa kallon ja kasvojen luiden olevan villityyppiin verrattuna pienempiä ja myöhässä kehityksen suhteen. Tutkimuksen tavoitteena on kuvailla kallon ja kasvojen luiden epämuodostumia, joita Gli2-geenin poistaminen hiirillä aiheuttaa ja siten määrittää Gli2-geenin roolia näiden luiden kehittymisessä.

14 4 Tutkimusaineisto ja menetelmät 4.1 Hiiret Tutkimuksen aineistona käytettiin Gli2-poistogeenisten hiirten sikiöiden kalloja, jotka ovat peräisin professori Andrea Vortkampin laboratoriosta Duisburg-Essenin yliopistosta. (28) Kalloja on 11 kappaletta, joista kolme sikiöiältään 16,5 päivää (E16,5) ja kahdeksan 18,5 päivän (E18,5) ikäisiä. Nuoremmista sikiöistä yksi on villityypin hiiri, toinen genotyypiltään Gli2 -/-, Ihh -/- ja kolmas Gli2 +/+, Ihh -/-. Vanhemmista sikiöistä kolme edustaa Gli2 -/- -genotyyppiä, neljä Gli2 +/- -genotyyppiä ja yksi on villityypin hiiri. Taulukossa 1 hiiret on esitellään siten, että pystysarakkeittain neljä allekkaista kalloa edustavat samaa yksilöä. Alimmilla neljällä rivillä esitellään E16,5-ikäiset kaksi sikiötä kahdessa pystysarakkeessa. (Taulukko 1) 4.1.1 Kallojen värjäys Hiiret on käsitelty alizarin-punavärillä, joka värjää mineralisoituneen luukudoksen purppuranpunaiseksi. Muita värjäysmenetelmiä ei käytetty, joten rustoiset, endokondraalisen luutumisen epäkypsät osat kalloista eivät kuvaudu. Hiirimalleilla E15,5-ikäinen sikiö vastaa luutumisen osalta noin 10 viikon ikäistä ihmissikiötä. 4.2 Kallojen kuvaaminen ja mittaus Kuvaamiseen käytössä olleen laitteiston mikroskooppi on tyypiltään Olympus BX41, kamera Colorview II (Soft Imaging System) ja ohjelmisto Analysis. Mittaukseen käytettiin Adobe Photoshop ohjelmaa. Hiirten kallot kuvattiin mikroskooppiavusteisesti sagittaali-, koronaali- ja transversaalisuunnista. Transversaalikuvaus toteutettiin sekä kaudaalisesta että kraniaalisesta näkökulmasta. Lisäksi kuvattiin nasaaliluita kraniaalisesta suunnasta katsottuna kohtisuoraan luun tasoon nähden.

15 ikä villityyppi Gli2 -/- Gli2 -/- Gli2 -/- E18,5 A B C D E18,5 E F G H E18,5 I J K L M N O P E18,5 Q R E16,5 S T E16,5 U V E16,5 E16,5 W X Taulukko 1. Tutkittuja kalloja. Kuvat I-L ja U-V kuvattu kraniaalisesti nenäluun tasossa ja M-P sekä W-X kaudaalisesti transversaalitasossa.

16 Kuva 3. E18,5-ikäisen villityypin hiiren kallon sivuprofiili, jossa n, nenäluu; pm, premaxilla; y, yläleukaluu; a, alaleukaluu; o, otsaluu; p, päälakiluu ja t, takaraivoluun interparietaalinen osa. Kuva 4. E18,5-ikäisen villityypin hiiren kallon yläprofiili, jossa n, nenäluu; pm, premaxilla; o, otsaluu; p, päälakiluu ja t, takaraivoluun interparietaalinen osa. Kuva 5. E18,5-ikäisen villityypin hiiren kallon alaprofiili, jossa pm, premaxilla ja y, yläleukaluu.

17 5 Tulokset Tutkimuksessa havaittiin, että Gli2-poistogeenisten hiirten kallon ja kasvojen kehitys ei etene normaalisti. Päiden luissa nähdään useita epämuodostumatyyppejä verrattuna villityypin hiiriin ja niiden normaaliin kallon ja kasvojen kehitykseen. 5.1 Pieni ja pyöreä kallo Gli2 -/- -poistogeenisten hiirten (E18,5) keskimääräinen kallon pituus mitattuna takaraivoluun interparietaaliosan takareunasta nenäluun etureunaan on 90,0% villityypin hiiren kallon pituudesta ja leveys 94,9%. E16,5-hiirillä vastaavasti 93,0% ja 98,0%. Lisäksi kallojen pituus-leveyssuhteista voidaan todeta, että Gli2 -/- -hiirillä on pienempi ja pyöreämpi kallo verrattuna villityypin hiiriin. (Taulukko 1 ja 2) E18,5 E18,5 E16,5 E16,5 Gli2 -/- Gli2 +/+ Gli2 -/- Gli2 +/+ Kallon pituus 59,62 (±3,32) 66,21 53,52 57,52 Kallon leveys 40,44 (±1,76) 42,63 39,17 39,98 Kallon pituus/leveys 1,47 (+0,15/-0,14) 1,55 1,37 1,44 Taulukko 2. Kallon mittasuhteita. Mitat ovat suhdelukuja ja keskiarvoja. 5.2 Nenäluiden epämuodostumat Nenäluiden pituusmittaus tehtiin keskiviivan kohdalta luun posteriorisesta reunasta anterioriseen reunaan ja leveys mitattiin edellä mainitun suoran keskikohdasta. Leveysmittaan laskettiin molemmat nenäluut, sillä ne ovat täysin yhtyneet osalla poistogeenisistä hiiristä. Gli2 -/- -hiirten nenäluut ovat silmämääräisestikin kapeita eikä kahden nenäluun välillä havaita suturaa lainkaan 18,5 päivän ikäisillä sikiöillä. Toisaalta kaksi kehityspäivää nuoremmilla sikiöillä havaitaan selkeästi kaksi erillistä, kehittyvää nenäluuta. (Taulukko 1, kuvat I-L ja U-V) Nenäluiden ennenaikaiseen yhtymiseen liittyy tutkituilla hiirillä myös epänormaali sierainten kehitys ja mikroskoopilla tarkasteltaessa mahdollisesti vain yksi sierain, jossa ei havaita nenän normaalia väliseinää.

18 Myös otsaluiden välinen sutuura välittömästi nenäluiden posterioripuolella vaikuttaa kaventuneen huomattavasti ja jopa luutuneen umpeen lyhyeltä matkalta. Tämän synostoosin tarkasteleminen kuvista ei kuitenkaan ole täysin luotettavaa. (Taulukko 1, kuvat I-L ja U-V) Nenäluiden pituudessa ei havaita merkittävää eroa, mutta Gli2 -/- -hiirten nenäluiden leveys on vain 76% villityypin hiireen verrattuna. Ne ovat myös pituuteensa suhteutettuna kapeita. Nenäluiden pituuden suhteessa kallon pituuteen ei ole merkittävää eroa, mutta Gli2 -/- -hiirten nenäluut ovat kapeampia kallon leveyteenkin suhteutettuna verrattuna villityypin hiireen. (Taulukko 3) Nenäluut eivät olleet luotettavasti mitattavissa E16,5-hiiriltä. E18,5 E18,5 Gli2 -/- Gli2 +/+ Nenäluun pituus 25,24 (±0,81) 26,01 Nenäluiden leveys 17,35 (±2,64) 22,74 Nenäluiden pituus/leveys 1,45 (+0,32/-0,23) 1,14 Nenäluun pituus/kallon pituus 0,42 (+0,04/-0,04) 0,39 Nenäluun leveys/kallon leveys 0,43 (+0,09/-0,08) 0,53 Taulukko 3. Nenäluiden mittasuhteita. Mitat ovat suhdelukuja ja keskiarvoja. 5.3 Kapeat yläkasvot Gli2 -/- -hiirten yläkasvot ovat kapeat. Otsaluun leveys mitattiin silmien välistä nenäluun posteriorisen reunan kohdalta E18,5-hiiriltä. Villityypin hiiriin verrattuna Gli2- poistogeenisten hiirten silmien välinen etäisyys on 80,0% ja kallon leveyteen suhteutettuna keskikasvot ovat myös villityypin hiirtä kapeammat. (Taulukko 1, kuvat I- L ja U-V), (Taulukko 4) E18,5 E18,5 Gli2 -/- Gli2 +/+ Orbitojen välimatka 31,21 (±4,86) 39,03 Orbitojen välimatka/kallon leveys 0,77 (+0,16/-0,15) 0,92 Taulukko 4. Keskikasvojen leveys. Mitat ovat suhdelukuja ja keskiarvoja.

19 5.4 Premaxilla-luiden yhtyminen ja suulaen epänormaali kehittyminen Premaxilla-luut muodostavat hiirellä suulaen etuosan. Kaudaalisuunnasta tarkasteltuna kaikilla E18,5 Gli2 -/- -hiirillä premaxilla-luut ovat fuusioituneet keskilinjassa. Kuitenkaan E16,5 sikiöllä premaxillan kehityksessä ei havaita merkittävää eroa saman ikäiseen villityypin hiireen verrattuna. E18,5-ikäisten Gli2 -/- -hiirten premaxilla-luun takaosan leveys on fuusioitumisen ja epämuodostumisen vuoksi vain 75,1% villityypin hiiren premaxillasta. Se on myös nenäluiden tavoin kapeampi suhteutettuna kallon leveyteen. (Taulukko 1, kuvat M-P ja W-X), (Taulukko 5) E18,5-Gli2 -/- -hiirillä luiden yhtymisen lisäksi nähdään inkisiivikanavan aukon olevan huomattavasti pienempi ja sijaitsevan kokonaan yläleukaluussa posteriorisesti, kun taas villityypin hiirellä vastaava aukon anteriorinen osa muodostuu premaxillasta ja posteriorinen yläleukaluusta. Keskiarvoista mitattuna Gli2 -/- -hiirten inkisiivikanavan aukon etureunasta takareunaan mitattu pituus on vain 18,1% villityypin hiiren aukosta. (Taulukko 1, kuvat M-P ja W-X), (Taulukko 5) E18,5 E18,5 E16,5 E16,5 Gli2 -/- Gli2 +/+ Gli2 -/- Gli2 +/+ Premaxillan leveys 15,03 (±2,10) 20,02 17,88 16,73 Premaxillan leveys/kallon leveys 0,37 (+0,07/-0,07) 0,47 0,46 0,42 Inkisiiviaukon pituus sagittaalisuunnassa 3,89 (±0,35) 21,47 Taulukko 5. Palatinaalisia mittoja. Mitat ovat suhdelukuja ja keskiarvoja. Kolmesta E18,5-ikäisestä Gli2 -/- -hiirestä yhdellä nähdään selkeä yläleuan luiden muodostama suulakihalkio. (Taulukko 1, kuva P) Tällä yksilöllä keskiviivastaan yhtyneet premaxilla-luut ovat takaosastaan leveämmät kuin niillä, joille ei ole kehittynyt suulakihalkiota. Toisaalta kahdella muullakaan hiirellä suulaen luut eivät ole kehittyneet normaalisti. (Taulukko 1, kuvat N-O) Halkio kuitenkin aiheuttaa suurimman variaation premaxilla-luiden leveysmittoihin.

20 5.5 Ylempien keskikasvojen retruusio Sagittaalikuvissa havaitaan kvalitatiivisesti selkeä ylempien keskikasvojen retruusio, jonka kvantitatiiviseen todentamiseen valokuvat eivät ole tässä yhteydessä riittäviä. (Taulukko 1, kuvat A-D ja Q-R) Röntgenkuvauksen avulla olisi mahdollista tehdä tarkempia kefalometrisiä mittauksia. 6 Johtopäätökset Tutkittaessa Gli2 -/- -poistogeenisten hiirisikiöiden kalloja havaittiin tässä tutkimuksessa merkittäviä poikkeamia normaalista kallon ja kasvojen kehityksestä. Mielenkiintoisimpana yksityiskohtana havaitaan yhtyneet nenäluut, jotka villityypin hiirillä kehittyvät erillisinä ja liittyvät toisiinsa sutuuran välityksellä. Kaikilla tutkituilla E18,5-ikäisillä Gli2 -/- -hiirillä sen sijaan nenäluut ovat keskiviivastaan lähes koko pituudeltaan yhtyneet. Kehitysiältään nuoremmilla sikiöillä luut ovat vielä erilliset. Lisäksi hiirillä vaikuttaa olevan ainoastaan yksi sierain ilman nenän väliseinää. Kuonon osalta myös suulaen luut ovat kehittyneet epänormaalisti. Premaxilla-luut ovat ennenaikaisesti yhtyneet keskiviivastaan. Toisaalta yhdellä Gli2 -/- -hiirellä havaitaan tämän lisäksi myös suulakihalkio ja muilla suulakiluut ovat muilla tavoin epämuodostuneet. Edellä mainitun lisäksi Gli2-geenin puuttumisesta seuraa keskimääräistä pienempi pään koko, ja kallo on muodoltaan pyöreämpi verrattuna villityypin hiireen. Yläkasvot jäävät kapeiksi ja keskikasvot vaikuttavat retrognaattisilta. 6.1 Gli2:n roolista osteogeneesissä Toimivat Hedgehog-perheen signaalireitit ovat normaalin sikiönkehityksen kannalta välttämättömiä. Gli2:n välittäessä niiden tärkeää transkriptioaktivaattorin tehtävää, on selvää, että sen toiminnan häiritseminen tai estäminen aiheuttaa laaja-alaisia

21 kehityshäiriöitä kaikissa kehityksellisissä yhteyksissä, joissa Hedgehog-signalointi on osallisena. Gli2-geenin puuttumisen voi olettaa suoraan vaikuttavan luiden kehittymiseen, sillä sen tiedetään olevan tärkeä Bmp-välitteinen tekijä osteoblastien erilaistumisessa. Gli2- poistogeenisille hiirille kuitenkin kehittyy mineralisoitunutta luukudosta, mutta luiden muodon kehitys häiriintyy ja osteogeneesin hidastumisen seurauksena luut ovat myös kokonsa puolesta kehityksestä reilusti jäljessä, minkä vuoksi tutkittujen hiirten kallot ovat villityyppiä pienemmät. 6.2 Gli2:n rooli sutuuroiden kehityksessä Se, että tutkituilla hiirillä sutuurat ovat ennenaikaisesti sulkeutuneet nenäluiden, premaxillan ja osittain otsaluiden alueella, viittaa siihen, että Gli2:lla on rooli sutuuroiden kehittymisessä. Muiden kallon ja kasvojen sutuuroiden sulkeutumattomuus voi tässä tapauksessa johtua joko siitä, että kallon kehitys on niin keskeneräistä E18,5 -ikäisillä sikiöillä, etteivät saumat ole vielä ehtineet luutua tai siitä, että kyseisten saumojen alueella ilmentyy tekijöitä, jotka kompensoivat Gli2:n sutuuroiden sulkeutumista kiihdyttävää vaikutusta. Joka tapauksessa tutkituilla hiirillä synostoosit ovat vahvasti polarisoituneet kuonon alueelle ja keskiviivaan, mikä viittaa suoraan holoprosenkefaliaan liittyviin löydöksiin. Toisaalta on myös oletettavaa, että jos useissa saumoissa on odotettavissa synostooseja, kuonon alueen ja etenkin nenä- ja otsaluiden sutuurat sulkeutuvat ensimmäisinä, sillä päässä luun muodostus ja mineralisaatio alkaa kyseiseltä alueelta. Sutuuran ennenaikaiseen sulkeutumiseen tarvitaan poikkeuksetta suhteellisen kiihtynyt osteoblastiaktivaatio. Gli2:n suhdetta osteoblastien erilaistumiseen pohdittaessa jää kuitenkin epäselväksi, millä mekanismilla tässä tapauksessa kranio- ja fakiaalisynostoosit aiheutuvat. Tässä tapauksessa lieneekin kyseessä ennemmin häiriö kallon ja kasvojen luiden kaavoittumisessa kuin itse osteoblastien erilaistumiseen

22 vaikuttaminen. Toisaalta Gli2:n mutaatioiden tiedetään aiheuttavan keskiviivahypoplasiaa, joten kapeat kasvot ja yhdistyneet nenäluut sopivat tähän havaintoon. 6.3 Gli2:n rooli suulaen kehityksessä Holoprosenkefalialöydöksiin liittyvä suulakihalkiofenotyyppi esiintyy tässä tutkimuksessa yhdellä E18,5 -ikäisellä hiirisikiöllä, mutta tavallisesti halkio on varsin yleinen löydös Gli2-mutaatioiden yhteydessä. Suulakihalkion olemassa olosta voidaan todeta Gli2:n osallistuvan myös suulaen kaavoittumiseen. 6.4 Tutkimuksen rajoitukset ja tarkennusehdotuksia Olennaisin rajoite tässä tutkimuksessa on aineiston pienuus. Sekä Gli2 -/- - että villityypin hiiriä tulisi tulosten tarkkuuden lisäämiseksi olla useampia. Lisäksi erilaisten fenotyyppien prevalenssi kävisi selkeämmäksi useammilla malleilla. Myös se, että aineisto on toistaiseksi kuvattu ainoastaan tavanomaisella kameralla, rajoittaa näytteiden mittausta. Röntgenkuvaus mahdollistaisi kallojen tarkemman ortognaattisen tutkimisen. Koronaalileikkeet Gli2 -/- -hiirten kasvoista ja kalloista toisivat ihanteellista lisätietoa etenkin nenäluiden saumojen ennenaikaisen yhtymisen tarkempaan tutkimiseen ja sierainten väliseinien olemassaolon selvittämiseen. Lisäksi keskiviivahypoplasiaan osallistuvien solusignalointimekanismien tarkempi tutkiminen, kuten geenien ilmentyminen kallon ja kasvojen luuston sekä saumojen alueella, selventäisi paremmin Gli2:n roolia luusaumojen sulkeutumisessa ja luiden kaavoittumisessa. 6.5 Tutkimuksen merkitys Tämän tutkimuksen voi luokitella pilottitutkimukseksi, jossa alustavasti kartoitetaan Gli2-geenin poistosta aiheutuvia epämuodostumia kallon sekä kasvojen luissa ja joka ohjaa aiheen jatkotutkimuksien suuntaa. Kallon ja kasvojen luiden monimutkaisen kehityksen ymmärrys puolestaan on välttämätöntä erityisesti kehityshäiriöiden

23 hoitomenetelmien kehittämisen kannalta ja joka tapauksessa lisää ymmärrystä terveenkin kallon ja kasvojen kehitysbiologiasta.

24 Lähteet (1) Schoenwolf GC, Larsen WJ. Larsen's human embryology. 4th ed. Philadelphia: Elsevier/Churchill Livingstone; 2009. (2) Sariola H, Frilander M. Kehitysbiologia: solusta yksilöksi. 2 uud p ed. Helsinki: Duodecim; 2015. (3) Reunanen H, Oksa V, Dadu E, Välilehto O, Lammi M, Rilla K, et al. Solunetti. 2006; Available at: www.solunetti.fi. Accessed 3/13, 2016. (4) Veistinen L. Role of Gli3 during intramembranous calvarial bone development. 2015-06-05. (5) AG Vijay K, Swapnil SA, Binay KB, Shivaramu MG and Ravindra SH. Journal of Forensic Research 1970 Jan 01(10):1-3. (6) Pattisapu JV, Gegg CA, Olavarria G, Johnson KK, Ruiz RL, Costello BJ. Craniosynostosis: Diagnosis and Surgical Management. Atlas of the Oral and Maxillofacial Surgery Clinics 2010 9;18(2):77-91. (7) Mishina Y, Snider TN. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Exp Cell Res 2014 Jul 15;325(2):138-147. (8) Kim HJ, Rice DP, Kettunen PJ, Thesleff I. FGF-, BMP- and Shh-mediated signalling pathways in the regulation of cranial suture morphogenesis and calvarial bone development. Development 1998 The Company of Biologists Ltd;125(7):1241-1251. (9) Richtsmeier JT, Flaherty K. Hand in glove: brain and skull in development and dysmorphogenesis. Acta Neuropathol 2013 03/23;125(4):469-489. (10) Hukki J, Saarinen P, Kangasniemi M, Niemela M. Yksinkertaiset kraniosynostoosit. Duodecim 2007;123(8):967-976. (11) Lattanzi W, Bernardini C. Genes and Molecular Pathways of the Osteogenic Process. In: Lin Y, editor. Osteogenesis: InTech; 2012. p. 21-56. (12) Levi B, James AW, Nelson ER, Brugmann SA, Sorkin M, Manu A, et al. Role of Indian Hedgehog Signaling in Palatal Osteogenesis. Plast Reconstr Surg 2011 03;127(3):1182-1190. (13) Burgos-Flórez FJ, Gavilán-Alfonso ME, Garzón-Alvarado DA. Flat bones and sutures formation in the human cranial vault during prenatal development and infancy: A computational model. J Theor Biol 2016 3/21;393:127-144.

25 (14) Alberts B. Molecular biology of the cell. 5th ed. New York: Garland; 2008. (15) Illustration reproduced courtesy of Cell Signaling Technology, Inc. 2014; Available at: www.cellsignal.com. Accessed 4/5, 2016. (16) Zhao M, Qiao M, Harris SE, Chen D, Oyajobi BO, Mundy GR. The zinc finger transcription factor Gli2 mediates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts in response to hedgehog signaling. Mol Cell Biol 2006 Aug;26(16):6197-6208. (17) Lebel M, Mo R, Shimamura K, Hui C. Gli2 and Gli3 play distinct roles in the dorsoventral patterning of the mouse hindbrain. Dev Biol 2007 2/1;302(1):345-355. (18) Joeng KS, Long F. The Gli2 transcriptional activator is a crucial effector for Ihh signaling in osteoblast development and cartilage vascularization. Development 2009 The Company of Biologists Ltd;136(24):4177-4185. (19) Miao D, Liu H, Plut P, Niu M, Huo R, Goltzman D, et al. Impaired endochondral bone development and osteopenia in Gli2-deficient mice. Exp Cell Res 2004 3/10;294(1):210-222. (20) Mo R, Freer AM, Zinyk DL, Crackower MA, Michaud J, Heng HH, et al. Specific and redundant functions of Gli2 and Gli3 zinc finger genes in skeletal patterning and development. Development 1997 The Company of Biologists Ltd;124(1):113-123. (21) Hardcastle Z, Mo R, Hui CC, Sharpe PT. The Shh signalling pathway in tooth development: defects in Gli2 and Gli3 mutants. Development 1998 The Company of Biologists Ltd;125(15):2803-2811. (22) Purcell P, Joo BW, Hu JK, Tran PV, Calicchio ML, O'Connell D,J., et al. Temporomandibular joint formation requires two distinct hedgehog-dependent steps. Proc Natl Acad Sci U S A 2009 07/17;106(43):18297-18302. (23) Bok J, Dolson DK, Hill P, Rüther U, Epstein DJ, Wu DK. Opposing gradients of Gli repressor and activators mediate Shh signaling along the dorsoventral axis of the inner ear. Development 2007 The Company of Biologists Ltd;134(9):1713-1722. (24) Cohen LE. GLI2 mutations as a cause of hypopituitarism. Pediatr Endocrinol Rev 2012 Aug;9(4):706-709. (25) Bear KA, Solomon BD, Antonini S, Arnhold IJP, França MM, Gerkes EH, et al. Pathogenic mutations in GLI2 cause a specific phenotype that is distinct from holoprosencephaly. Journal of Medical Genetics 2014 June 01;51(6):413-418.

26 (26) Bertolacini C, Ribeiro-Bicudo L, Petrin A, Richieri-Costa A, Murray J. Clinical findings in patients with GLI2 mutations? phenotypic variability. Clin Genet 2012;81(1):70-75. (27) Roessler E, Du Y, Mullor JL, Casas E, Allen WP, Gillessen-Kaesbach G, et al. Loss-offunction mutations in the human GLI2 gene are associated with pituitary anomalies and holoprosencephaly-like features. Proceedings of the National Academy of Sciences 2003 November 11;100(23):13424-13429. (28) Kesper DA, Didt-Koziel L, Vortkamp A. Gli2 activator function in preosteoblasts is sufficient to mediate ihh-dependent osteoblast differentiation, whereas the repressor function of Gli2 is dispensable for endochondral ossification. Developmental Dynamics 2010;239(6):1818-1826.