ANTIGEENIEN PAIKANTAMINEN SOLUBLOKEISTA LabQuality-päivät 8.2.2007 Antero Laasonen, Johanna Varpula, Tarja Ylimäki Seinäjoen keskussairaala Patologian osasto
YLEISTÄ Solublokkeja (histoblokkeja) valmistetaan kun: diagnoosin kannalta perusteltua ja näytemäärä huomioiden mahdollista Tänä päivänä suuri osa sytologisista näytteistä solupreparaateiksi solusentrifuugimenetelmällä Papa- ja viskooseja solunäytteitä lukuun ottamatta nopeus, halpa, tasalaatuisuus, soluhävikistä huolimatta useimmiten luotettava jos riittävästi henkilökuntaa ja näytemateriaalia saadaan fiksoimattomana - erikoistutkimukset mahdollisia säilyvyys?, fiksatiivin valinta?
Solusentrifuugivalmiste alkoholilla fiksoidun solunäytteen säilyminen valmiita PAPA-värjättyjä preparaatteja yleensä vain 1 tai korkeintaan muutama Immunohistokemiallisia värjäyksiä näistä voidaan yrittää purkamalla preparaatti (dokumentti?) ja hyvällä onnella ja arvauksella saadaan IHC tulos onnistuminen antigeenikohtainen kestävätkö solut värjäysprosessin
Solublokki/histoblokkitekniikka Käytössä pitkään agar-aggregointi, kaupallinen menetelmä (Shandonin sytoblok) agar-menetelmä työläs, solusaalis usein disaggregoituu agariin valettaessa Shandonin menetelmässä reunaefekti ja solujen imeytyminen kartonkiin eli molemmissa menetelmissä tiiviin solusaaliin saaminen ongelmana, soluhävikki valaminen ongelma HE:n lisäksi useita leikkeitä IHC-värjäyksiin
Solublokki/histoblokkitekniikka Plasma-trombiiniaggregointimenetelmä (PT) Tanskassa Aalborgin sairaalassa käytetty menetelmä sittemmin myös Suomessa esifiksoitu näyte sentrifugoidaan, sekoitetaan plasmaan ja aggregoidaan trombiinilla jälkifiksoidaan formaldehydillä, prosessointi valuvaiheessa selkeä preparaatti solusaalis usein hyvä
Solublokki/histoblokkitekniikka Opinnäytetyössä selvitettiin PT- aggregointimenettelytapa solupaketin tiiviys saostushetkellä/mikroskoopissa aggregointi: ennen fiksointia /fiksoinnin jälkeen Millä solumäärällä saadaan aikaiseksi blokki, joka on riittävä IHC värjäyksiä ajatellen solut laskettiin natiivista ja parafiiniin valetusta näytteestä Fiksatiivi: ETOH (50%)/PEG (5%) + jälkifiksointi formaldehydillä (4%) / pelkkä formaldehydi (4%) antigeenien säilyminen
PROSESSI
Näytetyypit Bal (11),virtsa (10), pleura (5), ascites (2) Valinta: saatavuuden perusteella ja tieto että ainakin virtsa ja bal-tyypeissä niukkoja näytteitä bal- ja virtsanäytteistä ei rutiinisti valmisteta sytoblok-näytteitä näytteen valmistus: ensin diagnostinen näyte ja loppuosa tutkimukseen
Paikannettavat antigeenit Bal: CD3, CD4, CD8, CD45 (LCA) Virtsa: CK-pan+,CK7, CK20, EMA, VIM, MOC-31 Pleura: CK-pan+, CK5/6, CD15, BerEP4, Moc 31 Ascites: CK-pan+, Calretinin, CK5/6, VIM
Immunohistokemiallinen menetelmä Käytimme samaa tekniikkaa kuin normaaleille kudosnäytteille esikäsittelyt vasta-ainelaimennukset osoitusmenetelmä (Powervision +)
Tulokset PT- menetelmä yhdistettynä Shandonin sytoblok menetelmään oli selvästi parempi aggregoimis-menetelmä kuin pelkkä Shandonin agar-menetelmä saadaan tiivis kompakti solupreparaatti (Kati Sorvali 2004 PT/Agar)
Tulokset Testaamistamme näytetyypeistä saatiin suhteellisen vähäisilläkin solumäärillä aikaiseksi riittävä solublokki (2 4 x 10 5) aina parempi mitä suurempi solusaalis ei kovin suurta eroa solusaaliissa aggregoitiinko natiivina vai fiksaation jälkeen poikkeuksena virtsanäytteet (tavanomainen normaali virtsa huono näytetyyppi - epiteelisolut poikkileikkautuvat kunnon tiivistä soluaggregaattia ei saatu pienillä solumäärillä aikaiseksi)
Tulokset: Aggregointimenetelmä Sentrifugoi näyte mielellään 50 ml:n putkissa Fiksoi solut 200ul-1000 ul:lla fiksiä n. 1-2 t HL:ssa (näyte voidaan laittaa jääkaappiin odottamaan prosessointia) Lisää 0.9 NaCl:a putki täyteen ja sentrifugoi näyte Pese näyte vielä 0.9% NaCl:lla (voi jättää pois?) Sekoita solunappi varovasti tuoreeseen plasmaan Tiputa tuoretta härän trombiinia päälle sekoita varovasti ravistellen näytettä Pasteur-pipetillä Shandonin sytoblokkiin, formaliinifiksaatio ja kudoskuljettimeen
Tulokset: Immunohistokemia Näytteet voitiin esikäsitellä ja värjätä samoin periaattein kuin tavalliset histologiset leikkeet Sytologiset näytteet fiksoituvat nopeasti ja vasta-aineita joudutaan laimentamaan Keratiiniantigeenit: ETOH/PEG+formaliinijälkifiksoiduissa näytteissä keratiinien paikantaminen onnistui yhtä luotettavasti kuin formaliinifiksoiduissa näytteissä
Tulokset: Immunohistokemia Ber EP4, Calretiniini, EMA ja erityisesti CD-antigeenien paikantaminen onnistui luotettavammin formaldehydillä fiksoiduista näytteistä kuin ETOH/PEGfiksoiduista näytteistä CD-antigeenien kohdalla ETOH/PEGfiksatiivi huonontaa selkeästi antigeenien säilymistä, vaikka solut jälkifiksoitiin formaldehydillä > saadaan negatiivinen tulos jos antigeenin määrä solussa vähäinen
Tulokset: Immnohistokemia Virtsanäytteissä tutkimukseen saatu näytemäärä oli aivan liian pieni varmojen johtopäätösten tekemiseksi
Formaliinifiksaatio PT aggregointi
Virtsa: Form/ETOH-PEG Formaliini PEG
Pleura BerEP4 Form/PEG Formaliini PEG
Pleura Moc 31 Form/PEG Formaliini PEG
Bal CD3 Formaliini/PEG Formaliini PEG
Johtopäätökset PT-aggregointi paras tapa tuottaa solublokkeja vaatii hienosäätöä - soluja riittävästi tutkimukseen Formaldehydifiksaatio immunohistokemian kannalta luotettavampi kuin ETOH/PEG + jälkifiksointi formaldehydillä IHC-menetelmä: sama kuin parafiinileikkeille
Johtopäätökset Vaihtoehtoja: tärkeät näytteet tuoreena tai kahdessa eri fiksatiivissa, joista toinen on formaldehydi (formaldehydi-fiksoitu näyte voi odottaa jääkaapissa) Tuoreet sytosentrifuugivalmisteet fiksaatio tulee päättää pian - työläs
Virtsanäyte