Hapettunut LDL-kolesteroli akuutissa koronaarisyndroomassa

Transkriptio

1 Hapettunut LDL-kolesteroli akuutissa koronaarisyndroomassa Olga Rimpilä LK HUS, Sisätautien yksikkö Helsinki Tutkielma Ohjaaja: Marja-Riitta Taskinen LT, prof. em., Marit Granér LT HELSINGIN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta

2 i HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Lääketieteellinen tiedekunta Laitos Institution Department HUS, Sisätautien yksikkö Tekijä Författare Author Olga Rimpilä Työn nimi Arbetets titel Title Hapettunut LDL-kolesteroli akuutissa koronaarisyndroomassa Oppiaine Läroämne Subject Sisätaudit Työn laji Arbetets art Level Tutkielma Tiivistelmä Referat Abstract Aika Datum Month and year Sivumäärä -Sidoantal - Number of pages Tutkimuksessa selvitetään oksidatiivisen stressin yhteyttä akuuttiin sepelvaltimotautioireyhtymään. Tämä tehdään vertaamalla veren hapettuneen LDL-kolesterolin pitoisuuksia kolmessa potilasryhmässä. Siinä pohditaan myös LDL-kolesterolin käyttöä biologisena merkkisuureena diagnostiikassa. Tällä hetkellä ei ole biomarkkeria, joka osoittaisi akuutin sydrooman vaarassa olevat potilaat. Hapettuneen LDL-kolesterolin pitoisuus määritettiin potilaiden plasmasta ELISA-menetelmää käyttäen. Tulokset tukevat työhypoteesia ja tutkimus antaa arvokasta tietoa suomalaisten statiinilääkitystä käyttävien sepelvaltimotautipotilaiden oksidatiivisestä stressistä. Avainsanat Nyckelord Keywords Oxidation, LDL, acute coronary syndrome, coronary artery disease Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information

3 ii Lyhenteet NCA SAP ACS LDL OxLDL HDL TG Normal coronary arteries Stable angina pectoris, stabiili rasitusrintakipu Acute coronary syndrome, akuutti koronaarisyndrooma Low density lipoprotein Oxidized LDL, hapettunut LDL-kolesteroli High density lipoprotein Triglyceride, triglyseridi MPO Myeloperoksidaasi PON1 Paraoksonaasi 1 hs-crp High-sensitivity C-reactive protein ELISA BMI NYHA Enzyme-linked immunosorbent assay Body Mass Index, painoindeksi New York Heart Association

4 iii Sisällysluettelo 1 Johdanto Sepelvaltimotauti Patogeneesi: lipidit ja tulehdus Tutkielman kuvaus Kirjallisuuskatsaus Muuttunut käsitys sepelvaltimotaudista LDL:n hapettumisen mekanismit Oksidaatio sepelvaltimotaudissa Aineisto COROGENE Ryhmien kuvaus Diabetes mellitus Menetelmät Näytteiden käsittely ELISA Spektrofotometria Muut määritykset Tilastollinen analyysi Tulokset Pohdinta OxLDL:n merkitys diagnostiikassa Tutkimuksen arviointi Lähteet Liite Liite

5 1 1 Johdanto 1.1 Sepelvaltimotauti Sepelvaltimotauti on maailmanlaajuisesti yleinen tauti, jonka esiintyvyys on jatkuvassa kasvussa. Suomessa vielä 2003-luvulle asti se oli yleisin syy työikäisten miesten ennenaikaisiin kuolemiin (1). Vuonna 2009 Kansaneläkelaitoksen korvausta sai ihmistä, mutta taudin arvellaan olevan alidiagnosoitu, erityisesti sen lievemmät muodot (2). Ateroskleroosi ilmenee paitsi sepelveltimotautina myös aivojen ja kaulasuonten valtimoissa tuottaen elämää rajoittavia oireita. Lisäksi se on syynä klaudikaatiolle eli ns. katkokävelylle, kun se manifestoituu alaraajan valtimoissa. Sepelvaltimotaudille altistavia tekijöitä tunnetaan runsaasti (ks. taulukko 1). Niistä tärkeimmät ovat veren suuri low density lipoprotein-kolesterolin (LDL) pitoisuus, kohonnut verenpaine ja tupakointi, joihin kaikkiin voidaan puuttua primaariprevention merkeissä. Sepelvaltimotaudin kaksi ilmenemismuotoa ovat krooninen (stabiili angina pectoris, stabiili rasitusrintakipu) ja akuutti taudinkuva. Kroonisessa taudissa ohimenevä hapenpuute aiheuttaa kipua silloin, kun sydänlihas tarvitsee tavallista enemmän verta esimerkiksi rasituksessa. Oireet alkavat yleensä vasta, kun tauti on edennyt niin pitkälle, että valtimon läpimitta on ahtautunut enemmän kuin 50 %. Ne voidaan kliinisesti luokitella NYHA-järjestelmän mukaan perustuen taudin auheuttamaan suorituskyvyn laskuun. Akuutti koronaarisyndrooma (ACS) on sateenvarjodiagnoosi, jonka alle kuuluu useita erilaisia oireita ja jonka määritteleminen on käytännössä vaikeaa (3). Akuutti koronaarisyndrooma voidaan nähdä ateroskleroosin omana ilmenemismuotona, mutta myös kroonisen sepelvaltimotaudin akuuttina vaiheena. Se voi olla myös taudin ensioire. ACS:n taustalla on aina valtimon seinämässä olevan ateromaattisen plakin vaurio, joka johtaa hyytymisjärjestelmän ja verihiutaleiden aktivaatioon. Tämän seurauksena verisuoni tukkeutuu ja distaalisempana oleva kudos kärsii hapenpuutteesta. Iskemia l. hapenpuute muuttaa sydänlihassolujen kykyä supistua ja johtaa sähkökemiallista signaalia. Laajan vaurion seurauksena sydän ei pysty tarkoituksenmukaisesti pumppaamaan verta itseään ravitseviin sepelvaltimoihin,

6 2 aivoihin ja muualle elimistöön ja kehittyy sydämen vajaatoiminta. Usein vaurio aiheuttaa myös rytmihäiriöitä, kuten kammiovärinää, jotka voivat johtaa kuolemaan. Akuutti koronaarisyndrooma ei reagoi tavallisiin sydänlaskimoita laajentaviin lääkkeisiin (nitraatit) ja vaatii aina sairaalatason hoitoa ja tukkeutuneen sepelvaltimon avaamista lääkkeellisesti tai kirurgisesti. Vielä ei tiedetä, miksi joillain ihmisillä sepelvaltimotaudin ensioire on ACS. Myöskään ei tiedetä, miksi toisilla krooninen sepelvaltimotauti ei koskaan ilmene ACS:na ja toisilla taas sepelvaltimotauti johtaa siihen statiini- ja muista hoidoista huolimatta. Taudin biokemiallisia suureita (ns. biomarkkereita) on useita ja viime vuosina niitä on löydetty jatkuvasti lisää. Tällä hetkellä kliinisessä käytössä on vain diagnostisia merkkiaineita, kuten herkkä spesifinen CRP ja troponiini. Taulukko 1. Sepelvaltimotaudin riskitekijät Muutettavissa olevat Suurentunut veren LDL-pitoisuus Suurentunut veren triglyseridipitoisuus Matala veren HDL-pitoisuus Suurentunut Lp(a)-pitoisuus Tupakointi Ei-muutettavissa olevat Ikä Sukupuoli Perinnölliset tekijät Krooninen tulehdustila Kohonnut verenpaine Diabetes Ylipaino Psyykkiset tekijät Veren hyytymiseen liittyvät tekijät Ravintoon liittyvät tekijät 1.2 Patogeneesi: lipidit ja tulehdus Aterooman kehitys alkaa, kun verisuonen sisäpintaa verhoava endoteeli vaurioituu usean riskitekijän vaikutuksesta. Endoteelivaurion seurauksena suonen intimakerrokseen alkaa kertyä LDL-kolesterolipartikkeleita. Tämä muuttaa

7 3 endoteelisolujen geeniekspressiota ja ne alkavat ilmentää proteiineja, jotka toimivat veren valkosolujen adheesiomolekyyleinä. Se puolestaan saa veren valkosolut hakeutumaan valtimon intimakerrokseen ja aktivoitumaan siinä. Monosyytit ja T- lymfosyytit hapettavat suonen lipidikertymää sekä erittävät viestimolekyylejä, mikä edistää tulehdusreaktiota ja houkuttelee lisää puolustussoluja paikalle. (Kuva 1 liitteessä 1.) Hapettuessa kolesterolin proteiiniosa muuttuu olennaisesti, jolloin se pystyy sitoutumaan makrofagin pinnalla olevaan ns. scavenger-reseptoriin. Tämän seurauksena kolesteroli otetaan soluun sisään endosytoottisesti säätelemättömällä mekanismilla. Makrofagi ei pysty poistamaan kertynyttä LDL:ää ja sitä alkaa kasautua niiden solulimaan rasvapisaroina (4). Muodostuu vaahtosoluja, jotka lopulta ohjautuvat apoptoosiin. Vaahtosolujen hajotessa lipidijäte vapautuu aterooman soluväliaineeseen. (Kuva 2 liitteessä 1.) Leukosyyttien viestimolekyylit saavat mediakerroksen sileälihassolut siirtymään mediakerroksesta intiman sisälle. Ne alkavat jakautua ja erittää soluväliaineita, mm proteoglykaaneja. Soluväliaineen proteoglykaanit taas sitovat lipoproteiineja altistaen ne oksidatiivisille ja entsymaattisille modifikaatioille (5). Näin LDL-kolesterolin kulku pois suonesta vaikeutuu edelleen ja se on entistäkin alttiimpi hapettumiselle. Plakin kasvaessa sydänverisuonen läpimitta pienenee, jolloin verenkierto voi heiketä ko. valtimon suonittamalla alueella ja aiheuttaa siinä kroonisen hapenpuutteen. Taudin vakavimmat muodot aiheuttaa aina kuitenkin plakin vaurio, kuten sen pinnan repeämä tai koko aterooman hajoaminen (rupturaatio), mikä aktivoi hyytymistä edistävät mekanismit ja lopulta johtaa verisuonen tukkeutumiseen (6). Tämän havainnollistaa kuva 3 liitteessä 1. Useiden lipidien on todettu osallistuvan sepelvaltimotaudin kehittymiseen. Rasvaaineenvaihdunnassa on useita osioita, joilla jokaisella on oma merkityksensä. LDL- ja HDL-kolesteroli ovat tärkeimmät tekijät. LDL on partikkeli, joka koostuu proteiini- ja rasvaosasta. Sen fysiologinen tehtävä on kuljettaa rasvaa perifeerisille kudoksille. HDL kuljettaa rasvoja periferiasta maksaan ja näitä lipidejä pidetäänkin toisilleen usein toiminnaltaan vastakkaisina. Kansankielessä puhutaan ns. hyvästä ja pahasta kolesterolista.

8 4 Ateroskleroosin kannalta oksidatiivinen stressi on avainasemassa. Se on todettu liittyvän kaikkiin toistaiseksi tunnettuihin taudin riskitekijöhin (7), joten se on olennainen taudin kehittymisen kannalta. Oksidaatio muuttaa lipidien ominaisuuksia, jolloin niistä tulee proaterogeenisiä eli taudinkehitystä edistäviä. Ne mm. käynnistävät paikallisen tulehdusreaktion verisuonen seinämässä sekä tarttuvat makrofagien scavenger-reseptoreihin, jolloin muodostuu vaahtosoluja. Kirjallisuuskatsauksessa käydään läpi oksidaation merkitystä taudin patogeneesissa ja akutisoitumisessa. 1.3 Tutkielman kuvaus Tämän työn tarkoitus on selvittää suomalaisessa aineistossa oksidatiivisen stressin merkitystä akuutissa sepelvaltimotaudissa. Hapettunut LDL (oxldl) on hyvä merkkisuure osoittamaan oksidatiivistä stressiä ACS.ssä (8). Työhypoteesimme on, että veren hapettuneen LDL-kolesterolin korkeat tasot ovat yhteydessä akuuttiin sepelvaltimotaudin vaiheeseen myös statiinilääkitystä käyttävillä suomalaisilla. Tässä tutkimuksessa on verrattu kolmen potilasryhmän veren lipidi-, oksidaatio ja tulehdusprofiilia määrittämällä plasman biologisten markkereiden pitoisuuksia. Tutkielmassa keskitytään tarkastelemaan hapettuneen LDL-kolesterolin tasoja ja selvitetään niiden eroja potilasryhmissä. Kirjallisuuskatsauksessa käydään tarkemmin läpi LDL-kolesterolin hapettumisen mekanismeja ja merkitystä erityisesti akuuteissa tapahtumissa. Aineisto- ja menetelmäluvut kuvastavat tutkimuksen asetelmia. Tulokset on esitetty omana lukunaan. Lopuksi pohdinta-osiossa käydään läpi tutkimuksen tulosten merkitystä sekä arvioidaan tutkimuksen luotettavuutta ja menetelmien kestävyyttä. 2 Kirjallisuuskatsaus 2.1 Muuttunut käsitys sepelvaltimotaudista Ateroskleroosia on pitkään pidetty degeneratiivisena tautina, joka väistämättömänä kuuluu vanhenemiseen (9). Nykyään huolimatta siitä, että taudin mekanismeja ei

9 5 täysin ymmärretä, ollaan kuitenkin sitä mieltä, että se on vältettävissä oleva sairaus. Tämän takia huomio kohdistuu aiempaa enemmän taudin primaaripreventioon taudille alttiilla henkilöillä sekä tehokkaaseen sekundaaripreventioon jo siihen sairastuneilla. Vaikka taudin ilmaantuvuus on kasvussa, yhä suurempi osa potilaista välttää akuuteista tapahtumista johtuvia taudin vakavia muotoja. Kansainvälisessä yli 52 maata kattavassa tutkimuksessa todettiin 90 % sydäninfarkteista liittyvän riskitekijöihin, joihin voisi vaikuttaa (10). Käsitys taudin luonteesta on muuttunut pelkästä lipidikertymähäiriöstä kohti kroonista tulehdustilaa (6). Nykykäsityksen mukaan molemmat ilmiöt ovat keskeisellä tavalla läsnä taudissa ja ovat vuorovaikutuksessa (11). Statiinit ovat lääkeryhmä, joka alentaa LDL-kolesterolin pitoisuutta veressä ja siten merkittävästi vähentää päätetapahtumia. Niiden käytöstä huolimatta vaara saada ACS on sepelvaltimotautipotilailla noin 50 %. (12) Tällä hetkellä ajankohtainen tutkimuksen aihe on selvittää, miten voidaan diagnosoida taudinmuodot, jotka johtavat akuutteihin tapahtumiin. Toisin sanoen, kuinka diagnosoida ateroomat, jotka ovat alttiita hajoamiselle. 2.2 LDL:n hapettumisen mekanismi LDL-kolesterolin hapettumista aiheuttaa oksidatiivinen stressi. Sillä tarkoitetaan tilaa, jossa elimistön kyky neutraloida hapettavia aineita on riittämätön suhteessa oksidaatiokuormaan. Hapettunutta LDL:a löydettiin ateroskleroottisista plakeista jo vuonna 1989 (13). Tuolloin oli vielä avoimena kysymyksenä, siirtyykö hapettunut partikkeli verisuonen seinämään vai tapahtuuko hapettuminen paikallisesti. Nykyään uskotaan kolesterolipartikkelien siirtyvän verisuoniin natiiveina ja oksidaation tapahtuvan vasta intimakerroksessa. Tätä tukee useampi seikka. Ensinnäkin veressä on suuri pitoisuus antioksidatiivisesti vaikuttavia aineita, jotka estävät LDL-hiukkasen hapettumista. Lisäksi maksa poistaa nopeasti hapettuneet partikkelit scavengerreseptoriensa kautta eivätkä ne pääse kertymään verisuoniin. Plakin oxldl-pitoisuus voi olla jopa 70-kertainen verrattuna plasmassa kiertävään (14). Hapettumisessa voidaan nähdä kaksi osittain samanaikaista tapahtumaa: lipidiperoksidaatio ja apolipoproteiini B:n modifikaatio (15). Lipidiperoksidaation on

10 6 hyvin tarkkaan kuvannut Ylä-Herttuala jo vuonna 1994 (16). Hapettuminen tapahtuu kolmessa vaiheessa. Initiaatiossa vapaa radikaali käynnistää reaktion tyydyttymättömien rasvahappojen kanssa. Reaktio etenee (propagaatiovaihe) siten, että edellisessä vaiheessa muodostunut lipidiradikaali reagoi hapen kanssa, mikä johtaa LOOH-partikkelien (lipidihydroperoksidi) ja uusien lipidiradikaalien syntymiseen. Kun LOOH:t reagoivat transitiometallien kanssa, muodostuu alkoksi- ja karboksyyliradikaaleja, jotka jatkavat ketjureaktiota. Lipidiperoksidaation seurauksena hiilirunko voi katketa, järjestäytyä uudelleen tai fuusioitua. Uusina reaktiotuotteina syntyneistä aldehydeistä, ketohapoista ja epoksideista osa reagoi proteiinien kanssa. Ketjureaktio päättyy, kun kaksi radikaalia lopulta reagoivat keskenään (terminaatio) (16). Hapettuneet lipidit edustavat suurta joukkoa eri hapetusvaiheessa olevia partikkeleita, joiden aterogeeniset ominaisuudet riippuvat mm. niiden hapetusasteesta (9). Reaktiiviset yhdisteet aiheuttavat apolipoproteiiniosassa fragmentaatiota erikokoisiin kappaleisiin, joihin voi liittyä modifioituja rasvahappoja (17). Apolipoproteiinin rakenteen muuttuessa myös sen ominaisuudet muuttuvat. Hapettunut LDL-partikkeli, jonka ApoB-lipoproteiini on modifioitunut, ei sitoudu enää LDL-reseptoreihin vaan makrofageissa oleviin scavenger-reseptoreihin johtaen vaahtosolumuodostukseen. Useat solulajit hapettavat verisuonen seinämässä olevia lipidejä. Endoteelisolut, sileälihassolut ja makrofagit voivat auheuttaa peroksidaatiota (18,19) mutta myös T- lymfosyytit (20). NO-syntaasi ja MPO ovat soluentsyymejä, jotka kehittävät lipidejä hapettavia radikaaleja (21). Tärkein entsyymi lienee myeloperoksidaasi (MPO) (22), joka on peräisin leukosyyteistä ja muista immuunipuolustuksen soluista. LDLpartikkelin koko vaikuttaa sen herkkyyteen hapettua (23). Hapettumista voivat estää antioksidantit, esimerkiksi HDL-partikkelissa oleva PON1 (paraoksonaasi 1) ja LDL-partikkelissa oleva alfatokoferoli eli E-vitamiini (24). Normaalisti toimiva HDL voi estää hapettumisen kaikkia vaiheita, mutta sepelvaltimotaudissa sen kyky neutraloida hapettumisen reaktiotuotteet rajoittuu (25). Myös statiineilla on todettu olevan antioksidatiivista vaikutusta veren lipidien vähentämisen lisäksi (26,27). Ravinnon antioksidantit, kuten E- ja C-vitamiinit sekä kasvisten flavonoidit, toimivat samalla tavalla oksidaatiota vastaan kuin elimistön

11 7 itsensä syntetisoimat. Ravinnon suurta antioksidanttipitoisuutta pidetään suojatekijänä ateroskleroosia vastaan. 2.3 Oksidaatio sepelvaltimotaudissa Miten LDL:n hapettuminen kiihdyttää ateroskleroosia LDL-kolesterolin oksidaatiota pidetään avaintapahtumana biologisissa prosesseissa, jotka aloittavat ja kiihdyttävät ateroskleroottisten plakkien esiasteiden, rasvajuosteiden kehittymistä (28-32). Hapettunutta LDL:ää on löydetty ateroomissa olevista makrofageista, mutta ei terveistä valtimoista (33). Hapettuneen partikkelin osuutta taudin kehittymiseen voidaan selvittää tutkimalla partikkelin ominaisuuksia ja vuorovaikutusta solujen ja molekyylien kanssa. Hapettuneen LDL:n aterogeenisuutta kuvasi ensimmäisenä Daniel Steinberg vuonna 1989 (15). Myöhemmin tuotiin esille lukuisia mekanismeja, joilla LDL-partikkelin hapettuneet muodot ja oksidaation sivutuotteet voivat kiihdyttää aterogeneesia (34) OxLDL ja plakin instabiliteetti Stabiilina vuosia pysynyt sepelvaltimotauti voi arvaamatta aktivoitua. Joillakin potilailla ACS taas voi olla sepelvaltimotaudin ensimmäinen ilmentymä. Akuutissa koronaarisyndroomassa on aina kyse ateroomaplakin vauriosta: ulseraatio, ruptuura, vuoto plakin sisään (35). ACS- tapahtumista taustalla on 75 %:ssa plakin rupturaatio eli sen repeäminen (36). Työmme kannalta on olennaista tietää, millä mekanismeilla oxldl on mukana prosesseissa, jotka tekevät stabiilista plakista hajoamiselle alttiin. Histologisiin löydoksiin pohjautuvat tutkimukset ovat osoittaneet eroja stabiilin ja epästabiilin plakin morfologiassa. Plakin herkkyys rupturoitua riippuu kolmesta tekijästä: 1) aterooman lipidiytimen koosta ja koostumuksesta 2) fibroottisen kalvon paksuudesta ja kollageenipitoisuudesta 3) kalvossa tapahtuvasta tulehduksesta (37). Epästabiili plakki sisältää myös enemmän oxldl sisältäviä makrofageja (38). OxLDL näyttää olevan mukana välittämässä plakin epästabiiliutta ym. kolmen mekanismin kautta. Aterooman ytimen nekroosissa apoptoosilla on suuri merkitys. OxLDL edistää vaahtosolujen ja sileälihassolujen apoptoosia ja täten nekroottisen ytimen kasvua. (34)

12 8 Plakin tukirakenne, kollageeni ja fibroottinen katekalvo aterooman päällä vastustavat normaalisti mekaanista stressiä. Hajoavassa plakissa fibroottinen katto ohenee solujen eritystoiminnan seurauksena. Makrofagit stimuloivat sileälihassoluja tuottamaan kollageenia hajottavia entsyymejä, metalloproiteinaaseja (39). Myös makrofagit itse tuottavat MMP-itä. OxLDL tunnetusti aktivoi makrofageja ja siten heikentää sidekudoskalvoa. Ehara on ensimmäisenä raportoinut, että korkeat kiertävän oxldl:n pitoisuudet ovat yhteydessä ACS:n vakavuusasteeseen ja plakin korkeaan oxldltäyteisten makrofagien pitoisuuteen (38). Nishi kumppaneineen on todennut, että plakin korkea oxldl-pitoisuus on vahvasti yhteydessä plakin epästabiilisuuteen, makrofagi-infiltraatioon ja plasman oxldl-pitoisuuteen (14). OxLDL provosoi makrofagi-infiltraatiota ja endoteeliaktivaatiota lisäten immuuniaktiivisuutta plakissa. ACS-potilailla havaitaan yleensä useita vaurioituneita plakkeja samanaikaisesti. Voitaisiin ajatella, että yhden plakin ruptuura ja oxldl-päästö lisäävät muiden plakkien hajoamista edistäviä mekanismeja johtaen noidankehään, joka pahentaa tilannetta. Tämä selittäisi myös sen, miksi aterooman akuutti paheneminen tapahtuu kohtauksenomaisesti eikä tasaisesti. Hapettunut LDL inhiboi myös endoteelisolujen migraatiota ja näin hidastaa jo vaurioituneen aterooman paranemista (40). Lisäksi plakin rupturoituessa oxldlpartikkelit edistävät tromboosia ja hidastavat sen vastakkaisia prosesseja (41). On selvää, että hapettunut LDL-kolesteroli on avainasemassa taudin kehittymisen kannalta. Sen rooli taudin akutisoitumisessa on kuitenkin vielä epäselvä. Tutkimustulokset viittaavat siihen, että oxldl voisi olla mahdollinen mittari osoittamaan taudin kehittyneisyyttä verisuonissa. 3 Aineisto 3.1 COROGENE COROGENE on vuonna 2006 käynnistetty tutkimus (42), jossa on tarkoitus selvittää geneettista vaihtelua sepelvaltimotautipotilailla. Tutkimukseen rekrytoitiin vuosien

13 aikana noin 5000 potilasta, jotka olivat tulleet HYKS:iin angiografiseen kuvaukseen. Potilaista otettiin verinäytteet sairaalaan tulon yhteydessä. COROGENE:n päätutkija on Markku Nieminen. COROGENE on toiminut monen, mm. meidän tutkimuksen lähteenä. Suuri COROGENE-kohortti oli jaettu neljään ryhmään angiografiakuvauksen löydöksen ja kliinisen kuvan perusteella seuraavasti: NCA-potilailla (=normal coronary arteries) oli stenoosia alle 50 % suonen läpimitan pinta-alasta, mutta ei sepelvaltimotaudin oireita. SAP (=stabiili angina pectoris, stable angina pectoris): stenoosia yli 50 % vähintään yhdessä suonessa, muttei akuuttia rintakipukohtausta. ACS-potilailla oli tyypillinen akuutin kohtauksen kipuoireisto ja merkittävä stenoosi vähintään yhdessä suonessa sekä infarktiin viittaava merkkiainepäästö (troponiini) ja/tai EKG:stä tulkittu ST-välin nousu. Muut potilaat (n=200) muodostivat neljännen ryhmän ja edustivat n. 3 % koko aineistosta. 3.2 Ryhmien kuvaus Tähän tutkimukseen valittiin COROGENE:n kolmesta ryhmästä (NCA, SAP, ACS) kustakin 242 potilasta. Valinta tehtiin siten, että ryhmät olisivat mahdollisimman hyvin vertailtavissa keskenään. Ryhmien ikä-, sukupuoli- ja BMI-jakaumat ovat tilastollisesti samoja, kuten käy ilmi taulukosta 2. Myös muut ryhmien riskitekijät on eritelty. Taulukko 2. Ryhmien riskitekijät NCA SAP ACS Ikä (v) 65,7 65,9 66 Miehet (%) BMI (kg/m²) 26,8 26,5 25,5 Tupakoivia (%) Hypertensio 66,7 67,2 71,1 Useimmilla potilailla oli näytteenottohetkellä käytössä lääkärin määräämä statiinilääkitys (atorva- tai simvastatiini) annoksella 20 tai 40 mg. Muitakin lääkkeitä oli

14 10 käytössä, mm. beetasalpaaja, ACE-estäjä, AT-estäjä ja asetyylisalisyylihappo. Muiden lääkkeiden käyttöä ei tässä eritellä tarkemmin. 3.3 Diabetes mellitus Diabetes mellitus on itsenäinen riskitekijä ateroskleroosin etenemiselle. Diabetekselle on tyypillistä muuttunut sokeri- ja rasva-aineenvaihdunta, joten se oli poissulkuperuste sekoittavana tekijänä. Taudista saatiin tietoa potilaan esitietojen ja lääkelistan avulla, ja varmistettiin myös seuraamalla laboratorioarvoja. HbA 1c määritys kertoo prosentteina, kuinka suuri osuus veren hemoglobiinista on glykosyloitunut eli muuntunut veressä olevan glukoosin vaikutuksesta. Sitä käytetään diabeteksen diagnostiikassa kertomaan veren sokeritasapainosta viimeisten muutaman kuukauden ajalta. Veren glukoosiarvoksi hyväksyttiin alle 7 mmol/l ja HbA 1c tulokseksi alle 5,8 %, jotta potilas tulisi valituksi tutkimukseen. 4 Menetelmät 4.1 Näytteiden käsittely Näytteet otti Meilahden sairaalan henkilökunta potilaiden sairaalaan tulon yhteydessä. Tutkimukseen luovutetut näyteputket varustettiin kunkin potilaan omalla tutkimusnumerolla, josta potilaan henkilöllisyys ei ollut suoraan identifioitavissa. Verinäytteet sentrifugoitiin ja seerumi eroteltiin, jonka jälkeen putket laitettiin -80 celsiusasteen pakkaseen ja säilytettiin Meilahden ja Haartman-instituutin tiloissa. Määritystä varten näytteet sulatettiin huoneenlämmössä ja sekoitettiin Vortex-laitetta käyttäen. Näytteiden ja potilaslistojen käsittely tehtiin noudattaen yleisesti hyväksyttyjä tietosuojaperiaatteita. Kaikki määritykset on pyritty tekemään samalla tavalla ja niiden toistettavuutta arvioitiin kontrollinäytteiden avulla.

15 ELISA ELISA-menetelmä (enzyme-linked immunosorbent assay) perustuu spesifisiin vastaaineisiin, joilla reaktiolevyn kuopan pohja on päällystetty. Kun kuoppaan lisätään seerumia, siinä olevat oxldl-partikkelit sitoutuvat vasta-aineisiin. Seerumin muut komponentit pestään pois ja kuoppaan lisätään liukoista vasta-ainetta, joka on merkattu entsyymillä. Se sitoutuu oxldl:iin. Ylimääräiset vasta-aineet pestään pois. Kun kuoppaan lisätään TMB:tä, se reagoi oxldl:ssa olevan liukoisen vasta-aineen entsyymin kanssa, mikä havaitaan värin muutoksena. Toimintaperiaate on esitetty kuvassa 4 tämän kappaleen lopussa. Määritykseen käytettiin Mercodian (Ruotsi) valmistamia menetelmäpakkauksia. ELISA-pakkaukset otettiin huoneenlämpöön noin puoli tuntia ennen kokeen suorittamista ja reagenssit valmistettiin ohjeiden mukaan laimentamalla pakkauksen mukana tulleet lyofilisaatit. Seeruminäytteet otettiin huoneenlämpöön sulamaan, jonka jälkeen niitä sekoitettiin Vortex-laitetta käyttäen n. 3 sekunnin ajan. Näytteet laimennettiin puskuriliuoksen kanssa suhteeseen 1/6561 erillisiin putkiin, jonka jälkeen ne huolellisesti sekoitettiin. Jokaisesta näyte-, standardi- ja kontrolliputkesta otettiin pipetillä 25 mikrolitraa kuoppalevyn kahden kuopan pohjalle (rinnakkaisnäytteet) vuokaaviota seuraten. Applikaatiossa käytettiin automaattipipettiä ja pipetinkärkeä vaihdettiin jokaista applikaatiota varten. Monikanavapipettiä käyttäen kuoppiin lisättiin 100 mikrolitraa näytepuskuria. Tämän jälkeen kuoppalevy peitettiin ja inkuboitiin huoneenlämmössä kaksi tuntia automaattisekoittimen päällä. Seuraavassa vaiheessa levy pestiin kuusi kertaa automaattipesurilla pesupuskuriliuosta käyttäen ja ylimääräinen neste poistettiin napakasti kopauttamalla levy pöydän reunaan. Entsyymikonjugaattia lisättiin 100 mikrolitraa kunkin kuopan pohjalle ja inkuboitiin yksi tunti. Levy pestiin ja kuivattiin, kuten aiemmin selostettu. Tämän jälkeen lisättiin substraatti TMB:tä 200 mikrolitraa 15 minuutiksi. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 mikrolitraa suolahappoa kuhunkin kuoppaan ja sekoittamalla lyhyen aikaa. Absorbanssin automaattinen mittaus suoritettiin välittömästi tämän jälkeen Safire-spektrofotometrillä. Tulokset tallennettiin tutkimuksen verkkolevylle sekä arkistoitiin laboratorion tiloihin tulosteina.

16 12 Kuva 1. ELISAn toimintaperiaate. OxLDL-4E6 on vasta-aine, johon plasman oxldl-partikkelit sitoutuvat. Anti-apoB on liukoinen vasta-aine, joka sitoutuu kuoppaan tarttuneen oxldl:n apob-proteiiniin. Se on leimattu entsyymillä ja aiheuttaa värimuutoksen liuoksessa. Tämän intensiteetti on suhteessa oxldlpitoisuuteen. 4.3 Spektrofotometria Menetelmä perustuu aineiden erilaiseen kykyyn absorboida valoa. Absorbanssi mitataan johtamalla valon säde liuoksen läpi (aallonpituus ja kyvetin syvyys vakioidaan) ja mittaamalla muutosta valon intensiteetissä. Kun nollaliuoksen ja kyvetin pohjan absorbanssi vähennetään mitatuista arvoista, saadaan liuoksessa olevien molekyylien aiheuttama absorbanssi. Koska absorbanssi on suoraan verrannollinen konsentraatioon, saadaan liuoksen konsentraatio suhdekuvaajasta (standardikuvaaja) absorption perusteella. Absorbanssi mitattiin Safire-laitteella aallonpituudella 450 nm. Jokaista määritystä varten tehtiin oma standardikuvaaja, jonka perusteella näytteille poimittiin pitoisuusarvot niiden absorbanssin perusteella korjaten ne alkuperäisellä laimennuskertoimella. Laskelmat tehtiin käyttäen Magellan-ohjelmaa. Määritystulosta ei hyväksytty, mikäli näytteen kahden rinnakkaisen kaivon mitattu absorbanssi poikkesi enemmän kuin 10 % vaan koko määritys uusittiin. 4.4 Muut määritykset Lipidimääritykset (Hannele Hildén) tehtiin automaattianalysaattorilla Konelab analyzer 60i. Menetelmä perustuu homogeeniseen entsymaattiseen värinmuutosreaktioon, joka mitataan absorbanssina spektrofotometrillä. Lipidien pitoisuus on suhteessa värin intensiteettiin.

17 13 Hs-CRP mittaus (Hannele Hildén) tehtiin käyttäen Konelab analyzer 60i:tä. Määritys perustuu immunopresipitaatioon. PON1- ja MPO-määritykset (Olga Rimpilä ja Helena Tikkanen) tehtiin käyttäen ELISAmenetelmää, joka on kuvattu aiemmin tässä luvussa. 4.5 Tilastollinen analyysi Tilastollisessa analyysissä käytettiin SPSS-ohjelmaa (Juha Sinisalo LT). Olennaisilta osin ajot on tarkistettu samaa ohjelmaa käyttäen ja päädytty samoihin tuloksiin. Tulosten jakaumat on esitetty laskettujen keskiarvojen lisäksi myös kvartiileina. Menettelyn perusteena on, etteivät mittaustulokset jakautuneet täysin normaalisti. 5 Tulokset Perinteisten rasva-arvojen mittaustulokset on eritelty ryhmittäin taulukossa 4. Kokonaiskolesterolin suhteen akuutin taudin ryhmällä ei ollut merkittävää eroa (p 0,03) verrattuna stabiiliin tautiin tai terveisiin verrokkeihin. LDL-kolesterolin pitoisuus oli korkein ACS-ryhmässä ja matalin NCA-ryhmässä. NCA- ja SAP-ryhmissä LDL-kolesterolin arvo oli viitealueella (43) ja ACS-ryhmässä lievästi koholla normaalina pidettyyn arvoon nähden. LDL-kolesteroli oli akuutin taudin ryhmässä merkittävästi koholla verrattuna stabiiliin tautiin (p=0,008). Triglyseridit eivät eronneet merkittävästi ryhmien välillä. Sen sijaan HDL-kolesterolin pitoisuus oli sitä pienempi, mitä vakavampi taudin ilmentymä oli. Ero oli merkittävä niin NCA ja SAP-ryhmien välillä (p=0,001) kuin ACS-ryhmässä verrattuna NCA- ja SAPryhmiin (p<0,001, p=0,001).

18 14 Taulukko 3. Rasva-arvot keskiarvoina NCA SAP ACS Kokonaiskolesteroli (mmol/l) 4,21 4,02 4,22 LDL-kolesteroli (mmol/l) 2,15 2,14 2,31 TG (mmol/l) 1,18 1,12 1,24 HDL (mmol/l) 1,18 1,1 0,99 Akuuttia koronaarisyndroomaa sairastavien potilaiden veren hapettuneen LDLkolesterolin pitoisuus erosi merkittävästi sekä SAP-potilaiden pitoisuudesta (p=0,043), että NCA-ryhmästä (p=0,012). Sen sijaan normaaliryhmän (NCA) ja SAP-ryhmän välille ei tullut eroa (p=0,61). Ryhmien oxldl-pitoisuudet on esitetty taulukossa 5. Alin oxldlpitoisuus oli kontrolliryhmän potilailla (49,5 U/l) ja korkein akuutin syndrooman potilailla (54,0 U/l). Taulukko 4. Ryhmien oxldl-kolesterolin pitoisuudet (U/l) NCA SAP ACS Keskiarvo 49,5 50,3 54,0 Kvartiilit Ylä- 35,9 37,6 38,6 Mediaani 46 46,9 50,2 Ala- 60,6 58,2 64,6 Eroja havainnollistaa kuva 1, jossa näkyy graafisesti mittaustulosten keskiarvojen luottamusvälit 95 %:n luottamustasolla. Tulokset kuvastavat plasman hapettuneen LDL:n pitoisuuden suhdetta taudin vakavuusasteen. Mitä vakavampi taudin ilmentymä oli, sitä suurempi hapettuneen LDL-kolesterolin pitoisuuden keskiarvo ryhmällä oli.

19 15 Kuva 2. Ryhmien oxldl-pitoisuus (U/l) Ryhmien tulehdus- ja oksidaatioparametrit on eritelty taulukossa 5. Myeloperoksidaasientsyymi (MPO) on tärkein LDL-partikkeleita hapettava entsyymi. Sen pitoisuus veressä oli korkeimmillaan ryhmän ACS-potilailla ja erosi merkittävästi muista ryhmistä (p<0,001). Paraoksonaasientsyymi 1 (PON1) on hapettumista estävä entsyymi, jonka pitoisuus oli korkein normaaliryhmällä. Se oli sitä matalampi, mitä aktiivisempi taudinilmentymä oli. Merkittävästi matala se oli ryhmällä NCA verrattuna ryhmään ACS (p<0,001). Hs-CRP, joka on akuutin tulehduksen merkkiaine, oli odotetusti suurentunut ACSryhmän potilailla (keskiarvo 4,49 mg/l) ja erosi merkitsevästi sekä NCA- että SAPryhmästä (p<0,0001).

20 16 Taulukko 5. Muut mitatut suureet keskiarvoina NCA SAP ACS MPO (ng/ml) 29,5 29,4 69,7 hs-crp (mg/l) 1,14 1,07 4,49 PON1 (µg/ml) 18,5 14,5 13,5 6 Pohdinta ACS-potilailla oxldl on merkittävästi kohonnut. Löydös tukee työhypoteesia, että oksidatiivinen stressi on keskeinen vaaratekijä akuuteissa koronaaritapahtumissa. Laaja, yli potilasta kattava meta-analyysi osoittaa, että 1/7 statiinilääkitystä käyttävistä potilaista saa sydäntapahtuman viiden vuoden aikavälillä hoidosta huolimatta (44). Tämän tutkimuksen osalta voi sanoa, että myös suomalaisilla statiinilääkitystä käyttävillä ACS-potilailla on useita vaaratekijöitä, jotka altistavat päätetapahtumille. Lipidisuureiden merkittävä ero oli HDL- ja LDLkolesterolipitoisuuden välillä. Tämä tarkoittaa sitä, että huolimatta tutkimushenkilöiden samansuuruisista LDL-kolesterolin pitoisuuksista ryhmien välillä oli selkeitä eroja riskiä osoittavissa parametreissä. Korkein oxldl-kolesterolin pitoisuus oli ACS-ryhmällä, mikä osoittaa oksidatiivista stressiä. Oksidaatiota vastaan suojaavana tekijänä toimiva PON1 oli kyseisessä ryhmässä merkittävästi alentunut, hapettavan myeloperoksidaasin pitoisuus oli tässä ryhmässä korkein. Suurentunutta vaaraa eli ns. jäännösriskiä voi selittää ainakin osittain elimistön proinflammatorinen tila (12), jota edistää LDL-kolesterolin hapettuminen ja on toisaalta sen seuraus. 6.1 OxLDL:n merkitys diagnostiikassa Ateroskleroosissa on kyse laajasta koko verenkiertoelimistöä koskevasta tulehduksellisesta tilasta. Systeemimerkkiaineiden käyttö voi täten olla perusteltua arvioitaessa henkilön oksidaatioprofiilia ja tulehdusastetta. Hyvän merkkiaineen tulisi

21 17 erottaa oireettomista potilaista ne, jotka voivat saada akuutin päätetapahtuman. Hyvän biomarkkerin on oltava riittävän herkkä ja toisaalta spesifinen. Lisäksi analyysin on oltava helposti ja kustannustehokkaasti suoritettavissa (45,46). Näiden kriteereiden mukaan oxldl olisi hyvä erottava merkkisuure. Erityisen merkityksellinen se näyttäisi olevan nimenomaan riskipotilaille, joilla LDL-kolesteroliarvot ovat viitealuella. Potilaita on tarkoitus seurata viiden vuoden ajan, jolloin voidaan arvioida oxldl:n voimaa ennustavana riskitekijänä. Vastaavaa tutkimusasetelmaa on käytetty vuonna 2004 Shimadan tutkimuksessa, jossa sepelvaltimotautipotilaiden oxldl-tasot määriteltiin ja sen jälkeen heitä seurattiin 52 kuukautta. Potiaat, joilla oxldl-tasot olivat tutkimuksen alussa korkeat, saivat seurannan aikana enemmän sydäntapahtumia (47). Tämän perusteella oxldl voi olla itsenäinen ennustava markkeri sepelvaltimotautipotilaille. Tutkimuksemme vahvistanee tuloksia suomalaisessa populaatiossa seurannan päättyessä. Tärkeä kysymys on, voidaanko tutkimuksen tuloksia soveltaa hoitostrategioiden kehittämiseen. Nykyaikainen sepelvaltimotaudin hoidon kulmakivi on LDL-kolesterolia alentava lääkitys (44). Kun LDL-kolesterolin kokonaispitoisuus laskee, myös oxldl:n pitoisuus verenkierrossa pienenee. Mutta tutkimustulokset huomioon ottaen hoitostrategiat pitäisi suunnata myös muiden lipidipoikkeavuuksien korjaamiseen. Muita keinoja oksidatiivisen stressin vähentämiseen ja ateroomaplakkien stabiloimiseen lääkkeiden lisäksi ovat elintapojen ja ravinnon koostumuksen muuttaminen (12). Tutkimuksissa on todettu ravinnon antioksidanttipitoisuuden liittyvän terveempään verisuonielimistöön (48-52). Käytännössä tutkimustulokset antioksidantti-interventioista ovat toistaiseksi olleet varsin ristiriitaisia (53). Osa tutkijoista pitääkin tutkimusten tulosten syynä vääränlaista interventiota, jolla ei ole voitu vaikuttaa suoraan valtimon seinämässä tapahtuvaan lipidien oksidaatioon (54,55). Tarvitaan lisää täsmätietoa akuutteja tapahtumia välittävien lipidien luonteesta ja metaboliasta, ennen kuin voidaan kehittää spesifisesti oksidaatiotapahtumaan kohdistuvia hoitomuotoja.

22 Tutkimuksen arviointi Menetelmät ovat tämän tutkimuksen vahvuuksia. ELISA on todettu luotettavaksi ja hyvin toistettavissa olevaksi tavaksi mitata oxldl-kolesterolin pitoisuuksia plasmasta. Se perustuu spesifeihin vasta-aineisiin eikä siten reagoi plasman muiden komponenttien kanssa. Se on myös herkkä havaitsemaan hyvin pienetkin pitoisuudet. Määritykset on pyritty tekemään samoja työtapoja käyttäen, ja kontrollien avulla on varmistettu kunkin määrityksen toimivuus. Kaikki laitteet ja välineet olivat kalibroituja ja laboratoriomittaukset standardisoituja. Tutkimuksessamme analysoitiin yli 600 suomalaispotilaan verinäytteiden tuloksia, joten otoskoko edustaa hyvin suomalaisia sepelvaltimotautipotilaita. Aineisto on valittu siten, että ryhmät ovat samankokoisia ja että riskitekijät niissä ovat olennaisesti samat. Tutkimuksen ulkopuolelle on jätetty henkilöt, joilla on todettu diabetes mellitus, sillä sokeritautia voidaan pitää sekoittavana tekijänä. Tämä tulee pitää mielessä tuloksia yleistettäessä, koska diabeteksen esiintyvyys on suurempi sepelvaltimotautipotilailla kuin normaaliväestössä. Tutkimuksessa olleet ACS-ryhmän potilaat ovat taudin suhteen heterogeeninen ryhmä, sillä osalla heistä tauti oli tiedossa ennestään ja osalle akuutti kohtaus tuli taudin ensioireena. Tämä on hyvä muistaa ryhmien keskinäisessä vertailussa. Laboratorioparametrit on mitattu taudin suhteen eri vaiheessa: NCA- ja SAP-ryhmillä verikokeet otettiin taudin rauhallisessa vaiheessa ja ACS-potilailla ns. kuumassa vaiheessa. On aihetta pohtia, miten akuutti tapahtuma vaikuttaa mitattaviin oksidaatio- ja tulehdusta osoittaviin suureisiin. Veren suurentunut oxldl-kolesterolin pitoisuus voi olla seurausta revenneestä plakista vuotaneista lipideistä tai heijastaa todellista sillä hetkellä vallitsevaa oksidatiivista stressiä, joka altistaa sydäntapahtumalle. Tähän kuitenkin saataneen vastaus, kun verrataan mitattuja tuloksia seuranta-ajan sydäntapahtumien yhteydessä tehtyihin määrityksiin. Keskeiseksi kysymykseksi myös jää, ennustaako oxldl-pitoisuus infarktin yhteydessä tapahtuneen vaurion suuruutta. Mahdollisen yhteyden selvittäminen vaatii seurantatutkimusta. OxLDL-tasoja ei tässä tutkimuksessa ole suhteutettu angiografisiin löydöksiin. Olisi hyvä tutkia myös, miten troponiinipäästöt ACS-ryhmässä suhtautuvat mitattuihin

23 19 oksidaatioarvoihin. Nämä on mahdollista tehdä, sillä angiografiakuvat ja troponiinireaktioiden tiedot ovat käytettävissämme. Tulokset osoittavat selvän suhteen oxldl-tasojen ja sepelvaltimotaudin vakavuuden välillä, sillä mitattu oxldl-pitoisuus oli sitä suurempi, mitä vakavampi taudin kliininen ilmentymä oli. Tulokset ovat samansuuntaisia muiden vastaavanlaisin asetelmin aiemmin tehtyjen tutkimusten kanssa (38) ja tukevat siten tätä yhteyttä.

24 20 Lähteet (1) Tilastokeskus. Kuolinsyytiedot ; Available at: (2) Mustajoki P editor. Lääkärikirja Duodecim. : Duodecim; (3) Braunwald E. Unstable angina. A classification. Circulation 1989 Aug;80(2): (4) Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005 Apr 21;352(16): (5) Williams KJ, Tabas I. The response-to-retention hypothesis of atherogenesis reinforced. Curr Opin Lipidol 1998 Oct;9(5): (6) Libby P, Theroux P. Pathophysiology of coronary artery disease. Circulation 2005 Jun 28;111(25): (7) Fraley AE, Tsimikas S. Clinical applications of circulating oxidized low-density lipoprotein biomarkers in cardiovascular disease. Curr Opin Lipidol 2006 Oct;17(5): (8) Holvoet P, Mertens A, Verhamme P, Bogaerts K, Beyens G, Verhaeghe R, et al. Circulating oxidized LDL is a useful marker for identifying patients with coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001 May;21(5): (9) Berliner JA, Watson AD. A role for oxidized phospholipids in atherosclerosis. N Engl J Med 2005 Jul 7;353(1):9-11. (10) Yusuf S, Hawken S, Ounpuu S, Dans T, Avezum A, Lanas F, et al. Effect of potentially modifiable risk factors associated with myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study): case-control study. Lancet 2004 Sep 11-17;364(9438): (11) Steinberg D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nat Med 2002 Nov;8(11): (12) Fruchart JC, Sacks F, Hermans MP, Assmann G, Brown WV, Ceska R, et al. The Residual Risk Reduction Initiative: a call to action to reduce residual vascular risk in patients with dyslipidemia. Am J Cardiol 2008 Nov 17;102(10 Suppl):1K-34K. (13) Yla-Herttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, Parthasarathy S, Carew TE, Butler S, et al. Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. J Clin Invest 1989 Oct;84(4):

25 21 (14) Nishi K, Itabe H, Uno M, Kitazato KT, Horiguchi H, Shinno K, et al. Oxidized LDL in carotid plaques and plasma associates with plaque instability. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002 Oct 1;22(10): (15) Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL. Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med 1989 Apr 6;320(14): (16) Ylä-Herttuala S, Salonen J. Rasvojen hapettumisen merkitys sydän- ja verisuonisairauksissa. Duodecim ;110(7): (17) Matsuura E, Hughes GR, Khamashta MA. Oxidation of LDL and its clinical implication. Autoimmun Rev 2008 Jul;7(7): (18) Itabe H. Oxidative modification of LDL: its pathological role in atherosclerosis. Clin Rev Allergy Immunol 2009 Aug;37(1):4-11. (19) Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005 Jan;25(1): (20) Lamb DJ, Wilkins GM, Leake DS. The oxidative modification of low density lipoprotein by human lymphocytes. Atherosclerosis 1992 Feb;92(2-3): (21) Silverstein RL. Inflammation, atherosclerosis, and arterial thrombosis: role of the scavenger receptor CD36. Cleve Clin J Med 2009 Apr;76(Suppl 2):S (22) Zhang R, Brennan ML, Shen Z, MacPherson JC, Schmitt D, Molenda CE, et al. Myeloperoxidase functions as a major enzymatic catalyst for initiation of lipid peroxidation at sites of inflammation. J Biol Chem 2002 Nov 29;277(48): (23) Ming-Lin Liu. LDL oxidation and LDL particle size in the development of atherosclerosis. Helsinki: University of Helsinki; (24) Woodside JV, Young IS, Yarnell JW, Roxborough HE, McMaster D, McCrum EE, et al. Antioxidants, but not B-group vitamins increase the resistance of low-density lipoprotein to oxidation: a randomized, factorial design, placebo-controlled trial. Atherosclerosis 1999 Jun;144(2): (25) Navab M, Hama SY, Anantharamaiah GM, Hassan K, Hough GP, Watson AD, et al. Normal high density lipoprotein inhibits three steps in the formation of mildly oxidized low density lipoprotein: steps 2 and 3. J Lipid Res 2000 Sep;41(9): (26) Rubba P. Effects of atorvastatin on the different phases of atherogenesis. Drugs 2007;67(Suppl 1): (27) Ky B, Burke A, Tsimikas S, Wolfe ML, Tadesse MG, Szapary PO, et al. The influence of pravastatin and atorvastatin on markers of oxidative stress in hypercholesterolemic humans. J Am Coll Cardiol 2008 Apr 29;51(17):

26 22 (28) Steinberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance. J Biol Chem 1997 Aug 22;272(34): (29) Steinberg D. Lewis A. Conner Memorial Lecture. Oxidative modification of LDL and atherogenesis. Circulation 1997 Feb 18;95(4): (30) Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, Frank JS, Demer LL, Edwards PA, et al. Atherosclerosis: basic mechanisms. Oxidation, inflammation, and genetics. Circulation 1995 May 1;91(9): (31) Heinecke JW. Oxidants and antioxidants in the pathogenesis of atherosclerosis: implications for the oxidized low density lipoprotein hypothesis. Atherosclerosis 1998 Nov;141(1):1-15. (32) Witztum JL, Horkko S. The role of oxidized LDL in atherogenesis: immunological response and anti-phospholipid antibodies. Ann N Y Acad Sci 1997 discussion 96-9; Apr 15;811: (33) Yla-Herttuala S. Is oxidized low-density lipoprotein present in vivo? Curr Opin Lipidol 1998 Aug;9(4): (34) Steinberg D, Witztum JL. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010 Dec;30(12): (35) Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Mitchell RN editors. Robbins Basic Pathology. 8th ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; (36) Falk E, Shah PK, Fuster V. Coronary plaque disruption. Circulation 1995 Aug 1;92(3): (37) Falk E. Why do plaques rupture? Circulation 1992 Dec;86(6 Suppl): (38) Ehara S, Ueda M, Naruko T, Haze K, Itoh A, Otsuka M, et al. Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes. Circulation 2001 Apr 17;103(15): (39) Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997 Oct;17(10): (40) Murugesan G, Chisolm GM, Fox PL. Oxidized low density lipoprotein inhibits the migration of aortic endothelial cells in vitro. J Cell Biol 1993 Feb;120(4): (41) Latron Y, Chautan M, Anfosso F, Alessi MC, Nalbone G, Lafont H, et al. Stimulating effect of oxidized low density lipoproteins on plasminogen activator inhibitor-1 synthesis by endothelial cells. Arterioscler Thromb 1991 Nov-Dec;11(6): (42) Sinisalo J, Nieminen M.S. COROGENE

27 23 (43) Tikkanen MJ, et al. Käypä hoito -suositus: Dyslipidemiat. Duodecim (44) Baigent C. Keech A. Kearney PM. Blackwell L. Buck G. Pollicino C. Kirby A. Sourjina T. Peto R. Collins R. Simes R. Cholesterol Treatment Trialists' (CTT) Collaborators. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins.[erratum appears in Lancet Oct 15-21;366(9494):1358]. Lancet 2005 Oct 8;366(9493): (45) Morrow DA, Cannon CP, Jesse RL, Newby LK, Ravkilde J, Storrow AB, et al. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes. Circulation 2007 Apr 3;115(13):e (46) Morrow DA, de Lemos JA. Benchmarks for the assessment of novel cardiovascular biomarkers. Circulation 2007 Feb 27;115(8): (47) Shimada K, Mokuno H, Matsunaga E, Miyazaki T, Sumiyoshi K, Miyauchi K, et al. Circulating oxidized low-density lipoprotein is an independent predictor for cardiac event in patients with coronary artery disease. Atherosclerosis 2004 Jun;174(2): (48) Hardin-Fanning F. The effects of a Mediterranean-style dietary pattern on cardiovascular disease risk. Nurs Clin North Am 2008 vii; Mar;43(1): (49) Hertog MG, Feskens EJ, Kromhout D. Antioxidant flavonols and coronary heart disease risk. Lancet 1997 Mar 8;349(9053):699. (50) Hertog MG, Kromhout D, Aravanis C, Blackburn H, Buzina R, Fidanza F, et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med 1995 Feb 27;155(4): (51) Knekt P, Jarvinen R, Reunanen A, Maatela J. Flavonoid intake and coronary mortality in Finland: a cohort study. BMJ 1996 Feb 24;312(7029): (52) Rimm EB, Stampfer MJ, Ascherio A, Giovannucci E, Colditz GA, Willett WC. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med 1993 May 20;328(20): (53) Briasoulis A, Tousoulis D, Antoniades C, Stefanadis C. The oxidative stress menace to coronary vasculature: any place for antioxidants? Curr Pharm Des 2009;15(26): (54) Jialal I, Devaraj S. Antioxidants and atherosclerosis: don't throw out the baby with the bath water. Circulation 2003 Feb 25;107(7): (55) Steinhubl SR. Why have antioxidants failed in clinical trials? Am J Cardiol 2008 May 22;101(10A): D.

28 (56) Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis. the road ahead. Cell 2001 Feb 23;104(4):

29 25 Liite 1 Kuva 1. Aterooman kehityksen varhaisvaiheen mekanismit. (56)

30 Kuva 2. Aterooman muodostus. (56) 26

31 Kuva 3. Aterooman ruptuura. (56) 27

32 28 Liite 2 TULOKSET mediaani; (25%-75%) NCA SAP ACS Kokonaiskolesteroli (mmol/l) 4,21; (3,76-4,77) 4,02; (3,59-4,58) 4,22; (3,66-4,93) LDL-kolesteroli (mmol/l) 2,15; (1,77-2,77) 2,14; (1,79-2,61) 2,31; (1,89-2,93) TG (mmol/l) 1,18; (0,90-1,73) 1,12; (0,87-1,60) 1,24; (0,93-1,65) HDL (mmol/l) 1,18; (0,95-1,51) 1,10; (0,85-1,36) 0,99; (0,82-1,17) OxLDL (U/l) 46,3; (36,0-60,7) 46,9; (37,6-58,2) 50,2; (38,6-64,6) MPO (ng/ml) 29,5; (23,5-40,8) 29,4; (23,1-41,0) 69,7; (46,7-100,8) hs-crp (mg/l) 1,14; (0,51-2,60) 1,07; (0,44-3,10) 4,49; (1,39-23,1) PON1 (µg/ml) 18,5; (12,4-27) 14,5; (9,3-22) 13,5; (9,4-19) P-arvot ACS vs SAP ACS vs NCA NCA vs SAP Kokonaiskolesteroli (mmol/l) 0,03 0,86 0,013 LDL-kolesteroli (mmol/l) 0,008 0,07 0,37 TG (mmol/l) 0,11 0,31 0,56 HDL (mmol/l) 0,001 < ,001 OxLDL (U/l) 0,043 0,012 0,61 MPO (ng/ml) < < ,99 hs-crp (mg/l) < < ,74 PON1 (µg/ml) < < ,71