Hengitystieinfektioita aiheuttava Mycoplasma pneumoniae

Transkriptio

1 Kandidaatintutkielma Hengitystieinfektioita aiheuttava Mycoplasma pneumoniae Aleksi Huuha Oulun yliopisto Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta 2017

2 Sisällysluettelo Käytetyt lyhenteet 2 1. Johdanto 3 2. Mykoplasmat 4 3. Mycoplasma pneumoniae 6 4. Mycoplasma pneumoniaen patogeeniset mekanismit Erityinen kiinnittymisorganelli on välttämätön patogeneesissä Kiinnittymisorganellin rakenne Paired plates -rakenne Terminal button -rakenne Bowl complex -rakenne Pintarakenteet Kiinnittymisorganelli M. pneumoniaen liikkumisessa M. pneumoniae -infektion vaikutukset isännän immuunisysteemiin Invaasio voi aiheuttaa taudin pitkittymistä Hengitystie-epiteelin vaurioituminen voi altistaa infektioille Kirjallisuusviitteet 19 1

3 Käytetyt lyhenteet ABC ADP ATP CARDS ECT ATP-binding cassette adenosiinidifosfaatti (adenosine diphosphate) adenosiinitrifosfaatti (adenosine triphosphate) community-acquired respiratory distress syndrome elektronikryotomografia (electron cryo-tomography) E. coli Escherichia coli IgG IgM IL JNK kda MAP Mbp mol-% immunoglobuliini G immunoglobuliini M interleukiini c-jun N-terminal kinase kilodalton mitogeenien aktivoima proteiini (mitogen-activated protein) megaemäsparia (mega base pairs) mooliprosentti M. genitalium Mycoplasma genitalium M. mobile Mycoplasma mobile M. pneumoniae Mycoplasma pneumoniae NF-κB PAMPS PCR TLR nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells pathogen-associated molecular patterns polymeraasiketjureaktio (polymerase chain reaction) tollin kaltainen reseptori (toll-like receptor) 2

4 1. Johdanto Urheilijoiden terveyttä käsitellään mediassa usein varsinkin suurten kansainvälisten kilpailujen lähestyessä ja niiden aikana. Viime vuosina yhtenä suurena puheenaiheena on ollut erityisesti urheilijoilla usein esiintyvä astma. Toinen sykleittäin kansaa puhuttava aihe on mykoplasmainfektiot. Esimerkiksi vuonna 2011 Yle uutisoi mykoplasmatartuntojen määrän nousseen hurjasti ja kertoi samassa jutussa myös huippu-urheilijoista, joilla koko vuoden arvokilpailut jäivät infektion vuoksi välistä. Infektiot tarttuvat urheilijalta toiselle helposti, koska kilpaurheilijat harjoittelevat, asuvat ja matkustavat paljon yhdessä. Lisäksi paljon ja kovalla intensiteetillä harjoittelevilla urheilijoilla hengitystieinfektioiden riski on tavallista suurempi (Nieman 1994). Ylähengitystieinfektioiden riski muuttuu liikunnan määrän ja tehon mukaan. Liikuntaa harrastamattomalla riski on suurempi kuin kohtuuliikkujalla, mutta erittäin paljon liikuntaa harrastavalla infektion riski on vieläkin suurempi. Tätä yhteyttä voidaan kuvata niin kutsutulla J-käyrällä. Teholtaan kova tai pitkäkestoinen liikuntasuoritus aiheuttaa väliaikaisen immuunipuolustuksen heikentymisen, jolloin infektioriski on suurempi. Myös perimä ja ravintotottumukset vaikuttavat osaltaan infektioriskiin (Nieman 1994, Heinonen 2005, Moreira et al. 2009). Infektiot lisäävät solujen toimintoja ohjaavissa säätelyjärjestelmissä toimivien viestinvälittäjien, sytokiinien, tuotantoa makrofageissa ja monosyyteissä. Erilaisten signaalireittien kautta sytokiinit muun muassa aiheuttavat lihasten proteiinien kataboliaa, jolloin proteiinien hajotuksen seurauksena verenkiertoon vapautuneita aminohappoja käytetään immuunisolujen tarpeisiin ja glukoosin muodostukseen. Lisäksi infektio aiheuttaa glykogeenivarastojen tyhjenemistä ja erityisesti kuumeisena heikentää aerobista suorituskykyä. Kun elimistö on tulehdustilassa ja energiavarastot vähissä, ei rasittavaa liikuntaa voi eikä saa harrastaa. Mycoplasma penumoniae-infektion aiheuttamat muutokset hengitysteissä voivat kestää viikoista kuukausiin, ja siten infektio voi helposti pilata huippu-urheilijan koko kilpailukauden. (Friman & Wesslén 2000, Heinonen 2005). Tässä tutkielmassa keskitytään mykoplasmoista hengitystieinfektioita aiheuttavaan Mycoplasma pneumoniaeen ja sen patogeenisiin mekanismeihin. Erityisen tarkastelun alaisena ovat patogeneesin kannalta välttämättömän kiinnittymisorganellin rakenne ja rooli 3

5 mykoplasman liikkeessä sekä infektion vaikutukset isäntäorganismin immuunijärjestelmään moninaisten mekanismien välityksellä. 2. Mykoplasmat Mykoplasmat ovat bakteereja, jotka kuuluvat mollicutes-luokkaan ja mycoplasmataceaeheimoon. Ne ovat pienimpiä itsenäisesti lisääntyviä prokaryootteja ollen pienimmillään halkaisijaltaan vain nm. Niiden muoto vaihtelee pallomaisista rihmamaisiin ja ne lisääntyvät binaarisella fissiolla. Mykoplasmat elävät loisina ihmis-, eläin- tai kasvisolujen sisällä tai niiden pinnalla. Monet mykoplasmat ovat patogeenisiä ja pääsääntöisesti myös elinja kudosspesifisiä. Esimerkiksi mycoplasma pneumoniaeta esiintyy useimmiten hengitysteissä ja mycoplasma genitaliumia virtsa- ja sukupuolielimien alueella (Hu et al. 1977, Tully et al. 1981, Razin 1996, Razin et al. 1998, Kashyap & Sarkar 2010). Mykoplasmojen rakenne on erittäin yksinkertainen. Kuten kaikilta mollikuutteihin luokitelluilta bakteereilta, myös mykoplasmoilta puuttuu soluseinä. Niitä ympäröi ainoastaan solukalvo, eikä niitä siksi voida gram-värjätä. Niin ikään soluseinän puutteen vuoksi monet perinteiset mikrobilääkkeet, kuten beetalaktaamiantibiootit ovat mykoplasmoja vastaan tehottomia. Myös monet muut bakteereille tyypilliset rakenteet puuttuvat mykoplasmoilta täysin; ne koostuvat käytännössä vain solukalvosta, ribosomeista ja nukleoidista (Razin et al. 1998, Kashyap & Sarkar 2010). Mykoplasmojen genomi on erittäin pieni, vain Mbp, ja se on järjestynyt yhdeksi rengasmaiseksi kromosomiksi. Mykoplasmoille on tyypillistä genomin suhteellisen alhainen guaniini- ja sytosiiniemästen määrä (23-40 mol-%). Geneettisten tutkimusten perusteella mollikuutit, ja edelleen mykoplasmat, ovat kehittyneet evoluution saatossa gram-positiivisista bakteereista omaksi haarakseen. Evoluution seurauksena vain pieni osa gram-positiivisille bakteereille tyypillisistä geeneistä on säilynyt mykoplasmojen kehityksessä. Geenien karsiutumisen on mahdollistanut mykoplasmojen omaksuma parasitistinen elämäntapa (Himmelreich et al. 1996, Razin et al. 1998,). Yksi suurista eroista muihin bakteereihin verrattuna on mykoplasmojen sisäisen säätelyn yksinkertaisuus. Mykoplasmoilta puuttuu esimerkiksi useita transkription säätelyyn, solun jakautumiseen sekä proteiinien laskostumiseen ja sekreetioon liittyviä geenejä. Esimerkiksi 4

6 proteiinien erityssysteemi on paljon yksinkertaisempi kuin vaikkapa E. colilla. Soluseinän ja periplasmisen tilan puutteen vuoksi proteiinien laskostuminen chaperonien avustuksella tapahtuu solun pinnalla. Laskostumista varten proteiinit kiinnittyvät solukalvoon ankkuroituneisiin lipoproteiineihin, joita mykoplasmoilla on runsaasti (Himmelreich et al. 1996, Razin et al. 1998). Mykoplasmoilta puuttuvat monet yleiset energia-aineenvaihdunnan systeemit, kuten sytokromit ja sitruunahappokierto malaattidehydrogenaasi-aktiivisuutta lukuunottamatta. Siten niiden ATP:n tuotto perustuu pääosin glykolyysiin. Useimmat mykoplasmat eivät pysty muodostamaan itse rasvahappoja ja kahdelta mykoplasmalta (M. genitalium ja M. pneumoniae) puuttuvat kaikki aminohapposynteesiin vaadittavat geenit (Pollack et al. 1997, Razin et al. 1998). Koska mykoplasmat ovat riippuvaisia isäntäorganismista, suuri osa niiden geeneistä liittyy isäntäsoluun kiinnittäytymiseen ja niille ovat kehittyneet mekanismit isäntäsolussa lisääntymiseen ja sen immuunisysteemiä vastaan. Flagellojen menettäminen evoluution aikana on johtanut myös uudenlaisten liikkumismekanismien syntyyn. Esimerkiksi liikkumiskykyisillä mykoplasmoilla, kuten Mycoplasma mobilella ja Mycoplasma pneumoniaella, on niiden pitkulaisen solun päässä erityinen kiinnittymisorganelli, jonka avulla ne pystyvät sekä kiinnittymään isäntäsoluihin tai kiinteisiin pintoihin, että myöskin liikkumaan niiden pinnalla (Razin et al. 1998, Miyata 2010). Mykoplasmat ovat tyypillisiä kontaminaatioiden aiheuttajia soluviljelmissä, koska niitä on hankala havaita ja ne ovat resistenttejä suurimmalle osalle yleisimmin käytetyistä antibiooteista. Suurin osa havaituista soluviljelmien mykoplasma-kontaminaatioista on peräisin ihmisistä ja bakteerit leviävät helposti esimerkiksi ilmateitse tai työvälineiden välityksellä. Siksi laboratoriossa työskentelevien täytyy huolehtia paitsi omasta hygieniastaan, myös työvälineiden ja reagenssien puhtaudesta sekä pyrkiä omaksumaan mahdollisimman aseptiset tekniikat välttääkseen kontaminaatioiden syntymisen (Drexler & Uphoff 2002). 5

7 3. Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniaet ovat keskimäärin kooltaan vain 1-2 µm pitkiä ja 0,1-0,2 µm leveitä. Ne ovat siten tilavuudeltaan alle 5 % tavallisen basillin tilavuudesta. Yleensä M. pneumoniae koloniat ovat halkaisijaltaan alle 100 µm. Niiden pienen koon vuoksi niitä ei havaita valomikroskoopeilla, eivätkä ne sameuta nestemäistä kasvatusliuosta (Waites & Talkington 2004, Atkinson et al. 2008). Kuva 1. Käsittelemätön Mycoplasma pneumoniae -solu kuvattuna negatiivisella värjäyksellä elektonimikroskoopilla. Kuva: Nakane et al Mycoplasma pneumoniaen genomi on niin ikään hyvin pieni. Se koostuu yhteensä :stä emäsparista ja käsittää 689 proteiinia koodaavaa geeniä, joista 231:n toiminta on toistaiseksi tuntematon. M. pneumoniaen genomin guaniini-sytosiiniparien prosenttiosuus on suurempi kuin muilla mykoplasmoilla, 40 mol-%. Kuten muiltakin mykoplasmoilta, myös M. pneumoniaelta puuttuvat lukuisien rakenteellisten osien, kuten soluseinän, rakentumiseen vaadittavat geenit sekä kokonaisia rakennusaineenvaihdunnan reittejä. Lisäksi monet tavalliset prosessit, kuten DNA:n korjausmekanismit ja solunjakautuminen, ovat sillä yksinkertaisempia kuin monissa muissa bakteereissa (Himmelreich et al. 1996, Yus et al. 2009, Xiao et al. 2015). M. pneumoniaen aineenvaihdunta on kaiken kaikkiaan selvästi suoraviivaisempaa kuin suurempien bakteerien. Sen aineenvaihdunnan entsyymeistä 60 % on välttämättömiä, kun esimerkiksi E. colilla vastaava osuus on 15 %. Lisäksi kaikkiaan 129:stä entsyymistä 32 6

8 katalysoi useampaa kuin yhtä reaktiota. Myös tämä monitoiminnallisten entsyymien osuus (25 %) on selvästi suurempi kuin monilla muilla bakteereilla (Yus et al. 2009). M. pneumoniae on M. genitaliumin ohella ainut mykoplasma, joka ei kykene lainkaan aminohapposynteesiin. Siltä puuttuvat täysin myös sitruunahappokierto ja elektroninsiirtoketju sytokromit mukaan lukien. Sen energiantuotanto perustuu substraattitason fosforylaatioon glykolyysissä sekä sitä seuraavissa maitohappo- ja etikkahappokäymisreaktioissa. Aineenvaihdunnan puutteiden vuoksi Mycoplasma pneumoniae on riippuvainen ulkoisista, isäntäsolusta saatavista metaboliiteista. Esimerkiksi kolesteroli on mycoplasma pneumoniaen kasvun kannalta välttämätön. Aineenvaihdunnan rajoittuneisuus, erityisesti aminohapposynteesin puute, vaikuttaa myös M. pneumoniaen kahdentumisaikaan, mikä on suhteellisen pitkä, vähintään 8 tuntia. (Himmelreich et al. 1996, Atkinson et al. 2008, Xiao et al. 2015). Mycoplasma pneumoniae aiheuttaa ihmisillä enimmäkseen ylä- ja alahengitysteiden infektioita, kuten trakeiittia ja bronkiittia, mutta vähemmissä määrin myös keuhkokuumetta nimensä mukaisesti. Tavallisin oire mykoplasma-infektioissa on jopa kuukausia jatkuva yskä. Pisaratartuntana leviävän taudin itämisaika on viikosta jopa neljään viikkoon. Myös hengitysteiden ulkopuoliset oireet ovat mahdollisia. Esimerkiksi keskushermosto-oireisena tauti voi olla hyvin vaarallinen. Tauti voi kuitenkin olla myös lähes oireeton, eikä hoitoa aina tarvita. Hoitoa tarvitsevissa tapauksissa voidaan käyttää makrolideja, doksisykliiniä tai fluorokinoloneja, jotka toisin kuin perinteisesti mikrobitautien hoidossa käytetyt penisilliinit tai kefalosporiinit, tehoavat soluseinättömään M. pneumoniaeen (Razin et al. 1998, Puolakkainen & Järvinen 2012). Mycoplasma pneumoniae -infektioiden spesifinen diagnosointi on vaikeaa. Viljelyyn perustuvaa diagnostiikkaa pidetään huonona mykoplasman hitaan kasvun vuoksi ja sitä käytetäänkin nykyään harvoin. Suomessa diagnostiikka perustuu serologiseen IgM- ja IgGluokan vasta-aineiden havaitsemiseen. Näitä vasta-aineita ilmestyy vereen muutaman viikon kuluttua tartunnasta. IgM-luokan vasta-aineita voidaan havaita IgG-vasta-aineita aiemmin, mutta toisaalta IgM-vaste voi säilyä jopa 6 kuukautta infektion jälkeenkin. Muualla maailmalla käytetään myös esimerkiksi nukleiinihapon osoitukseen perustuvia PCR-testejä. Varmemman tuloksen saamiseksi voitaisiin käyttää IgM-vasta-ainetestauksen ja PCR-testin kombinaatiota (Puolakkainen & Järvinen 2012, Loens & Ieven 2016). 7

9 4. Mycoplasma pneumoniaen patogeeniset mekanismit Mycoplasma pneumoniae on pääsääntöisesti solunulkoinen patogeeni, ja sen selviytyminen on isäntäsolusta riippuvaista, kuten jo aiemmin mainittu. Siksi Mycoplasma pneumoniaen patogeneesin kannalta onkin välttämätöntä paitsi pääsy hengitysteihin, myös onnistunut kiinnittäytyminen epiteelisoluihin. Adheesion seurauksena aktivoituu useita eri mekanismeja, jotka osaltaan selittävät infektion aiheuttamia oireita. Pitkittynyt tauti saattaa olla seurausta patogeenin invaasiosta isäntäsoluun (Dallo & Baseman 2002, Shimizu 2016) Erityinen kiinnittymisorganelli on välttämätön patogeneesissä Mycoplasma pneumoniaelle on kehittynyt isäntäsoluun kiinnittäytymisen ja infektoimisen mahdollistava organelli. Sen avulla pisaratartuntana hengitysteihin kulkeutuneet bakteerisolut kykenevät kiinnittymään epiteelisolujen värekarvoihin (cilia) ja liikkumaan niitä pitkin solun pintaan ja infektoimaan solun. Kiinnittyminen suojaa mykoplasmoja normaalilta mukosiliaariselta puhdistumalta estämällä värekarvojen liikkeen (ciliostasis). Kiinnittymisorganelleja on tavallisesti yksi per solu, mutta ennen solunjakautumista niitä voidaan havaita useampiakin. Kiinnittymisorganelli osallistuu nimestään huolimatta myös solun liikkumiseen. Myös muutamilla muilla mykoplasmoilla on samantyyppisiä organelleja, mutta ne poikkeavat M. pneumoniaen terminaalisesta organellista muodoltaan ja ulkonäöltään. (Razin et al. 1998, Waites & Talkington 2004, Hasselbring et al. 2006, Miyata & Hamaguchi 2016) Kiinnittymisorganellin rakenne Kiinnittymisorganelli on noin nm pitkä solukalvon uloke, jonka rakenneosat voidaan jakaa solun pinnalla oleviin ja solunsisäisiin osiin. Proteiinit, jotka muodostavat pinnan rakenteet, osallistuvat suoraan isäntäsoluun kiinnittäytymiseen. Solunsisäiset osat puolestaan voidaan jaotella läpikuultavaan osaan ja tukirankana toimivaan keskusosaan (Miyata & Hamaguchi 2016). Läpikuultavan osan koostumus ja merkitys ovat vielä epäselviä. Koska siinä ei ole havaittu suuria sytoplasmassa tavallisesti sijaitsevia rakenteita, kuten ribosomeja, sen on ehdotettu 8

10 sisältävän vähemmän diffuuseja rakenteita, jotka estävät sytoplasmisten osien pääsyn organellin alueelle. Koska tällaisia ehdotettuja rakenteita ei kuitenkaan ole voitu kunnolla havaita elektronikryotomografialla (ECT), täytyy niiden olla joko hyvin pieniä tai kapeita (Hegermann et al. 2002, Kawamoto et al. 2016, Miyata & Hamaguchi 2016). Organellin keskusosa on keskimäärin nm pitkä ja nm leveä proteiinikeskittymä. Sitä kutsutaan myös elektronitiheäksi keskukseksi, koska elektronitiheys on sen alueella selvästi suurempi kuin muissa solun osissa. Se muodostuu kolmesta osasta: organellin päässä olevasta terminal button -rakenteesta, siihen kiinnittyneestä pitkänmallisesta paired platesrakenteesta ja organellin muuhun soluun yhdistävästä bowl (wheel) complex -rakenteesta (Biberfeld & Biberfeld 1970, Wilson & Collier 1976, Meng & Pfister 1980, Miyata & Hamaguchi 2016). Kuva 2. Mycoplasma pneumoniaen kiinnittymisorganellin jakautuminen erikseen tarkasteltaviin rakenneosiin. Rakenteisiin kuuluvien proteiinien nimet on ryhmitelty rakenneosan nimen viereen. Alkuperäinen kuva: Nakane et al. 2015, päivitetty versio: Miyata & Hamaguchi Paired plates -rakenne Jäykkä paired plates -rakenne muodostuu kahdesta eri pituisesta ja paksuisesta sauvasta, joiden välissä on noin 7 nm rako. Paksumman ja pidemmän sauvan (thick plate) paksuus vaihtelee välillä 18-26,6 nm. kun taas pienempi sauva (thin plate) on paksuudeltaan keskimäärin 10,6 9

11 nm. Suurempi sauva on yhteydessä terminal button -rakenteeseen. Kumpikin sauva on taipunut läheltä keskikohtaansa noin 150 ja pienempi sauva on ikään kuin suuremman sylissä. Taipumiskohdasta organellin päähän päin sauvat ovat jakautuneet osiin muistuttaen selkärankaa. Suuremmassa sauvassa segmentoituminen on selkeämpää. Siinä on arvioitu olevan osasta, joiden keskimääräiseksi pituudeksi on arvioitu noin 8 nm. Pienemmässä sauvassa osien pituus vaihtelee enemmän. (Meng & Pfister 1980, Krause et al. 1997, Hegermann et al. 2002, Henderson & Jensen 2006, Nakane et al. 2015, Kawamoto et al. 2016) HMW1, HMW2 ja CpsG ovat paired plates -rakenteen muodostavia proteiineja. Paksumpi sauvarakenne todennäköisesti muodostuu dimeerejä muodostavasta HMW2-proteiinista, jonka N- ja C-päät lokalisoituvat vastaavasti paired plates -rakenteen etu- ja takapäähän, osittain terminal button ja bowl complex -rakenteiden kanssa limittäin. Aminohapposekvenssin perusteella HMW2 rakentuu kaikkiaan 1818 aminohaposta, joista 1257 aminohappoa muodostavat 11 coiled-coil-aluetta. Nämä alueet todennäköisesti vastaavat sauvan segmentoineena havaittavaa distaalista osaa, koska juovien määrän on arvioitu vaihtelevan kymmenestä kahteentoista. Paired plates -rakenteen keskiosaan paikannettu HMW1-proteiini rakentuu 1018 aminohaposta ja sen keskiosassa on kaksi coiled-coil-aluetta. Se ja vastikään havaittu CpsG ovat todennäköisesti ohuemman sauvan rakenneproteiineja (Krause et al. 1997, Hahn et al. 1998, Nakane et al. 2015, Kawamoto et al. 2016, Miyata & Hamaguchi 2016) Terminal button -rakenne Erillistä keskusosan kuroutumaa kutsutaan terminal button -rakenteeksi. Se koostuu pääasiassa kahdesta erilaisesta proteiinista, P65:stä ja HMW3:sta. Rakenteen päähän sijoittuneet P65- proteiinit toimivat vuorovaikutuksessa organellin pinnalle sijoittuvien P30-kalvoproteiinien kanssa ja sitovat näin terminal button -rakenteen solukalvon pintaosiin. P65-proteiinin katkaisu vaikuttaa patogeneesin kannalta tärkeän P30:n lokalisoitumiseen ja hidastaa M. pneumoniaen liikettä sekä heikentää isäntäsoluun kiinnittymistä. HMW3-proteiinit lokalisoituvat terminal button ja paired plates -rakenteiden välille. Niiden uskotaan olevan yhteydessä HMW2- proteiineihin, joiden N-päät lokalisoituvat osittain HMW3-proteiinien kanssa päällekkäin. (Seto et al. 2001, Seto & Miyata 2003, Hasselbring et al. 2012, Nakane et al. 2015). 10

12 Bowl complex -rakenne Bowl complex -rakenteeseen on yhdistetty 6 erilaista proteiinia; MPN387, P200, P41, P24, TopJ ja Lon. Näiden proteiinien lisäksi myös HMW2-proteiinien C-päät ulottuvat bowl complex - rakenteen alueelle (Nakane et al. 2015, Miyata & Hamaguchi 2016). MPN387-proteiini esiintyy bowl complex -rakenteen etuosassa käsipainoa muistuttavana homodimeerinä. Se yhdistää bowl complex ja paired plates -rakenteet toisiinsa. MPN387 ei ole kiinnittymisen kannalta välttämätön proteiini, mutta sillä on tärkeä rooli M. pneumoniaen liikkumisessa. Sen uskotaan liittyvän suoraan joko voiman tuottamiseen tai sen siirtämiseen organellin juurelta eteenpäin (Hasselbring et al. 2006, Nakane et al. 2015, Kawakita et al. 2016). Myöskään MPN387 läheisyydessä esiintyvä P200-proteiini ei ole välttämätön Mycoplasma pneumoniaen kiinnittymisessä, mutta sen puuttumisen on havaittu aiheuttavan häiriöitä niin organismin liikkumisessa, kuin myös sen kolonisaatiossa keuhkoputken epiteelisoluihin. Niin ikään MPN387 välittömään läheisyyteen paikallistetun P41-proteiinin, sekä rakenteen perällä sijaitsevan P24-proteiinin merkitystä osana bowl complex -rakennetta on toistaiseksi vähemmän tutkittu (Kenri et al. 2004, Jordan et al. 2007, Nakane et al. 2015, Miyata & Hamaguchi 2016). TopJ ja Lon -proteiinit sijaitsevat kiinnittymisorganellin juuressa. TopJ eroaa selvästi muista kiinnittymisorganellin proteiineista sen oletetun J-domeenin vuoksi. J-domeenin omaavat proteiinit toimivat eräänlaisina avustavina chaperoneina stimuloimalla DnaK-chaperonien ATPaasi-aktiivisuutta. Siten ne vaikuttavat proteiinien laskostumiseen, translokaatioon ja erilaisten makromolekyylikompleksien muodostumiseen ja hajotukseen. TopJ saattaa olla merkittävä tekijä kiinnittymisorganellin oikeanlaisessa rakentumisessa ja siten myös sen toiminnassa. Lon puolestaan on ATPaasi, jolla on selvää sekvenssihomologiaa ennestään tunnettujen Lon proteaasien kanssa. Sen merkitystä kiinnittymisorganellissa ei kuitenkaan ole toistaiseksi tutkittu. (Balish et al. 2001, Cloward & Krause 2009, 2010, 2011, Miyata & Hamaguchi 2016) Pintarakenteet Integraalista P1 kalvoproteiinia pidetään tärkeimpänä M. pneumoniaen adheesioproteiineista. Sitä on pääasiassa kiinnittymisorganellissa, mutta vähäisemmissä määrin myös muualla solukalvolla. Spontaanin mutaation tai trypsiinikäsittelyn seurauksena vähentynyt P1 11

13 aktiivisuus johtaa kiinnittymisen estymiseen ja siten avirulenssiin (Krause & Balish 2001, Waites & Talkington 2004). P1 adhesiini (MPN141) on 170 kda painoinen proteiini, joka muodostuu 1627 aminohaposta. Aminohapposekvenssin perusteella sen on päätelty koostuvan kolmesta domeenista ja yhdestä transmembraanisesta osasta. Domeeni I sijaitsee kokonaan solun ulkopuolella, kuten myös domeeni II lyhyttä transmembraaniosaa lukuunottamatta. Domeeni III sijaitsee solun sisäpuolella ja on luultavasti yhteydessä muihin solun proteiineihin (Seto et al. 2001, Nakane et al. 2011, Miyata & Hamaguchi 2016). Pelkästään P1-proteiinit eivät riitä kiinnittymiseen isäntäsoluun, vaan infektoivaan adheesioon tarvitaan myös useita avustavia pintaproteiineja. Yksi näistä on transmembraaninen proteiini P30, joka on niin ikään välttämätön adheesiossa. Sen puuttuminen aiheuttaa paitsi adheesion estymisen, myös liikkumiskyvyn menettämisen ja solun muodon muuttumisen sekä nukleoidin leviämisen koko solun alueelle. P30 on todennäköisesti vuorovaikutuksessa P65-proteiinin kanssa, koska toisen näistä puuttuminen vaikuttaa toisen proteiinin stabiiliuteen (Jordan et al. 2001, Krause & Balish 2001, Seto et al. 2001, Hasselbring et al. 2012). Adheesion onnistumisen kannalta välttämättömiä proteiineja ovat myös P1-operonin alaisen MPN142-geenin (ORF6) koodaamasta 1218 aminohapon pituisesta 130 kda proteiinista translaation jälkeisissä muokkauksissa erilleen jakautuvat P40- ja P90-proteiinit, jotka on nimetty niiden molekyylikokojen mukaan. Ne ovat niin ikään integraalisia kalvoproteiineja (Sperker et al. 1991, Franzoso et al. 1993, Layh-Schmitt & Herrmann 1994, Widjaja et al. 2015). P1- ja P90-proteiinit muodostavat heterodimeerejä, jotka puolestaan muodostavat pareittain globulaarisen heterotetrameerikompleksin. Nämä kompleksit ovat halkaisijaltaan nm ja molekyylipainoltaan noin 480 kda. Näiden suurten kompleksien uskotaan toimivan M. pneumoniaen liikkumisessa ikään kuin jalkoina. Samaisten kompleksien uskotaan myös muodostavan kohotettua liinaa muistuttavat rakenteet (nap structure), jotka havaitaan negatiivisella värjäyksellä toteutetulla elektronimikroskopialla, sekä nappulamaiset rakenteet (knob-like structures), jotka havaitaan kolmiulotteisissa tutkimuksissa ECT:llä. Nämä organellin pinnalla olevat rakenteet ovat noin 7-8 nm solukalvon pinnalta. Niiden etäisyys toisistaan vaihtelee nm välillä (Nakane et al. 2011, Nakane et al. 2015, Kawamoto et al. 2016). 12

14 Kuva 3. Vasemmassa yläkulmassa on esitetty elektronimikroskopialla kuvattu, eristetty P1-adhesiinikompleksi. Oikeassa yläkulmassa on kuvainnollinen esitys P1-adhesiinikompleksin rakenteesta. Kaksi P1-proteiinia ja kaksi P90-proteiinia muodostavat globulaarisen kompleksin, jossa proteiinien C-päät sijaitsevat solun sisällä. Kompleksin avulla Mycoplasma pneumoniae kykenee kiinnittymään kiinteisiin pintoihin. P1-proteiinin domeenit I, II ja III on erotettu toisistaan värein. Punaisella on esitetty domeeni I, valkoisella ja vihreällä domeeni II ja sinsiellä domeeni III. Vihreä osa kuvaa proteiinin kalvonläpäisevää osaa. Alla olevassa kuvassa esitetään P1- proteiinin aminohapposekvenssin jakautuminen domeeneihin vastaavin värein. Kuva: Miyata & Hamaguchi 2016 tutkimuksen Nakane et al pohjalta Kiinnittymisorganelli M. pneumoniaen liikkumisessa Liike on olennainen osa M. pneumoniaen patogeneesiä, koska ilmateiden (keuhkotorven) epiteelisolujen värekarvojen päihin kiinnityttyään bakteerin täytyy vielä liikkua värekarvaa pitkin isäntäsolun pintaan asti. Liikkumattomiksi mutatoitujen mykoplasmojen kyky infektoida isäntäsolu on heikompi kuin liikkumaan kykenevien mykoplasmojen (Prince et al. 2014). Mycoplasma pneumoniaen liikkumiseen liittyvien geenien selvittäminen on edennyt verrattain hitaasti, sillä sen genomista ei ole löydetty mitään entuudestaan tunnettuja, muille bakteereille tai aitotumaisille soluille tyypillisiä liikkumiseen liittyviä geenejä. Lisäksi sen suhteellisen hitaan liikkumiskyvyn ja adheesion merkittävyyden vuoksi tutkimus on keskittynyt enemmän isäntäsoluihin kiinnittymiseen. Mycoplasma mobilen kyky liikkua paljon muita mykoplasmoja nopeammin, jopa 7,5 µm/s, havaittiin yli 30 vuotta sitten. Sen jälkeen M. pneumoniaen, ja muidenkin mykoplasmojen, liikkumiseen liittyvät tutkimukset ovat perustuneet pitkälti M. 13

15 mobilella aiemmin tehtyihin tukimuksiin (Kirchhoff & Rosengarten 1984, Himmelreich et al. 1996, Miyata 2010). Mycoplasma pneumoniaen on havaittu kykenevän liikkumaan kiinnittymisorganellin avulla kiinnittymispinnoilla keskimäärin nopeudella 0,4 µm/s. Liikkuminen tapahtuu kiinnittymisorganellin suuntaisesti, eli toisin sanoen organelli toimii johtavana päänä mykoplasmojen liikkeessä. Kiinnittymisorganellin sisäosalla on tärkeä tehtävä liikkumiseen vaadittavan voiman tuottamisessa. Tarkemmin voimantuoton uskotaan paikantuvan bowl complex -rakenteeseen, koska siihen lokalisoituvien proteiinien MPN387:n ja P200:n on osoitettu olevan organismin liikkumisen kannalta välttämättömiä. Bowl complex -rakenteesta liikkeen uskotaan johtuvan paired plates -rakenteen kautta eteenpäin terminal button - rakenteeseen ja edelleen P65- ja P30-proteiinien vuorovaikutuksen välityksellä organellin päähän. Organellin ojentumis- ja taittumisliike välittyvät lopulta P1-adhesiinikomplekseille, jotka kiinnittyvät sialyloituihin oligosakkarideihin, tuottavat vetomaisen liikkeen ja lopuksi irtoavat toistaakseen saman syklin uudelleen ja uudelleen. (Radestock & Bredt 1977, Kenri et al. 2004, Hasselbring et al. 2005, Seto et al. 2005, Balish 2014, Miyata & Hamaguchi 2016). Kuva 4. Rakenneproteiinien sijoittuminen kiinnittymisorganellissa ja liikkumiseen vaadittavan voiman eteneminen. Musta nuoli kuvaa M. pneumoniaen liikkeen suuntaa. Liikkeeseen vaadittavan voiman uskotaan syntyvän bowl complex -rakenteessa (i), ja etenevän paired plates -rakenteen kautta P1-adhesiinikomplekseille (iii). Kuva: Miyata & Hamaguchi

16 Liikkeen syntyyn vaaditaan energiaa. Useimmiten bakteerien liikkumismekanismeissa energianlähteenä toimii kalvopotentiaali, mutta Mycoplasma mobile käyttää liikkeessään energianlähteenä ATP:tä. M. pneumoniaen liikkeen voitaisiin siis olettaa käyttävän ATPenergiaa. M. mobilella tehdyt, energianlähteen selviämiseen johtaneet kokeet eivät kuitenkaan ole onnistuneet M. pneumoniaella, joten muiden energianlähteiden mahdollisuutta ei voida poissulkea (Uenoyama & Miyata 2005, Miyata & Hamaguchi 2016) M. pneumoniae -infektion vaikutukset isännän immuunisysteemiin M. pneumoniae -infektion aiheuttamien oireiden, kuten kuumeen ja yskän, uskotaan syntyvän infektion aiheuttamien tulehdusvasteiden ja sytotoksisuuden yhteisvaikutuksesta. Tulehduksen synnyssä tärkeinä välittäjämolekyyleinä toimivat sytokiinit, erityisesti interleukiinit (IL). Niiden tuotanto lisääntyy useiden mekanismien välityksellä. M. pneumoniae -infektion indusoimat tulehdusvasteet perustuvat kuitenkin pääosin neljään mekanismiin: TLR2- reseptorien aktivoitumisen synnyttämiin signaalinvälitysreitteihin, autofagia-välitteiseen signalointiin, inflammasomien aktivoitumiseen ja adheesion suoriin vaikutuksiin (Shimizu 2016). Koska mykoplasmoilla ei ole soluseiniä, niillä ei ole myöskään mikrobeille tavallisia, erilaisina toistuvina jaksoina esiintyviä immunostimulantteja (PAMPS), kuten lipopolysakkarideja tai peptidoglykaania. Tavallisesti näiden stimulanttien tunnistaminen tapahtuu tiettyjen isäntäsolun reseptorien (pattern recognition receptors) avulla. Tällaisia reseptoreita ovat esimerkiksi TLR-reseptorit (Toll-like receptors), joiden aktivoituminen johtaa signaalinvälitysreitin kautta geenien transkriptioon ja adaptiivista immuunivastetta välittävien solujen aktivoitumiseen. PAMPS-stimulanttien puutteesta huolimatta Mycoplasma pneumoniaen vaikutukset isäntäsolun immuunivasteeseen perustuvat osittain TLR-reseptorien aktivoitumiseen. Stimulantteina toimivat tietyt M. pneumoniaen lipoproteiinit. (Akira & Takeda 2004, Shimizu et al. 2014, Shimizu 2016). Mycoplasma pneumoniaella on tunnistettu yhteensä 48 eri lipoproteiinia, joiden N-pään rakenteen TLR2-reseptorit tunnistavat. Kaikista 48:sta lipoproteiinista vain viiden rakenne tunnetaan tarkemmin. Yksi näistä viidestä, MPN602 (F0F1 ATP-syntaasin b-alayksikkö) on diasyloitu lipoproteiini, jonka sitoutuminen heterodimeeriseen TLR2/6-reseptoriin saa aikaan NF-κB-signaalireitin (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) aktivoitumisen ja johtaa lopulta tulehdusvasteen syntymiseen. Loput neljä paremmin tunnettua 15

17 lipoproteiinia ovat MPN611 (N-ALP1, NF-κB-activating lipoprotein 1), MPN162 (N-ALP2), MPN052 ja MPN415. Ne ovat triasyloituja lipoproteiineja, joiden vaikutukset perustuvat TLR2/1-reseptorien aktivoimiseen (Into et al. 2007, Shimizu et al. 2007, Shimizu et al. 2014, Shimizu 2016). Koska edellä mainittujen lipoproteiinien rakenteet ovat identtisiä normaalin mikroflooran bakteerien, lipoproteiinien rakenteiden kanssa, kaikkia tulehduksellisia vasteita ei voida selittää pelkästään niiden toiminnalla. M. pneumoniae saa aikaan tulehdusvasteita myös TLR2:sta riippumattomien tekijöiden kautta. Näihin lukeutuvat esimerkiksi autofagia/tlr4-välitteinen reitti ja CARDS-toksiini (Simizu et al. 2014, Shimizu 2016). Makrofagien havaitessa ja fagosytoidessa M. pneumoniaen TLR4-välitteisesti, autofagia ja proinflammatoristen sytokiinien tuotanto lisääntyvät. Tarkkaa mekanismia ei ole vielä saatu selvitettyä, mutta on voitu osoittaa, että ABC-transportteri (MPN333) ja F0F1 ATP-syntaasin ε- alayksikkö (MPN597) ovat oleellisia autofagia/tlr4-välitteisen reitin aktivoitumisessa. Lisäksi mykoplasman hajottaminen autofagosomeissa ja JNK MAP-kinaasien toiminta signaalinvälityksessä ovat välttämättömiä edellytyksiä sytokiinien tuotannon indusoinnissa tällä mekanismilla (Shimizu et al. 2014). CARDS-toksiinilla (MPN372) on ADP-ribosyylitransferaasi-aktiivisuutta sen karboksyylipäässä. Se sitoo keuhkojen surfaktanttiproteiini A:ta ja aiheuttaa solujen vakuolisaatiota sekä estää värekarvojen liikettä. CARDS myös aktivoi ADP-ribosylaatiolla NLRP3-inflammasomeja, jotka lisäävät proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-1β:n, maturaatiota ja vapautumista. Sytokiinien maturaatio tapahtuu spesifisten proteaasien, aktivoituneiden kaspaasien, pilkkoessa sytokiinien esimuotoja. Esimerkiksi kaspaasi-1 pilkkoo IL-1β:n esimuotoa pro-il-1β:aa. Maturoitunut IL-1β aktivoi solussa NF-κB-signaalireittiä ja vaikuttaa sen välityksellä geenien transkriptioon. Lisäksi M. pneumoniaen adheesio indusoi ATP:n ulosvirtausta isäntäsoluista, minkä puolestaan on osoitettu aktivoivan solukalvolla P2X7-reseptoreja ja edelleen IL-1β:n maturaatiota ja vapautumista inflammasomien välityksellä (Kannan & Baseman 2006, Shimizu et al. 2011, Bose et al. 2014, Shimizu et al. 2014, Shimizu 2016). Mycoplasma pneumoniaen kiinnittyminen ja kolonisaatio keuhkoputken epiteelisolujen pintaan saa aikaan alueellista vahinkoa. Mykoplasma vapauttaa Ca 2+ -riippuvaista sytotoksista nukleaasia (MPN133), ja glyseroliaineenvaihdunnan tuloksena syntyviä vetyperoksidia ja superoksidia, jotka saavat aikaan epiteelisolujen rakenteen muutoksia, turpoamista, 16

18 oksidatiivista stressiä ja solukuolemaa. Vaikka M. pneumoniae tuottaa vetyperoksidia ja superoksideja, siltä puuttuu oksidatiivista stressiä estävät superoksididismutaasi- ja katalaasientsyymit. Onkin ehdotettu, että tioreduktaasisysteemi suojaisi mykoplasmoja reaktiivisilta happiyhdisteiltä (Himmelreich et al. 1996, Ben-Menachem et al. 1997, Atkinson et al. 2008, Shimizu 2016). Kuva 5. Mycoplasma pneumoniaen tulehdusvasteita synnyttävät mekanismit. Kuvassa esitetyt mekanismit ovat: (1) TLR1 tai TLR6 avusteisten TLR2-reseptorien aktivoituminen mykoplasman lipoproteiinien sitoutuessa, (2) autofagia/tlr4-välitteinen reitti, (3) inflammasomien aktivoituminen CARDS-toksiinin tai ATP:n ulosvirtauksen seurauksena, (4) suoraan adheesiosta aiheutuva alueellinen vahinko ja oksidien vapautuminen. Kuva: Shimizu Invaasio voi aiheuttaa taudin pitkittymistä M. pneumoniaen on havaittu kykenevän soluviljelmissä tunkeutumaan tarttumaansa soluun ja vahingoittamaan sitä sisältä päin. Invaasio vaatii isäntäsolun reseptoreihin ja sytoskeletaalisiin elementteihin liittyviä signaalinvälitysreittejä. Siirtyminen isäntäsolun sisään voi tapahtua tunnista seitsemään päivään infektoitumisen jälkeen. Solunjakautuminen voi olla isäntäsolun sisällä vielä normaaliakin hitaampaa ja invaasio voikin olla yhteydessä pitkittyneisiin oireisiin. 17

19 Täytyy kuitenkin huomata, että erilaistuneissa normaaleissa ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa invaasiota ei ole havaittu (Atkinson et al. 2008, Baseman et al. 1995, Dallo & Baseman 2000). 5. Hengitystie-epiteelin vaurioituminen voi altistaa infektioille Kuten jo johdannossa kerrottiin, kasvaa ylähengitystieinfektioiden riski J-käyrän mukaisesti liikunnan määrän ja tehon kasvaessa. Riskin kasvun on jo pitkään tiedetty johtuvan urheilusuoritusta seuraavasta väliaikaisesta, sekä synnynnäisen että hankitun immuunipuolustuksen heikentymästä. Lisäksi perimän ja ravinnon vaikutuksista on kerrottu. Esimerkiksi atopia on tunnustettu yhdeksi hengitysteiden yliherkkyyden ja astman riskitekijäksi. Ainakin yhtenä hieman myöhemmin havaittuna infektioriskiä kasvattavana tekijänä voidaan pitää toistuvan, hengityselimistöä rasittavan harjoittelun seurauksena tapahtuvaa hengitystie-epiteelin vaurioitumista (Bougault et al. 2009, Kippelen et al. 2012, Kurowski et al. 2014). Keuhkoputken värekarvattomista Clara-soluista erittyy normaalisti suuria määriä CC16- proteiinia (Clara cell secretory protein), joka suojaa hengitysteitä oksidatiivista stressiä ja tulehdusta vastaan. Sen seerumipitoisuutta voidaan pitää hengitystie-epiteelin eheyden markkerina. Olympiaurheilijoilla (n=203) tehdyssä tutkimuksessa urheilijoilla havaittiin selvästi muuta väestöä alempia seerumin CC16-proteiinin pitoisuuksia, minkä uskotaan olevan seurausta huippu-urheilijoille tyypillisestä intensiivisestä ja säännöllisestä fyysisestä harjoittelusta. Alhainen CC16-pitoisuus oli yhteydessä kohonneeseen hengitystieinfektioiden, kuten Mycoplasma pneumoniaen ja astman, riskiin ja se voi siten osaltaan selittää niiden yleisyyttä huippu-urheilijoilla. (Broeckaert & Bernard 2000, Kurowski et al. 2014). Täytyy huomata, että vaikka usein tutkimuksissakin käytetään yleisesti termiä huippu-urheilija, vaihtelevat hengitystieinfektioiden riskit urheilijan lajista riippuen lähinnä harjoittelun luonteen ja vallitsevien ympäristötekijöiden erilaisuuden vuoksi. Hengitysteiden vaurioitumista voivat edistää esimerkiksi kuiva ja kylmä ilma sekä uima-altaissa klooriyhdisteiden ja orgaanisten typpiyhdisteiden, kuten hien, välisissä reaktioissa muodostuvat kloramiinit (Kippelen et al. 2012). 18

20 6. Kirjallisuusviitteet Akira S. & Takeda K. (2004) Toll-like Receptor Signalling. Nature Reviews Immunology, 4(7): Atkinson T.P., Balish M.F. & Waites K.B. (2008) Epidemiology, clinical manifestations, pathogenesis and laboratory detection of Mycoplasma pneumoniae infections. FEMS Microbiology Reviews, 32: Baseman J.B., Lange M., Criscimagna N.L., Giron J.A. & Thomas C.A. (1995) Interplay between mycoplasmas and host target cells. Microbial Pathogenesis, 19: Ben-Menachem G., Himmelreich R., Herrmann R., Aharonowitz Y. & Rottem S. (1997) The thioredoxin reductase system of mycoplasmas. Microbiology 143: Biberfeld G. & Biberfeld P. (1970) Ultrastructural Features of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 102(3): Bose S., Segovia J.A., Somarajan S.R., Chang T.-H., Kannan T.R. & Baseman J.B. (2014) ADP-Ribosylation of NLRP3 by Mycoplasma pneumoniae CARDS Toxin Regulates Inflammasome Activity. MBio, 5(6):e Bougault V., Turmel J., St-Laurent J., Bertrand M. & Boulet L. (2009) Asthma, airway inflammation and epithelial damage in swimmers and cold-air athletes. The European Respiratory Journal. 33: Broeckaert F. & Bernard A. (2000) Clara cell secretory protein (CC16): characteristics and perspectives as lung peripheral biomarker. Clinical & Experimental Allergy, 30: Cloward J.M. & Krause D.C. (2009) Mycoplasma pneumoniae J-domain protein required for terminal organelle function. Molecular Microbiology, 71(5): Cloward J.M. & Krause D.C. (2010) Functional domain analysis of the Mycoplasma pneumoniae co-chaperone TopJ. Molecular Microbiology, 77(1): Cloward J.M. & Krause D.C. (2011) Loss of Co-chaperone TopJ Impacts Adhesin P1 Presentation and Terminal Organelle Maturation in Mycoplasma pneumoniae. Molecular Microbiology, 81(2): Dallo F.B. & Baseman J.B. (2000) Intracellular DNA replication and long-term survival of pathogenic mycoplasmas. Microbial Pathogenesis, 29(5):

21 Drexler H.G. & Uphoff C.C. (2002) Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology 39: Franzoso G., Hu P. C., Meloni G. A., & Barile M. F. (1993) The immunodominant 90- kilodalton protein is localized on the terminal tip structure of Mycoplasma pneumoniae. Infection and Immunity, 61(4): Friman G. & Wesslén L. (2000) Infections and exercise in high-performance athletes. Immunology and Cell Biology, 78(5): Hahn T.-W., Willby M. J., & Krause D. C. (1998) HMW1 Is Required for Cytadhesin P1 Trafficking to the Attachment Organelle in Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 180(5): Hasselbring B.M., Jordan J.L. & Krause D.C. (2005) Mutant analysis reveals a specific requirement for protein P30 in Mycoplasma pneumoniae gliding motility. Journal of Bacteriology, 187(18): Hasselbring B.M., Jordan J.L., Krause R.W. & Krause D.C. (2006) Terminal organelle development in the cell wall-less bacterium Mycoplasma pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(44): Hasselbring B.M., Sheppard E.S. & Krause D.C. (2012) P65 Truncation Impacts P30 Dynamics during Mycoplasma pneumoniae Gliding. Journal of Bacteriology, 194(11): Hegermann J., Herrmann R. & Mayer F. (2002) Cytoskeletal elements in the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Naturwissenschaften (2002) 89: Heinonen O. (2005) Infektiot. Julkaisussa Vuori I., Taimela S., Kujala U. (toim.) Liikuntalääketiede. 3. uud. p. Duodecim. Henderson G.P. & Jensen G.J. (2006) Three-dimensional structure of Mycoplasma pneumoniae s attachment organelle and a model for its role in gliding motility. Molecular Microbiology, 60(2): Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B. C. & Herrmann R. (1996) Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucleic Acids Research. 24:

22 Hu P.C., Collier A.M. & Baseman J.B. (1977) Surface parasitism by Mycoplasma pneumoniae of respiratory epithelium. The Journal of Experimental Medicine. 145(5): Into T., Dohkan J., Inomata M., Nakashima M., Shibata K. & Matsushita K. (2007) Synthesis and Characterization of a Dipalmitoylated Lipopeptide Derived from Paralogous Lipoproteins of Mycoplasma pneumoniae. Infection and Immunity. 75(5): Jordan J.L., Berry K.M., Balish M.J., Krause D.C. (2001) Stability and Subcellular Localization of Cytadherence-Associated Protein P65 in Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 183(24): Jordan J.L., Chang H.-Y., Balish M.F., Holt L.S., Bose S.R., Hassebring B.M., Waldo R.H., Krunkosky T.M. & Krause D.C. (2007) Protein P200 Is Dispensable for Mycoplasma pneumoniae Hemadsorption but Not Gliding Motility or Colonization of Differentiated Bronchial Epithelium. Infection and Immunity, 75(1): Kannan T.R. & Baseman J.B. (2006) ADP-ribosylating and vacuolating cytotoxin of Mycoplasma pneumoniae represents unique virulence determinant among bacterial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(17): Kashyap S. & Sarkar M. (2010) Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India 27(2): Kawakita Y., Kinoshita M., Furukawa Y., Tulum I., Tahara Y.O., Katayama E., Namba K. & Miyata M. (2016) Structural Study of MPN387, an Essential Protein for Gliding Motility of a Human-Pathogenic Bacterium, Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 198(17): Kawamoto A., Matsuo L., Kato T., Yamamoto H., Namba K. & Miyata M. (2016) Periodicity in Attachment Organelle Revealed by Electron Cryotomography Suggests Conformational Changes in Gliding Mechanism of Mycoplasma pneumoniae. MBio, 7(2):e Kenri T., Seto S., Horino A., Sasaki Y., Sasaki T., Miyata M. (2004) Use of Fluorescent-Protein Tagging To Determine the Subcellular Localization of Mycoplasma pneumoniae Proteins Encoded by the Cytadherence Regulatory Locus. Journal of Bacteriology, 186(20): Kirchhoff H. & Rosengarten R. (1984) Isolation of a Motile Mycoplasma from Fish. Journal of General Microbiology, 130:

23 Krause D.C., Proft T., Hedreyda C.T., Hilbert H., Palgens H. & Herrmann R. (1997) Transposon Mutagenesis Reinforces the Correlation between Mycoplasma pneumoniae Cytoskeletal Protein HMW2 and Cytadherence. Journal of Bacteriology, 179(8): Krause D.C. & Balish M.F. (2001) Structure, function, and assembly of the terminal organelle of Mycoplasma pneumoniae. FEMS Microbiology Letters, 198:1-7. Kurowski M., Jurczyk J., Jarzębska M., Moskwa S., Makowska J.S., Krysztofiak H. & Kowalski M.L. (2014) Association of serum Clara cell protein CC16 with respiratory infections and immune response to respiratory pathogens in elite athletes. Respiratory Research, 15(1):45. Layh-Schmitt G. & Herrmann R. (1994). Spatial arrangement of gene products of the P1 operon in the membrane of Mycoplasma pneumoniae. Infection and Immunity, 62(3): Loens K. & Ieven M. (2016) Mycoplasma pneumoniae: Current Knowledge on Nucleic Acid Amplification Techniques and Serological Diagnostics. Frontiers in Microbiology, 7:448. Meng K.E. & Pfister R.M. (1980) Intracellular structures of Mycoplasma pneumoniae revealed after membrane removal. Journal of Bacteriology, 144(1): Miyata M. & Hamaguchi T. (2016) Integrated Information and Prospects for Gliding Mechanism of the Pathogenic Bacterium Mycoplasma pneumoniae. Frontiers in Microbiology, 7:960. Moreira A., Delgado L., Moreira P. & Haahtela T. (2009) Does exercise increase the risk of upper respiratory tract infections? British Medical Bulletin, 90: Nakane D., Adan-Kubo J., Kenri T. & Miyata M. (2011) Isolation and Characterization of P1 Adhesin, a Leg Protein of the Gliding Bacterium Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 193(3): Nakane D., Kenri T., Matsuo L. & Miyata M. (2015) Systematic Structural Analyses of Attachment Organelle in Mycoplasma pneumoniae. PLoS Pathogens, 11(12): e Nieman D.C. (1994) Exercise, upper respiratory tract infection, and the immune system. Medicine and Science in Sports and Exercise. 26(2): Pollack J.D., Williams M.V. & McElhaney R.N. (1997) The Comparative Metabolism of the Mollicutes (Mycoplasmas): The Utility for Taxonomic Classification and the Relationship of 22

24 Putative Gene Annotation and Phylogeny to Enzymatic Function in the Smallest Free-Living Cells. Critical Reviews in Microbiology. 23(4): Prince O., Krunkosky T. & Krause D. (2014) In Vitro Spatial and Temporal Analysis of Mycoplasma pneumoniae Colonization of Human Airway Epithelium. Infection and Immunity. 82(2): Puolakkainen M. & Järvinen A. (2012) Mycoplasma pneumoniae infektiot. Duodecim, 128(21): Radestock U. & Bredt W. (1977) Motility of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 129(3): Razin S. (1996) Mycoplasmas. Julkaisussa: Baron S. (toim.). Medical Microbiology. 4th edition. University of Texas Medical Branch at Galveston. Saatavilla: Razin, S., Yogev, D., & Naot, Y. (1998). Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(4), Seto S., Layh-Schmitt G., Kenri T. & Miyata M. (2001) Visualization of the Attachment Organelle and Cytadherence Proteins of Mycoplasma pneumoniae by Immunofluorescence Microscopy. Journal of Bacteriology, 183(5): Seto S. & Miyata M. (2003) Attachment Organelle Formation Represented by Localization of Cytadherence Proteins and Formation of the Electron-Dense Core in Wild-Type and Mutant Strains of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology, 185(3): Seto S., Kenri T., Tomiyama T. & Miyata M. (2005) Involvement of P1 adhesin in gliding motility of Mycoplasma pneumoniae as revealed by the inhibitory effects of antibody under optimized gliding conditions. Journal of Bacteriology, 187: Shimizu T., Kida Y. & Kuwano K. (2011) Cytoadherence-dependent induction of inflammatory responses by Mycoplasma pneumoniae. Immunology, 133(1): Shimizu T., Kimura Y., Kida Y., Kuwano K., Tachibana M., Hashino M. & Watarai M. (2014) Cytadherence of Mycoplasma pneumoniae Induces Inflammatory Responses through Autophagy and Toll-Like Receptor 4. Infection and Immunity, 8(7):

25 Shimizu T. (2016) Inflammation-inducing Factors of Mycoplasma pneumoniae. Frontiers in Microbiology. 7:414. Sperker B., Hu P.-C. & Herrmann R. (1991) Identification of gene products of the P1 operon of Mycoplasma pneumoniae. Molecular Microbiology, 5(2): Tully J.G., Taylor-Robinson D., Cole R.M. & Rose D.L. (1981) A newly discovered mycoplasma in the human urogenital tract. The Lancet, 1(8233): Uenoyama A. & Miyata M. (2005) Identification of a 123-kilodalton protein (Gli123) involved in machinery for gliding motility of Mycoplasma mobile. Journal of Bacteriology, 187(16): Waites K.B. & Talkington D.F. (2004) Mycoplasma pneumoniae and Its Role as a Human Pathogen. Clinical Microbiology Reviews, 17(4): Widjaja M., Berry I.J., Pont E.J., Padula M.P. & Djordjevic S.P. (2015) P40 and P90 from Mpn142 are Targets of Multiple Processing Events on the Surface of Mycoplasma pneumoniae. Proteomes, 3: Wilson M.H. & Collier A.M. (1976) Ultrastructural Study of Mycoplasma pneumoniae in Organ Culture. Journal of Bacteriology, 125(1): Xiao L., Ptacek T., Osborne J.D., Crabb D.M., Simmons W.L., Lefkowitz E.J., Waites K.B., Atkinson T.P. & Dybvig K. (2015) Comparative genome analysis of Mycoplasma pneumoniae. BMC Genomics, 16:610. Yus E. Maier T., Michalodimitrakis K., van Noort V., Yamada T., Chen W.-H., Wodke J.A.H., Guëll M., Martínez S., Bourgeois R. Kühner S., Raineri E., Letunic I., Kalinina O.V., Rode M., Herrmann R., Gutiérrez-Gallego R., Russell R.B., Gavin A.-C., Bork P. & Serrano L. (2009) Impact of Genome Reduction on Bacterial Metabolism and Its Regulation. Science, 326: