(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT. (51) Kv.lk.5 - Int.cl.5 C 12N 7/00, A 61K 39/15, C 12N 15/01. (24) Alkupäivä - Löpdag

Transkriptio

1 (B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT (51) Kv.lk.5 Int.cl.5 C 12N 7/00, A 61K 39/15, C 12N 15/01 SUOMIFINLAND (FI) Patentti ja rekisterihallitus Patent och registerstyrelsen (21) Patenttihakemus Patentansökning (22) Hakemispäivä Ansökningsdag (24) Alkupäivä Löpdag (41) Tullut julkiseksi Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (32) (33) (31) Etuoikeus Prioritet US P (71) Hakija Sökande 1. Smithkline Beckman Animal Health Products S.A., Rue du Tilleul 13, Genval (Rixensart), Belgium, (BE) (72) Keksijä Uppfinnare 1. Delgoffe, JeanClaude, Rue Joseph Francis,54, Bierges, Belgium, (BE) 2. Lobmann, Michele, Rue RosierBois,4, Rosieres, Belgium, (BE) 3. Zygraich, Nathan, Avenue H. Boulanger, Bruxelles, Belgium, (BE) (74) Asiamies Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys Uppfinningens benämning Naudan muunnettujen diarreaviruskantojen valmistus Framställningen av nötets modifierade diarrevirusstammar (56) Viitejulkaisut Anförda publikationer (57) Tiivistelmä Sammandrag e Jim. n J rreavirus käsitellään kemiallisella mutageenilla, hiipokkeella, ja eristetään sellainen lämpöherkkä jeiika kasvukyky ri C:ssa on huomattavasti pienc, mmi tdvallisessa 3 () Cin lämi;ötilassa. Tällainen ; [Lu!::. :1 kanta on hyödyllinen rokotekäytössä parenteraaiii; =a anncttaessa. täiärrevirps ;,chandlas med en kemisk mutagen, t.ex. salrsyrligii t, en mutant isoleras, vars tillväxtförmågd år avsevärt reducerad jämförd mod tillväxtförmågan sedvanliga tillväxttemperaturen 39 0C. En sådan mri'fierad otan är värdefull för vaccineringsändamål vid

2 Naudan muunnettujen diarreaviruskantojen valmistus Framstäliningen av nötets modifierade diarrevirusstammar Keksintö koskee naudan muunnettujen diarreaviruskantojen (BVD) valmistusta. Naudan virusperäinen diarrea on yksi laajimmalle levinneistä ja taloudellisesti merkityksellisimmistä nautakarjan sairauksista. Se havaittiin ensinnä Yhdysvalloissa (Olafson et al., Cornell Vet. 36:205213, 1946), kun karjalaumoissa puhkesi äkillinen, usein kuolemaan johtanut karjaruttoa muistuttava syndrooma, johon liittyi haavaumia ruuansulatuselinten limakalvoissa sekä ripulia. Samanaikaisesti selostettiin vastaavia tapauksia, joiden vakavuusaste, kroonisuus ja esiintymistihey5vaihtelivat, ja niille annettiin nimeksi limakalvosairaus (Ramsey F.K. et al., North Am. Vet. 34:629633, 1953). Jonkin aikaa luultiin, että esiintyi useita erilaisia tartuntoja. Ajan mittaan kuitenkin Päädyttiin siihen, että kumpikin syndrooma oli saman viruksen aiheuttama, mutta tämä tapahtui vasta sitten, kun molemmat termit olivat juurtuneet kirjallisuuteen ja termi limakalvosairausoireryhmä oli yleisessä käytössä. Useimmiten sairautta nimitettiin naudan virusdiarreaksi. BVD:n etiologinen synnyttäjä on RNAvirus, joka luokitellaan Togaviridaeheimoon kuuluvaksi ruttovirukseksi (Andrewes C, et al., Viruses of the Vertebrates, 4th ed., London; Bailliere Tindall, 1978). Kliinisen sairauden ilmenemismuodot vaihtelevat kentällä huomattavasti. Yleensä 711 vrk:n itämisaikaa seuraa 12vaiheinen kuumetila (39,541,5 C), anorexia ja diarrea. Joskus diarrea etenee siten, että ilmenee sulamattoman ruuan oksentaminen, veripaakkuja sisältävää limaa, kurkkumätäisiä alueita sekä voimakas ulostuspakko. Huolimatta samanaikaisesta polydipsiasta eläimet kärsivät nestevajausta ja menettävät nopeasti hyvän kuntonåa.

3 Vaikka BVD tavallisesti aiheuttaa tartunnan ruuansulatuskanavassa, on arveltu että oireiden eteneminen alkaa tavallisesti hengitystien välityksellä: ensin nenästä valuu limaa, joka myöhemmin muuttuu märkäiseksi, ja sen lisäksi ilmenee polypnoeaa ja yskimistä (S.F. Rosner, Iowa Vet. 35: 1114, 1964). Useat tutkijat ovat myös maininneet, että esiintyy nenästä tulevaa eritettä, joka muuttuu heramaisesta märkäiseksi limaksi. Sairauteen liittyvät pääasialliset patologiset muutokset ovat ruuansulatuselinten limakalvon hyperaemia, verenvuoto, ödeema, sierrettyminen ja haavautuminen. Myös havaitaan hengitysteiden limakalvoissa verentungosta sekä keuhkoödeemaa. Erityisesti tartunnan alkuvaiheessa esiintyy voimakas leukopenia. Valkoisten verisolujen määrän havaittiin palautuvan normaalitasolle noin 14 vuorokauden kuluttua keinotekoisesta tartutuksesta lukien (Scott F.W. et al., Cornell Vet. 63:536560, 1973). Tällä perusteella, Mills J.H.L. et al. (Am. J.Vet.Res. 29: , 1968) arvelivat, että tauti leviää hengitysteiden välityksellä. Synnynnäistä immunotoleranssia BVDinfektiolle on pidetty mahdollisena syyllisenä harvoin kuolemaan johtavalle sairaudelle, ja tiedetään, että kortikoidikäsittelyllä aiheutettu immunodepressio vahvistaa keinotekoisen BVDinfektion virulenssia. Eläimet, joiden vastustuskyky oli heikennetty, menehtyivät usein yleistyneeseen viraemiaan (Rohde, G, et al., Zbl. Vet. Med. 17 B:686, 1970, ja Shope R.E. et al., Can.J.Comp.Med. 40:355359, 1976). Siinä vaiheessa, kun laumassa havaitaan selviä kliinisiä merkkejä, infektio on yleensä päässyt hyvään vauhtiin yksilöissä ja koko karjassa. Tällä hetkellä ei ole tarjolla spesifisiä terapeuttisia keinoja kliinisten tapausten hoitamiseksi. Jos sairaus on vakava, se tavallisesti aiheuttaa kuoleman, jos taas lievä, antibiooteilla voidaan nopeuttaa paranemista, sillä näin voidaan hallita sekundäärisiä infektioita.

4 Tavallisissa maatilaolosuhteissa ovat yritykset pitää yllä "suljettua karjaa" osoittautuneet riittämättömiksi BVDviruksen aiheuttaman infektion ehkäisyssä. Näin ollen ehkäisymenetelmät perustuvat suurelta osin rokotteisiin. Inaktivoituja rokotteita on tutkittu paljon (McClurkin A.W. et al., Pro. US Anim. Health Assoc. 79:114123, 1975). Tähän mennessä niitä ei ole ollut kaupallisesti saatavissa. Niiden käyttöä on haitannut puute sellaisista menetelmistä, joilla voitaisiin tuottaa hyväksyttäviä annosmuotoja, joilla saataisiin annetuiksi tarvittavat antigeenimäärät taloudellisesti. Julkaisuista US , US ja US tunnetaan kemiallisella mutatointimenetelmällä aikaansaatuja lämpöherkkiä naudan Rhinotracheitis ja Adenoviruskantoja rokotekäyttöön. Myös USpatentissa on esitetty rokote kolmelle naudan virustaudille. Joitakin eläviä BVCrokotteita on markkinoilla. Kuten R.M. Phillips et al. (Am. J. Vet. Res 36:135140, 1975) ovat selostaneet, "BVDrokotteita kehitettiin aluksi siten, että virus heikennettiin viemällä se sarjassa kanien tai naudan maksasoluviljelmien läpi. Nämä rokotteet osoittautuivat tehokkaiksi BVDvirusinfektioiden ehkäisemisessä nautakarjassa, mutta rokotuksen jälkeisistä komplikaatioista on ollut mainintoja". Samassa julkaisussa selostettiin myös eläviä BVDvirusrokotteita, jotka oli heikennetty sikojen solulinjassa. Kuitenkaan tarjolla olevilla elävillä BVDrokotteilla ei voida välttää ennestään tunnettuihin liittyviä vaaroja (Terpstra, C., Eikelenboom, J.L. and Glas, C., Proceedings of the XIIth world congress on diseases of cattle, vol. 1:177, 1982). Useita vaikuttavia syitä, jotka ovat muita kuin rokotekannan itsensä virulenssi, on esitetty yritettäessä selittää niitä vakavia rokotuksen jälkeisiä komplikaatioita, jotka esiintyvät vaihtelevassa määrin; kuitenkin alkuperän toteaminen on vaikeata ja rokotteet on asetettu vakavasti kyseenalaisiksi. Nyt esillä olevalla keksinnöllä vältetään nykyään tiedossa olevat eläviin BVDrokotteisiin liittyvät vaarat tarjoamalla muunnettuja kantoja, jotka ovat BVDviruksen lämpöherkkiä (ts) mutanttikantoja, so. kantoja, joiden lisääntymiskyky on huomat

5 tavasti rajoittunut eläimen ruumiinlämpötilassa, mutta jotka kykenevät saamaan aikaan immuniteetin naudoissa ilman vakavia sivuvaikutuksia. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisessa patenttivaatimuksessa. Tämän keksinnön mukaiset muunnetut kannat valmistetaan aiheuttamalla mutaatioita BVDviruskannoille, tarkemmin sanottuna käsittelemällä BVDviruskanta kemiallisella mutageenilla, kuten käsittelemällä typpihapokkeella BVDvirus, joka on eristetty tartunnan saaneesta eläimestä, esim. villityyppiä oleva BVDkanta, joka on eristetty ja talletettu Euroopan patenttisopimuksen (EPC) sääntöjen mukaisesti 20. heinäkuuta 1982 kokoelmanumerolla 1198 Pasteurinstituutin, Pariisi, kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes". Kanta 1198 saadaan antamalla tyypillisen naudan diarreaviruksen kasvaa vasikan kivessoluissa. Mutaatioiden aikaansaaminen kemiallisilla aineilla on alalla tunnettu menettelytapa ja tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi sopivia mutageenisia aineita ovat edellä mainitun typpihapokkeen lisäksi mm. NmetyyliNnitrosoNnitroguanidiini, metyylimetaanisulfonaatti, etyylimetaanisulfonaatti, 5bromiurasiili, 2aminopuriini, hydroksyyliamiini ja akridiiniväriaineet, kuten 5aminoakridiini ja proflaviini. Tarkemmin sanottuna USpatenteissa ja selostetaan lämpöherkkien virusmutanttien valmistusta typpihapokekäsittelyllä ja mainittujen mutanttien käyttöä elävissä virusrokotteissa nautakarjan hengityselinsairauksien ehkäisyssä. Kuitenkaan lämpöherkkiä BVDvirusmutantteja ei tunneta ennen tätä keksintöä. Tämän keksinnön mukaisesti, kun halutaan valmistaa rokotekanta villityyppisestä BVDviruskannasta, kannan annetaan reagoida kemiallisen mutageenin, esim. typpihapokkeen kanssa, toimintalolosuhteissa, jotka vähentävät alkuperäistä virustiitteriä 23 1og10:11ä, ja viljelemällä saatuja mutantteja 35 C:ssa ja 39,5 C:ssa vastaavasti ja lämpöherkkä (ts) mutantti eristetään sen jälkeen sen perusteella, että sen kasvukyky 39,5 C:ssa (joka on naudan sisäelinten lämpötila), on n. 3 log10 pienempi kuin sen kasvukyky 35 C:ssa. Lämpöherkkä mutanttikanta eristetään kloonaamalla

6 mihin tahansa sellaiseen kudosviljelmään, jonka tiedetään hyväksyvän naudan diarreaviruksen kasvun (esim. joko naudan munuaissolulinja, joka on taltioitu ja rajoituksitta saatavissa American Type Culture Collectionkokoelmista kokoelmanumerolla ATCC CC144, tai naudan turbinalissolukerros, jota ovat selostaneet McClurkin A.W. et al. julkaisussa Arch. Gesam. Virusforsch. 45:285289, 1974) sopivana laimennuksena niin, että voidaan valita kloonit laimennuksen loppupisteessä. Tarkemmin sanottuna villityyppisen kannan, joka on eristetty eläimestä, jolla esiintyy tyypilliset naudan virusdiarrean oireet, esim. C.N.C.M. I198viruskanta, annetaan lisääntyä kudosviljelmässä, jossa naudan diarreavirus kykenee kasvamaan, esim. naudan munuaissolulinja tai naudan turbinalissolulinja, kun mainittu kanta on mandollisesti ensin mukautettu mainittuun kudosviljelmään, ja mainitun naudan diarreavirussuspension annetaan reagoida huoneen lämpötilassa kemiallisen mutageenin kanssa, esim. puskuroitu typpihapokkeen vesiliuos, kuten typpihappo etikkahappopuskurissa, jossa typpihapokkeen ja asetaattiionin väkevyydet ovat 4 N ja N vastaavasti, 115 min ajan esim. 6 ( 1) minuuttia, phalueella 56, esim. ph 5,7 ( 0,1), jonka ajanjakson jälkeen reaktio pysäytetään esim. säätämällä pharvoon 7,5 ( 0,5) lisäämällä tipoittain 1 N natriumhydroksidia. Sen jälkeen suspensio on edullista dialysoida ja laimennettujen erien annetaan kasvaa kudosviljelmässä edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen positiivisia viljelmiä kasvatetaan vertaamalla toisiinsa ja titrataan 35 C:ssa ja 39,5 C:ssa ja valitaan ne kannat, joiden tiittereiden ero on n. 3 log io TCID 50 näiden lämpötilojen välillä. Sitten tällaisen lämpöherkän mutantin annetaan lisääntyä kudosviljelmässä, jossa virus kasvaa edellä kuvatulla tavalla, ja se kloonataan vähintään yhdellä päätepistelaimennusläpäisyllä, jotta saadaan eristetyksi lämpöherkkä mutantti, esim. C.N.C.M. I199viruskanta. Kun immuunisuudeltaan heikennetyille eläimille suoritettiin laboratoriokoe rokotteella, jos::..a oli C.N.C.M. I199kantaa,

7 havaittiin, että tämä keksinnön mukainen rokote osoitti selviä viitteitä paremmuudesta ennestään tunnettuihin rokotteisiin verrattuna. Se vähäinen oireiden ilmeneminen, joka havaittiin C.N.C.M. I199kannalla, on todella jyrkästi vastakkainen sille huonolle kliiniselle kuvalle, joka on annettu tutkimuksissa, joissa on käytetty joko virulentteja tai "heikennettyjä" BVDkantoja immuunisuudeltaan heikennetyissä eläimissä. Tätä eläinmallia käyttämällä saatuja tutkimuksia, joissa on käytetty virulentteja kantoja, on julkaissut Shope R.E. et al., Can.J.Vomp.Med. 40: , 1976 ja tuloksia, joissa on käytetty "heikennettyä kantaa" ovat julkaisseet Bittle J.S. ja House J.A., J.A.V.M.A. 163:878879, Tässä viimeksimainitussa tapauksessa Bittle käsitteli kahta vasikkaa deksametasonilla 11 vuorokauden ajan ja havaitsi, että eläimet pysyivät normaaleina "heikennetyllä viruksella (C24V)" tapahtuneeseen rokottamiseen asti ja sen jälkeen niillä ilmeni tyypillisiä limakalvosairauden merkkejä kuumeen ja leukopenian kera heti, kun immunodepressiivinen hoito lopetettiin. Toinen eläin kuoli 24 vuorokauden kuluttua rokottamisesta, kun taas toinen toipui ajan mittaan. Kokeessa, jossa käytettiin tämän keksinnön mukaista C.N.C.M kantaa sisältävää rokotetta immuunisuudeltaan heikennetyissä vasikoissa, ei havaittu mitään limakalvosairaudelle tyypillisiä kliinisiä merkkejä, paitsi eriasteista diarreaa, joka poistui ilman sen kummempia seuraamuksia. Kuitenkaan BVDvirusta ei saatu uudestaan eristetyksi rokotetuista eläimistä, vaikka virus yritettiin päivittäin saada talteen sinä aikana, jona esiintyi ruuansulatushäiriöitä. Näin ollen kliiniset havainnot eivät liittyneet rokoteviruksen läsnäoloon rokotuksen saaneen ulosteessa tai silmien ja nenän eritteessä. Havaitut oireet eivät myöskään liittyneet viremiaan. On myös huomionarvoista, että ei havaittu geneettisesti muuttuneen rokoteviruksen ilmenemistä. Lisäksi verrattuna ennestään tunnettuihin rokotteisiin, joiden vaikuttava aineosa on lämpöherkkä mutantti, ja jotka annetaan

8 organismin kylmään kohtaan, eivät tämän keksinnön mukaiset rokotteet ole tarttuvia tätä kautta annettaessa, vaan ne pitää antaa klassista parenteraalista kautta, so. joko subkutaanisti tai eläimen lihakseen, ja siten, että mainittua parenteraalista antoa seuraa tehoste hieman, esim. muutamaa viikkoa, myöhemmin. Rokotteen annosyksikkö sisältää mielellään vähintään 10 3 ' 5 50 ja erityisesti vähintään 10 4 TCID 50 muunnettua virusta. TCID Laboratoriokokeet, joissa käytettiin yhdistelmärokotetta, joka sisälsi tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatua muunnettua BVDvirusta ja parenteraalisesti annettavaa toista elävää nautakarjan hengitystievirusta /so. naudan respiratorista synkytiaa (BRS) virusrokotetta7, osoittivat, että muunnettu BVDvirus ei häiritse, so. ei vaikuta, toisen rokoteviruksen immunogeenisyyteen ja näin ollen toisen toteutustavan mukaan tämä keksintö koskee nautakarjalle tarkoitettuja eläviä virusyhdistelmärokotteita, jotka sisältävät lämpöherkän BVDvirusmutantin, kuten edellä on selostettu, sekä toisen nautakarjalle tarkoitetun elävän virusrokotteen, joka voidaan antaa parenteraalista kautta. Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavilla esimerkeillä. Esimerkki 1 Mutaation aikaansaaminen ja mutantin valinta Naudan diarreaviruskanta, joka oli saatu sellaisen vasikan nenän limakalvosta, jolla oli tyypilliset sairauden oireet, mukautettiin vasikan kivessoluviljelmään suorittamalla 10 kertaa läpäisy mainitussa kudosviljelmässä ja saatu kanta taltioitiin Euroopan patenttisopimuksen (EPC) mukaisesti 20. heinäkuuta 1982 Pariisiin Pasteurinstituutin kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.), joissa sille annettiin kokoelmanumero Sitten viruksen määrä lisättiin suorittamalla 6 kertaa läpäisy naudan munuaissolulinjan läpi, josta seuraavassa käytetään nimitystä NLBK 4 solulinja, käyttämällä kasvualustaa, jossa oli

9 :50seos (tilavuusosina) Eaglen perusalustaa ja minimialustaa täydennettynä 0,25 %:11a (paino/tilavuus) naudan laktalbumiinihydrolysaattia. 1,25 ml virussuspensiota, joka oli saatu 16. läpäisystä ja sisälsi 10 4 ' 0 TCID50 /0 ' 1 ml, sekoitettiin seokseen, jossa oli 1,25 ml 1M etikkahapponatriumasetaattipuskuria ja 1,25 ml natriumnitriitin 4M vesiliuosta. Seoksen lopullinen ph oli 5,7. Sitten seoksen annettiin reagoida 6 minuuttia laboratoriolämpötilassa, jonka jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä tipoittain 1N natriumhydroksidiliuosta niin, että ph:ksi tuli 7,5 ( 0,5). ph:n säätöä seurattiin virussuspension sisältämän fenolipunaindikaattorin värin muutoksena. Käsiteltyä virussuspensiota dialysoitiin välittömästi 5 tuntia 5 o C:ssa ( 1) fosfaattipuskurisuolaliuoksessa NaC1 (8 g); KC1 (0,2 g); Na 2 HPO 4 (1,15 g); KH 2 PO 4 (0,2 g) tislattua vettä(800 ml:aan asti), sekoitettiin MgC1 2.6H 2 0liuoksen kanssa (100 ml:ssa tislattua vettä) ja sen jälkeen CaC1 2 liuoksen kanssa (0,1 g 100 ml tislattua vettä), lopullinen liuos steriloitiin suodattamalla ja lopullinen ph oli välillä 7,27,4. Dialysoinnin jälkeen virussuspensiota säilytettiin nestemäisessä typessä. Infektiokyvyn titrauskokeet suoritettiin 37 C:ssa käyttämällä neljää putkea kutakin kymmenkertaista laimennusta kohti. Saadun virussuspension jäännösinfektiointikyky oli 10 1,7 TCID /0,1 ml 50 alunperin käytetyn C.N.C.M. I198viruskantasuspension infektointikyvystä. Virussuspensionäytteet (0,1 ml), jotka oli laimennettu 1/9 Eaglen perusalustan ja minimialustan seokseen 50/50 (tilavuusosina), johon oli lisätty 0,25 % (paino/tilavuus) naudan laktalbumiinihydrolysaattia, siirrostettiin 80:een NLBK 4 naudan munuaissolulinjaviljelmään, ja sen jälkeen inkuboitiin 5 vrk 37 o C:ssa. 80 putkesta 31:ssä ilmeni viruksen lisääntymisen aiheuttama sytopatogeeninen vaikutus. Kutakin viimeksimainituista kasvatettiin toisiinsa verraten ja titrattiin 35 C:ssa ja 39,5 C:ssa. Nämä inkubointilämpötilat valittiin kasvun sallivaksi ja kasvua rajoittavaksi vastaavasti, koska alkuperäinen virus (C.N.C.M. 1198) kasvoi yhtä hyvin molemmissa lämpö

10 tiloissa ja vahingoittui 40 C:ssa. Yhdellä eristetyllä viruksella oli tiittereiden ero 3,0 log 10 TCID 50 (kudosviljelmän infektoiva annos 50 %:ssa viljelmästä) välillä 35 C ja 39,5 C, joka osoitti sen lämpöherkkyyden. Se rikastettiin lisäläpäisyllä (19.) samoissa toimintaolosuhteissa kuin edellisissä läpäisyissä käytettiin ja sen jälkeen kylmäkuivattiin. Sitten virusta kasvatettiin kandella läpäisyllä naudan turbinalissolulinjassa, josta käytetään nimitystä NLBT 1, käyttämällä edellä mainittua kasvualustaa ja virusvarasto valmistettiin läpäisyssä 21. Tästä virusvarastosta suoritettiin vielä kloonausläpäisy 10 4 ' 5 laimennuksessa samoissa olosuhteissa käyttämällä 96 viljelmää, joista 8 oli positiivista. Yksi näistä rikastettiin lisäläpäisyllä (21.) samoissa olosuhteissa, jolloin saatiin siemen, joka kylmäkuivattiin pienissä lasisissa lääkepulloissa, jotka kukin sisälsivät 10 3 ' 9 TCID virusta. Saadun kloonin näytteet on 50 taltioitu Euroopan patenttisopimuksen (EPC) sääntöjen mukaisesti Pariisiin 20. heinäkuuta 1982 Pasteurinstituutin kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.), jossa sille on annettu numero Esimerkki 2 Rokotevalmiste Siemenerästä (C.N.C.M. 1199), otettiin näyte, siihen lisättiin vettä ja se siirrostettiin NLBT 1 soluviljelmiin, jotka sen jälkeen peitettiin edellä kuvatulla ylläpitoalustalla. Soluja inkuboitiin kasvun sallivassa lämpötilassa (35 0,5 C) 5 vrk. Sitten emäliuosta siirrostettiin uudestaan toiseen viijelmäsarjaan. Kun sytopatogeeninen vaikutus ilmeni 50 %:ssa monokerroksista, emäliuokset otettiin talteen ja yhdistettiin ja niihin lisättiin kasitonia (6 % paino/tilavuus) ja seosta säilytettiin 70 C:ssa. Virussuspensio sulatettiin, jaettiin lasisiin lääkepulloihin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin pulloja, joista kukin sisälsi 10 4 TCID 50 tai sen kerrannaisia.

11 82264 Välittömästi ennen antamista rokotteeseen lisättiin fysiologista suolaliuosta (0,9 % NaC1 steriilissä tislatussa vedessä) käyttämällä 2,0 ml/annos. Rokote annetaan intramuskulaarisesti ja mielellään annetaan 2 annosta esim. 3 viikon välein. Esimerkki 3 Muunnetun kannan lämpöherkkyys Kummallekin kannalle C.N.C.M ja 1199 määritettiin täplänmuodostusteho (EOP) ilmaistuna yksikköinä log io PFU (plaque forming units) per 0,2 ml inkuboimalla eri lämpötiloissa. Tulokset on esitetty taulukossa 1, josta ilmenee, että villikannan C.N.C.M EOP on välillä 10 4 ' ' 0, kun taas mutantin C.N.C.M optimaalinen EOP on 3537 C:ssa, joka on 1,5 log io pienempi 39 C:ssa ja 3,0 log pienempi 39,5 C, eikä infektoivia viruksia saada talteen siirrostetuista viljelmistä, jotka eivät ole positiivisia CPE:lle 39,5 C. Taulukko 1 Kanta Täplänmuodostusteho (EOP) 35 C 37 o C 38,5 o C lämpötiloissa 39 o C 39,5 C CNCM CNCM ,8 4,8 NT 4,2 4,2 3,6 NT 2,7 4,8 1,2 Viruksen tiitterit määritettiin myös 35 0C:ssa ja 39,5 0C:ssa eri läpäisyissä ja tulokset on esitetty taulukossa 2, josta ilmenee, että ero tiittereiden välillä 35 C:ssa ja 39,5 C:ssa on vakio viruksen eri läpäisyissä. Virus Taulukko 2 Vertailukokeet NLBT solulinjassa kasvun sallivassa ja kasvun estävässä lämpötilassa Suhde 35 o /39,5 o C (x) Läpäisykerta Kokeiden määrä Geometrinen keskiarvo Standardipoikkeama CNCM ,2 0,1 CNCM ,4 0, , ,0 0, ,2 0,4

12 (x) log TCID50 tai PFU 35 o C:ssa log TCID 50 tai PFU 39,5 C:ssa Esimerkki 4 Heikentyneisyys normaaleissa vasikoissa Rokotteen siemenerä testattiin viidessä seronegatiivisessa eläimessä. Tätä varten 10 rokoteannokseen lisättiin kuhunkin 2 ml fysiologista suolaliuosta ja siirrostettiin kuhunkin eläimeen intramuskulaarisesti. Sama rokoteannos annettiin samalla tavalla 3 viikkoa myöhemmin. 14 vuorokautena ensimmäisen annoksen antamisesta lukien suoritettiin päivittäin kliininen tutkimus, mitattiin lämpötila peräsuolesta ja suoritettiin valkoisten verisolujen laskenta. Mitään oireita ei havaittu. Kuten taulukosta 3 ilmenee, lämpötila ei missään vaiheessa noussut 39,2 C:n yläpuolelle. Vrk (x) Peräsuolen Taulukko 3 lämpötila ( C) Vasikka n:o ,2 38,5 38,5 38,7 38,6 9 38,0 38,0 38,5 38,7 38,6 8 38,1 37,8 38,8 38,7 39,2 7 38,0 38,0 39,0 38,8 38,7 3 38,2 38,0 38,8 39,0 38,7 2 38,0 38,2 39,0 38,9 38,7 1 38,5 38,2 38,2 38,6 38,0 0 38,3 38,0 39,0 38,9 38,7 1 38,4 38,0 38,7 38,9 38,8 5 38,3 38,3 38,9 38,6 38,6 6 38,0 38,2 38,8 38,6 38,6 7 38,2 38,2 38,5 38,8 38,4 8 38,4 38,6 39,0 38,7 38, ,2 38,4 38,8 38,5 38, ,4 38,4 38,8 38,5 38, ,4 38,2 38,4 38,4 38, ,6 38,1 38,8 39,0 38,7

13 (x) päivä 0 on ensimmäisen annoksen antamispäivä. Valkoisten verisolujen lukumäärän (WBC) keskiarvo pysyi normaalina koko havainnoinnin ajan. Vastaaineet BVD:n suhteen osoittivat, että eläimet olivat tulleet immuuneiksi. Esimerkki 5 Heikentyneisyys immuunisuudeltaan heikennetyissä eläimissä Yhdeksälle vasikalle, jotka olivat seronegatiivisia sekä BVD:n suhteen että naudan hengityselinten synkytiaalivirusten (BRS) suhteen, annettiin vuorokausittain deksametasonia 0,1 mg/kg kahtenatoista peräkkäisenä päivänä alken 5 vrk ennen ensimmäisen rokoteannoksen antamista. Neljälle eläimelle (n:ot 16, 30, 82 ja 83) annettiin rokotetta siemenerästä intramuskulaarisesti päivänä 0 ja ne saivat samalla tavalla saman annoksen päivänä 21. Päivänä 0 annetusta rokotteesta käytetään tässä nimitystä ensimmäinen rokotus ja ensimmäisessä rokotuksessa annettiin 10 5 TCID 50 esimerkissä 2 saatua rokotetta. Päivinä 0 ja 21 kolmelle eläimelle (n:ot 13, 14 ja 19) annettiin yhdistettyä BRS/BVDvirusrokotetta, jossa oli 10 5 ' 7 TCID 50 BRSvirusta ja 10 5 TCID 50 BVDvirusta. Kandelle eläimelle (n:ot 80 ja 81) annettiin päivinä 0 ja 21 samaa BRSvirusrokotetta, jossa oli 10 5,7 TCID 50 virusta/annos. 14 vrk:n aikana ensimmäisestä annoksesta lukien suoritettiin kliininen tutkimus, mitattiin ruumiinlämpötila ja laskettiin valkoiset verisolut. Samana aikana neljästä rokotteen saaneesta vasikasta yritettiin eristää virus silmien ja nenän eritteestä ja ulosteesta. Tulokset ja niiden tulkinta on esitetty taulukoissa 4 ja 5.

14 Vasikka n:o Taulukko 4 Kliiniset pistemäärät Vuorokausipistemäärät (vrk ensimmäisestä rokotuksesta) //21 Keskiarvot yksilöl. ryhmä , J , , ,9 Vuorokauden keskiarvo 5 12,5 12,5 12,5 52,5 50,0 47,5 40,0 27,5 17,5 17,5 22,5 10,0 19 2, ,5 15, ,8 N uorpkau n Keskiarvo 7,5 15,0 15,0 15,0 40,0 35,0 35,0 37,5 30,0 10,0 10,0 2,5 2,5 0 2, ,3 Vuorokauden keskiarvo 15,0 15,0 15,0 : negatiivinen 15,25

15 Taulukko 5 Kliinisten pistemäärien laskutapa Parametri Aste Pistemäärä Yksikkö (1) Pistemäärä painotus (2) Kliininen pistemäärä Apatia ei lainkaan 0 summa hieman 1 10 makuuhaava 2 Anorexia ei lainkaan 0 (1) vähentynyt ruokahalu 1 20 täydellinen 2 Diarrea normaali uloste 0 kerrottu pehmeä uloste 1 vetinen uloste 2 moelena 3 kuolio 4 (2):11a Tuloksista ilmenee, että kaikissa rokotetuissa vasikoissa ilmeni eriasteista anorexiaa ja diarreaa. Kuitenkaan yhdelläkään ei ollut ylilämpöä eikä leukooeniaa eikä BVDvirusta saatu eristetyksi otetuista näytteistä. BRS:n ja BVD: vhdistelmän aiheuttamaa kumuloituvaa patogeenisuutta tai häirintää ei havaittu. Esimerkki 6 C.N.C.M.kannan 1199 tehokkuus keinotekoista ärsykettä vastaan Eläimet, jotka rokotettiin immuunisuutta heikentävän käsittelyn aikana, saivat vastaainetta seerumiinsa toisen annoksen antamisen jälkeen. Niille samoin kuin kandelle verrokille (eläimet, jotka oli rokotettu vain BRS:llä) annettiin ärsykettä päivänä 35 ensimmäisen annoksen antamisesta lukien. Ärsykkeenä käytetty BVDvirus oli Oslosskanta (Rohde G. ja Liess B., Zbl. Vet.Med. 17 B:686, 1970). Se annettiin sierainten kautta annoksena 10 6 ' 8 TCID 50 per eläin.

16 vrk:n aikana ärsytyksestä lukien tutkittiin kliiniset oireet, ruumiin lämpötila ja valkoisten verisolujen lukumäärä. Kaikkien eläinten verestä yritettiin eristää virus. Mitään kliinisiä oireita tai ylilämpöä ei havaittu. Eläimillä, jotka olivat saaneet 2 rokoteannosta, ei havaittu lainkaan laskua valkoisten verisolujen määrässä ärsykkeen antamisen jälkeen, kun taas verrokit (eläimet n:o 80 ja 81) olivat leukooeenisia. Jopa niinkään suurena annoksena kuin 10 6 ' 8 TCID 50 /eläin Oslosskanta ei ollut natogeeninen. Eläimissä n:o 80 ja 81, jotka oli rokotettu vain BRSviruksella, ei havaittu vlilämpöä eikä kliinisiä oireita. Kuitenkin näillä kandella eläimellä oli alemmat valkoisten verisolujen lukumäärät kuin vasikoilla, jotka olivat saaneet kaksi BVDrokoteannosta, ja näissä vasikoissa ilmeni viremia. Eläimet, jotka oli rokotettu yhdistetyllä BVD/BRSrokotteella, olivat yhtä hyvin suojattuja (n:ot 19, 13 ja 14). Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 6. Vasikka n:o Taulukko 6 Ärsykkeen aiheuttama viremia Rokote Indeksi 16 BVD /68 13 BVD/BRS NT 14 NT BRS 81 9/20 IF (Immunofluoresenssikoe) negatiivinen IF (Immunofluoresenssikoe) positiivinen NT ei tutkittu.

17 Nämä tulokset eivät ole ristiriidassa kirjallisuudessa ilmoitettujen kanssa, koska tiedetään, että villityyppiä olevan BVD:n aiheuttama koeinfektio harvoin johtaa vakaviin kliinisiin oireisiin (Saurat P. et al., La Maladie des Muqueuses, Ed. L'Expansion Scientifique Francaise, Paris 1972, p. 76). Indeksi (so. positiivisten näytteiden lukumäärä verrattuna testattujen näytteiden lukumäärään) oli huomattavasti suurempi (90/20) sillä eläinryhmällä, joka oli rokotettu vain BRS:llä, kuin muilla vasikoilla, joiden joukossa 2 vasikkaa oli muuttuvasti positiivisia. Esimerkki 7 C.N.C.M kannan tehokkuus kentällä 103:11e vasikalle, joiden ikä oli välillä 15 vrk 18 kk, ja joilla oli matalat (so. <8) vastaainetiitterit BVD:n suhteen, annettiin intramuskulaarisesti kaksi annosta 10 4 ' 0 TCID 50 esimerkin 2 rokotetta 3 viikon välein. Mitään rokotteeseen liittyvää kliinistä reaktiota ei havaittu, mikä osoittaa rokotteen turvallisuuden kenttäolosuhteissa. Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 7. Vastaainetiitteri ennen rokotusta Taulukko 7 Vastaaineita kehittäneiden / eläinten yhteismäärä määrä < 1 18 Yhteensä Ikä () 2 >2 yhteensä 2 >2 Yhteensä Yhteensä Kokonaismäärät 9/20 51/57 60/77 2/6 6/10 8/16 68/9 Prosenttia () kuukausina

18 Taulukosta 7 voidaan havaita, että kaikkiaan 73 %:11a eläimistä vastaaineiden määrä kasvoi merkittävästi rokotuksen jälkeen. Kuitenkin tarkasteltaessa vain niitä vasikoita, jotka olivat seronegatiivisia rokotushetkellä, havaittiin selvä ero (p < 0,001) seerumin vastaaineiden ilmenemisessä 2 kk vanhemmilla eläimillä (90 %) verrattuna nuorempiin (45 %). Seropositiivisilla eläimillä ilmeni sama suuntaus. Vanhemmilla eläimillä havaittiin parempi vaste. Yli 2 kk vanhoissa seroneaatiivisissa eläimissä lämpöherkkä kanta C.N.C.M sai aikaan 90 % vastaaineiden kehittymisestä kanden 10 4 TCID annoksen jälkeen. Tämä havainto ei ole 50 ristiriidassa sen 9598 %:n määrän kanssa, joka saavutetaan optimaalisissa olosuhteissa kaupallisilla rokotteilla (Lambert G. et al., Modern Vet. Practice s. 34, huhtikuu 1970). Serokonversio, joka on 50 %, ja joka havaittiin alle 2 kk:n ikäisillä vasikoilla vastaa tuloksia, jotka Smith P.E. et al. ovat saaneet (Vet. Med. Small Anim. 63:457, 1968), ja jotka ilmoittivat positiivisen vasteen rokotukselle 5/10 eläimessä, joiden ikä oli alle 60 vrk, ja 42/48 vanhemmissa eläimissä, joilla oli sama immunoloainen tila rokotushetkellä. Nyt tehdyssä kokeessa rokotettiin 16 seropositiivista eläintä, joilla oli matalat emolta saadut vastaainetiitterit, ja 50 % kehitti vastaainetta. Vaikka luvut ovat pieniä, nämä tulokset osoittivat, että onnistunut immunisoituminen voidaan saavuttaa yli 2 kk:n ikäisissä eläimissä, joilla on matala vastaainetiitteri rokotushetkellä.

19 18 Patenttivaatimus Menetelmä rokotteen valmistamiseksi naudan viraalisen diarreaviruksen aiheuttamaa tulehdusta vastaan, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää (1) naudan viraalisen diarreaviruskannan C.N.C.M saattamisen kosketukseen 4N typpihapon kanssa 1N asetaatti/etikkahappopuskurissa ph:ssa 5,7 (/ 0,1) 6 (/ 1) minuutin ajasi, joka käsittely aikaansaa alkuperäisen virustiitterin alentumisen 23 1og10; (2) lämpöherkän mutantin eristämisen viljelemällä naudan kudosviljelmässä ja titraamalla 35 C:ssa ja 39,5 C:ssa vastaavasti, joka mutantti omaa kannan C.N.C.M lämpöherkät ominaisuudet, eli tiittereiden ero on noin 3 1og10 TCID välillä 35 C ja 39,5 C; (3) mainitun eristetyn lämpöherkän mutantin kasvattamisen naudan kudosviljelmässä mutantin lisäämiseksi. Patentkrav Förfarande för framställning av ett vaccin mot inflammation förorsakad av nötets virala diarrevirus, kännetecknat av att förfarandet omfattar att (1) nötets virala diarrevirusstam C.N.C.M bringas i kontakt med 4N salpetersyra i 1N acetat/ättiksyrabuffert vid ph 5,7 (/ 0,1) för 6 (/ 1) minuter, vilken behandling åstadkommer sänkning pä den ursprungliga virustitern med 23 1og10; (2) den värmesensitiva mutanten isoleras genom kultivering i nötets vävnadskultur och titrering vid 35 C och 39,5 C respektive, vilken mutant har stammens C.N.C.M värmesensitiva egenskaper, med andra ord differens pä titrar är cirka 3 log10 TCID50 mellan 35 C och 39,5 C; (3) kultivering av nämnda isolerade värmesensitiva mutant i nötets vävnadskultur för ökning av mutanten.