Erikoistutkija, INFO/INVI Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello

Transkriptio

1 Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä Haider Al-Hello Erikoistutkija, INFO/INVI Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 1

2 Ripulitauteja aiheuttavat virukset Norovirukset Rotavirukset Adenovirukset (serotyypit 40 ja 41) Sapovirukset Astrovirukset Tartuntatautirekisteriin ilmoitetut norovirus tapaukset (KPL) Norovirustapaukset Akuuttien gastroenteriittien aiheuttamien epidemioiden lukumäärä on lisääntynyt maailmanlaajuisesti Vuosi Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 2

3 Norovirus Akuutin suolistotulehduksen yleisin aiheuttaja. Voi aiheuttaa sairauden lähes jokaisessa Lapsista vanhuksiin. Virus ei tuota pitkäaikaista immuniteettia. Oireina akuutti ripuli, oksentelu, vatsan kouristelu, kuume ja väsymys Infektiivisyys viruspartikkelia Infektoituneiden potilaiden ulosteessa virusta /g Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 3

4 Norovirukset Caliciviridae N-Term NTPase VPg ORF1 3A-like pro Pol ORF2 ORF Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 4

5 Ruoka- ja vesivälitteisten epidemioiden selvittäminen potilasnäytteiden mikrobiologiset tutkimukset viruspositiiviset ulostesuspensiot ja RNA:t + näytetiedot F-VirEpid (noro, adeno, rota, astro) 3-5 ulostenäytettä/epidemia primääridiagnostiikka: reaaliaikainen RT-PCR THL INVI epidemiatiedot THL INTA THL/Kuopio vesiepidemiat Rotavirukset kuuluvat kantakokoelmaan, positiiviset löydökset pitää aina lähettää virusinfektiotyksikköön Tunnistus ja genotyypitys sekvensoimalla valikoiduista näytteistä HY/Leena Maunula EVIRA Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 5

6 NOROVIRUSDIAGNOSTIIKKA VIRUKSEN OSOITUS: ELEKTRONIMIKROSKOPIA ANTIGEENIN OSOITUS: ELISA PERIMÄN OSOITUS: Q-RT-PCR: GI, GII-TUNNISTUKSET (diagnostiikka) RT-PCR: Polymeraasi / kapsidialueen tyypitykset Sekvensointi: genotyypitys (epidemian tunnistus ja jäljitys) Nested-PCR (THL, RIVM:sta Vennema), menetelmä ei ole vielä julkaistu. NGS vuodesta 2012 (Oxford) Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 6

7 Tyypitys- ja tunnistusalueet GII ja GI Q-RT-PCR (Loisy et al., 2005) Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 7

8 Norovirus nested- PCR Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 8

9 Kolmivaiheinen PCR 1. cdna synteesi. Yksi aluke molemmille genoryhmille. 2. PCR1. Genoryhmä-spesifiset alukeet. 3. PCR2. PCR1 sisäpuolella myös genoryhmä-spesifiset alukkeet. 1kb sekvenssi verrattuna A-alueen sekvenssiin 0,3 kb. Tietomäärä on huomattavasti parempi. Rekombinanttikannat löytyvät yhdellä sekvensointi- menetelmällä. Menetelmä on hinnaltaan 5 euroa kalliimpi kuin alueen A tyypitysmenetelmä. Vielä kehitetään! ORF1 N-Term NTPase VPg 3A-like pro Pol ORF2 ORF3 cdna-synteesi PCR-1 PCR-2 Sekvensointi Sekvensointi Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 9

10 Norovirus NGS Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 10

11 Näytenumero lähettäjä tulos PVM Tulos Huomioitavaa Nordlab (Oulu) Huonoa sekvenssiä Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI HUSLAB (Tampere) GII HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Bakteeri sekvensi HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.4 Näytteessä oli 2 genoryhmäänkuuluvia viruksia(sek. kapsidi Uimavesiepidemia Uimavesiepidemiaan kuuluvia näytteitä. Tullut THL:n Virusinfektiot-yksikköön Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 11

12 näytenumero lähettäjä tulos PVM Tulos Huomioitavaa HUSLAB Huonoa sekvenssiä Nordlab (Oulu) Huonoa sekvenssiä Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI HUSLAB (Tampere) GII HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Bakteeri sekvensi HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.4 Näytteessä oli 2 eri genoryhmäänkuuluvia viruksia siksi sekvensoitiin kapsidi(ei fylogeneettisessa puussa) Uimavesiepidemia Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 12

13 näytenumero lähettäjä tulos PVM Tulos Huomioitavaa HUSLAB Huonoa sekvenssiä Nordlab (Oulu) Huonoa sekvenssiä Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI HUSLAB (Tampere) GII HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) Unassigned HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) Bakteeri sekvensi HUSLAB (Tampere) Huonoa sekvenssiä HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.4 Näytteessä oli 2 eri genoryhmäänkuuluvia viruksia siksi sekvensoitiin kapsidi(ei fylogeneettisessa puussa) Uimavesiepidemia NGS työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 13

14 Näytteiden käsittely Versio 1.0 Näyte suspensio RNA-eristys sscdna-synteesi random hexamereilla Primereiden puhdistus CleanUp kitillä Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 14

15 DNA-sekvensointi ja genomiikkalaboratorio, Biotekniikan instituutti ss cdna ds cdna sekvensointikirjaston valmistaminen Paired-end sekvensointi Illuminan MiSeq-laitteella Sekvenssien analyysi Sekvenssien trimmaus ja laatutarkistus Assembly = Sekvenssien kokoaminen päällekäin menevistä sekvenssijaksoista Tuloksena contigeja = päällekkäisistä sekvensseistä yhdistelemällä muodostettu yhtenäinen sekvenssi Contigien blastaus (= vertailu ) geenipankin sekvenssejä vastaan Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 15

16 näytenumer lähettäjä tulos PVM Tulos 1. NGS o HUSLAB GII Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI HUSLAB (Tampere) GII HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) No blast hit HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.2 GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.4 Tulos Fylogeneettinen puu Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 16

17 Näytteiden käsittelyä muokattiin Versio 2.0 Näyte suspensio Spin-X filtteri putket 0,22µm DNAasi/RNAasi käsittely + lopuksi inhibiittorit RNA-eristys sscdna-synteesi random hexamereilla Random hexamerien puhdistus CleanUp kitillä Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 17

18 DNA-sekvensointi ja genomiikkalaboratorio, Biotekniikan instituutti ss cdna ds cdna sekvensointikirjaston valmistaminen Paired-end sekvensointi Illuminan MiSeq-laitteella Sekvenssien analyysi Sekvenssien trimmaus ja laatutarkistus Assembly = Sekvenssien kokoaminen päällekkäin menevistä sekvenssijaksoista Tuloksena contigeja = päällekkäisistä sekvensseistä yhdistelemällä muodostettu yhtenäinen sekvenssi Contigien blastaus (= vertailu ) geenipankin sekvenssejä vastaan Lisäksi työn alla: Assembloimattomien readien alkuperän selvitys Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 18

19 Tulokset toinen kokeilu Edelleen suurinosa sekvensseistä ulosteelle tyypillisiä bakteereja Enemmän virussekvenssiä kuin ensimmäisessä kokeilussa Viruslöydökset Rotavirus Norovirus Lisäksi muita viruksia (nämä vaativat lisätarkastelua) Viruslöydöksissä selkeitä sekvenssi-kattavuuseroja näytteiden sisältämän viruksen määrässä Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 19

20 Tulokset toinen kokeilu Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 20

21 Esityksen nimi / Tekijä 21

22 näytenumer lähettäjä tulos PVM Tulos 1. NGS 2. NGS o HUSLAB GII Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI.2 GI.2/Rotavirus Nordlab (Oulu) GI Nordlab (Oulu) GI HUSLAB (Tampere) GII HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) No blast hit GI.2/Rotavirus HUSLAB (Tampere) GI.2/Rotavirus HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI.2 GI HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) HUSLAB (Tampere) GI HUSLAB (Tampere) GI Esityksen nimi / Tekijä 22

23 Kiitos THL Carita Savolainen-Kopra Soile Blomqvist Haider al-hello Svetlana Kaijalainen Alena Kaijalainen Päivi Hirttiö DNA-sekvensointi ja genomiikka laboratorio Biotekniikan instituutti Petri Auvinen Lars Paulin Päivi Laamanen Pia Laine RIVM Harry Vennema Uudet menetelmät työkaluna norovirusten epidemiaselvityksessä/ Haider al-hello 23