Vertailu eri tekniikoiden yhdistelystä lipopolysakkaridien puhdistamiseksi bakteriofaginäytteistä

Transkriptio

1 2018 Vertailu eri tekniikoiden yhdistelystä lipopolysakkaridien puhdistamiseksi bakteriofaginäytteistä Ville Hietala Pro Gradu-tutkielma Yleinen mikrobiologia Bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta

2 Tiedekunta Fakultet Faculty Bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta Tekijä Författare Author Ville Jaakko Ilmari Hietala Työn nimi Arbetets titel Title Vertailu eri tekniikoiden yhdistelystä lipopolysakkaridien puhdistamiseksi bakteriofaginäytteistä Oppiaine/Opintosuunta Läroämne/Studieinriktning Subject/Study track Yleinen mikrobiologia Työn laji Arbetets art Level Pro Gradu Tiivistelmä Referat Abstract Koulutusohjelma Utbildingsprogram Degree Programme Molekyylibiotieteiden koulutusohjelma Aika Datum Month and year Toukokuu 2018 Sivumäärä Sidoantal Number of pages 50 Antibioottiresistenssi yleistyy infektioita aiheuttavien bakteereiden keskuudessa. Infektioita hoitaessa joudutaan siten miettimään uusia tapoja infektioiden parantamiseksi. Yhden vaihtoehdon tarjoaa bakteriofagiterapia. Siinä infektiota sairastavalle annetaan bakteriofageja, jotka infektoivat bakteereita, lisääntyvät niissä ja tuhoavat ne. Kirjallisuudessa on runsaasti lupaavia esimerkkejä tästä terapiamuodosta. Kuitenkin bakteriofagituotteiden on oltava tarpeeksi puhtaita, erityisesti siinä tilanteessa, jos niitä annetaan suonensisäisesti. Gramnegatiivisten bakteereiden tärkeä rakenneosa on lipopolysakkaridi eli LPS, joka ihmisen verenkiertoon päästessään voi olla vaarallinen. Siksi, mikäli bakteriofagit on tuotettu gramnegatiivisissa bakteereissa, LPS:t on kyettävä poistamaan näytteistä. Tässä Pro Gradu-työssä tutkittiin viidessä eri koejärjestelyssä, kuinka erilaiset tekniikat ja niiden yhdistelmät vaikuttivat bakteriofagien ja LPS:n määrään näytteissä. Lisäksi arvioitiin SDS-PAGE-geelissä näytteiden proteiinikoostumusta. Näytteistä mitattiin myös dsdna-pitoisuus. Tutkitut tekniikat olivat ultrafiltraatio, anioninvaihtokromatografia, oktanoliuutto ja kaupalliset endotoksiininpoistotuotteet EndoTrap- ja Pierce high endotoxin removal-pylväät. Koejärjestelyssä 1 suodatettua bakteriofagilysaattia puhdistettiin ensiksi oktanoliuutolla, sitten ultrafiltraatiolla, anioninvaihtokromatografialla ja lopuksi uudella ultrafiltraatiolla. Endotoksiinipitoisuus laski eniten kromatografiassa mutta toisen ultrafiltraation jälkeen se pysyi varsin samana. Tiitteri pieneni vain oktanoliuutossa ja kromatografiassa (jossa osittain laimenemisen takia), kun ultrafiltraatioissa muutos edeltävään tiitteriin oli varsin pieni. Lopuksi näytteissä oli keskimäärin n. 15 EU (endotoksiiniyksikköä)/10^9 pfu (plaque forming unit). Toisessa koejärjestelyssä aloitettiin ultrafiltraatiolla ja sen jälkeen näytteet puhdistettiin joko EndoTrap- tai Pierce-pylväällä. Kaikki vaiheet poistivat endotoksiineita. Ultrafiltraatio pienensi hieman tiittereitä mutta EndoTrap-pylväs ei. Pierce-pylväässä tiitterin aleneminen oli huomattavaa, jolloin EndoTrap-pylvään jälkeen näytteissä oli keskimäärin 0,0574 EU/10^9 pfu ja Pierce-pylvään jälkeen EU/10^9 pfu eli suhde oli jopa enemmän kuin lysaatissa. Kolmannessa koejärjestelyssä aloitettiin ultrafiltraatiolla, jonka jälkeen oli kromatografia ja uusi ultrafiltraatio. Ensimmäisessä ultrafiltraatiossa tiitterit pienenivät jonkin verran mutta kromatografian ja toisen ultrafiltraation jälkeen se oli varsin sama, kuin ensimmäisen ultrafiltraation jälkeen. Endotoksiinipitoisuus pieneni taas eniten kromatografiassa ja se oli varsin sama toisen ultrafiltraation jälkeen, jolloin puhdistetuissa näytteissä oli keskimäärin 57,1 EU/10^9 pfu. Neljännessä koejärjestelyssä lysaattia ultrafiltroitiin ensiksi, sen jälkeen ruiskutettiin kromatografialaitteeseen, ultrafiltroitiin uudestaan ja sen jälkeen puhdistettiin joko EndoTrap- tai Pierce-pylväällä. 1. ultrafiltraatio pienensi taas hieman tiitteriä mutta se oli varsin sama EndoTrap-pylväällä puhdistetussa näytteessä. Pierce-pylvään kanssa tiitteri pieneni taas huomattavasti. Endotoksiinipitoisuudet pienenivät taas kaikissa vaiheissa, jolloin EndoTrap-pylväällä puhdistetussa näytteissä oli keskimäärin 0,0839 EU/10^9 pfu ja Pierce-pylväällä 5480 EU/10^9 pfu. Viides koejärjestely oli muuten sama, kuin koejärjestelyn 2 Pierce-pylväs järjestely mutta korkeamman NaCl-pitoisuuden eluutiopuskurilla ja suuremmalla näytetilavuudella. Tällöin tiitteri ei pienentynyt yhtä paljon, endotoksiinipitoisuus oli lopussa vain hieman korkeampi kuin koejärjestelyssä 2 ja loppuun asti puhdistetussa näytteessä oli keskimäärin 71,21 EU/10^9 pfu. SDS-PAGE-tutkimuksessa ja dsdna-mittauksissa näkyi, että ultrafiltraatio yksin riittää poistamaan muut bakteeriperäiset proteiinit ja dsdna:n. Tosin koejärjestelyssä 1 käytetty oktanoli saattaa vaikuttaa dsdna:n puhdistumiseen ultrafiltraatiossa. Töissä onnistuttiin tuottamaan näytteitä, joissa sekä riitti bakteriofageja, että endotoksiinipitoisuus oli pudonnut huomattavasti. Kun huomioidaan käytännöllisyys ja nopeus, parhaaksi tavaksi puhdistaa LPS:t valikoitui ultrafiltraatio yhdistettynä EndoTrappylvääseen. Johtuen bakteriofagien ja LPS:ien monimuotoisuudesta, ei toisella bakteriofagilla välttämättä päästä samoihin tuloksiin mutta nyt tiedetään, millä tavalla puhdistus kannattaa aloittaa. Avainsanat Nyckelord Keywords Bakteriofagi, Bakteriofagiterapia, LPS, Endotoksiinit, Puhdistaminen, Oktanoliuutto, Anioninvaihtokromatografia, Ultrafiltraatio, EndoTrap, Pierce high-capacity endotoxin removal resin Ohjaaja tai ohjaajat Handledare Supervisor or supervisors Saija Kiljunen, Sarah Butcher Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Molekulaaristen ja integratiivisten biotieteiden tutkimusohjelma Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information 1

3 Tiedekunta Fakultet Faculty Faculty of biological and environmental sciences Tekijä Författare Author Ville Jaakko Ilmari Hietala Työn nimi Arbetets titel Title Comparison of different methods for purification of lipopolysaccharides from bacteriophage samples Oppiaine/Opintosuunta Läroämne/Studieinriktning Subject/Study track General microbiology Työn laji Arbetets art Level Master s thesis Koulutusohjelma Utbildingsprogram Degree Programme Decree programme in Molecular biosciences Aika Datum Month and year May 2018 Sivumäärä Sidoantal Number of pages 50 Tiivistelmä Referat Abstract Resistance against antibiotics is becoming more common among bacteria causing infections. Therefore, new ways to treat infections are needed to be considered. One option is bacteriophage therapy. There infected person is treated with bacteriophages, which infect bacteria, replicate inside them and destroy them. There are plenty of promising results in literature about this form of therapy. However, bacteriophage samples need to be clean enough, especially if they are to be provided intravenously. An important structural component of gramnegative bacteria is lipopolysaccharide or LPS, which can be dangerous if present in human blood stream. That is why, if bacteriophages are produced in gramnegative bacteria, one has to be capable to remove the LPS molecules from the samples. In this master s thesis it was studied in five different scenarios, how different techniques and their combinations affect the amounts of bacteriophages and LPS in samples. Also, the protein composition of samples was evaluated in SDS-PAGE-gel and the dsdna concentration in the samples was measured. The techniques studied were ultrafiltration, anion-exchange chromatography, octanol extraction and commercial endotoxin removal products EndoTrap- and Pierce high endotoxin removal-columns. In scenario one, filtered bacteriophage lysate was purified with octanol extraction, then with ultrafiltration, anion-exchange chromatography, and finally with another ultrafiltration. Endotoxin concentration fell most in anion-exchange chromatography but it stayed quite the same after second ultrafiltration. Titer fell only in octanol extraction and in anion-exchange chromatography and in the case of chromatography partly due to dilution, while in ultrafiltration the change compared to the previous titer was quite small. Finally, samples had overall 15 EU (endotoxin units)/10^9 pfu (plaque forming unit). Second scenario started with ultrafiltration and after that the samples were purified with either EndoTrap- or Pierce-column. All phases removed endotoxins. Ultrafiltration slightly reduced titers but EndoTrap-column not so much. The reduction of titer was noticeable with Pierce-column so that after EndoTrap-column the samples had approximately 0,0574 EU/10^9 pfu and after Pierce-column samples had EU/10^9 pfu which was even more than in the lysate. The third scenario was started with ultrafiltration, after that was anion-exchange chromatography and a new ultrafiltration. In the first ultrafiltration the titers fell a bit but after anion-exchange chromatography and second ultrafiltration the titers stayed quite the same as in the samples after first ultrafiltration. Endotoxin concentration fell mostly in the anion-exchange chromatography again and it was quite the same after second ultrafiltration, when purified samples had approximately 57,1 EU/10^9 pfu. Scenario four started with ultrafiltration first, after which came anion-exchange chromatography and a second ultrafiltration. After that the samples were purified with either EndoTrap- or Pierce-column. First ultrafiltration again slightly reduced titers but it stayed quite the same in EndoTrap-column purified samples. The reduction of titer after Pierce-column was again significant. Endotoxin concentration fell again in all phases so that EndoTrap-column had only 0,0839 EU/10^9 ml and Pierce column had 5480 EU/10^9 ml. The fifth scenario was much like in scenario two with Pierce column except that sample volume was higher and elution buffer had increased NaCl concentration. Here the titer didn t drop that much, endotoxin concentration was only slightly higher compared to scenario two and purified sample had approximately 71,21 EU/10^9 pfu. In SDS-PAGE-study and dsdna-measurement showed that ultrafiltration alone is enough to remove bacteria originating proteins and dsdna although octanol used in scenario one might affect the removal of dsdna. It was successful to produce samples in these experiments which had enough bacteriophages and at the same time had significantly dropped endotoxin concentrations. When also practicality and speed are considered, the best way to purify samples from LPS turned out to be ultrafiltration combined with EndoTrap-column. Because of the diversity of bacteriophages and LPS, there won t probably be similar results with another bacteriophage but now it is known which way is the best to start purification procedure. Avainsanat Nyckelord Keywords Bacteriophage, Bacteriophage therapy, LPS, Endotoxins, Purification, Octanol extraction, Anion-exchange chromatography, Ultrafiltration, EndoTrap, Pierce high-capacity endotoxin removal resin Ohjaaja tai ohjaajat Handledare Supervisor or supervisors Saija Kiljunen and Sarah Butcher Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Molecular and integrative biosciences research programme Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information 2

4 Sisällysluettelo Abstrakti Tausta Bakteriofagit Bakteriofagiterapia Lipopolysakkaridit Tekniikat lipopolysakkaridien poistamiseksi Tavoite Metodit ja materiaalit Materiaalit Bakteriofagi ja sen isäntäbakteeri Tekniset välineet Puskurit ja muut liuokset Metodit Bakteriofagilysaatin valmistus Oktanoliuutto Ultrafiltraatio Anioninvaihtokromatografia Titraus Pierce LPS:n poistopylväs EndoTrap LPS:n poistopylväs EndoLISA-mittaus Qubit bakteeri-dna:n mittaus SDS-PAGE Tulokset Endotoksiinipitoisuudet, tiitterit, niiden suhde ja bakteriofagisaannot Koejärjestely Koejärjestely Koejärjestely Koejärjestely Koejärjestely Qubit DNA-mittaustulos SDS-PAGE Tulosten arviointi Yhteenveto Kiitokset Lähteet Liitteet

5 Abstrakti Antibioottiresistenttien bakteerikantojen lisääntyessä maailmalla infektioiden hoitoon on etsittävä muita keinoja. Bakteriofagiterapiassa bakteeri-infektiota hoidetaan bakteereita infektoivilla ja hajottavilla viruksilla eli bakteriofageilla. Gramnegatiivisten bakteereiden tärkeä rakenneosa on lipopolysakkaridi (LPS), joka on ihmiselle haitallinen. Mikäli bakteriofageja halutaan tuottaa kliiniseen käyttöön kasvattamalla ne gramnegatiivisissa bakteereissa, bakteriofagituotteesta on puhdistettava LPS:t. Tässä työssä tutkittiin viidessä eri koejärjestelyssä näiden menetelmien eri yhdistelmiä ja kuinka ne vaikuttivat mm. lysaatin puhdistumiseen ja bakteriofagitiitteriin. Koejärjestelyissä hyödynnettiin ultrafiltraatiota, oktanoliuuttoa, ioninvaihtokromatografiaa ja kaupallisia pylväitä. Tavoitteena oli saada nopeasti näytteitä, joissa oli korkein mahdollinen tiitteri ja mahdollisimman vähän LPSmolekyylejä. Samalla oli otettava huomioon tekniikan skaalautuminen isompaan käyttöön ja tekniikan käyttönopeus. LPS:n määrä laskettiin endotoksiiniyksikköinä (EU) ja sen suhde miljardia bakteriofagia kohden saatiin putoamaan useimmissa koejärjestelyissä alle sadan ja joissain jopa alle 0,1. Paras tulos saatiin puhdistamalla lysaattia ultrafiltraatiolla ja kaupallisella EndoTrap-pylväällä, jolloin puhdistetussa näytteessä oli vain n. 6 EU/10^11 pfu (plaque forming unit). Lisäksi tämä tapa on nopea ja näytteiden volyymeille oli nousuvaraa. Tällä yhdistelmällä olisi paras aloittaa uusien bakteriofagien puhdistus lipopolysakkarideista. 1. Tausta 1.1 Bakteriofagit Eukaryootti- ja bakteerisoluilla on molemmilla omat viruksensa. Niitä, jotka infektoivat bakteereita, kutsutaan bakteriofageiksi. Ensimmäisiä viitteitä niistä saatiin 1896, kun Intiassa työskennellyt tutkija Ernest Hankin huomasi suodatetun jokiveden tuhoavan kolerabakteereita (Hankin, 1896). Joitain vuosia myöhemmin, 1915, Frederick Twort vastaavasti huomasi siitä muitakin ominaisuuksia. Tämän "suodatettavan agentin" muodostamat pesäkkeet eivät kyenneet kasvamaan ilman bakteereita mutta kylläkin siirtymään ja tuhoamaan kasvatuksia määrittelemättömien sukupolvien ajan. Pari vuotta myöhemmin Felix d Herelle pääsi itsenäisesti samoihin lopputuloksiin. Meni kuitenkin vielä vuosikymmeniä, ennen kuin bakteriofagien olemus viruksina ymmärrettiin ja niiden elinkaari, kiinnittyminen isäntäsoluun, solun tuhoutuminen ja uusien viruksien syntyminen, kuvailtiin. (Wittebole et al., 2014). Kuvassa 1 on otettu elektronimikroskooppikuva VB_EcoM_fHoEco02-bakteriofagista (kirjoitetaan vastaisuudessa vain fho-eco02). 4

6 Kuva 1. Elektronimikroskooppikuva fho-eco02-bakteriofagista. Kuvan on ottanut Anu Wicklund. Bakteriofagit voivat olla joko lyyttisiä (jonka elinkaarta kuvailtiin edellisessä kappaleessa) tai lauhkeita eli temperaatteja. Lyyttiset bakteriofagit kykenevät ainoastaan ensiksi infektoimaan isäntäsolunsa, valjastamaan sen bakteriofagin genomin kopioimiseen, kapsidin proteiinien tuottamiseen ja uusien virionien kokoamiseen. Tämän jälkeen solu tuhoutuu vapauttaen uudet virionit. Temperaatit taas kykenevät bakteerien hajottamisen lisäksi siirtymään osaksi bakteereiden perimää jopa useiden sukupolvien ajaksi. Tämä tunnetaan lysogeenisenä syklinä ja tässä muodossa (isäntäsolun genomin osana) niitä kutsutaan profaageiksi. Siitä ne voivat joskus siirtyä tietyissä tilanteissa lyyttiseen sykliin (Gill & Hyman, 2010). Temperaateilla ja lyyttisillä bakteriofageilla on muitakin eroja. Temperaatit bakteriofagit kykenevät siirtämään bakteereiden perimään uusia osia, jotka saattavat tehdä bakteereista vain vaarallisempia ja isäntäsolu voi esimerkiksi alkaa uuden geneettisen materiaalin myötä tuottamaan toksiineita. Temperaattien bakteriofagien infektiot aiheuttavat myös sen, että infektion jälkeen tietyllä bakteriofagilla, uudet samansukuiset bakteriofagit eivät kykene infektoimaan sitä vaan isäntäsolu on tullut immuuniksi niille. Lisäksi useimmiten temperaatit bakteriofagit kykenevät myös transduktioon, jolloin ne siirtävät isäntäsolun genomin osia toiseen bakteerin, mikä saattaa muuttaa uuden isäntäsolun vain virulentimmaksi. (Gill & Hyman, 2010). Taksonomisesti bakteriofagit voidaan luokitella esim. sen mukaan onko niiden perimä RNA- vai DNA-muodossa ja onko se virioneissa yksi- vai kaksijuosteisena. Myös muoto vaikuttaa taksonomiseen luokitteluun. Esim. Caudovirales-lahkoon kuuluu hännällisiä bakteriofageja (Weinbauer, 2004). Muodon ja DNA:n kemiallisen rakenteen lisäksi eri jaottelutavoiksi on ehdotettu bakteriofagien genomeita. Tämä kuitenkin kaatuu siihen, että bakteriofageilta ei löydy yhteisiä geneettisiä markkereita, joita verrata keskenään. Sen takia 5

7 bakteriofagien taksonomisen jaottelun perusteeksi on myös kokeiltu bakteriofagien genomeista ennustettuja proteomeja (Rohwer & Edwards, 2002). Bakteriofageille on hyvin lajikohtaista, mitä bakteereita ne infektoivat. Osa kykenee infektoimaan vain yhden bakteerilajin tiettyjä kantoja, kun taas osa kykenee infektoimaan täysin eri lajeja (Weinbauer, 2014). Luonnollisesti bakteerit ovat ajan myötä myös kehittäneet erilaisia tapoja taistella bakteriofagi-infektioita vastaan. Tällaisia ovat esim. bakteriofagin kiinnittymisen isäntäsoluun estäminen tai bakteriofagin geneettisen aineksen pilkkominen entsyymeillä. Isäntäsolu voi myös joissain tilanteissa käynnistää itsetuhon, vaikka bakteriofagin perimän siirto soluun onnistuisikin (Hyman & Abedon, 2010). 1.2 Bakteriofagiterapia Antibiootteja on käytetty ihmisten hoidossa vuosikymmenien ajan. Samaan aikaan bakteerit ovat muodostaneet vastustuskykyä niille. Esim. Pseudomonas aeruginosabakteeri on valmiiksi resistentti monille antibiooteille ja kykenee myös muuttumaan useimmille vastustuskykyiseksi. Esimerkiksi palovammapotilaat ovat alttiita sille ja moniresistentin P. aeruginosa-bakteerin leviämistä palovammaosastolla potilaiden välillä onkin kuvailtu hyvin (Pirnay et al., 2003). Tämä pakottaa pohtimaan uusia keinoja erilaisten bakteeri-infektioiden taltuttamiseen. Bakteriofagien käytöstä bakteeri-infektioiden hoidosta on olemassa tietoa lähemmäs sadan vuoden ajalta. Jo d Herelle ymmärsi niiden potentiaalin tekemällä kokeita bakteriofageilla ja Shigella-bakteerilla infektoiduilla eläimillä. (Wittebole et al., 2014). Palovammapotilaille onkin jo tarjottu Belgiassa kokeiluna bakteriofagiterapiaa, jossa potilaat saivat P. aeruginosa- ja Staphylococcus aureus-bakteeereita infektoivia bakteriofageja (Rose et al., 2014). Tämä tapahtui samassa sairaalassa, jossa Pirnay et al. (2003) kuvailivat n. kymmenen vuotta aiemmin P. aeruginosa-bakteerin leviämisen. Bakteriofagiterapiatutkimuksen tärkeät keskukset ovat sijainneet Georgian Eliava- ja Puolan Hirszfeld-instituuteissa. Georgia lähetti jo vuonna 1918 instituutin ensimmäisen johtajan George Eliavan opiskelemaan Ranskaan, missä hänestä tuli d Hérellen yhteistyökumppani. Vuosia myöhemmin Eliava-instituutti tuotti 1980-luvulla ennen Neuvostoliiton romahdusta 1200-työntekijän voimin 2000 kg erilaisia bakteriofagituotteita. (Kutter et al., 2010). 6

8 Kun bakteriofagiterapiaa ja antibiootteja verrataan keskenään, bakteriofagit kykenevät myös tunkeutumaan kudoksiin, joihin antibiootit eivät välttämättä pääse. Lisäksi bakteriofagien itsessään voidaan olettaa olevan turvallisempia kuin antibiootit. Siinä missä antibiootti voi olla liian suurina konsentraatioina myrkyllistä, jolloin sen annostusta ei voida nostaa, bakteriofageja voidaan antaa hyvinkin paljon johtuen bakteriofagien yleisesti pienemmästä myrkyllisyydestä. Pienempi myrkyllisyys johtuu siitä, että bakteriofagit ovat hyvin spesifisiä verrattuna antibiootteihin (eivät häiritse normaaliflooraa) ja isäntien kadotessa elimistö kykenee poistamaan bakteriofagit helposti. (Kutter et al., 2010). Bakteriofagien turvallisuus on osoitettu myös esimerkiksi siten, että Escherichia coli-bakteerin T4- bakteriofagi ei aiheuttanut koehenkilöillä oraalisesti käytettynä enempää ongelmia, kuin niillä koehenkilöillä, jotka olivat saaneet plaseboa. Lisäksi veren plasmanäytteissä ei nähty T4- bakteriofageja, saati niiden vasta-aineita (Bruttin ja Brüssow, 2005). On hyvä mainita, että johtuen kappaleessa 1.1 mainituista eroista temperaattien ja lyyttisten bakteriofagien välillä, bakteriofagiterapiassa on suosittu nimenomaan lyyttisiä lajeja. Poikkeuksena ainakin Belgia (Pirnay et al., 2018), bakteriofagiterapialla ei ole kuitenkaan länsimaissa standardisoitua valmistus- tai käyttöönottotapaa. Perinteisille lääkkeille, kuten antibiooteille, suunniteltu standardisoitu käyttöönottotapa ei sovi bakteriofagituotteille. Kuitenkin bakteriofagi-tuotteiden valmistamiselle on ehditty kerätä tärkeimmät turvallisuus- ja laatuperiaatteet, jotta niitä voitaisiin valmistaa käyttöön. Nämä kattavat sellaiset alueet kuin bakteriofagituotteiden tuotantoympäristön ja -prosessin, laadunvalvonnan, varastoinnin ja käytön valvonnan (Pirnay et al., 2015). Belgiassa tilanne on ratkaistu tiivistetysti siten, että bakteriofagipankista valitaan haluttuja kantoja, joita kasvatetaan kontrolloidusti, minkä jälkeen apteekki valmistaan bakteriofageja sisältävän tuotteen käyttöä varten (Pirnay et al., 2018). Terveydellisten huomioiden lisäksi voidaan ottaa huomioon myös taloudelliset näkökannat, sillä bakteriofagiterapia saattaisi myös olla halvempaakin kuin perinteinen antibioottiterapia. Międzybrodzki et al. (2007) laskivat, että esim. kymmenen päivän kuuri teikoplaniini-antibioottia MRSA-bakteeria vastaan olisi maksanut tuolloin melkein Puolan zlotya. Silloisella euron ja zlotyn vaihtokurssilla eli n. 3,75 zlotya/euro (Kauppalehti, 2018) se teki melkein 2800 euroa. Vastaavasti kuuden ja puolen viikon bakteriofagiterapian stafylokokki-infektiota vastaan olisi arvioitu keskimäärin maksavan vain hieman alle 2100 zlotya eli 560 euroa. 7

9 Tuoreempaa tietoa bakteriofagiterapian tehosta on saatu myös eläinkokeilla. Burkholderia pseudomallei-bakteeri aiheuttaa hengitystiesairaus melioidoosia, jonka kuolleisuus on korkea. Melioidoosin aiheuttava bakteeri on lisäksi monille antibiooteille resistentti. Kun kolmea ryhmää hiiriä infektoitiin nenän kautta bakteerilla ja niille kahdesta annettiin intraperitoneaalisesti (vatsakalvon alle ruiskutettuna) 100 µl:n annoksena 0,2*10^9 bakteriofagia joko ennen tai jälkeen bakteeri-inokulaation, kahden viikon päästä molemmista ryhmistä oli jäljellä viisi viidestätoista hiirestä. Yksikään pelkästään bakteerilla infektoiduista viidestätoista hiirestä ei selvinnyt (Guang-Han et al., 2016). Huomioitakoon, että tämä tulos oli saatu vain yhdellä bakteriofagikannalla. Bakteriofagiterapian tehokkuutta on myös päästy testaamaan ihmisillä kaksoissokkokokeissa. Esim. edellä mainittu P. aeruginosa aiheuttaa usein myös otiittia eli korvatulehdusta. Eräässä kokeessa kroonista korvatulehdusta sairastaneille potilaille, joilla oli antibioottiresistentti P.aeruginosa-infektio, annettiin korvatippoina 200 µl annoksena bakteriofagia (Wright et al., 2009). Lopputuloksena 42-päivän jälkeen näkyi selvä ero plaseboa ja bakteriofageja saaneiden ryhmien välillä. Esim. bakteriofageja saaneilla oli vähemmän P. aeruginosa-bakteereita, kahdestatoista bakteriofageja saaneesta koehenkilöstä kolmella oli kokeen lopuksi P. aeruginosa-määrä havaitsemisrajan alla ja bakteriofageja saaneen ryhmän tila oli yleisesti huomattavasti parantunut. Plaseboa saaneilla taas bakteerimäärissä ei ollut suuria muutoksia eikä ryhmän tilassa kokonaisuutena ollut huomattavia muutoksia parempaan suuntaan. Bakteriofagiterapian tehokkuutta on tutkittu myös analysoimalla tulehduksesta kertovien tekijöiden, kuten esim. C-reaktiivisen proteiinin määrää. Tutkimuksessa annettiin bakteriofageja eri bakteereita vastaan infektioista kärsiville potilaille, joiden infektiot aiheuttivat antibioottiresistentit bakteerit, antibiootteja ei voitu käyttää tai syystä tai toisesta perinteiset tavat infektion hoitamiseksi eivät tulleet kysymykseen. Kokeessa huomattiin, että C-reaktiivisen proteiinin keskiarvo potilailla pieneni kokeen kuluessa (Międzybrodzki et al., 2009). 8

10 1.3 Lipopolysakkaridit Lipopolysakkaridit (LPS), jotka myös endotoksiineina tunnetaan, ovat tärkeä rakenneosa gramnegatiivisten bakteereiden ulkokalvossa. Ne koostuvat hydrofobisesta lipidi A:sta, ydinoligosakkaridista ja O-antigeeni-alueesta, joka koostuu oligosakkaridien toistojaksoista. LPS:n perusrakenne löytyy kuvasta 2. Lipopolysakkaridit vapautuvat solun ympäristöön sen jakautuessa ja kasvaessa mutta etenkin kuollessa. LPS-molekyylit aiheuttavat immuniteetin aktivoitumisen ja LPS:n osista lipidi A on tässä suhteessa merkittävä (Magãlhaes et al, 2007). Esimerkiksi, kun terveisiin koehenkilöihin ruiskutettiin LPS-molekyylejä, heidän kehojensa lämpötila, syke ja veren sytokiinien määrät nousivat monien muiden vaikutusten ohella (van Deventer et al., 1990). Endotoksiinien pääsy verenkiertoon voikin olla kohtalokasta. Kuva 2. LPS:n perusrakenne. O-polysakkaridi-ketju (O-polysaccharide chain) on hyvin vaihteleva eri bakteerikantojen välillä. Toistuvien alayksiköiden (repeating oligosaccharide subunit) määrä voi olla hyvinkin suuri tai alayksiköt voivat puuttua kokonaan. Sen jälkeen tule ydinoligosakkaridi, joka jakautuu ulompaan ja sisempään osaan (outer core ja inner core). Lähimpänä solukalvoa sijaitsee lipidi A (lipid A) (Erridge et al., 2002). O-polysakkaridi on hyvin vaihteleva. Siinä voivat vaihdella niin sokerit, niiden järjestys, kuin toistotkin mutta se voi puuttua myös kokonaan. Alayksiköitä voi olla jopa 50. Ydinpolysakkaridilla ei esiinny yhtä suurta variaatiota kuin O-polysakkaridilla vaan ulkoydin on yleensä jokin heksoosi. Sisemmästä ytimestä löytyy 3-deoxi-D-manno-oktulosonihappo (Kdo), joka löytyy melkein kaikilta gramnegatiivisilta bakteereilta. Lisäksi sieltä löytyy yleensä L-glyseroli-D-mannoheptoosi (Hep). Lipidi A taas koostuu yleensä kahdesta disakkaridista, joihin on kiinnitynyt fosforyyli- ja asyyliryhmiä (kuva 3) (Erridge et al., 2002). 9

11 Kuva 3. E. coli-bakteerin lipidi A:n kemiallinen rakenne (Erridge et al., 2002). LPS-molekyyleillä on myös taipumus kerääntyä yhteen kda LPS monomeerit voivat kerääntyä kda miselleiksi. Nämä voivat edelleen muodostaa yli 1000 kda vesikkeleitä. Vaihtelu yksittäisen monomeerin painossa johtuu eroista oligosakkaridiketjussa. Lisäksi nämä yhteenkerääntymät ovat hyvin stabiileja, vaikkakin erilaiset yhdisteet, kuten deoksikolaatti, voivatkin aiheuttaa kerääntymien hajoamista monomeereihin (Petsch & Anspach, 2000). On tiedetty useiden vuosien ajan, että kaikkien bakteereiden LPS:t eivät ole samanlaisia. Esimerkiksi, kun E. coli- ja Salmonella typhimurium-bakteereista erotetun LPS:n annettiin inhiboida kananmunan lysotsyymiä, huomattiin, että LPS:ää tarvittiin eri määriä (Ohno & Morrison, 1989). Eri bakteerilajien LPS:n rakenteet voivatkin olla hyvin erilaisia, millä on merkitystä immuunipuolustuksen vasteelle. Tässä merkittäväksi nouseekin lipidi A:n asyyliketjujen määrä ja pituus. Esimerkiksi E. coli-bakteerin lipidi A sisältää kuusi asyyliketjua pituudeltaan hiiliatomia ja tämän LPS:n pääsy verenkiertoon suurena määränä voi aiheuttaa shokin ja kuoleman. Vastaavasti Bacteroides fragilis-bakteerin lipidi A sisältää yleensä viisi ketjua, jotka ovat pituudeltaan hiiliatomia ja voivat haarautua. Sen lipidi A:n endotoksiininen aktiivisuus on varsin heikko. Näiden lisäksi LPS:n vaikutuksiin immuniteetin aktivaatiossa vaikuttavat muutkin seikat, kuten fosforylaation määrä LPSmolekyylissä (Erridge et al., 2002). 10

12 Gramnegatiivisissa bakteereissa on tuotettu useita ihmisille tärkeitä terapeuttisia tuotteita. Siksi niiden puhdistamiseen bakteeriperäisestä materiaalista on kiinnitetty runsaasti huomiota jo aiemminkin. Esim. potentiaalisia syöpärokotteiden antigeenejä on tuotettu Escherichia coli-bakteereissa. Endotoksiinit on myöhemmin puhdistettu niistä menestyksekkäästi (Chen et al., 2009). LPS:n määrä ei saisikaan ylittää suonensisäisesti annettuna 5 EU/(kg*h) (endotoksiiniyksikköä/(potilaan paino*tunnissa)). (Pirnay et al., 2015). 70 kg painavalla henkilöllä tämä tarkoittaisi enintään 8400 endotoksiiniyksikköä vuorokaudessa. On tärkeätä muistaa, että endotoksiinipitoisuudelle on annettu raja-arvot vain sellaisille näytteille, joita aiotaan käyttää suonensisäisesti. Sellaisille näytteille joita aiotaan käyttää suun kautta (oraalisesti) tai paikallisesti iholle (topikaalisesti), endotoksiinipitoisuudella ei ole niin suurta merkitystä, vaikka näytteitä pitääkin puhdistaa ennen käyttöä. Esim. Międzybrodzki et al. (2009) antoivat potilaille bakteriofageja sen mukaan, mitä bakteereita potilailta löydettiin ja anto tapahtui joko oraalisesti tai topikaalisesti. Ainoa puhdistus, minkä he tekivät, oli raakalysaatin suodattaminen. 1.4 Tekniikat lipopolysakkaridien poistamiseksi Ajan myötä on kehitetty useista erilaisia tekniikoita lipopolysakkaridinäytteiden poistamiseksi, kuten esim. erilaisia kaupallisia tuotteita. Tällainen on esim. EndoTrap-pylväs. Sillä puhdistettiin S. aureus- ja P. aeruginosa-bakteereiden bakteriofageja. Pylväällä puhdistettu bakteriofagikoktaili aiheutti jänisten pyrogeenisyys-testissä lämpötilan nousun, joka oli alle sallitun ja täten olisi sen osalta kelvannut potilaskäyttöön (Merabishvili et al., 2009). Kuitenkin EndoTrap-pylvään tehosta on osittain ristiriitaista tietoa. Kun eri tutkimuksessa bakteriofagilysaatti puhdistettiin EndoTrap-pylväällä, oli endotoksiinipitoisuuden muutos hyvin pieni verrattaessa käsittelemättömään lysaattiin (Cooper et al., 2013). Lisäksi sen käyttöä tulevaisuudessa uhkaa valmistajan antama ilmoitus tuotannon lopettamisesta (Hyglos, 2018a). 11

13 Toinen, endotoksiinien puhdistuksessa hyödynnetty keino on Thermo Scientificyhtiön Pierce high-capacity endotoxin removal resin-aine. Sen vaikutusta on tutkittu puhdistamalla E. coli-bakteereissa tuotettua kollageenia ja kuinka esim. eri ionikonsentraatiot vaikuttavat kollageenin puhdistustehokkuuteen. Tällä Pierce-tuotteella tutkimusryhmä sai endotoksiinipitoisuuden laskemaan näytteessä n EU/ml-arvosta arvoon 8,3 EU/ml (Zhang et al., 2014). Bakteriofaginäytteiden puhdistamisessa on tutkittu myös runsaasti erilaisia ioninvaihtokromatografia tekniikoita. (Smrekar et al., 2011a; Smrekar et al., 2011b). Anioninvaihtokromatografiaa pidetään hyvänä keinona bakteriofagi-näytteen konsentroimiseksi. Se mahdollistaa myös suurten näytemäärien käsittelyn. Haittapuolena tosin on, että jokaiselle bakteriofagille kromatografian parametrit täytyy optimoida erikseen. Lisäksi eri bakteriofagit puhdistuvat erilaisilla tehokkuuksilla anioninvaihtokromatografiassa, jossa vaikuttaa myös valittu pylväs (Adriaenssens et al., 2012). Kirjallisuudesta löytyy kuitenkin varsin vähän merkintöjä anioninvaihtokromatografian hyödyntämisestä juuri LPS:ien puhdistamiseen. LPS:ien erottamiseen on käytetty myös orgaanista liuotinta eli 1-oktanolia. Sen on todettu olevan varsin tehokas keino poistaa LPS:t bakteriofaginäytteestä. Oktanoliuuton tehokkuudesta on kirjoitettu esimerkiksi siten, että useissa puhdistetuissa näytteissä olisi ollut keskimäärin vain 5,3 EU/ml (95% luottamusväli oli 3,3-7,3). Alkuperäisistä näytteistä endotoksiinipitoisuus olisi tällöin pudonnut sadas- ja jopa kymmenestuhannesosaan (Szermer- Olearnik & Boratyński, 2015). Ultrafiltraatiotakin on ehdotettu LPS:ien poistamiseen näytteistä. Siinä erilaiset aineet pääsevät kulkeutumaan tietyn kalvon lävitse, joka päästää vain tiettyä kokoa pienemmät tuotteet läpi. Tallainen on ollut esim. polysulfonikalvo. Ongelmaksi muodostuu kuitenkin LPSmonomeerien taipumus muodostaa aggregaatteja, mikä haittaa tällaista kokoon perustuvaa erotusta (Boratyński et al., 2004). Kuten anioinvaihtokromatografiassa, eri bakteriofagit käyttäytyvät myös eri lailla ultrafiltraatiossa. Esim. saman sukuisista bakteriofageista osan tiitteri pieneni enemmän ja osan vähemmän ultrafiltraatiossa. Sama päti myös endotoksiinipitoisuuteen eikä tiitterin pieneneminen näyttänyt korreloivan endotoksiinipitoisuuden pienenemisen kanssa (Bourdin, 2014). Sama artikkeli mainitseekin ultrafiltraation tärkeimmän tehtävän olevan bakteriofagilysaatin konsentrointi. 12

14 Eri tekniikoiden yhdistämisestä on kirjoitettu jonkin verran muuallakin. Esim. Van Belleghem et al. (2017) saivat kolmella neljästä P. aeruginosa-bakteerin bakteriofagista LPS-pitoisuuden puhdistustehokkuudeksi yli 92%. Sen neljännen puhdistustehokkuus oli vain 63,83 %. Tämä tapahtui yhdistämällä ensiksi EndoTrap-puhdistus sen jälkeen tapahtuvaan oktanoliuuttoon. Tiitterit olivat puhdistuksen jälkeen hyvin vaihtelevia, 2,06%-34% alkuperäisestä lysaatista. Kuitenkin, kun puhdistusta yritettiin kahdella eri bakteriofagikannalla ensiksi EndoTrap-pylväällä ja sitten anioninvaihtokromatografialla, saatiin endotoksiininpuhdistustehokkuudeksi yhdellä bakteriofagilla 98,15% ja toisella 40,39%. Saannot olivat 2,44% ja 0,62% alkuperäisestä bakteriofagimäärästä. Endotoksiinien poistamiseksi on kehitetty muitakin metodeja. Esim. ammoniumkloridin- ja guanidiinihydrokloridin lisäystä fuusioproteiininäytteeseen yhdistettynä hydrofobisiin vuorovaikutuksiin perustuvaan kromatografiaan on yritetty (Wilson et al., 2001). Tätä kyseistä tekniikkaa ei kuitenkaan voida soveltaa bakteriofageihin sen denaturoivan vaikutuksen takia. Toinen tekniikka olisi myös bakteriofaginäytteen deoksikolaatti (DOC)-käsittely ennen ultrafiltraatiota LPS-aggregaattien hajottamiseksi. Kun näytteet käsiteltiin ensiksi deoksikolaatilla ja tämän jälkeen ultrafiltroitiin ja nämä molemmat tehtiin yhteensä kolme kertaa, LPS- pitoisuus pieneni yli 99,9%. Samaan aikaan tiitteri pieneni erittäin vähän (Hashemi et al., 2013). Kuitenkaan kaikkien bakteriofagien herkkyyttä DOC:lle ei tunneta. 1.5 Tavoite Työn tarkoituksena onkin tutkia, kuinka eri tekniikoiden yhdistäminen vaikuttaa bakteriofagien ja LPS:n määrään näytteissä. Lisäksi otetaan huomioon, kuinka nopeasti koejärjestely voidaan suorittaa ja kuinka paljon näytteiden käsittelymääriä voitaisiin tarvittaessa nostaa. Tätä varten tarkastellaan viittä erilaista järjestelyä: 1. Bakteriofagilysaatti puhdistetaan ensiksi oktanoliuutolla, jonka jälkeen tapahtuu ultrafiltraatio suodattimella, joka päästää 100 kda pienemmät kappaleet lävitseen. Tätä seuraa anioninvaihtokromatografia ja uusi ultrafiltraatio. 2. Toisessa tutkitaan pelkän ultrafiltraation ja joko EndoTrap- tai Pierce-pylvään yhteisvaikutusta. 3. Kolmannessa järjestelyssä alun ultrafiltraatiota seuraa ioninvaihtokromatografia ja uusi ultrafiltraatio. 13

15 4. Neljännessä järjestelyssä aloitetaan ultrafiltraatiolla, jota seuraa anioninvaihtokromatografia ja uusi ultrafiltraatio. Tämän jälkeen saadut tuotteet puhdistetaan joko EndoTrap- tai Pierce-pylväillä. 5. Lopuksi tutkitaan toisen koejärjestelyn tapaan ultrafiltraation ja Pierce-pylvään yhteisvaikutusta. Muutoksena siihen käytetään lisättyä lysaattimäärää sekä erilaista puskuria bakteriofagien eluointiin pylväästä. Tämä tehtiin koejärjestelyn 2 tulosten perusteella tarkoituksena Pierce-pylvään käytön optimointi. Järjestelyiden vaikutuksia bakteriofaginäytteisiin tutkitaan endotoksiinimittausten, tiitterien laskemisen, bakteeri-dna:n mittausten ja SDS-PAGE:n avulla ja vertailukelpoiset tulokset pyritään järjestämään aina kolmella rinnakkaisella näytteellä. Tutkimusjärjestely on piirretty kuvaan 4. Kuva 4. Koejärjestely. Kaikista näytteistä tutkitaan tiitteri, bakteeri DNA:n pitoisuus ja LPS-pitoisuus. Tekniikoista tutkitaan saannot. Osa näytteistä ajetaan SDS-PAGE-geelissä siten, että samalla lailla puhdistetuista näytteistä valitaan vain yksi. O tarkoittaa oktanoliuuttoa, A anioninvaihtokromatografiaa, U ultrafiltraatiota, E EndoTrap- ja P Piercen pylväällä puhdistamista. Pienet e ja p näytteiden perässä tarkoittavat, kummalla pylväällä näyte on puhdistettu. 14

16 Koejärjestelyissä käytetään kuvassa 1 nähtyä, sairaalan jätevedestä eristettyä bakteriofagi fho-eco02:ta. Se kuuluu Myoviridae-heimoon ja sen T4virus-sukuun. Sillä on emäsparin kokoinen genomi, jossa on 272 proteiinia koodaavaa geeniä ja 10 trnageenä (Kiljunen et al., Painossa). 2. Metodit ja materiaalit 2.1 Materiaalit Bakteriofagi ja sen isäntäbakteeri Työssä käytettiin bakteriofagi fho-eco02:ta, joka on eristetty HUS-sairaaloiden jätevesinäytteiden seoksesta. Bakteriofagin isäntänä käytetty bakteeri oli HUSLAB:n potilaskanta E. coli Bakteriofagin genomi löytyy tunnisteella MG (Kiljunen et al., 2018) Tekniset välineet Ioninvaihtokromatografiapylväänä oli CIM QA-1 tube monolithic column I (BIA separations). Sen kanssa käytettiin Äkta purifier HPLC-laitetta (GE) ja Unicorn 5.11-ohjelmaa tulosten analysoimiseen. Ultrafiltraatiosuodattimina käytettiin Vivaspin 6-putkia ( molecular weight cut-off, Sartorius). EndoTrap-paketti oli Hygloksen EndoTrap HD1/1. Piercen endotoksiininpuhdistuspylväs oli Pierce high capacity endotoxin removal spin column 1 ml (Thermo scientific). Absorbanssimittauksissa käytettiin Eppendorf biophotometerlukijaa, jossa oli V1.32-ohjelmisto ja fluoresenssimittauksissa HIDEX Sense microplate reader-laitetta, jossa Platereader software Ultrafiltraatioissa käytettiin Thermo Scientific-yhtiön SL 16R-sentrifuugia ja Pierce-pylväiden kanssa Universal 320R-sentrifugia (Hettich Zentrifugen). SDS-PAGE-kuvauksessa oli Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR+-laite. Kuvauslaitteessa oli Image Lab -ohjelma, versio ja build 25. Kuvausparametreina oli Coomassie Blue heikoille juoville. SDS-PAGE:ssa käytettiin valmiita Mini-Protean TXG-geelejä (Bio-Rad) Puskurit ja muut liuokset Oktanoliuutossa käytettiin 1-oktanolia (99 %, Acros Organics). Luria-Bertani (LB)-liemessä oli 10 grammaa tryptonia, 5 grammaa hiivaekstraktia ja 10 grammaa NaCl liuotettu 1 litraan vettä. 0,4 % LB-softagarissa oli lisäksi 4 grammaa agaria litrassa LB-liuosta. Bakteerit kasvatettiin HUS:n elatusaineyksiköstä tilatuilla LB-maljoilla. SM-puskurissa 100 mm NaCl, 10 mm mgso4, 50 mm Tris-HCl, ph 7,5 ja 0,01 % (w/v) gelatiini mutta koejärjestelyssä 5 näytteen eluointiin ja ensimmäiseen ultrafiltraatioon käytettiin SM-puskuria, 15

17 jossa 400 mm NaCl. Piercen pylvään regeneraatiopuskurina oli 0,2 M NaOH. SDS-PAGEnäytteiden valmistuksessa käytettiin 2x näytepuskuria, jossa oli 100 ml 1,5 M Tris-Cl (ph 6,8), 60 ml 20 % SDS, 300 ml glyserolia 150 ml β-merkaptoetanolia ja 18 mg bromofenolin sinistä liuotettu yhteen litraan vedellä. Ioninvaihdossa käytetyistä puskureista A-puskurissa oli 20 mm Tris-HCl ja ph 7.4 ja B-puskurissa 20 mm Tris-HCl, 1 M NaCl ja ph Metodit Bakteriofagilysaatin valmistus 184 ml LB:tä, 16 ml yli yön kasvatettua bakteeria ja 300 μl bakteriofagilysaattia sekoitettiin, kunnes LB muuttunut samean kautta kirkkaaksi raakalysaatiksi. Tämän jälkeen raakalysaattia suodatettiin 0,2 µm:n Nalgene Rapid-Flow -suodattimella (Thermo Scientific). Suodatettua tuotetta kutsutaan vastaisuudessa lysaatiksi Oktanoliuutto 7 ml:aan bakteriofagilysaattia lisättiin 5 ml:aa 99 % 1-oktanolia. Seosta ravisteltiin 3 tuntia huoneenlämmössä. Tämän jälkeen putkia sentrifugoitiin 4000 G 10 min +4 C ja oktanolifaasi otettiin pois. Sentrifugiajo ja oktanolin poisto toistettiin kaksi kertaa Ultrafiltraatio Ultrafiltraatiossa käytettiin 6 ml:n Vivaspin 6-suodattimia (Sartorius), jotka päästivät 100 kda pienemmät molekyylit lävitseen. Pylväitä pestiin ensiksi kaksi kertaa 5 ml:lla SM-puskuria. Sentrifugoinnin olosuhteet olivat 3500 G, 23 C, 1-3 min. Tämän jälkeen lisättiin bakteriofaginäyte, jota ajettiin sentrifugissa samoin asetuksin kaksi kertaa niin kauan, kunnes putkessa olleen näytteiden tilavuus oli alle kymmenesosan alkuperäisestä tilavuudesta. Ensimmäisen ajon jälkeen pylvään läpitullut neste otettiin talteen ja bakteriofaginäyte palautettiin pylvääseen syötettyyn tilavuuteen SM-puskurilla. Koejärjestelyssä 5, ensimmäinen pesu ja näytteen palauttaminen alkuperäiseen tilavuuteen tapahtuivat SM-puskurilla, jossa oli korkeampi NaCl-pitoisuus. Mikäli ultrafiltraation jälkeen oli kromatografia, pylvään pesussa ja näytteiden täyttämisessä alkuperäiseen tilavuuteen käytettiin A-puskuria. Kromatografian jälkeen tulleiden, yhdistettyjen fraktioiden jälkeen tapahtuneessa ultrafiltraatiossa näytteet palautettiin kromatografialaiteeseen syötettyyn tilavuuteen siten, että yhdistetyistä fraktioista otettujen näytteiden vaikutus tilavuuteen oli otettu huomioon. 16

18 2.2.4 Anioninvaihtokromatografia Pylvästä puhdistettiin ensiksi 20 % etanolilla, jonka jälkeen tuli vesi, sitten A- puskuri, jota seurasi B-puskuri ja lopuksi oli uusi pesu A-puskurilla. Näytettä injektoitiin laitteeseen noin 900 µl. Laitteen ajo-ohjelma oli seuraava: Pylvään läpi kulki ensiksi A- puskuria 4 pylvästilavuutta. Tämän jälkeen tapahtui pesu kuuden pylvästilavuuden ajan siten, että eluutionesteessä oli 74 % puskuri A:ta ja 26 % puskuri B:tä. Lopuksi näytettä eluoitiin kuusi pylvästilavuutta liuoksella, jossa oli 65% A-puskuria ja 35% B-puskuria. Kromatografiassa kerättiin 1 ml:n fraktioita Titraus Titraus tapahtui joko A) kaksoiskerros- tai B) pisaramenetelmällä: A: 1.3 ml isäntäbakteeria kasvatettiin n. 2-4 h 37 C sekoittaen, jonka jälkeen laskettiin tarvittava määrä maljaa kohden kaavalla (90/kasvatuksen absorbanssi 600nm:ssa). Tämän jälkeen bakteriofaginäytettä lisättiin joko 25 tai 50 µl n. 3 ml:aan sulatettua ja 55 celsiusasteeseen temperoitua softagaria bakteerikasvatuksen kanssa. Sekoitettiin hyvin, kaadettiin LB-maljalle ja kasvatettiin yön yli 37 celsiusasteessa. Maljan tiitteri (pfu/ml) saatiin kaavalla (40 (25 µl) tai 20 (50 µl)) * (bakteriofaginäytteen laimennoskerroin) * (plakkien määrä). Liitteiden taulukkoon A on laskettu tällä metodilla saatujen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja -hajonnat. B: Pisaramenetelmä oli muuten samanlainen kuin kaksoiskerrosmenetelmä, paitsi että bakteriofaginäytettä ei lisätty maljalle suoraan vaan 10 µl:n pisaroina jähmettyneen softagarin päälle. Tätä metodia ei käytetty tiitterin tarkkaan laskemiseen vaan esim. bakteriofagien todentamiseen ultrafiltraatioputkesta läpitulleista puskureista ultrafiltraation jälkeen ja anioninvaihtokromatografiasta saaduista fraktioista sekä yksittäisten näytteiden tiitterin karkeaan arviointiin Pierce LPS:n poistopylväs Pylväs regeneroitiin, valmisteltiin ja tasapainotettiin SM-puskurilla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Koejärjestelyissä 2 ja 4 näytteitä siirrettiin pylvääseen kaksi millilitraa, annettiin sekoittua ja sentrifugoitiin. Koejärjestelyssä 4 näytteet oli ennen pylvääseen siirtoa laimennettu 1:4 SM-puskuriin. Koejärjestelyssä 5 näytteitä siirrettiin pylvääseen 5 ml ja ensimmäisessä ultrafiltraatiossa ja Pierce-pylväästä eluoinnissa käytettiin SM-puskuria, jossa 0,4 M NaCl. Yli yön säilytyksissä pylväs oli 0,2 M NaOH:ssa ja pitempiaikaisessa 20 % etanolissa. 17

19 2.2.7 EndoTrap LPS:n poistopylväs Pylvästä puhdistettiin ensin yhdeksällä ml:lla regenraatiopuskuria (20 mm HEPES, 1 M NaCl, 2 mm EDTA, ph 7,5), jonka jälkeen pylväs tasapainotettiin kuudella ml:lla SM-puskuria, jossa 0,1 mm Ca 2+ (tasapainotuspuskuri). 749,5 µl:aan näytteitä lisättiin 0,5 µl 150 mm MgCl2. Nämä siirrettiin pylvääseen ja siirron jälkeen otettiin välittömästi n. 300 µl talteen. Näytteisiin lisättiin 1 ml tasapainotuspuskuria ja kerättiin talteen. Lisäksi pylvästä pestiin kolmella ml:lla regeneraatiopuskuria ja pesuliuos otettiin talteen pylvääseen jääneiden bakteriofagien tutkimiseksi. Lisäksi putkeen lisättiin kolme ml regeneraatiopuskuria, mikäli sitä käytettiin uudestaan seuraavana päivänä. Muuten putki säilytettiin ohjeiden mukaisesti natriumazidiliuoksessa EndoLISA-mittaus LPS-pitoisuuden mittaamiseen käytettiin EndoLISA-kittiä (Hyglos). Fluoresenssiarvoista laskettiin lineaarisen regression avulla endotoksiinipitoisuudet. jonka jälkeen niistä laskettiin laimennuskorjaamalla alkuperäisten näytteiden pitoisuudet. Toisin kuin kitin ohjeissa sanottiin, jokaista näytettä (kuva 4) oli levyllä vain yksi. Mahdollisten mittausta häiritsevien ainesosien todentamiseksi osasta näytteistä valmistettiin spike-näytteitä, joihin oli lisätty endotoksiinistandardia siten, että niiden endotoksiinipitoisuuksissa on 5 EU/ml lisäys. Liitteiden taulukossa A ovat näytteiden laimennokset ja näytteet laimennettiin siten, etteivät niiden tulokset osuisi standardikuvaajan ulkopuolelle. Mittaus tapahtui käyttämällä HIDEXlaitetta sen High- tai Medium-herkkyysasetuksella. Tuloksista valittiin se asetus, jolla standardikuvaajan R^2-arvo oli suurempi. Lisäksi kitti asetti saaduille stadardikuvaajille laatuvaatimukseksi, että kuvaajien R^2 oli oltava suurempi kuin 0,98. Eksitaatioarvona oli 390/20 nm ja emissioarvona 444/12 nm. Liitteiden taulukkoon A on kerätty laimennuskorjatut keskiarvot ja hajonnat triplikaateista eri koejärjestelyiden eri puhdistusvaiheista Qubit bakteeri-dna:n mittaus 10 µl näytteiden päälle lisättiin 190 µl Qubit dsdna BR assay-kitin ohjeiden mukaan valmistettua työliuosta, jonka jälkeen näytteet mitattiin Qubit 2.0 V.3.11 fluorometrillä (Invitrogen). Havaintoraja bakteerien kromosomaaliselle DNA:lle oli 0,01 µg/ml näytettä. 18

20 SDS-PAGE 2-kertaiseen näytepuskuriin (kts. kohta 2.1.3) lisättiin 0,2 M DTT. Niitä ja näytteitä sekoitettiin 1:1, keitettiin 100 C 5 min ja kaivoihin ruiskutettiin 30 µl sekoitusta. Standardina oli 5 µl PageRuler Prestained protein ladder (Thermo Scientific). Geelejä ajettiin 150 V 39 min, jonka jälkeen ne huuhdeltiin vedellä, värjättiin Instant Blue dye-värillä (Expedeon) ja kuvattiin. Mahdollisten bakteriofagiproteiinien aminohappojärjestykset löytyivät NCBI:ltä (Kiljunen et al., 2018) ja niiden molekyylipainot laskettiin ProtParamohjelmalla (ExPASy) niiden sekvenssien perusteella 3. Tulokset 3.1 Endotoksiinipitoisuudet, tiitterit, niiden suhde ja bakteriofagisaannot Koejärjestely 1 Koejärjestelyssä 1 näytteet puhdistettiin ensiksi oktanoliuutolla, jonka jälkeen ne ultrafiltroitiin. Sen jälkeen näytteet ajettiin anioninvaihtokromatografiapylvään läpi, jota seurasi uusi ultrafiltraatio. Kuvaan 5 on laskettu näytteiden tiittereiden, endotoksiinipitoisuuksien, saantojen endotoksiinipitoisuus-tiitteri-suhteiden keskiarvot ja hajonnat. Kuvassa 5 ovat myös eri tekniikoille lasketut bakteriofagisaannot. Ne laskettiin vertaamalla käytetyn tekniikan jälkeistä, talteen saatujen bakteriofagien kokonaismäärää siihen bakteriofagimäärään, johon kyseistä tekniikkaa sovellettiin. Liitteiden taulukossa A on kaikkien koejärjestelyiden tiittereiden ja endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot- ja hajonnat. Samoissa endotoksiinimittauksissa tutkittiin näytteitä monesta eri järjestelystä. Mittauksissa käytettyjen standardikuvaajien R^2 oli suurempi kuin 0,98 eli standardeista saadut pisteet muodostivat hyvin lineaarisen suoran, jolta kyettiin laskemaan endotoksiinipitoisuus näytteissä niiden fluoresenssiarvojen perusteella. Yhden standardikuvaaja on liitteiden kuvassa B. Kuvan 5 paneeleista A ja B näkyvät, kuinka ioninvaihtokromatografialla ja toisella ultrafiltraatiolla on varsin pieni vaikutus tiittereihin ja endotoksiinipitoisuuksiin. Kuitenkin paneelista C näkyy, kuinka endotoksiinien määrä bakteriofagia kohden keskimäärin pienenee jokaisessa vaiheessa. Tämä tarkoittaa, että endotoksiineja poistuu jokaisessa vaiheessa enemmän, kuin bakteriofageja. Bakteriofagisaannoissakin tulokset ovat aina yli 10 % mutta toisessa ja erityisesti ensimmäisessä ultrafiltraatiossa saannot ovat hyviä. 19

21 Lysaatista ja yhdestä loppuun asti puhdistetuista näytteestä valmistettiin spikenäytteet. Kun laimennetun lysaatin endotoksiinipitoisuus oli 44,447 EU/ml niin siitä tehdyn spike-näytteen endotoksiinipitoisuus oli hieman yli havaintorajan eli 48,078 EU/ml. Yhden loppuun asti puhdistetun ja laimennetun näytteen endotoksiinipitoisuus oli 0,289 EU/ml ja siitä tehdyn spike-näytteen endotoksiinipitoisuus oli 7,205 EU/ml. Täten on epätodennäköistä, että lysaatissa tai puhdistetussa näytteessä olisi ollut runsaasti LPS-molekyylejä sitovia yhdisteitä, jotka olisivat voineet vaikuttaa mittaukseen. Lisäksi liitteiden kuvassa C on kuva tyypillinen kromatografiasta saadusta kuvaajasta. Bakteriofagit eluoituivat pois pylväästä, kun B-puskurin pitoisuus nousi 26 %:sta 35 %: iin eluointinpuskurissa eli NaCl-pitoisuus nousi 260 mm:sta 350 mm:iin. 20

22 Suhde (EU/10^9 pfu) Tiitteri (pfu/ml) Endotoksiinipitoisuus (EU/ml) A) Tiitterit B) Endotoksiinipitoisuus 1,0E+11 1,0E+05 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+04 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+03 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+02 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E+00 I II III IV V 1,0E-01 I II III IV V C) Endotoksiinipitoisuus bakteriofagia kohden 1,000E ,00% 200,00% D) saanto 1,000E ,00% 1,000E ,00% 50,00% 1,000E+01 0,00% 1,000E+00 I II III IV V Kuva 5. Koejärjestelyn 1 tiitterit, endotoksiinipitoisuudet, niiden suhde ja saannot eri puhdistustekniikoista. A) Koejärjestelyn aikana laskettiin kerättyjen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja hajonnat. B) Työn eri vaiheissa kerätyistä näytteistä määritettiin eri vaiheiden endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja hajonnat. C) Tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien avulla määritettiin endotoksiinipitoisuus miljardia bakteriofagia kohden. D) Saanto saatiin laskemalla puhdistusmenetelmästä saatujen bakteriofagien kokonaismäärän suhde puhdistukseen laitettujen bakteriofagien kokonaismäärään ja laskemalla sen jälkeen suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat. Paneeleissa A, B, C vaakarivien numerot tarkoittavat puhdistuksen vaihetta: I tarkoittaa lysaattia, II oktanoliuutettua näytettä, III ultrafiltroitua näytettä, IV ioninvaihtokromatografiasta tullutta näytettä ja V toisen kerran ultrafiltroitua näytettä. 21

23 3.1.2 Koejärjestely 2 Koejärjestelyssä 2 näytteet ultrafiltroitiin ensiksi, jonka jälkeen ne puhdistettiin joko EndoTrap- tai Pierce pylväällä. Kuvaan 6 on laskettu näytteiden tiittereiden, endotoksiinipitoisuuksien ja endotoksiinipitoisuus-tiitteri-suhteiden keskiarvot ja hajonnat. Kuvassa 6 ovat myös eri tekniikoille lasketut bakteriofagisaannot. Kuvassa 6 paneeleissa A ja B näkyy, kuinka ultrafiltraatiolla ja EndoTrappylväällä tiitteri pysyy varsin muuttumattomana mutta endotoksiinipitoisuus pienenee molemmissa vaiheissa ja erityisesti EndoTrap-pylvään jälkeen. Niistä näkyy myös, että vaikka Pierce-pylväällä on LPS-pitoisuutta pienentävä vaikutus, sillä on myös huomattavan suuri vaikutus bakteriofagien määrään näytteissä. Paneelissa C ero korostuu, kun EndoTrappylväällä puhdistetussa näytteessä endotoksiinipitoisuuden suhde tiitteriin on alle 0,1, niin Pierce-pylväällä puhdistetussa näytteessä se on suurempi kuin lysaatissa. Paneelissa C Piercepylvään saanto onkin olematon. EndoTrap-pylväällä saanto taas on yli 100 %. Koska näyte laimenee EndoTrap-pylväällä puhdistamisen aikana, sen tiitterin pitäisi pienetä. Lisäksi saanto ei koskaan voi olla yli sataa prosenttia yhdelle näytteelle. Tämä tarkoittaa, että pylvääseen on mahdollisesti jäänyt puhdistusten välillä bakteriofageja, jotka siirtyivät näytteeseen. Lisäksi tutkittiin 1. ultrafiltraation jälkeen suodattimen läpitullutta nestettä. Lysaattia ultrafiltroitiin kahdella eri kerralla. Ensimmäisellä kerralla endotoksiinipitoisuus oli 2,08 ja ja toisella 3,516 EU/ml läpitulleissa nesteissä. Samaan aikaan kuvan 6 paneelin B perusteella näytteiden endotoksiinipitoisuus pieneni melkein EU/ml. Todennäköisesti LPS on jäänyt kiinni suodattimeen. 22

24 Suhde (EU/10^9 pfu) Tiitteri (pfu/ml) Endotoksiinipitoisuus (EU/ml) A) Tiitterit B) Endotoksiinipitoisuus 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 I II III III Pierce EndoTrap 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 I II III III Pierce EndoTrap C) Endotoksiinipitoisuus bakteriofagia kohden 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E ,00% 400,00% 350,00% 300,00% 250,00% 200,00% 150,00% 100,00% 50,00% 0,00% D) saanto 1,00E-02 I II III III Pierce EndoTrap Kuva 6. Koejärjestelyn 2 tiitterit, endotoksiinipitoisuudet, niiden suhde ja saannot eri puhdistustekniikoista. A) Koejärjestelyn aikana laskettiin kerättyjen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja hajonnat. B) Työn eri vaiheissa kerätyistä näytteistä määritettiin eri vaiheiden endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja hajonnat. C) Tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien avulla määritettiin endotoksiinipitoisuus miljardia bakteriofagia kohden. D) Saanto saatiin laskemalla puhdistusmenetelmästä saatujen bakteriofagien kokonaismäärän suhde puhdistukseen laitettujen bakteriofagien kokonaismäärään ja laskemalla sen jälkeen suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat. Paneeleissa A, B, C vaakarivien numerot tarkoittavat puhdistuksen vaihetta: I tarkoittaa lysaattia, II ultrafiltroitua näytettä, III EndoTrap ja III Pierce kyseisillä pylväillä puhdistettuja näytteitä. 23

25 3.1.3 Koejärjestely 3 Koejärjestelyssä 3 näytteet ultrafiltroitiin ensiksi, jonka jälkeen ne puhdistettiin ioninvaihtokromatografiassa. Lopuksi näytteet vielä ultrafiltroitiin. Kuvaan 7 on laskettu näytteiden tiittereiden, endotoksiinipitoisuuksien ja endotoksiinipitoisuus-tiitteri-suhteiden keskiarvot ja hajonnat. Kuvassa 7 ovat myös eri tekniikoille lasketut bakteriofagisaannot. Kuvan 7 paneelissa A näkyy, kuinka näytteiden tiitteri pienenee kromatografiaan asti, jonka jälkeen se palaa jotakuinkin yhtä suureksi, kuin 1. ultrafiltraation jälkeen. Tiitterin pieneneminen kromatografiassa johtuu alkuperäisten näytteiden laimenemisesta fraktioihin, joka korjaantuu, kun 2. ultrafiltraatiossa näytteet palautetaan alkuperäiseen tilavuuteen. Vastaavasti paneelissa D näkyvä, korkea saanto johtuu siitä, että tiitterien määrityksessä tapahtuu aina jonkin verran heittoa. Koska tiitteri on vain hieman suurempi, kuin 1. ultrafiltroidun näytteen tiitteri, näkyy tämä yli sadan prosentin saantona. Endotoksiinipitoisuudet ja niiden suhde tiitteriin kuvan 7 paneeleissa B ja C taas pienevät jokaisen vaiheen jälkeen. Suurin pudotus suhdeluvulle tulee toisen ultrafiltraation jälkeen, vaikka ero endotoksiinipitoisuudessa ennen ja jälkeen sen ei olekaan kovin suuri. Tämä tarkoittaa sitä, että näytteen konsentrointi ei ole vaikuttanut bakteriofagien määrään vähentävästi niin paljon kuin endotoksiinien määrään. 24

26 Suhde (EU/10^9 pfu) Tiitteri (pfu/ml) Endotoksiinipitoisuus (EU/ml) A) Tiitterit B) Endotoksiinipitoisuus 1,0E+11 1,0E+05 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+04 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+03 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+01 1,0E+00 I II III IV 1,0E+00 I II III IV C) Endotoksiinipitoisuus bakteriofagia kohden 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 I II III IV 500,00% 450,00% 400,00% 350,00% 300,00% 250,00% 200,00% 150,00% 100,00% 50,00% Kuva 7. Koejärjestelyn 3 tiitterit, endotoksiinipitoisuudet, niiden suhde ja saannot eri puhdistustekniikoista. A) Koejärjestelyn aikana laskettiin kerättyjen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja hajonnat. B) Työn eri vaiheissa kerätyistä näytteistä määritettiin eri vaiheiden endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja hajonnat. C) Tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien avulla määritettiin endotoksiinipitoisuus miljardia bakteriofagia kohden. D) Saanto saatiin laskemalla puhdistusmenetelmästä saatujen bakteriofagien kokonaismäärän suhde puhdistukseen laitettujen bakteriofagien kokonaismäärään ja laskemalla sen jälkeen suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat. Paneeleissa A, B, C vaakarivien numerot tarkoittavat puhdistuksen vaihetta: I tarkoittaa lysaattia, II ultrafiltroitua 0,00% 1. ultrafiltraatio näytettä, III kromatografiasta tullutta näytettä ja IV 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. D) saanto Kromatografia 2. ultrafiltraatio 25

27 3.1.4 Koejärjestely 4 Koejärjestelyssä 4 näytteet ultrafiltroitiin ensiksi, jonka jälkeen ne puhdistettiin ioninvaihtokromatografiassa ja ultrafiltroitiin uudestaan. Lopuksi ne puhdistettiin joko Pierce- tai EndoTrap-pylväällä. Kuvaan 8 on laskettu näytteiden tiittereiden, endotoksiinipitoisuuksien ja endotoksiinipitoisuus-tiitteri-suhteiden keskiarvot ja hajonnat. Kuvassa 8 ovat myös eri tekniikoille lasketut bakteriofagisaannot. Koejärjestelyssä 4 ei enää tutkittu tiittereitä vaiheessa III niin tarkasti siitä syystä, että ne olivat käyneet samanlaiset puhdistuksen siinä vaiheessa kuin järjestelyssä kolme. Täten kuvassa 8 paneeleissa A, B ja C ei ole merkitty tätä vaihetta ja paneelissa D saanto kromatografian ja 2. ultrafiltraation jälkeen on yhdistetty. Kuvan 8 paneelista A näkyy, kuinka kromatografiaan asti tiitteri on pienentynyt varsin vähän. Kuten koejärjestelyssä 2, EndoTrap-pylvään vaikutus on pieni, kun taas Piercepylväällä tiitteri pienenee n osaan. Tämä näkyy myös paneelin D saannossa, jossa kromatografian ja 2. ultrafiltraation sekä EndoTrap-pylvään jälkeen saanto oli lähellä 100%. Pierce-pylvään jälkeen saanto oli lähes 0 %. Vastaavasti kuvan 8 paneelissa B näkyy, kuinka LPS-pitoisuus pienenee joka askeleella lysaatista toisen kerran ultrafiltroituun näytteeseen. Tällä kertaa ero Pierce- ja EndoTrap-pylvään välillä on varsin pieni, mitä tulee endotoksiinipitoisuuksiin itsessään, mutta paneelissa B näkyy taas, kuinka vähän Pierce-pylväällä puhdistetussa näytteessä on bakteriofageja verrattaessa EndoTrap-pylväällä puhdistettuun. Kaikki vaiheet läpikäyneen näytteen endotoksiinipitoisuudeksi tuli 0,103 EU/ml. Siitä tehdyn spike-näytteen pitoisuudeksi 5,799 EU/ml. Tämä viittaa siihen, ettei näytteessä ole paljon LPS-molekyylejä sitovia yhdisteitä, jotka olisivat estäneet LPS:n sitoutumisen fluoresenssilevylle. 26

28 Suhde (EU/10^9 pfu) Tiitteri (pfu/ml) Endotoksiinipitoisuus (EU/ml) A) Tiitterit B) Endotoksiinipitoisuus 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 1,0E-02 C) Endotoksiinipitoisuus bakteriofagia kohden 1,00E+04 1,00E+03 1,00E ,00% 200,00% 150,00% D) saanto 1,00E+01 1,00E+00 1,00E-01 1,00E ,00% 50,00% 0,00% Kuva 8. Koejärjestelyn 4 tiitterit, endotoksiinipitoisuudet, niiden suhde ja saannot eri puhdistustekniikoista. A) Koejärjestelyn aikana laskettiin kerättyjen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja hajonnat. B) Työn eri vaiheissa kerätyistä näytteistä määritettiin eri vaiheiden endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja hajonnat. C) Tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien avulla määritettiin endotoksiinipitoisuus miljardia bakteriofagia kohden. D) Saanto saatiin laskemalla puhdistusmenetelmästä saatujen bakteriofagien kokonaismäärän suhde puhdistukseen laitettujen bakteriofagien kokonaismäärään ja laskemalla sen jälkeen suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat. Saannon X-akselilla kohta k2u tulee sanoista kromatografia ja 2. ultrafiltraatio. Paneeleissa A, B, C vaakarivien numerot tarkoittavat puhdistuksen vaihetta: I tarkoittaa lysaattia, II ultrafiltroitua näytettä, III kromatografiasta tullutta näytettä ja IV 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. V EndoTrap ja V Pierce tarkoittavat kyseisillä pylväillä puhdistettuja näytteitä 2. ultrafiltraation jälkeen. 27

29 3.1.5 Koejärjestely 5 Koejärjestelyssä 5 näytteiden käsittely aloitettiin ultrafiltraatiolla, jossa bakteriofagien puskuriksi vaihdettiin suolaisempi SM-puskuri. Tätä seurasi puhdistaminen Pierce-pylväällä, jonka jälkeen näytteet ultrafiltroitiin toisen kerran. Kuvaan 9 on laskettu näytteiden tiittereiden, endotoksiinipitoisuuksien ja endotoksiinipitoisuus-tiitteri-suhteiden keskiarvot ja hajonnat. Kuvassa 9 ovat myös eri tekniikoille lasketut bakteriofagisaannot. Kuvan 9 paneelissa A näkyy, kuinka loppuun asti puhdistettujen näytteiden tiitteri on hyvin lähellä lysaattia. Paneelissa D tämä tulee myös esille siten, että tiitterit ovat yleensä välillä 40-90%. Kuvan 9 paneelissa B taas näkyy hyvin, kuinka endotoksiinipitoisuus pienenee Pierce-pylväällä puhdistamiseen asti. Kuitenkin paneelissa C näkyy, kuinka endotoksiinipitoisuuden ja tiitterin suhde on huomattavasti pienempi kuin koejärjestelyissä 2 ja 4. Kohotetulla suolapitoisuudella on ollut selvä vaikutus. Viimeisellä ultrafiltraatiolla ei ole kuitenkaan ollut suurta vaikutusta sekä endotoksiinipitoisuuteen että LPS-tiitteri-suhteeseen. 28

30 Suhde (EU/10^9 pfu) Tiitteri (pfu/ml) Endotoksiinipitoisuus (EU/ml) A) Tiitterit B) Endotoksiinipitoisuus 1,0E+11 1,0E+05 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+04 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+03 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+01 1,0E+00 I II III IV 1,0E+00 I II III IV C) Endotoksiinipitoisuus bakteriofagia kohden 10000,00 120,00% 100,00% D) saanto 1000,00 80,00% 100,00 60,00% 40,00% 10,00 20,00% 1,00 I II III IV 0,00% 1. ultrafiltraatio Pierce-pylväs 2. ultrafiltraatio Kuva 9. Koejärjestelyn 5 tiitterit, endotoksiinipitoisuudet, niiden suhde ja saannot eri puhdistustekniikoista. A) Koejärjestelyn aikana laskettiin kerättyjen näytteiden tiittereiden keskiarvot ja hajonnat. B) Työn eri vaiheissa kerätyistä näytteistä määritettiin eri vaiheiden endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja hajonnat. C) Tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien avulla määritettiin endotoksiinipitoisuus miljardia bakteriofagia kohden. D) Saanto saatiin laskemalla puhdistusmenetelmästä saatujen bakteriofagien kokonaismäärän suhde puhdistukseen laitettujen bakteriofagien kokonaismäärään ja laskemalla sen jälkeen suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat. Paneeleissa A, B, C vaakarivien numerot tarkoittavat puhdistuksen vaihetta: I tarkoittaa lysaattia, II ultrafiltroitua näytettä, III Pierce-pylväällä puhdistettua näytettä ja IV 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. 29

31 3.2 Qubit DNA-mittaustulos DNA-mittauksissa mitattiin bakteerin genomisen DNA:n määrää näytteissä. Lysaatin DNA-pitoisuus oli 4,72 μg/ml. Koejärjestelyssä 1 oktanolilla puhdistettujen näytteiden DNA-pitoisuuden keskiarvo oli 4,59 μg/ml ja keskihajonta 0,22. Sen jälkeen ultrafiltroitujen näytteiden DNA-pitoisuuden keskiarvo oli 1,39 μg/ml ja keskihajonta 0,47. Koejärjestelyssä 1 kromatografian ja 2. ultrafiltraation jälkeen mitatuissa DNA-pitoisuus oli alle havaintorajan. Kaikissa muissa koejärjestelyissä ensimmäisen ultrafiltraation jälkeen DNApitoisuus oli pudonnut alle havaintorajan. Koejärjestelyssä 2 tutkittiin myös ultrafiltraatiosuodattimen läpitullutta nestettä kahdesta eri näytteestä, kun lysaattia oli ultrafiltroitu kerran. Toisessa näytteessä oli 3,52 ja toisessa 3,84 μg/ml DNA:ta. Nämä tulokset indikoivat sitä, että ultrafiltraatio yksin on useimmiten tarpeeksi hyvä poistamaan irtonaisen DNA:n näytteistä mutta oktanoli voi vaikuttaa tähän heikentävästi. 3.3 SDS-PAGE SDS-PAGE-ajo suoritettiin sen takia, että nähtäisiin, mikä on näytteiden proteíinikoostumus. Raakalysaatin suodatuksen jälkeen lysaatissa näkyi vain kolme heikkoa juovaa, jotka olivat hieman alle 55 kda, hieman yli 70 kda ja n. 100 kda. Koejärjestelyssä 1 oktanoliuutto poisti n. 100 kda olevan juovan näytteestä, kun alle 55 kda ja yli 70 kda olevat juovat näkyivät edelleen heikosti. Ultrafiltraatio koejärjestelyssä 1 poisti molemmat juovat. Vastaavasti koejärjestelyissä 2 ja 5 ensimmäinen ultrafiltraatio riitti poistamaan sekä yli 70 kda ja n. 100 kda olevat juovat muttei kuitenkaan hieman alle 55 kda:n juovaa. SDS-PAGEgeelistä otetut kuvat on yhdistetty kuvaan 10. Tämä viittaa siihen, että n. 55 kda:n proteiini olisi bakteriofagiperäinen. 30

32 Kuva 10. SDS-PAGE-kuvat. Kaivoihin pipetoitiin 30 µl näytteitä, joissa oli 15 µl puhdistettuja näytteitä ja 15 µl 2x-näytepuskuria, jossa 0,2 M DTT. Geelinä oli Bio-Rad protean TGX-valmisgeeli. Näytteitä ajettiin 39 min 150 V. Kaivon yläpuolella olevissa tunnuksissa etumerkki kertoo, missä koejärjestelyssä näyte on puhdistettu ja sen jälkeen tuleva numero sitä, mistä puhdistusvaiheesta se on otettu. B on koejärjestelystä 1 ja numero II tarkoittaa oktanoliuutettua näytettä, III 1. kerran ultrafiltroitua näytettä, IV ioninvaihtokromatografiasta tullutta ja V 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. E on koejärjestelystä 2 ja II tarkoittaa ultrafiltroitua näytettä, IIIP Pierce-pylväällä puhdistettua näytettä ja IIIE EndoTrap-pylväällä puhdistettua näytettä. H on järjestelystä 3 ja III tarkoittaa ioninvaihtokromatografiasta tullutta ja IV 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. K on järjestelystä 4 ja VP tarkoittaa Pierce-pylväällä ja VE-EndoTrap-pylväällä puhdistettua näytettä. N on järjestelystä 5 ja II tarkoittaa 1. kerran ultrafiltroitua näytettä, III Pierce-pylväällä puhdistettua ja IV 2. kerran ultrafiltroitua näytettä. 31

33 4. Tulosten arviointi Näissä kokeissa saatuja lopullisia näytteitä arvioitaessa on tärkeää miettiä, onko endotoksiinien ja tiitterien suhde sellainen, että näytteissä riittää bakteriofageja endotoksiinipitoisuuden ollessa tarpeeksi pieni. Vastaavasti yksittäisiä tekniikoita arvioitaessa on pohdittava niiden käytännöllisyyttä, vaikutusta bakteriofagisaantoon ja endotoksiinipitoisuuteen sekä kuinka niillä onnistuu suurempien näytemäärien käsittely, mikäli potilaita olisi runsaasti. Koejärjestelyssä 1 aloitettiin lysaatin puhdistaminen oktanoliuutolla. Tämä pienensi tiitteriä vain hieman ja se olikin sen jälkeen edelleen yli 10^9 pfu/ml, kun lysaatin tiitteri oli n. 1,2^10 pfu/ml. Ultrafiltraation jälkeen tiitteri pysyi varsin samana ja siinä vaiheessa olikin järjestelyn paras saanto bakteriofagien suhteen. Mutta mitattaessa anioninvaihtokromatografiasta tulleita, yhdistettyjä fraktioita, oli tiitteri pienentynyt alle kymmenesosaan ensimmäisen ultrafiltraation jälkeisen näytteen tiitteristä. Todennäköisin syy tälle oli näytteen laimeneminen yhdistettyihin fraktioihin, koska tutkittaessa kokonaisbakteriofagimääriä, kromatografian saanto oli lähes yhtä hyvä, kuin oktanoliuutolla. Viimeinen ultrafiltraatio ei merkittävästi muuttanut näytteen tiitteriä vaan se pysyi n. 10^8 pfu/ml. Koejärjestelyssä 1 tutkittiin myös endotoksiinipitoisuuksia näytteissä. Lysaatissa oli aluksi n EU/ml. Sekä oktanoliuutto, että ensimmäinen ultrafiltraatio pienensivät endotoksiinipitoisuuksia näytteissä, kuten myöskin kromatografia. Kromatografian vaikutus johtui todennäköisesti jälleen osittain vain näytteen laimenemisesta. Ultrafiltraatio edelleen pudotti hieman endotoksiinipitoisuutta. Alussa lysaatissa endotoksiinien ja bakteriofagien määrän suhde olikin varsin korkea, n EU/10^9 pfu. Lopussa se oli keskimäärin enää vain 15 EU/10^9 pfu. Mikäli potilaalle annettaisiin enintään 5 EU/(h*kg), tarkoittaisi se sitä, että koejärjestelyssä 1 puhdistetusta näytteestä voitaisiin antaa n. 3,3*10^8 pfu potilaan painokiloa kohden tunnissa. Koejärjestelyssä 2 tiitteri tippui vain hieman ultrafiltraatiossa. EndoTrappylväällä puhdistettaessa tiitteri oli melkein sama, jolloin saantokin oli erinomainen. Piercepylvään kanssa tilanne ei kuitenkaan ollut näin vaan saanto oli lähellä nollaa tiitterin pienennyttyä melkein sadasosaan ultrafiltroituun näytteeseen verrattaessa. Ultrafiltraatio ja Pierce-pylväs molemmat pienensivät näytteiden LPS-pitoisuuksia. Kuitenkin EndoTrap- 32

34 pylväällä keskimääräinen tulos oli erittäin pieni, vain 0,221 EU/ml. Ottaen huomioon muutokset tiittereissä, EndoTrap-pylväällä puhdistetuissa näytteissä oli vain 0,0574 EU/10^9 pfu, kun Pierce-pylväällä se oli EU/10^9 pfu eli noin kymmenen kertaa enemmän kuin lysaatissa. EndoTrap-puhdistetussa näytteessä voitaisiinkin mahdolliselle potilaalle antaa n. 8,7*10^10 pfu/(kg*h). Pierce-pylväässä se olisi vain n.1,48*10^5 pfu/(kg*h). Verrattaessa muissa tutkimuksissa EndoTrap-pylväällä saatuihin LPS:n pienenemistuloksiin, on hyvä pitää mielessä, että niissä ei ole välttämättä käytetty ihan samaa pylvästä. Esim. Merabishvili et al. (2009) käyttivät EndoTrap Blue-pylvästä, joka valmistajan tietojen mukaan on aikaisempi versio nyt käytetystä pylväästä (Hyglos, 2018b). Täten pylväällä saatuja tuloksia verrattaessa on muistettava kriittisyys. Koejärjestelyssä 3 tiitteri laski hieman ultrafiltraatiossa sekä kromatografiassa. Kuten järjestelyssä yksi, osa tiitterin laskusta kromatografiassa on selitettävissä näytteen laimentumisella. Kuitenkin ensimmäisen ja toisen ultrafiltraation jälkeen tiitterit ovat varsin lähellä toisiaan eli hieman yli 10^9 pfu/ml. Saanto toisen ultrafiltraation jälkeen olikin erinomainen. Vastaavasti endotoksiinipitoisuudet laskivat jokaisen vaiheen aikana, vaikkakin toisen ultrafiltraation jälkeen hieman vähemmän kuin ultrafiltraatiossa yksi. Lopuksi näytteissä oli keskimäärin vain 85,1 EU/ml. Lopullisissa näytteissä olikin enää vain 57,1 EU/10^9 pfu, mikä tarkoittaa, että potilaille voitaisiin antaa näin puhdistetuista bakteriofaginäytteistä n. 8,76*10^7 pfu/(kg*h). Koejärjestelyssä 4 näytteiden tiitterit toisen ultrafiltraation jälkeen olivatkin keskimäärin 2,31*10^9 pfu/ml, joka on varsin lähellä samalla lailla puhdistettuja näytteitä järjestelyssä kolme. Kuten järjestelyssä kaksi, tiitteri pieneni varsin vähän EndoTrap-pylväällä puhdistettaessa mutta erittäin paljon, kun kyseessä oli Pierce-pylväs. Tämä siitä huolimatta, vaikka huomioitaisiin, että näytteitä oli laimennettu 1:4 ennen Pierce-pylvääseen lisäämistä. Siinä missä saanto kromatografian ja toisen ultrafiltraation sekä EndoTrap-pylvään jälkeen oli lähellä 100%, saanto Pierce-pylvään jälkeen oli olematon. LPS-pitoisuudet olivat puhdistuksien jälkeen n. 0,1 EU/ml molempien pylväiden jäljiltä. Kuitenkin, johtuen taas tiitterin putoamisesta Pierce-pylvästä käytettäessä, kun EndoTrap-pylväällä puhdistetuissa näytteissä oli keskimäärin vain 0,0839 EU/10^9 pfu, Pierce-pylväällä vastaava luku oli 5480 EU/10^9 pfu. Nämä tarkoittavat, että tässä koejärjestelyssä EndoTrap-pylväillä puhdistetuista näytteistä voitaisiin antaa n. 5,96*10^10 pfu/(kg*h) mahdollisille potilaille mutta Piercepylväällä puhdistetuista vain n. 9,12*10^5 pfu/(kg*h). 33

35 Kuten koejärjestelyissä 2 ja 4 huomattiin, niin puhdistettaessa bakteriofaginäytettä Pierce-pylväällä, läpitulleen näytteen tiitteri pieneni huomattavasti. Tätä varten varsinaisen näytteen jälkeen Pierce-pylvästä pestiin lisää 2 ml:lla SM-puskuria. Titrattaessa paljastui pesuvedessä olevan ainakin 10^6 pfu/ml pisaratitrauksen perusteella. Kun toisen näytteen puhdistuksen jälkeen pylvästä pestiin koeluontoisesti 2 m:lla liuosta, jossa oli 1,6 ml SM-puskuria ja 400 µl 2 M NaCl, pesuvedessä osoittautui pisaratitrauksen perusteella olevan ainakin 10^8 pfu/ml. Tätä varten muodostettiin koejärjestely 5, jotta saataisiin tietää, paljonko bakteriofagia kyettäisiin puhdistamaan tällä pylväällä, kun puskurin suolapitoisuutta on korotettu. Koejärjestelyssä 5 tiitteri oli muuttunut varsin vähän viimeisenkin ultrafiltraation jälkeen. Viimeinen ultrafiltraatio oli lisätty järjestelyyn sen takia, ettei näytteissä olisi ollut liikaa suolaa, mikä olisi lyhentänyt bakteriofagien infektiivisyysaikaa. Lisäksi, kun saanto ensimmäisen ultrafiltraation jälkeen oli vain 40%, Pierce-pylvään sekä toisen ultrafiltraation jälkeen se oli molemmissa yli 60%. LPS-pitoisuudet taas pienenivät tasaisesti jokaisen puhdistuksen jälkeen. Kun järjestelyä viisi verrataan tilanteeseen kaksi, tiitterit pysyvät huomattavasti korkeampina Pierce-pylväällä puhdistamisen jälkeen. Koejärjestelyssä 2 Piercepylvään jälkeen LPS ja tiitterisuhde olikin EU/10^9 pfu, kun järjestelyssä viisi se oli keskimäärin vain 71,21 EU/10^9 pfu. Todennäköisesti tämä tarkoittaa sitä, että pylväs sitoo fho-eco02 bakteriofageja ja tarvitaan korkeampi suolapitoisuus irrottamaan ne siitä. Tällä tavoin puhdistetusta näytteestä voikin antaa mahdollisille potilaille jopa 7,02*10^7 pfu/(kg*h). Endotoksiinipitoisuutta arvioitaessa on hyvä pitää mielessä, että endotoksiiniyksikkö määreenä ei kerro yksiselitteisesti ja universaalisti LPS-molekyylien määrästä, kuten gramma tai mooli. Nyt käytetty EndoLISA-metodi kertoo pakkauksessaan perustuvansa siihen, että bakteriofageista eristetyt ja fluoresenssimittauslevylle kiinnitetyt reseptorit sitovat LPS-molekyylejä, jotka edelleen aktivoivat rekombinanttitekijä C:n. Tämä proteaasi taas aktivoituna pilkkoo kromogeenistä substraattia synnyttäen valoa. Näiden tietojen perusteella voidaan sanoa, että kahdesta eri bakteriofagikannasta tai -lajista saadut näytteet, joissa olisi samat kappalemäärät rakenteellisesti erilaisia endotoksiineja, voivat antaa erilaiset tulokset. Tämä syntyy esim. siitä, että levyn LPS:ää sitova proteiini vuorovaikuttaa rakenteellisesti erilaisiin endotoksiineihin eri lailla. Näin voi olla esim. mittauksissa käytettyjen standardien ja varsinaisten näytteiden kanssa, koska standardit tulivat valmistajalta. Ja vaikka nekin oli eristetty E. coli-bakteereista, ei ole mitään varmuutta, että ne olisivat keskenään kemiallisesti samanlaisia. Kuitenkaan tässä työssä niillä ei ole väliä, koska isäntänä (ja siten 34

36 endotoksiinien lähteenä) näytteissä käytettiin vain yhtä bakteerikantaa, jolloin eri näytteiden LPS-pitoisuudet ovat keskenään verrannollisia, vaikka eivät ne olisikaan täysin verrannollisia standardeihin. Lisäksi kitin käyttöohjeissa mainittiin, että näytteissä voi mahdollisesti olla LPS:n sitoutumista haittaavia komponentteja. Tässä tilanteessa niiden lähde olisi voinut olla joko bakteriofagien tuottamiseen käytetyt kemikaalit, bakteerit tai jopa bakteriofagit itse. Tätä varten valmistettiin näytteistä laimennokset, joihin lisättiin endotoksiinistandardia sen verran, että niissä olisi pitänyt näkyä 5 EU/ml lisäys. Kun laimennetuista näytteistä mitattiin endotoksiinipitoisuudet, niissä oli 0,289 ja 0,103 EU/ml. Vastaavissa Spike-näytteissä taas oli 7,205 ja 5,799 EU/ml. Tämä tarkoittaa, että ainakaan näin puhdistetuissa näytteissä ei ole LPSmolekyleejä sitovia yhdisteitä. Vastaavasti laimennetussa lysaatissa oli 44,447 EU/ml, kun taas sen spike-näytteessä fluoresenssit olivat vain hieman standardien yläpuolella. Lineaarisella regressiolla lasketun standardikuvaajan yläraja oli 48,078 EU/ml. Tästä voidaan arvioida, että koska lysaatissa, niin todennäköisesti muissakaan vaiheissa ei ollut sellaisia yhdisteitä vapaana, jotka olisivat sitoneet LPS-molekyylejä. Koejärjestelyistä 2-4 näkyi, että ultrafiltraatio on myös tehokas poistamaan DNA:ta lysaatista. DNA-pitoisuus pieneni lysaatin arvosta alle havaintorajan. Ultrafiltraatiosuodattimen läpitulleesta nesteestä näkyi, että suurin osa siitä meni läpi ensimmäisellä pesulla. Kiinnostavaa kyllä, oktanolilla puhdistetuista näytteistä ei DNApoistunut ensimmäisessä ultrafiltraatiossa vaan vasta ioninvaihtokromatografiassa. Tällöin oktanolilla saattaa olla jokin vuorovaikutus suodattimen materiaalin kanssa. Bakteriofagilysaatti, jota näissä töissä käytettiin, oli suodatettu ensiksi 0,2 µm:n suodattimella. Ilman tätä SDS-PAGE-kuvissa olisi lysaatissa (ja muissa puhdistusvaiheissa) näkynyt enemmän proteiineja. Kaksi juovaa poistui heti ultrafiltraatioiden jälkeen. Kolmas juovista, joka oli hieman alle 55 kda, pysyi näytteissä ultrafiltraation jälkeenkin. Tämä herättää epäilyksen siitä, että se olisi bakteriofagiperäinen proteiini, koska sen pitäisi alle 100 kda:n painoisena mennä suoraan ultrafiltraatiosuodattimen läpi. Se vapautui näytteisiin todennäköisesti, kun näytteitä keitettiin näytepuskurin kanssa SDS-PAGE-ajoa varten. Potentiaalisia kandidaatteja ovat esim. yleinen kapsidiproteiini (major capsid protein, laskennallinen molekyylipaino noin 56 kda), lyhyt hännän kuituproteiini (short tail fiber protein, n. 55 kda) tai viruksen pään ulkoinen kapsidiproteiini (head outer capsid protein, n. 41 kda) (Kiljunen et al. 2018). Voidaan myös pohtia, kuinka kuvaa voitaisiin parantaa. 35

37 Näytteiden konsentroinnilla saataisiin paremmin näkyviin bakteriofagit ja ne proteiinit, joita näytteissä oli vähemmän. Lisäksi hopeavärjäämällä geeli ennen kuvaamista voitaisiin parantaa proteiinien ja LPS:n näkyvyyttä geelissä. Arvioitaessa eri koejärjestelyiden paremmuutta yksi kriteeri puhdistetuissa näytteissä oli mahdollisimman suuri tiitteri mutta mahdollisimman pieni endotoksiinipitoisuus. Koejärjestelyiden 2 ja 4 Pierce-pylväällä puhdistetut näytteet eivät täytä tätä kriteeriä, koska niissä LPS-bakteriofagi-suhde oli jopa suurempi, kuin lysaatissa. Koejärjestelyssä 5 suhde oli saatu jo huomattavasti pienemmäksi. Järjestelyissä kolme ja yksi suhde oli pienentynyt mutta se oli edelleen yli 10 EU/10^9 pfu. Koejärjestelyissä 2 ja 4, EndoTrap-pylväällä puhdistetuissa näytteissä suhde oli kaikkein pienin, alle 0,1. Niistä koejärjestelyssä 2 puhdistetussa näytteessä suhde oli pienempi. Kun arvioidaan koejärjestelyitä ainoastaan sillä perusteella, kuinka paljon bakteriofageja ne ovat kyenneet säilyttämään, endotoksiineja poistamaan ja kuinka paljon puhdistettuja näytteitä voidaan antaa potilaille, näytteen puhdistamiseen kannattaa käyttää ultrafiltraatiota yhdistettynä EndoTrap-pylvääseen. On hyvä myös arvioida yksittäisten tekniikoiden vaikutusta endotoksiinipitoisuuteen, tiitteriin ja bakteriofagisaantoon. Ultrafiltraatio vaikutti tiittereihin eniten silloin, kun puhdistamatonta lysaattia ultrafiltroitiin ja silloinkin vaikutus oli varsin pieni. Kun ultrafiltraatioiden läpitulleista nesteistä tutkittiin bakteriofageja useasta eri näytteestä, pahimmillaankin siinä on näkynyt vain 1000 pfu/ml. Tämäkin on ollut vain yksittäisessä näytteessä. Muuten näytteiden läpitulleessa nesteessä ei ole näkynyt bakteriofageja. Todennäköisesti tiitterien pieneneminen ultrafiltraatiossa onkin perustunut muutamien bakteriofagien jäämiseen suodattimeen tai niiden vuotamiseen läpitulleeseen nesteeseen. Puhdistettujen näytteiden lisäksi endotoksiinipitoisuus tutkittiin ultrafiltraatiopylvään läpi tulleesta nesteestä, kun näytteitä ultrafiltroitiin lysaatista. Endotoksiinipitoisuus toisessa näytteen läpitulleessa nesteessä oli vain n. 2,1- ja toisessa 3,5 EU/ml. Lysaatissa oli yli EU/ml, kun toisessa ultrafiltroidussa näytteessä oli enää vain n EU/ml ja toisessa n EU/ml. Läpitullut näyte ei ole voinut laimentua, koska se otettiin heti ultrafiltraation jälkeen talteen. Tämä tarkoittaa, että kyseisen ultrafiltraatiopylvään tehokkuus perustuu todennäköisesti LPS:n sitomiseen suodattimessa. Endotoksiinin poistokyky ei kuitenkaan ole erityisen hyvä verrattuna muihin metodeihin. Endotoksiinipitoisuuden suhde tiittereihin putosi ultrafiltraatioissa yleensä varsin vähän. 36

38 Ultrafiltraatioita voidaan mahdollisesti myös optimoida. Hashemi et al. (2013) kuvailivat tavan, jossa he saivat pelkällä yhdellä 1 % DOC-käsittelyllä ja ultrafiltraatiolla lysaatin LPS-pfu-suhteen putoamaan n EU/(10^9) pfu-arvosta arvoon 12,5 EU/(10^9) pfu ja kolmen käsittelyn jälkeen suhde oli enää 0,00166 EU/(10^9) pfu. He käyttivät geneettisesti muunneltua T7-bakteriofagia, jonka isäntänä oli E. coli-bakteeri. Nyt tehdyissä kokeissa, kun lysaatissa suhde oli n EU/ (10^9) pfu, oli se pelkkien lysaatin ultrafiltraatioiden jälkeen keskimäärin n EU/(10^9) pfu koejärjestelyiden 2-4 perusteella. Heidän koejärjestelyssään LPS-PFU-suhde oli kerran DOC-käsitellyssä ja ultrafiltroidussa näytteessä yli 99 % pienempi kuin lysaatissa. Nyt saaduissa tuloksissa järjestelyiden 2-4 ensimmäisen ultrafiltraation perusteella vastaava luku oli vain 70,9 %. Heillä lisäksi suodatin oli samankokoinen kuin nyt eli 100 kda. Tulevaisuudessa on hyvä pohtia sitäkin mahdollisuutta, että bakteriofagien DOC-herkkyyttä analysoitaisiin yleisemmällä tasolla, jotta selviäisi, olisiko DOC-käsittelyllä ja ultrafiltraatiolla yksin mahdollista puhdistaa bakteriofageja kliiniseen käyttöön. Esim. heidän kolme kertaa puhdistettujen näytteidensä EUpfu-suhde oli jopa pienempi, kuin nyt EndoTrap-pylväällä puhdistetuissa näytteissä. Mahdollisten DOC-jäämien terveysvaikutuksia pitää kuitenkin pohtia. DOC on sappisuola ja sen 1 % laimennoksen käyttöä ihonalaisesti ruiskeina rasvan poistamiseen on tutkittu. Tällöin haittavaikutuksia ovat olleet lievä polttelu, ihon punoitus, lievä turvotus, arkuus ja yksittäisessä tapauksessa veren vuoto ihon alle. Kaikki oireet katosivat viikoissa (Rotunda et al., 2005). DOC on selvästi poistettava näytteistä esim. ylimääräisellä ultrafiltraatiolla veden kanssa. Silloin saadut näytteet saattaisivat olla kelvollisia ainakin topikaalisesti ja oraalisesti annettuina. Kuitenkin olisi arvioitava erityisen tarkasti, millaisia vaikutuksia pienillä DOC-määrillä olisi suoraan suoneen ruiskutetuissa bakteriofaginäytteissä. Oktanoliuutto pienensi tiitteriä vain hieman ja saanto olikin n. 16 %. Endotoksiinipitoisuus pieneni samaan aikaan noin kymmenekseen, kuten myös niiden suhde. Kuitenkin nyt saadut suhteet ovat kaukana Szermer-Olearnikin ja Boratyńskin (2015) saamista arvoista. He olivat käyttäneet töissä useaa eri bakteriofagia ja isäntäbakteeria. Vertaan nyt saatuja tuloksia niihin, joissa he olivat käyttäneet isäntäsoluna E. coli-bakteeria ja T4- bakteriofagia, koska fho-eco02-bakteriofagi on T4-sukuinen ja molemmissa tilanteissa LPS:n rakenteen pitäisi olla isäntäsolujen takia varsin samanlaista. He olivat tutkineet endotoksiinipitoisuuden ja tiitterin suhdetta useassa eri koejärjestelyssä, joissa useimmissa oli lisätty magnesiumkloridia näytteiden joukkoon tarkoituksena tutkia sen vaikutusta 37

39 puhdistumiseen. Vertailun vuoksi siinä järjestelyssä, missä ei oltu nyt tehtyjen kokeiden tapaan lisätty magnesiumkloridia ennen oktanoliuuttoa, oli endotoksiinipitoisuuden ja tiitterin suhde ennen uuttoa 310 EU/10^9 pfu ja kokeen jälkeen 0,7 EU/10^9 pfu. Nyt tehdyissä koejärjestelyissä suhde putosi vain kymmenesosaan. Syy parempaan tulokseen on todennäköisesti se, että he dialysoivat oktanoliuuton jälkeen saadun vesifaasin ensiksi 25 % etanolissa ja sen jälkeen 0,15 M NaCl. Tulevaisuutta varten on hyvä pohtia, kannattaako se lisätä puhdistusvaiheiden joukkoon, jos sillä saadaan näin paljon parempia tuloksia. Se kuitenkin lisäisi työn monimutkaisuutta eivätkä kaikki bakteriofagit eivät välttämättä kestäisi niin korkeata etanolipitoisuutta. Lisäksi oktanolista voi jäädä jäänteitä puhdistettuun bakteriofagilysaattiin, joka on otettava huomioon, mikäli oktanolia käytetään kliiniseen käyttöön tarkoitettujen bakteriofagituotteiden valmistamiseen. Oktanolia on kuitenkin käytetty puhdistamaan sellaisia bakteriofageja, joita on käytetty potilashoitoon antamalla niitä suoraan potilaan kehon onteloihin (Schooley et al., 2017). Lisäksi oktanolin käytön puolesta puhuu se, että aine itsessään on etanolia vaarattomampi ja se muuttuu elimistössä nopeasti oktaanihapoksi, jota itsessään voidaan käyttää oraalisesti jopa satoja milligrammoja painokiloa kohden turvallisesti. Oktanolia onkin kokeiltu useilla ihmisillä essentiaalisen vapinan hoidossa (Nahab et al., 2011). Oktanolia puhdistuksessa ei todennäköisesti tarvitse hylätä täysin, vaikka sillä saatu endotoksiini-bakteriofagisuhteen putoaminen näissä töissä ei ollutkaan paras mahdollinen. Anioninvaihtokromatografia pienensi tiittereitä mutta se johtui mitä todennäköisimmin näytteiden laimenemisesta fraktioissa. On todettu jo, että ultrafiltraatio harvoin vaikuttaa negatiivisesti bakteriofagien kokonaismäärään näytteissä. Ioninvaihtokromatografioiden jälkeisissä tiittereissä näkyy, kuinka molemmilla kerroilla tiitteri on pienentynyt kymmenesosaan, kun toisen ultrafiltraation tulosta on verrattu ensimmäiseen ultrafiltraatioon. Kuitenkin vaikutus endotoksiinipitoisuuteen on niin paljon suurempi, että endotoksiinipitoisuuden ja tiitterin suhdekin putoaa n. kymmenesosaan, kuten oktanoliuutossakin. EndoTrap-pylväässä saannot olivat erinomaisia ja tiittereissä näkyi vain pieni pudotus. Vastaavasti vaikutus endotoksiinipitoisuuteen oli massiivinen ja endotoksiinipitoisuuden ja tiitterin suhde putosikin tällä pylväällä koejärjestelyssä 1 noin sadastuhannesosaan ja järjestelyssä 4 noin tuhannesosaan. Ero johtuu siitä, että koejärjestelyssä 4 näytteitä oli puhdistettu jo valmiiksi enemmän. On hyvä myös huomioida, että alkuperäiseen 38

40 tilavuuteen palautettuna tiitterit ja endotoksiinipitoisuudet olisivat olleet hieman korkeampia. Näytteitä siirretiin pylväisiin 749,5 µl ja näytteiden lopputilavuudet olivat alle 1,4 ml. Kuitenkin koska nyt laskettiin niiden suhdetta, ei laimentumisella ole niin suurta merkitystä. EndoTrap-pylväässä voi on kuitenkin ominaisuus, joka täytyy huomioida. Samaa pylvästä käytettiin kaikissa koejärjestelyissä. Näytteiden ja regeneraatiopuskurin lisäämisen jälkeen otetuista näytteistä arvioitiin pisaramenetelmällä tiitterit. Näytteissä oli poikkeuksetta vähintään 10^6 pfu/ml. Tämä tarkoittaa, että pylvääseen jää varsin runsaasti bakteriofageja, eikä regeneraatio poista niitä kokonaan. Nämä ylimääräiset bakteriofagit näkyivät todennäköisesti myös reilusti yli 100 % saantona kuvan 6 paneelissa D. Vaikkei mittausvirhettä voikaan poissulkea, on se epätodennäköinen. Tämä johtuu siitä, että kaikkien kolmen EndoTrap-pylväällä puhdistetun näytteen tiitterit koejärjestelyssä 2 olivat melkein yhtä suuria tai suurempia kuin ultrafiltroitujen näytteiden tiitterit, huolimatta laimentumisesta. Koejärjestelyssä viisi tiitterin nouseminen ja yli 100 % bakteriofagisaanto nähtiin vain yhdessä näytteessä mutta se oli tarpeeksi aiheuttamaan saannon keskiarvon nousun koko triplikaattijoukossa. Ongelma ei ole kuitenkaan suuri, koska tiitterit puhdistetuissa näytteissä ovat hyvät, niissä ei ole endotoksiineja kuin vähän ja niissä on samaa bakteriofagilajia. Kuitenkin, samaa pylvästä voidaan käyttää aina vain yhdelle bakteriofagille. Pierce-pylväällä tilanne ei ollut niin hyvä ensimmäisillä kerroilla. Saanto oli olematon, vaikka endotoksiinipitoisuudet laskivatkin. Endotoksiinipitoisuuden suhde tiitteriin puhdistetuissa näytteissä olikin jopa suurempi, kuin lysaatissa. Vasta korkeampi suolapitoisuus näytteessä muutti tilanteen ja sillä puhdistetuissa näytteissä endotoksiinipitoisuuden suhde tiitteriin oli tippunut n. sadasosaan siitä, mitä lysaatissa oli, jolloin se oli jopa parempi kuin anioninvaihtokromatografia tai oktanoliuutto. Koejärjestelyissä 2 ja 4 käytettiin näytteiden kanssa samaa pylvästä. Yhden näytteen jälkeen pylvästä säilytettiin yön yli 8 ml:ssa 0,2 M NaOH. Seuraavana päivänä NaOH:sta tutkittiin bakteriofagipitoisuus, joka oli nolla. Täten Pierce-pylvääseen ei jää bakteriofageja, kuten EndoTrap-pylvääseen. Kun pohditaan pelkkää vaikutusta tiitteriin ja endotoksiinipitoisuuteen, EndoTrap-pylväs on paras ja sen jälkeen tulee Pierce-pylväs, kunhan Pierce-pylvään kanssa käytetään korkeampaa suolapitoisuutta. Mikäli näytteitä aletaan valmistamaan suuremmalle joukolle potilaita, on myös mietittävä nyt käytettyjen tekniikoiden skaalautumista suuremmille näytemäärille. Ultrafiltraatiopylväitä myydään monessa eri koossa, joten ultrafiltraatio työvaiheena ei 39

41 muodosta estettä käsiteltävien tilavuuksien nostamiselle, vaikka pylväät ovatkin kertakäyttötavaraa. Mahdollisuus skaalautumiseen pätee myös Pierce- ja EndoTrap-pylväisiin, joissa LPS-molekyylejä sitovia matriiseja myydään itsenäisesti isommissa erissä. Niistä voi täten valita itselleen sopivia määriä. EndoTrap-pylvästä voi kuitenkin käyttää vain yhdelle bakteriofagilajille kerrallaan, jolloin erilaisia pylväitä tarvitaan runsaasti. Pierce-pylväästä taas bakteriofagit voi puhdistaa etanolilla ja natriumhydroksidilla, jolloin sitä voi käyttää usealle eri bakteriofagille. Oktanoliuutossakaan skaalautuminen ei ole ongelma, koska oktanolia on helppo lisätä vastaamaan noussutta näytteen määrää. Oktanolia on myös helppo hankkia lisää, vaikka se onkin valitettavasti kertakäyttöistä. Näytteiden määrää on myös helppo lisätä ioninvaihtokromatografiassa, jossa näytteen määrän lisääntyminen voidaan ratkaista käyttämällä suuremman tilavuuden pylvästä ja pylväät ovat regeneroitavissa. Eli skaalautumisen suhteen yksi tekniikka ei nouse yli muiden. Nopeuden ja helppouden suhteen taas eri tekniikoiden ja järjestelyiden välillä on suuri ero. Siinä missä ultrafiltraatio voidaan tehdä muutamassa tunnissa alusta loppuun, anioninvaihtokromatografia vie useita päiviä, koska siinä vaaditaan monenlaisia liuoksia ja saadut fraktiot on ensiksi titrattava ja analysoitava ennen yhdistämistä. Oktanoliuutolla ja EndoTrap- ja Pierce-pylväillä näyte pystyttiin puhdistamaan päivässä ilman suurta määrää erilaisia reagensseja. Käytetyistä koejärjestelyistä paras olisi täten järjestely 2 ja huonoin järjestely 4, mikäli ainoana kriteerinä olisi näytteen puhdistusnopeus ja helppous. Kun otetaan huomioon nopeus, mahdollisuus näytemäärien lisäämiseen ja endotoksiinien määrä bakteriofagia kohden, paras tapa puhdistaa nyt töissä käytetyt bakteriofagit LPS-molekyyleistä on koejärjestely 2, jonka jälkeen tulee koejärjestely 5. Näytteissä oli vähän endotoksiineita bakteriofagia kohden, puhdistus oli nopeaa, mahdollisuus skaalautumiseen on hyvä ja erilaisia kemikaaleja ei tarvita niin paljon. 40

42 5. Yhteenveto Antibiooteille resistenttien bakteereiden levitessä on pohdittava muita keinoja niitä vastaan taistelemiseksi. Bakteriofagiterapialla on potentiaalia resistenttien bakteeriinfektioiden hoidossa. Ennen kuin tätä terapiaa voidaan hyödyntää, on tekniikka bakteriofagituotteiden tuottamiseksi optimoitava ennen laaja-alaisempaa käyttöä. Tässä tutkielmassa tutkittiin eri tapoja erään bakteriofagin puhdistamiseksi endotoksiineista. Lopputulokseksi saatiin, että parhaiten se tapahtuu käyttämällä yksinkertaista ultrafiltraatiota yhdistettynä kaupalliseen pylvääseen. Kuitenkaan tämä tulos ei välttämättä ole sovellettavissa kaikille bakteriofageille, koska monimuotoisuus bakteriofagien ja LPS:n joukossa on erittäin suurta. Tämä on pidettävä mielessä, kun nyt saatuja tutkimustuloksia aletaan soveltamaan muihin bakteriofageihin. Voikin olla, että esim. toisten bakteerilajien LPS ei sitoudukaan EndoTrap-pylvääseen niin voimakkaasti tai vastaavasti LPS ei jääkään ultrafiltraatiopylvääseen, jolloin saatetaan tarvita lisää puhdistustoimenpiteitä. Kuitenkin nyt saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä näytteiden ultrafiltroimisen ja EndoTrappylväällä puhdistamisen olevan paras tapa aloittaa puhdistettujen bakteriofaginäytteiden tuottaminen. Ja vaikkei se osoittautuisikaan sopivaksi, tämä tutkielma tarjoaa muitakin keinoja lipopolysakkaridien poistamiseen bakteriofaginäytteistä. 6. Kiitokset Suuret kiitokset Saija Kiljuselle, jonka ohjaus ja neuvot työn aikana olivat ensiarvoisen tärkeitä. Kiitokset myös toiselle ohjaajalleni Sarah Buthcherille sekä Mikael Skurnikille, jonka ryhmässä sain työskennellä. 41

43 7. Lähteet Adriaenssens E. M., Lehman S. M., Vandersteegen K., Vandenheuvel D., Philippe D. L., Cornelissen A., Clokie M. R. J., Garría A. J., De Proft M., Maes M., Lavigne R. (2012). CIM monolithic anion-exchange chromatography as a useful alternative to CsCl gradient purification of bacteriophage particles. Virology 434, Boratyński J., Syper D., Weber-Dąbrowska B., Łusiak-Szelachowska M., Poźniak G., Górski A. (2004). Preparation of endotoxin-free bacteriophages. Cell Mol Biol Lett 9, Bourdin G., Schmitt B., Guy L. M., Germond J., Zuber S., Michot L., Reuteler G., Brüssow H. (2014). Amplification and purification of T4-like Escherichia coli Phages for phage therapy: From laboratory to pilot scale. Appl Environ Microbiol 80, Bruttin A. & Brüssow H. (2005). Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally: A safety test of phage therapy. Antimicrob Agents Ch 49, Chen R. H., Huang C., Newton B. S., Ritter G., Old L. J., Batt C. A. (2009). Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography. Protein Expres Purif 64, Cooper C. J., Denyer S. P., Maillard J. -. (2013). Stability and purity of a bacteriophage cocktail preparation for nebulizer delivery. Lett Appl Microbiol 58, Erridge C., Bennet-Guerrero E., Poxton I. R. (2002). Structure and function of lipopolysaccharides. Microbes Infect 4, Gill J. J. & Hyman P. (2010). Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy. Curr Pharm Biotechno 11, Guang-Han O., Leang-Chung C., Vellasamy K. M., Mariappan V., Li-Yen C., Vadivelu J. (2016). Experimental phage therapy for Burkholderia pseudomallei Infection. Plos One 11, e

44 Hankin M. E. (1896). L action bactericide des eaux de la jumna et du gange sur le vibrion du cholera. Ann De l Inst Pasteur 10, (Englanninkielinen käännös: (2011). The bactericidal action of the waters of the Jamuna and Ganges rivers on Cholera microbes. Bacteriophage, 1, ) Hashemi H., Pouyanfard S., Bandehpour M., Mahmoudi M., Bernasconi M., Kazemi B., Mokhtari-Azad T. (2013). Efficient endotoxin removal from T7 phage preparations by a mild detergent treatment followed by ultrafiltration. Acta Virol 57, Hyglos. (2018a). EndoTrap HD - High-Definition Endotoxin Removal. Katsottu 27/4/2018. Hyglos. (2018b). EndoTrap Frequently Asked Questions (FAQ). Katsottu 28/4/2018 Hyman P. & Abedon S. T. (2010). Bacteriophage host range and bacterial resistance. Adv Appl Microbiol 70, Kauppalehti. (2018). Valuutta: Puola zloty. =12. Katsottu 26/04/2018. Kiljunen S., Wicklund A., Skurnik M. (Painossa). Complete genome sequences of two Escherichia phages isolated from wastewater in Finland. Genome Announc. Kiljunen S., Wicklund A., Skurnik M. (2018). Escherichia phage vb_ecom-fhoeco02, complete genome. Ncbi 2018, Katsottu 8/5/2018 Kutter E., De Vos D., Gvasalia G., Alavidze Z., Gogokhia L., Kuhl S., Abedon S. T. (2010). Phage therapy in clinical practice: Treatment of human infections. Curr Pharm Biotechno 11,

45 Magãlhaes P. O., Lopes A. M., Mazzola P. G., Rangel-Yagui C., Penna T. C. V., Pessoa Jr A. (2007). Methods of endotoxin removal from biological preparations: A review. J Pharm Sci 10, Merabishvili M., Pirnay J.-P., Verbeken C., N., Tediashvili M., Laskhi N., Glonti T., Krylov V., Lavigne R., Volckaert G.& other authors. (2009). Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. Plos One 4, e4944. Międzybrodzki R., Fortuna W., Weber-Dąbrowska B., Górski A. (2007). Phage therapy of staphylococcal infections (including MRSA) may be less expensive than antibiotic treatment. Postepy Hig Med Dosw 61, Międzybrodzki R., Fortuna W., Weber-Dąbrowska B., Górski A. (2009). A retrospective analysis of changes in inflammatory markers in patients treated with bacterial viruses Clin Exp Med 9, Nahab F. B., Wittevrongel L., ippolito D., Toro C., Grimes G. J., Starling J., Potti G., Haubenberger D., Bowen D.& other authors. (2011). An open-label, single-dose, crossover study of the pharmacokinetics and metabolism of two oral formulations of 1-octanol in patients with essential tremor. Neurotherapeutics 8, Ohno N. & Morrison D. C. (1989). Lipopolysaccharide interaction with lysozyme. J Biol Chem 264, Petsch D. & Anspach F. B. (2000). Endotoxin removal from protein solutions J Biotechnol 76, Pirnay J.-P., Verbeken G., Ceyssens P.-J., Huys I., De Vos D., Ameloot C., Fauconnier A. (2018). The magistral phage. Viruses 10. Pirnay J.-P., De Vos D., Cochez C., Bilocq F., Pirson J., Struelens M., Duinslaeger L., Cornelis P., Zizi M., Vanderkelen A. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: Persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol 41,

46 Pirnay J.-P., Blasdel B. G., Bretaudeau L., Buckling A., Chanishvili N., Clark J. R., Corte- Real S., Debarbieux L., Dublanchet A.& other authors. (2015). Quality and safety requirements for sustainable phage therapy products. Pharm Res 32, Rohwer F. & Edwards R. (2002). The phage proteomic tree: A genome-based taxonomy for phage. J Bacteriol 184, Rose T., Verbeken G., De Vos D., Merabishvili M., Vaneechoutte M., Lavigne R., Jennes S., Zizi M., Pirnay J.-P. (2014). Experimental phage therapy of burn wound infection: Difficult first steps. Int J Burn Trauma 4, Rotunda, A.M., Ablon, G., Kolodney, M.S. (2005). Lipomas treated with subcutaneous deoxycholate injections. J Am Acad Dermatol 53, Schooley R. T., Biswas B., Gill J. J., Hernandez-Morales A., Lancaster J., Lessor L., Barr J. J., Reed S. L., Rohwer F.& other authors. (2017). Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii Infection. Antimicrob Agents Ch 61, e Smrekar F., Ciringer M., Štrancar A., Podgornik A. (2011a). Characterisation of methacrylate monoliths for bacteriophage purification. J Chromatogr A 1218, Smrekar F., Ciringer M., Jančar J., Raspor P., Štrancar A., Podgornik A. (2011b). Optimization of lytic phage manufacturing in bioreactor using monolithic supports. J Sep Sci 34, Szermer-Olearnik B. & Boratyński J. (2015). Removal of endotoxins from bacteriophage preparations by extraction with organic solvents. Plos One 10, e Van Belleghem J. D., Merabishvili M., Vergauwen B., Lavigne R., Vaneechoutte M. (2017). A comparative study of different strategies for removal of endotoxins from bacteriophage preparations. J Microbiol Meth 132, van Deventer S. J. H., Buller H. R., Ten Cate J. W., Aarden L. A., Hack C. E., Sturk A. (1990). Experimental endotoxemia in humans: Analysis of cytokine release and coagulation, fibrinolytic, and complement pathways. Blood 76,

47 Weinbauer M. G. (2004). Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev 28, Wilson M. J., Haggart C. L., Gallagher S. P., Walsh D. (2001). Removal of tightly bound endotoxin from biological products. J Biotechnol 88, Wittebole X., De Roock S., Opal S. M. (2014). A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens. Virulence 5, Wright A., Hawkins C. H., Änggård E. E., Harper D. R. (2009). A controlled clinical trial of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa; a preliminary report of efficacy. Clin Otolaryngol 34, Zhang H., Fan D., Deng J., Zhu C., Hui J., Ma X. (2014). Effect of tris-acetate buffer on endotoxin removal from human-like collagen used biomaterials. Mater Sci Eng 42,

48 8. Liitteet Taulukkoon A on merkitty eri koejärjestelyistä saatujen näytteiden tiitterien ja endotoksiinipitoisuuksien keskiarvot ja -hajonnat. Koejärjestely 1 Koejärjestely 2 Koejärjestely 3 Koejärjestely 4 Koejärjestely 5 4,86E+04 0,00E+00 1,18E+10 0,00E+00 2,75E+03 8,65E+01 4,77E+09 9,90E+08 2,16E+02 3,33E+00 4,20E+09 1,77E+09 1,96E+02 6,07E+00 2,93E+09 8,75E+08 Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) Lysaatti 1. ultrafiltraatio Pierce-pylväs 2. Ultrafiltraatio 4,86E+04 0,00E+00 1,18E+10 0,00E+00 3,17E+03 1,52E+02 2,43E+09 8,94E+08 1,08E+02 3,14E+01 8,71E+01 1,54E+01 2,31E+09 2,53E+09 9,00E-02 1,84E-02 Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajont endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/m Lysaatti 1. ultrafiltraatio Ioninvaihtokromatografia 2. Ultrafiltraatio EndoTra 4,86E+04 0,00E+00 1,18E+10 0,00E+00 3,04E+03 1,28E+02 1,17E+09 4,89E+08 1,05E+02 3,92E+01 2,26E+08 9,85E+07 8,51E+01 4,31E+01 2,99E+09 2,63E+09 Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) Lysaatti 1. ultrafiltraatio Ioninvaihtokromatografia 2. Ultrafiltraatio 4,86E+04 0,00E+00 1,18E+10 0,00E+00 2,86E+03 1,36E+02 2,67E+09 1,97E+09 2,21E-01 7,99E-02 4,17E+09 9,73E+08 1,34E+02 8,32E+00 4,65E+06 2,31E+06 Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) Lysaatti Ultrafiltraatio EndoTrap-pylväs Pierce-pylväs 4,86E+04 0,00E+00 1,18E+10 0,00E+00 1,55E+03 3,39E+02 2,95E+09 6,66E+08 6,75E+02 1,75E+02 3,16E+09 3,23E+09 1,56E+00 1,40E+00 9,13E+07 3,98E+07 1,56E+00 8,70E-01 Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajonta Keskiarvo Keskihajont endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/ml) Tiitteri (pfu/ml) endotoksiinipitoisuus (EU/m Lysaatti Oktanoliuutto 1. ultrafiltraatio Ioninvaihtokromatografia 2. Ultraf Taulukko A. Koejärjestelyiden endotoksiinipitoisuudet ja tiitterit kokeiden eri vaiheissa 47

49 standardikuvaaja. Kuvaan B on merkitty yhdessä endotoksiinimittauksessa käytetty Kuva B. 1. Endotoksiinimittauksen standardikuvaaja. 48