Utaretulehdusten PCR diagnostiikka - miten tuloksia tulkitaan?

Transkriptio

1 Utaretulehdusten PCR diagnostiikka - miten tuloksia tulkitaan? Heidi Hiitiö 1*, Rauna Riva 2, Tiina Autio 2, Tarja Pohjanvirta 2, Jani Holopainen 3, Satu Pyörälä 1, Sinikka Pelkonen 2 1 Department of production animal medicine, Faculty of veterinary medicine, University of Helsinki, Finland, 2 Finnish Food Safety Authority Evira, Finland, 3 Thermo Fisher Scientific, Finland, *heidi.hiitio@helsinki.fi

2 Märehdittäviä asioita tänään.. PCR vs. perinteinen viljely Tulkintaohjeita Uudet patogeenit ja niiden hoitosuositukset

3 Utaretulehdus tiivistettynä Pyörälä, S. & Tiihonen T. Nautojen sairaudet CD-ROM. Helsingin yliopisto, oppimateriaalia 6, Kliinisellä mastiitilla tarkoitetaan utaretulehdusta, jossa on piilevien oireiden lisäksi ainakin yksi seuraavista, kliinisessä tutkimuksessa havaittavista oireista: yleisoireet (kuume, syömättömyys), paikallisoireet utareessa (lämpö, turvotus, arkuus), tai makroskooppiset muutokset sairaan neljänneksen maidossa (vetisyys, kokkareet). Piilevä mastiitti on todettavissa vain jollakin testillä, kuten solutestillä (CMT). Eri karjoissa mastiitin insidenssi vaihtelee, nousten jopa yli sataan prosenttiin vuodessa. Yleisenä tavoitteena on alle 2,5 kliinistä mastiittitapausta 10 lehmää kohti vuodessa. Karjan neljänneskohtaisen infektioprosentin tulisi olla alle 10. Akuutti kliininen mastiitti vaatii hoitoa, tavallisesti mikrobilääkitystä, mutta hoito voi olla myös pelkkää tukihoitoa, kuten tiheää lypsyä. Kliinisten mastiittien asianmukainen hoito on yksi osa karjan utareterveysohjelmaa. Subkliinisia mastiitteja pitäisi lypsykauden aikana käsitellä antibiootein vain erityisestä syystä, jollainen on esim. tavallista suurempi tartuntavaara (Streptococcus. agalactiae)....mutta TÄMÄ KAIKKI VAATII BAKTERIOLOGISEN DIAGNOOSIN!!

4 Perinteinen maitonäytteen viljely Perinteistä maitonäytteen bakteeriviljelyä pidetään edelleen golden standardina mastiittidiagnostiikassa, mutta Hidas Subjektiivinen Vaatii osaavaa henkilökuntaa

5 ..toisaalta Kasvu maljalla = elinkykyiset bakteerit Taudinaiheutuskykyiset bakteerit? Selektiivimaljat puolustavat paikkaansa kenttälaboratorioissa Päivystysdiagnostiikka Tulkintavaikeuksia myös tässä.. Erkkilä S. Praktisoivien eläinlääkäreiden utaretulehdusdiagnostiikka pilottitutkimus. Lisensiaatintutkielma, Helsingin yliopisto, 2007.

6 Uudet tuulet mastiittidiagnostiikassa.. PathoProof Mastitis PCR Assay markkinoille vuonna 2008 Tällä hetkellä yli 90 % kaikista Suomessa tutkituista maitonäytteistä tehdään PCR-menetelmällä Valio ThermoFisher (ent. Finnzymes) MasTest (ThermoFisher Scientific) PathoProof Mastitis PCR Assay

7 1. DNA extraction DNA of the bacteria present in bovine milk is isolated and purified. In this step, bacterial DNA is released by breaking the cells and purified from all other components in milk such as lipids, proteins and bacterial cell debris. The DNA extraction protocol of the PathoProof Mastitis PCR Assay has been developed for use with even the most difficult samples from cows having mastitis. 2. DNA amplification Bacterial DNA is amplified using real-time PCR. In this step, species-specific regions of DNA are simultaneously amplified and detected by a real-time PCR instrument. 3. Analysis The data obtained from the real-time PCR step are interpreted, reported and stored with a special software. Total time required 2 h 1.5 h 30 min 4 h

8 Thermo Scientific PathoProof Mastitis PCR Assay Complete-16 Staphylococcus aureus Coagulase negative staphylococci Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis Escherichia coli Corynebacterium bovis Enterococcus faecalis and faecium Klebsiella pneumoniae and oxytoca Serratia marcescens Arcanobacterium pyogenes and Peptoniphilus indolicus Mycoplasma sp Mycoplasma bovis Hiiva Prototheca (levä) Staphylococcal beta-lactamase gene 8

9 Perusperiaatteet utaretulehdusnäytteen tuloksen tulkinnassa ovat edelleen ihan samat oli käytössä mikä tahansa menetelmä Lehmän ja karjan taustatiedot (anamneesi) Kliiniset oireet Maidon ulkonäkö Tulehdusreaktio utareessa eli maidon solupitoisuus Bakteerilaji(t) Bakteerimäärä 9

10 Mikä sitten on muuttunut, kun on siirrytty PCR-testiin? Hyviä asioita Nopeus Helppous Näyte maitoauton mukaan/postiin Tulos tekstiviestillä Objektiivisuus Yhtenäinen diagnostiikka Uusia käyttötapoja esim. Str. Agalactiae seuranta tankkimaidosta Mycoplasma bovis Vaatii laboratoriossa viikon kasvatusajan Myös säilöntäainetabletin sisältävät näytteet voidaan tutkia Eläinlääkärien rooli korostuu tulkinnassa entistä enemmän!! Arveluttavaa.. Hinta? Houkutus ottaa lehmänäytteitä neljännesnäytteiden sijaan Herkkyysmääritykset jäävät puuttumaan vain stafylokokkien penisilliiniherkkyys Näytteenoton aseptiikka entistä vaativampi herkempi testi Sekakasvuja ei ilmoiteta Loputtomat bakteerilistat Uusia bakteerien nimiä epätietoisuus mitä tehdä Tunnistaa vain ne bakteerit, jotka on testissä mukana Myös kuolleet bakteerit ovat listassa Testi tunnistaa vain DNA:n Antibioottihoitojen lisääntyminen? 10

11 .. Ja mikä sen tulkinnassa ontuu? Pitkät tuloslistat eri bakteereita Sekakasvuja ei ole ilmoitettu Mistä tietää onko tuloksella merkitystä? Vähäiset määrät ympäristöperäisiä aiheuttajamikrobeja Onko tartunnallisistakaan bakteereista pieni määrä (+) merkittävä löydös? Onko löydetty bakteeri taudinaiheutuskykyinen? PCR ei erottele kuolleita ja eläviä bakteereja toisistaan

12 Perinteisen viljelyn ja PCR diagnostiikan vertailua PCR todettu tutkimuksissa erittäin herkäksi analyysimenetelmäksi (Koskinen ym ja 2010) Testiä ei ole validoitu diagnostiikkakäyttöön! Permissible use. This product is intended to be used for the purpose of detection and/or analysis of microorganisms in milk for quality assurance and quality control purposes (Food Testing Applications), as well as for identification, enumeration, or count of microorganisms in raw material sample, process control sample, or finished product sample of an industrial process for the purpose of detecting the presence, absence or amount either of a contaminant or of an intended component (Industrial Microbiology Applications). Not for use in veterinary diagnostic procedures. The quality system of Thermo Scientific PathoProof is certified according to standard SFS-EN ISO9001: Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. Agilent Mx3005P is a registered mark or trademark of Agilent Technologies. All other trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries. Folio No LT1393A/AM/09/11

13 Uuden tutkimuksen tuloksia 295 näytettä viljeltiin Kuopion Evirassa Jokainen pesäke tunnistettiin Samat näytteet tutkittiin myös PCRllä Viljelytuloksista tehtiin diagnoosit Eviran suositusten mukaisesti Diagnooseja verrattiin PCR tuloksiin, pitäen viljelytulosta ns. golden standardina

14 Uuden tutkimuksen tuloksia Herkkyys PCR testille oli 91.3 % mutta tarkkuus vain 52.3 % S. aureuksen kohdalla herkkyys oli 97% ja tarkkuuskin 95.9% Näiden lukujen perusteella todennäköisyys sille, että lehmällä on S. aureus mastiitti (eli se on diagnosoitu positiiviseksi viljelyssä) on 87.6 % KNSn tapauksessa kyseinen todennäköisyys on vain 41 %

15 Results - genome copy numbers vs. CFUs (S. aureus) 15

16 Results - genome copy numbers vs. CFUs (CNS) 16

17 Tulkintaohjeita ja pohdintaa Vain vähän tutkimusta aiheesta PCR diagnostisena menetelmänä Julkaisuja tulee jatkuvasti lisää Ohjeistusta laajennetaan ja tarkennetaan heti kun uutta tutkimustietoa saadaan käyttöön

18 PCR testin tulkintaohjeita N:o 1. Kiinnitä huomio vain vallitsevaan bakteerilajiin mastiitti on melkein aina vain yhden bakteerin aiheuttama infektio Näytteet, joissa tuloksessa ilmoitetaan >90 / >99 % Esimerkki: A. pyogenes and P. indolicus + 35,8 Staphylococcus sp. ++ >99% 26,5 18

19 PCR testin tulkintaohjeita N:o 2. Yhden plussan bakteerit (+) Yleensä kontaminantteja KNS Hiiva Poikkeuksena S. aureus (?) S. agalactiae M. bovis Mikäli bakteerin määrä on ++/+++ tai sen osuudeksi on ilmoitettu yli 90 % Tulkitse vallitsevaksi ja hoida tarpeen mukaan Jos näytteessä on yli 3 eri bakteeria ilmoitettu määrällä ++/+++ Uusi näyte!

20 PCR testin tulkintaohjeita N:o 3. - likainen näyte Sovella perinteisen viljelyn sääntöä: kontaminoituneita näytteitä ei tutkita eikä tulkita Kontaminoitunut näyte > 2 pesäketyyppiä PCR tuloksissa > 2 lajia tuloslistassa Huomioi monilajisista näytteistä kuitenkin Str. agalactiae Mycoplasma bovis Uusi näyte! Varmista, että näyte osataan ottaa oikein! A. pyogenes and P. indolicus + Beta-lactamase gene + C. bovis ++ E. coli + Mycoplasma sp. +/- Prototheca sp. + Staph. aureus + Staphylococcus sp. ++ Str. dysgalactiae +/- Yeasts

21 Maitonäytteen otto Viite: Honkanen-Buzalski, T., Sampling technique, transportation and history. In: Sandholm, M., Honkanen-Buzalski, T., Kaartinen, L., Pyörälä, S. (Eds), The bovine udder and mastitis.gummerus Press, Jyväskylä, Finland, pp S. Pyörälä Puhtaat kädet! Jos utare on lantainen, se pestään vedellä ja kuivataan. Neljänneksistä lypsetään alkusuihkeet Potkiminen/hännällä huiskiminen näytteenoton aikana on estettävä Vetimestä otetaan toisella kädellä tukeva ote ja vedinaukkoa hangataan kolmella erillisellä dsinfektioliuokseen kastetulla tupolla tai kääntäen samasta tuposta/desinfektioliinasta puhdas pinta 5 sek per pinta Jos tuppo on vielä tämän jälkeen näkyvästi likainen, aloitetaan alusta. Jos vetimen pää on rupinen, syyläinen tai rikki, kunnollista näytettä on vaikea saada ja puhdistamiseen on käytettävä enemmän aikaa. Näyteputken korkki avataan ja sitä pidetään kädessä niin, ettei siihen pääse varisemaan likaa (ks. kuva). Korkin sisäpintaan ei saa koskea käsin. Maitosuihkeet lypsetään putkeen niin, että putki on lähes vaakatasossa (ks. kuva); näin vältetään lian variseminen putkeen. Näytteeksi riittää muutama millilitra eli 3-5 sentin kerros putken pohjalle. Korkki suljetaan heti ja putki lähetetään laboratorioon

22 Resistenssigeeni Betalactamaasi eli Blaz-geeni Näytteestä on havaittu stafylokokeille ominainen resistenssigeeni jos näytteessä sekä S. aureus että KNS, kummalta peräisin? Uusi näyte? Tilan historia? S. aureus ongelmatila vai yksittäinen löydös? Muiden bakteerien resistenssistä Blaz ei kerro mitään..

23 Neljännes Tulos Määrä, arvio Vallit- sevuus CT TULKINTAESIMERKKI 73 C. bovis + 38,5 EI KASVUA 74 S. Agalactiae + 36,2 UUSI NÄYTE! 75 Beta-lactamase gene + 37,6 KNS kontaminantti? Staphylococcus sp. + 32,8 ELÄIMEN OIREET? CMT? 76 S. aureus + 33,5 EI KASVUA vai S. aureus? Str. dysgalactiae +/- 38,2 ELÄIMEN OIREET? CMT? 77 Str. dysgalactiae +++ >99% 21,3 Str. dysgalactiae Yeasts + 36,1 78 Beta-lactamase gene + 34,1 Staphylococcus sp Str. dysgalactiae Str. dysgalactiae +++ >99% 20,7 Huom! Jos S. dysgalactiae olisi vain +/++ ottaisin uuden näytteen! Yeasts +/- 39,3 79 A. pyogenes and P. indolicus + 33,3 SEKAKASVU, UUSI NÄYTE! Beta-lactamase gene + 30,3 E. coli +/- 37,1 Staphylococcus sp. ++ >90% 28,4 Str. dysgalactiae + 32,9 Yeasts

24 Tuloslistan uutuudet!!?! Serratia marcescens A. (T.) pyogenes/p. indolicus Hiiva Mycoplasma sp. Mycoplasma bovis Prototheca 24 Hanna-Maria Aho

25 Serratia marcescens Kolityyppinen maaperäbakteeri Tartunnanlähteenä vesi saastuneet kuivikkeet raportoitu myös kontaminoitunut vedinkasto Lypsykaudella tai ummessaollessa, useaan neljännekseenkin Ei leviä lehmästä toiseen ympäristöperäinen Lievemmät oireet kuin tavallisessa kolimastiitissa usein subkliinisenä ja kroonistuu möykkyjä utareeseen Karjaongelmana todettu Suomessakin vedellä läträys altistaa Antibioottihoito ei tehoa Ehkäisy kuten kolimastiitissa eli puhdista ja kuivata on ainoa keino 25

26 Kesämastiitti: T. (A.) pyogenes, P. indolicus ym. Sekainfektio: anaerobeja ja aerobeja ns. kesämastiittisyndrooma Yleisimmät bakteerit: Trueperella (Arcanobacterium) pyogenes Streptococcus dysgalactiae, Peptoniphilus (Peptostreptococcus) indolicus (Fusobacterium necrophorum, Bacteroides) Hiehoilla ja lehmillä ummessaoloaikana, laidunkaudella Sisäruokintakaudella yhteydessä vedinvammoihin Kärpäset levittävät Paranemisennuste käytännössä nolla 26

27 Hiivat ja homesienet PCR-testissä yleinen kontaminantti, tulkitse positiiviseksi vain jos ainoa laji/vallitsevana näytteessä/runsas määrä (+++) Diagnoosi varmistettava, uusi näyte? Vähäinen hiivan määrä näytteessä kertoo myös näytteen huonosta laadusta..kontaminoitunut Saaren aineistossa 1 2 % näytteissä hiiva diagnosoidaan mastiitin aiheuttajaksi Kliiniset oireet voivat olla voimakkaat, maidontuotanto laskee voimakkaasti Oireenmukainen hoito, ei antibioottia Kliinisesti mahdollista parantua voi parantua muutamassa viikossa tai jäädä soluttamaan Tartuntalähteenä kontaminoitunut rehu tai kuivike, sieltä ruuansulatuskanavaan ja ulosteeseen tai suoraan ympäristöstä utareeseen Joskus niin paha, ettei maidontuotanto palaudu (C. neoformans?)

28 Mykoplasmat infektioiden (mastiitin) aiheuttajina Mycoplasma spp. Sisältää sekalaisen joukon mycoplasmoja, joita voi esiintyä navettaympäristössä Harvinainen mastiitin aiheuttajana, lievät oireet M. bovis aiheuttajana valtaosassa Mykoplasma -mastiiteista Yhdysvalloissa raportoitu 1960-luvulta lähtien, Euroopassa aiheuttaa erityisesti vasikoiden infektioita kuten bronkopneumoniaa, otiittia, artriittia, meningiittiä Mastiitti harvinaisempi ilmenemismuoto (Euroopassa) Tanskassa ja Virossa positiivisia karjoja (mastiitti), Ruotsissa yksi Suomessa ensimmäiset positiiviset joulukuu 2012 Suomessakin ollut aiemmin muita mykoplasmoja (M. dispar, M. bovigenitalis, mutta ei mastiitissa (aikaisemmin ei testiä)). Mastiittilehmä voi erittää 300 milj. mykoplasmaa/ml maitoa M. bovis mastiitti - ilmoitusvelvollisuus, kiinnitä huomiota myös vasikoihin Eviran tämänhetkinen ohje sairastunut eläin tulee heti eristää ja poistaa karjasta Lisäohjeita tulossa, uusi eläintautilaki 28

29 Prototheca spp. - levät Prototheca zopfii yleisin laji mastiitin aiheuttajana Yksisoluinen, hiivan kaltainen levä, 3 biotyyppiä joista yksi vallitseva Yleinen Brasiliassa, Kaliforniassa ym. lämpimissä, kosteissa olosuhteissa Suomessa aikaisemmin raportoitu yksi tapaus (Pitkälä ym SEL), Tanskassa ja Saksassa satunnaisesti Nyt löytyy PCR-testillä (monesti kontaminantti?) Kliininen tai piilevä mastiitti, ei hoitoa, kroonistuu Piilevästi infektoituneet eivät aina eritä maidossa Protothecaa voi olla runsaasti ympäristössä, ei yhteyttä mastiittiin 29

30 Take home messages.. Eläinlääkärin rooli entistä tärkeämpi! Vaadi epäpuhtaista näytteistä uusintanäytteitä ja varmistu että tilallinen ymmärtää näytteenoton aseptiikan tärkeyden ja osaa ottaa hyvän näytteen! Eläimen hoitohistorialla, oireilla ja maitomuutoksilla olennainen rooli eli perusasioiden tärkeys korostuu ja eläin täytyy oikeasti tutkia Älä aloita turhia antibioottikuureja! Ole tarkkana: S. agalactiae ja M. bovis myös vähäiset määrät huomioidaan ja tarkastetaan uusintanäytteellä Uusien tutkimusten perusteella tulkintaohjeita yritetään parantaa Myös testin kehittäjä mukana prosessissa Tuloksista tiedotetaan eläinlääkäreille heti kun niistä saadaan lisää tietoa Naseva

31 Kiitos mielenkiinnostanne!