Nitraatin ja nitriitin määritysmenetelmät Christina Bäckman Elintarviketurvallisuusvirasto Evira Kemian ja toksikologian yksikkö Christina Bäckman 29.9.2011
Nitraatille altistuminen Nitraatille (NO 3 - eli nitraatti-ioni) altistuminen tapahtuu suurimmaksi osaksi kasvisten välityksellä. Altistuminen veden ja muiden elintarvikkeiden välityksellä on vähäisempää.
Nitraattien ja nitriittien lähteet elintarvikkeissa Nitraattia esiintyy elintarvikkeissa luonnostaan Kaikki kasvikset sisältävät nitraatteja luonnollisen kasvun seurauksena. Viljelytekniikan avulla voidaan vaikuttaa nitraattipitoisuuteen Lisäaineena Nitraattia ja/tai nitriittiä käytetään lisäaineena liha- ja makkaravalmisteisiin ja juustoihin. Vesi Veden nitraatti on peräisin etupäässä peltolannoitteista ja typpeä sisältävien aineiden hajoamisen ja hapettumisen seurauksena. Suomessa yleensä <5 mg/l Haja-asutusalueilla 30-100 mg/l Euroopassa usein >50 mg/l alatunnistetiedot 1.1.2007
Nitriitti/nitraatti ja lihan aistittava laatu Natriumnitriitti (NaNO 2 ) vaikuttaa tuotteen makuun ja säilyttää lihan värin punaisena kypsytyksen aikana. Nitraatti pelkistyy nitriitiksi mikro-organismien toimesta lihavalmisteissa ja nitriitti puolestaan pelkistyy varsinkin happamissa olosuhteissa typpioksidiksi (NO), joka puolestaan reagoi myoglobiinin kanssa nitrosomyoglobiiniksi, antaen lihavalmisteille toivotun punaisen värin.
Nitriitin/nitraatin aiheuttamat terveysriskit Nitriitti häiritsee imeväisikäisten veren punasolujen aineenvaihduntaa. Elimistön nitriitit voivat reagoida hemoglobiinin kanssa muodostaen methemoglobiinia Nitriitin (nitraatti reservinä) ja sekundääristen amiinien vuorovaikutuksista voi muodostua syöpää aiheuttavia nitrosoamiineja
Paljonko nitriittiä/nitraattia lisätään? EU-lainsäädännön mukaan ruoka- ja leikkelemakkaraan saa lisätä natriumnitriittiä/natriumnitraattia 150 mg/kg. Suomessa ruoka- ja leikkelemakkaraan lisätään natriumnitriittiä enintään 120 mg/kg. Kestomakkaran valmistusmassaan saa lisätä kaliumnitriittiä ja nitraattia 300 mg/kg 100 % sääntö
Nitraatin/nitriitin pitoisuuteen vaikuttavat tekijät Prosessi Aika Lämpötila ph Muut lisäaineet Nitriitin/nitraatin reaktiivisuus Hajoaminen
Mitä määritetään? Sidottu nitriitti Jäännösnitriitti Analyyttisesti ollaan ensisijaisesti kiinnostuneita jäännösnitriitistä/nitraatista
Milloin määritetään? Lihavalmisteiden jäännösnitriittimäärät ovat tuoreissa tuotteissa keskimäärin 45-55 % Säilyvyysajan lopussa olevissa tuotteissa n. 20-25 % alkuperäisistä käyttömääristä. Syöntihetkellä nitriitti/nitraattipitoisuudet voivat olla keskimäärin 10 % alkuperäisistä käyttömääristä
Nitraatin ja nitriitin pysyvyys lihavalmisteissa Pvm Nitraatti (mg/kg) Nitriitti (mg/kg) 19.5.2010 35,7 33,6 27.5.2010 33,5 14,8 10.6.2010 48,6 ei todettu 22.6.2010 64,6 ei todettu
Määritysmenetelmät Elintarvikkeiden turvallisuuden ja lainsäädännöllisten vaatimusten vuoksi tarvitaan luotettavia menetelmiä.
Vertailututkimukset FAPAS Advisory commmittee kiinnitti v. 2003 pätevyyskokeiden tulosten vaihteluun FAPAS 2010 (nitraatti mg/kg) Meat min 92,1 max 2149 Assigned value 226 VTT 2000 (nitraatti mg/kg) Maitojauhe Vihannessose Makkara min 0,1 0,95 0,47 Max 87,9 75,2 41,1 Ka. 25,2 43,6 43,0 VTT 2003 (nitraatti mg/kg) min 10,3 max 57,4 Ka. 27,3
Tavallisimmat määritysmenetelmät elintarvikematriiseille Nitraatin pelkistäminen nitriitiksi kadmiumilla Nitraatin pelkistäminen nitriitiksi entsymaattisesti Nitraatin ja nitriitin määrittäminen ionikromatografisesti (IC) tai nestekromatografisesti (HPLC) Kapillaarielektroforeesi (CE)
Standardimenetelmiä Determination of nitrate and nitrite content- part:1. Method by cadmium reduction and spectrometry ISO/FDIS 14673-1:2000E (standard method) Determination of nitrate and nitrite content- part: 2. Method by segmented flow analysis ISO/FDIS 14673-2:2000 (routine method). Determination of nitrate and nitrite content- part: 3. Method by cadmium reduction and flow injection analysis using in-line dialysis ISO/FDIS 14673-3:2000 (routine method). Automatisoidut menetelmät ja kaupalliset Cd-pylväät vähentävät Cd-jätteen määrää ja kertakäyttöiset pylväät helpottavat ongelmajätteen käsittelyä
Menetelmien kehittämisen tarve CODEX säännökset kieltävät kadmiumin käytön, jonka vuoksi tarve korvaavien menetelmien kehittämiseksi elintarvikkeille on suuri.
Nykyaikaisten menetelmien standardoiminen Kansainväliset standardisointijärjestöt NMKL, CEN ja ISO/IDF ovat ottaneet ohjelmistoihinsa nitraatin/nitriitin Cd:n korvaavien määritysmenetelmien kehittämisen ja standardoimisen. NMKL (Pohjoismainen elintarvikkeiden metodiikkakomitea) työstää parhaillaan menetelmää, jossa kadmium korvataan sinkillä.
Milk and milk products determination of nitrate and nitrite contents Method by enzymatic reduction (for nitrate) and molecular absorption spectrometry after Griess reaction. Draft International Standard WD ISO 20541 IDF 197 Menetelmä perustuu nitraatin entsymaattiseen pelkistämiseen ja Griessin reaktion kautta muodostuneen värillisen yhdisteen spektrofotometriseen mittaukseen aallonpituudella 546 nm. Menetelmä on kollaboratiivisesti validoitu 2003/2004 Menetelmä on yhdenmukainen pren 12014-3 menetelmän kanssa (validoitu 2004 liha ja lihavalmisteille) Menetelmään sisältyy proteiinien ja rasvan saostus Carrez reagensseilla (1 ja 2) poistaminen ultrasuodatuksella Haitat: Menetelmä soveltuu pienten nitraattipitoisuuksien määrittämiseksi maitovalmisteista, mutta ei sovellu pienten nitriittipitoisuuksien määrittämiseksi Käytettävillä entsyymeillä on rajattu käyttöikä
IC ja HPLC-menetelmät Eivät edellytä nitraatin pelkistämistä. NO2 ja NO3 ovat määritettävissä samassa ajossa Ionikromatografia (IC) Aminopropyl, heikko anionivaihtokolonni Foodstuffs Determination of nitrate end/or nitrite content Part 4: IC method for the determination of nitrate and nitrite content of meat products (prenv 12014-4, 1998). Foodstuffs HPLC/IC method for determination of nitrate content in vegetables and vegetable products (prenv 12014-part 2) Liquid Chromatographic Determination of Residual Nitrite/nitrate in foods. NMKL nro 165; 2000 Käänteisfaasitekniikka (RP) C 8 ja C 18 kolonnit myös tavallisia, varsinkin näytteen esikäsittelyn automatisointiin yhdistettynä (kiinteäfaasi tai dialyysi)
Nestekromatografia ja dialyysirobotiikka
Kapillaarielektroforeesi (CE) Nopeus Ympäristöystävällisyys (reagenssien ja liottimien määrät). Henkilökunnan altistuminen orgaanisille liuottimille on vähäinen Analyysin hinta
Kapillaarielektroforeesin periaate
2,267 3,425 4,588 4,925 5,029 8,783 5,167 4,121 5,475 3,121 nitraatti - 10,682 AU AU AU CE- ja HPLC-ajo samasta näytteestä 0,020 PDA - 200nm Migration Time 0,020 0,45 0,40 0,015 0,015 0,35 0,30 0,25 0,010 0,010 0,20 0,15 0,005 0,005 0,10 0,05 0,000 0,000 0,00 0 1 2 3 4 5 6 Minutes -0,05 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 Minutes
Menetelmän validointi LOD 5 mg/kg LOQ 10 mg/kg Spiikkaussaanto 68 % BIAS (CRM) 101 % Toistettavuuden RSD 3,86 Uusittavuuden RSD 10,3 Mittausepävarmuus 10-600 mg/kg 15 % Mittausepävarmuus 600-300 mg/kg 1 % Tuloksia verrattiin alkuun myös standardimenetelmään (HPLC)
Nitris hanke Evirassa on käynnistynyt riskinarviointihanke, jossa arvioidaan suomalaisten lasten ja aikuisten altistumista nitraatille ja nitriitille sekä luontaisista lähteistä, että lisäainekäytöstä. Hankkeen tavoitteena on määrittää Suomessa yleisimmin käytettyjen kasvisten (luontaiset lähteet) sekä liha- ja makkaraleikkeiden ja juustojen (lisäainekäyttö) nitraatti- ja nitriittipitoisuudet. Hanke aloitettiin 2009 kasviksilla (n.300 kpl) 2010 hanketta jatkettiin tutkimalla liha- ja kalavalmisteita sekä juustoa Näytteet analysoitiin kapillaarielektroforeesilla Evirassa ja METLAn toimitiloissa Lopullinen raportti valmistunee vuoden 2012 loppuun mennessä
Nitris hanke Tutkimusryhmä Erikoistutkija Vera Mikkilä (Evira) Ylitarkastaja Kirsi-Helena Kanninen (Evira) Erikoistutkija Tapani Lyytikäinen (Evira) Ylitarkastaja Ulla Karlström (Evira) Tutkija Christina Bäckman (Evira) Erikoistutkija Tiina Putkonen (Evira) Suvi Virtanen (THL) Marja-Leena Ovaskainen (THL) Heli Tapanainen (THL)
Nitraatin pitoisuudet kasviksissa (mg/kg tp.) N ka MED MIN MAX Avomaankurkku 6 36,5 31,0 23,2 153 Herne 15 45,2 42,7 6,2 101 Kaali 16 279 276 6 510 Kesäkurpitsa 12 400 237 26 2398 Kiinankaali 4 674 595 470 1035 Kukkakaali 14 90,0 50,9 13,2 256 Kurkku 20 217 178 16 714 Kyssäkaali 2 1103 178,0 1093 1113 Lanttu 14 145,6 345 10,7 480 Mansikka 11 61,0 57,8 18,6 120 Omena 3 15,8 18,0 13,5 45 Paprika 11 279 26,1 10,8 62 Parsakaali 12 338 299 67 671 Peruna 35 64 52 12 173 Pinaatti 6 924 769,4 82,0 2381 Porkkana 32 311,4 170 11,2 829 Punajuuri 15 1517 715 205 3689 Purjo 6 517 598 147 878 Raparperi 11 281 42 21 1222 Sipuli 20 55,7 54,5 2,6 111 Tomaatti 21 47,0 47,2 14,0 76
EFSAN arviointi Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen EFSA katsoi arviossaan vuonna 2008, että kasvisten ja hedelmien käytön hyödyt kuitenkin ylittävät nitraatille altistumisesta mahdollisesti aiheutuvat terveydelliset haitat.
Turun Sanomat 17.11.2009 Kasvisten nitraatit hyväksi terveydelle
Eri valmisteiden nitraatti+nitriittipitoisuudet 2010-2011 Yhteensä mg/kg ei tod. <5 mg/kg Lkm. (nitraatti+nitriitti) nitriitti lkm. lkm. Keittomakkarat 71 82,3 22 Kestomakkarat 12 107 12 Täyslihavalmisteet 48 60,8 23 Raakamakkarat 2 145 0 Juustot 19 10,5 4 6 Kalavalmisteet 2 142 2
Loppupäätelmät Nitriitin aiheuttaman riskin vähentämiseksi on todettu, että nitriitin/nitraatin määrä muuttuu jatkuvasti prosessin ja säilytyksen aikana. Siksi nitriittipitoisuuden analyysivalmiuksia Suomessa tulee kehittää nykyistä parempien menetelmien ja menettelytapojen käyttöönottamiseksi luotettavampien saantiarvojen saamiseksi KIITOS!