Rintasyövän ER, PR ja Ki-67: menetelmät ja värjäysten digitaaliavusteinen tulkinta Jorma Isola, TaY
Kliinikot ovat tyytymättömiä ER/PRmääritysten tarkkuuteen, koska Kahdessa uudessa monikeskushoitotutkimuksessa ER/PR-statukset olleet vääriä 25-30%:ssa tapauksia!! Vaikutti oleellisesti hoitotutkimusten tuloksiin Käsitys ER+PR- kategoriasta edelleen hatara tamoksifeeni vai aromataasi-inhibiittori? tulos muuttui res. määrityksistä riippuen kansainvälisiin trialeihin paikalliset ER/PR:t eivät enää kelpaa (HER2:sta puhumattakaan...)
ER/PR-tulostason vaihtelun syyt 1) Eroja/puutteita värjäysmenetelmissä NordiQC PR : 23% borderline, 2% poor NordiQC ER : 10% borderline, 15% poor 2) Eroja värjäystulosten +/- tulkinnassa esim. NordiQC:n ekspertit tulkitsivat heikkoja värjäysreaktioita todella vaihtelevasti. => kuva-analyysi
ER/PR:n vasta-aineet ER : vasta-aineet 1D5, 6F11, SP1 moitteettomia PR : vasta-aineet PgR636, 16, PgR1294,1E2 moitteettomia rabbit monoclonal SP2 poistettu myynnistä! klooni 1A6 on huono, todettu moneen kertaan kehotan labroja Suomessa vaihtamaan tämän
Värjäysmenetelmistä Ei erityistä verrattuna IHC-värjäyksiin yleensä Kuumennusesikäsittely ph 9 Posit. kontrollien valinta edelleen vaikeaa cervix hyvä kontrolli PR:lle tuumorien lisäksi ER:lle pitää valita myös heikosti pos. tuumoreita mieluiten monikudosblokki
PgR 636 väärä laim. Huomaa ero sensitiivisyydessä vaikka stroomasolut molemmissa voimakkaasti positiivisia PgR 636 optimaalinen ER/PR:n värjäysmenetelmät tulisi testata laboratorioissa huollellisesti. Klooni 1A6, epäspesifi
ER/PR-tulostason vaihtelun syyt 1) Eroja/puutteita värjäysmenetelmissä NordiQC PR : 23% borderline, 2% poor NordiQC ER : 10% borderline, 15% poor 2) Eroja värjäystulosten +/- tulkinnassa esim. NordiQC:n ekspertit tulkitsivat heikkoja värjäysreaktioita todella vaihtelevasti.
%-pos. soluja vai histoscore? (HISTOSCORE = intensiteetti x %pos.soluosuus) Oma vahva mielipiteeni on : %-pos. soluja KOSKA : VÄRJÄYSINTENSITEETTI VAIHTELEE LIIKAA VÄRJÄYSERIEN VÄLILLÄ VÄRJÄYSINTENSITEETIN TOISTETTAVA LUOKITTELU LIIAN VAIKEAA HISTOSCOREN YLIVERTAISUUTTA EI OLE OSOITETTU MISSÄÄN.
Mikä on ER/PR:n positiivisuuden raja-arvo? Ei tiedetä kunnolla!!!!! Ennen käytimme 20% pos. ca-soluja Kansainvälisen käytännön mukaisesti käytämme nykyisin 10% pos. ca-soluja Ki-67:ssa kolmiluokkainen jaottelu käyttökelpoisempi kuin kaksiluokkainen meillä <10% / 10-20% / >20%
Suurin osa ER/PR-värjäyksistä on tulkinnaltaan täysin selviä Niin on, mutta rajatapauksia voi olla jopa 10-15% ja se on suuri määrä potilaita
Missä menee värjäysreaktion positiivisuuden raja? - Säilyykö tulkintasi viikosta toiseen samana...? neg neg neg? neg? neg??????? pos??? pos? pos pos pos pos pos pos kaikki ER-värjäyksiä
Ki-67:ssa nähdään usein runsas vaihtelu värjäysintensiteetissä. - %-osuuden laskenta edellyttää toistettavaa positiivisen solun määritelmää => jopa tärkeämpää kuin ER/PR:ssa!!! Ki-67 IHC
Ki-67%:n silmämääräistä arviointia sotkee myös solutiheyden vaihtelu näytteiden välillä Ki67= _ % Ki67= _ %
Ki-67%:n silmämääräistä arviointia sotkee myös solutiheyden vaihtelu näytteiden välillä Ki67= 7 % Ki67= 7 %
ER/PR/Ki-67:n kuva-analyysi Muinainen CAS200 Parikymmentä heikkotasoista julkaisua erilaisista ohjelmistotekeleistä Yhtään laajalla kliin. aineistolla validoitua ohjelmistoa ei ole tiedossani lähinnä esimerkkikuvia + kaupall. esitteitä => Päätimme tehdä oman ohjelmiston
Perimmäinen idea : Kuva-analyysiohjelma tulkitsee värjäyksen positiivisuuden aina samalla tavalla. Vaikka kukaan ei pysty sanomaan mihin raja oikeasti pitäisi asettaa - tärkeintä on toistettavuus 12%
Ohjelmiston tekninen toteutus Käytämme ImageJ nimistä kuva-analyysiohjelmistoalustaa (public domain) 2. Sovellusohjelma ( Immunoratio ) kirjoitettu itse 3. Kuvien otto 1300x1000 pix. värikameralla (Scion) - kuvaus 20x objektiivilla - valotuksen vakiointi (helppoa)
Ohjelmiston toimintaperiaate : 1. Värikuvan laskennallinen hajoitus DABja DAB+hematox-komponenteiksi color deconvolution algoritmi (Ruifrok et al. 2001) alkuper. kuva DAB. Hematox+DAB (mitkään PhotoShop kikkailut eivät toimi)
2. DAB-värjäyksen itseoppiva kynnystys Sama ruskean sävy näytteestä riippuen joko oikeaa värjäytymistä tai sytoplasmista taustaa Molemmista oikea digitaalinen tulkinta Silmämääräisestikin otetaan aina huomioon signaali / tausta
3. Laskenta : ruskeat / ruskeat + siniset pikselit % - sama tulos kuin pos. solujen %-osuus Alkup. kuva Analyysiohjelman tulkinta
Visuaalinen kontrolli tärkeää: ER alkup. kuva Kuva-analyysin tulos DAB-posit. Hematox-posit. %-luku täytyy olla järkeenkäypä.
Litteimmät solut ovat stroomaa - suljetaan pois laskennasta Kuva-analyysiohjelman suorittama solujen tunnistus Peroksidaasi+ Hematoksyliini+
ER/PR-värjäytyminen on tunnetusti heterogeenistä tuumorin sisällä Alkup. kuva digitaalinen tulkinta Kuvataan 3 näkökenttää per näytelasi, enemmänkin näkökenttiä voi halutessaan kuvata
Analyysiohjelman kalibraatio Ohjelman tulostaso (ruskea/ruskea+sin%) säädettiin vastaamaan kuvista laskettua pos. solujen %-osuutta toimii myös käytännössä >2000 ER/PR/Ki-67 -määritystä tehty Tarvitaan ulkoinen/riippumaton validaatio & testaus
Kokemuksia kuva-analyysin käytöstä 10/2005-3/2007 Tähän mennessä tehty 748 (x3) kliin. potilasmääritystä kuva-analyysi onnistuu teknisesti >95%:ssa Jos halutaan määrittää ER%, PR% ja Ki-67% kunnolla => Immunoratio nopeuttaa huomattavasti työtä Digitaalikuvat kuva-palvelimelle kl.pat. kokouksia varten (myös CISH) käytetään yllättävän paljon! Pos. palautetta onkologeilta!
Jos kiinnostusta Tarkoituksena tehdä Immunoratioohjelmasta web:n kautta käytettävä versio Uutta web-teknologiaa: 1) Ota kuva(t) omalla mikroskooppikamerallasi 2) Syötä kuvasi web-ohjelmaan (upload) 3) Tee analyysi ja poimi tulos & kuva Periaatteessa hoitaja/solubiologi voisi ottaa & analysoida kuvat => Patologi hyväksyy tulosteet.