Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena

KATSAUS Aleksi Isomursu, Juha Kononen ja Teijo Kuopio Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena Syöpien nopea geneettinen muuntelu ja siitä aiheutuva klonaalinen heterogeenisuus johtavat usein lääkkeille vastustuskykyisten syöpäsolupopulaatioiden syntymiseen. Kasvainten genotyypitys voi auttaa hoitojen valinnassa, mutta kudosnäytettä edellyttävät tutkimukset ovat kajoavia, ja taudin reaaliaikainen seuranta on siksi hankalaa. Yksi vaihtoehto kudospohjaisten testien tueksi on niin sanottu nestebiopsia. Syöpäsoluista vapautuu potilaan verenkiertoon DNA:ta, joka sisältää kullekin syövälle ominaisia somaattisia mutaatioita ja epigeneettisiä muutoksia. Riittävän herkillä tutkimusmenetelmillä verinäytteessä oleva kasvain-dna kyetään havaitsemaan, ja sitä voidaan käyttää apuna esimerkiksi syövän primaaridiagnostiikassa, kliinisissä mutaatiomäärityksissä, hoitovasteen seurannassa ja hoitoresistenssin sekä mahdollisen jäännöstaudin havaitsemisessa. laatioista, eikä yksittäinen kudosnäyte edusta välttämättä kattavasti koko taudin geneettistä profiilia (1). Kaiken kaikkiaan kudospohjaiset tutkimusmenetelmät soveltuvat huonosti nopeasti muuntuvien syöpätautien reaaliaikaiseen seurantaan. Yksilöllistettyjen syöpähoitojen tehokas hyödyntäminen edellyttää monipuolisia merkkiaineita, joista on apua taudin varhaisessa toteamisessa, hoidon valinnassa, hoitovasteen seurannassa sekä mahdollisen kehittymässä olevan resistenssin tai jäännöstaudin havaitsemisessa. Yksi tämän hetken lupaavimmista ehdokkaista uudeksi syövän merkkiaineeksi on verenkierron solunulkoinen DNA (2). TAULUKKO 1. Solunulkoisen DNA:n terminologiaan on äskettäin ehdotettu uutta luokitus- ja nimeämisjärjestelmää. Eri käsitteet perustuvat muun muassa DNA:n alkuperään ja siihen, minkälaisia vuorovaikutuksia nukleiinihapoilla on muiden molekyylien kanssa. 424 Syöpäbiologinen tutkimus on mahdollistanut molekyylitason kohteisiin vaikuttavien biologisten syöpälääkkeiden kehittämisen, mutta hoitojen käyttö edellyttää tietoa kunkin kasvaimen genomissa ja biokemiassa tapahtuneista muutoksista. Kiinteiden kasvaimien geneettisiä muutoksia määritetään DNA:sta, joka on eristetty parafiiniin valetuista kudosnäytteistä tai tuorekudoksesta. Näytteenotto on kajoava toimenpide, johon liittyy aina komplikaatioriski. Kasvain voi myös sijaita alueella, josta biopsiaa ei turvallisuussyistä voida ottaa. Itse näyte voi olla niukka tai muuten epäedustava, esimerkiksi runsaan nekroosin vuoksi. Lisäksi ongelmana on syöpätautien klonaalinen heterogeenisuus: pitkälle edennyt syöpä koostuu useista genotyypiltään erilaisista solupopu- cfdna/eodna fdna pddna ctdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA, extracellular occuring DNA). Kaikki elimistössä solujen ulkopuolella esiintyvä DNA (3). Vapaa DNA (free DNA). cfdna:n alakäsite; solujen ulkopuolella vapaana esiintyvä DNA, joka ei sijaitse solunulkoisissa vesikkeleissä tai ole suorassa vuorovaikutuksessa esimerkiksi histonien kanssa (3). Partikkelilähtöinen DNA (particle-derived DNA). cfdna:n alakäsite; solujen ulkopuolella esiintyvä DNA, joka on vuorovaikutuksessa yhden tai useamman muun molekyylin kanssa (vrt. fdna) (3). Kiertävä kasvain-dna (circulating tumor DNA). cfdna:n alakäsite; solujen ulkopuolella esiintyvä, syöpäsoluista peräisin oleva DNA. Duodecim 2015;131:424 32 = Tiedosta taidoksi

Kasvain Apoptoosi / nekroosi / aktiivinen eritys Nukleosomi Kiertävä syöpäsolu Kromosomitason mutaatio Pistemutaatio Syöpälähtöinen mikrovesikkeli Metylaatiomuutos KUVA 1. Syöpälähtöisen ctdna:n vapautuminen verenkiertoon. Syöpäkasvaimissa esiintyy usein hypoksiaan liittyvää apoptoosia ja nekroosia. Hajoavasta kudoksesta vapautuu pilkkoutunutta DNA:ta, josta ainakin osa kulkeutuu verenkiertoon (2, 4, 6). Solutuho koskee syöpäsolujen ohella stroomaa ja ympäröiviä kudoksia, mikä havaitaan samanaikaisena ctdna:n ja cfdna:n kokonaismäärän lisääntymisenä. Myös elävät solut voivat erittää cfdna:ta ympäristöönsä. Mekanismeja on useita, ja cfdna voi olla esimerkiksi osa nukleosomeja tai pakkautuneena erilaisiin vesikkeleihin. Myöhemmin samat rakenteet suojaavat cfdna:ta veren nukleaaseilta (3). Eritetyillä nukleiinihapoilla ja proteiineilla on useita solujen normaaliin viestinvälitykseen ja itsesäätelyyn liittyviä tehtäviä, minkä lisäksi ne ovat yhteydessä syöpään ja sen patogeneesiin (10). Verenkierron solunulkoinen DNA Solunulkoinen DNA (cf DNA) tarkoittaa nimensä mukaisesti kaikkea elimistössä solujen ulkopuolella esiintyvää DNA:ta. Termi kiertävä kasvain-dna (ctdna) viittaa yksinomaan syöpäsoluista lähtöisin olevaan cf DNA:han (TAULUKKO 1) (3). Syöpätutkimuksen ja -diagnostiikan yhteydessä käytetään myös käsitettä "nestebiopsia (liquid biopsy) (2), joka tarkoittaa veren tai muiden kehon nesteiden käyttöä syöpänäytteenä tutkittaessa esimerkiksi cf DNA:ta tai veressä kiertäviä syöpäsoluja (CTC). Syöpäpotilailla veren cf DNA-pitoisuus on tyypillisesti kasvanut: terveiden ihmisten veressä cf DNA:ta on yleensä muutamia nanogrammoja millilitraa kohden, pitkälle edenneessä syöpätaudissa pitoisuus voi olla jopa 100 1 000 µg/l (4, 5). Osa tästä DNA:sta on peräisin kasvainsoluista. ctdna:n suhteellinen osuus koko cf DNA:sta on yleensä pieni, noin 0,01 1 %, mutta myös yli 90 %:n osuuksia on mitattu (4, 6, 7). Syöpätyyppi, kasvaintaakka ja kasvaimen kliinis-patologiset ominaisuudet vaikuttavat siihen, kuinka paljon ctdna:ta vapautuu verenkiertoon (8). cf DNA:n kokonaismäärää voivat kasvattaa lisäksi aivohalvaus, autoimmuunisairaudet, traumat ja monet muut sairaudet ja patologiset tilat (2). Myös sytotoksiset syöpähoidot voivat aiheuttaa hetkellisen piikin cf DNA:n kokonaispitoisuudessa, ja ilmiö on hyvä ottaa huomioon esimerkiksi cf DNA-pitoisuuksien pidempiaikaisen seurannan yhteydessä (9). cf DNA:n vapautumismekanismeja on useita. Todennäköisiä cf DNA:n lähteitä ovat ainakin veren tumalliset solut, mukaan lukien CTC:t, jotka hajoavat in vivo tai verinäytteen ottamisen jälkeen koeputkessa. CTC:t ovat 425 Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena

KATSAUS kuitenkin verrattain harvinaisia, eikä niistä vapautuva genominen DNA yksin riitä selittämään syöpäpotilaiden suurimpia ctdna-pitoisuuksia (8). Nukleiinihappoja siirtyykin vereen apoptoosin eli ohjelmoituneen solukuoleman, nekroosin ja aktiivisen erityksen välityksellä myös suoraan kasvaimesta (KUVA 1) (2, 3, 4, 6, 10). cfdna syöpätutkimuksessa ja -diagnostiikassa Veren cf DNA:n käyttö syöpätutkimuksessa ja hoitojen tukena on lisääntyvän kansainvälisen kiinnostuksen kohteena. Kudosnäytteistä eristettyyn DNA:han verrattuna cf DNA:lla on useita diagnostista käyttöä puoltavia ominaisuuksia (TAULUKKO 2). Yksinkertaisin tapa hyödyntää cf DNA:ta syövän merkkiaineena on tarkastella sen kokonaismäärää veressä. Suuria cf DNA-pitoisuuksia on mitattu muun muassa ei-pienisoluisen keuhkosyövän, eturauhassyövän, kohtusyövän ja hepatosellulaarisen karsinooman yhteydessä (5, 11, 12, 13). Ero terveisiin ihmisiin ja niihin, joilla on vain hyvänlaatuisia kasvaimia, on usein merkittävä, vaikka kyseessä olisi matalan levinneisyysasteen syöpäkasvain. Lisäksi ainakin kolorektaalisyövässä yksittäisten potilaiden cf DNA-pitoisuuksien päiväkohtaisen vaihtelun on havaittu olevan vähäistä (14). Veren cf DNA-pitoisuudella on todennäköisesti myös ennusteellinen merkitys. Esimerkiksi kohtusyövässä ja hepatosellulaarisessa karsinoomassa suurten mittaustulosten on havaittu olevan yhteydessä lyhyeen elossaoloaikaan (12, 13). Tutkimustulokset eivät kuitenkaan ole näiltä osin yksiselitteisiä, ja myös cf DNA-pitoisuuden ja syövän kliinis-patologisten ominaisuuksien välinen yhteys on epäselvä: toisinaan suurten cf DNA-pitoisuuksien on havaittu olevan yhteydessä korkeaan levinneisyys- tai erilaistumisasteeseen sekä kasvaimen suureen kokoon, toisissa tutkimuksissa tällaista yhteyttä ei ole kyetty osoittamaan (5, 11, 12, 13). cf DNA:n kokonaispitoisuuden käyttö syövän merkkiaineena on hankalaa, sillä aiheesta julkaistujen tutkimusten tulokset vaihtelevat merkittävästi. Tähän vaikuttavat ainakin erot verinäytteiden ottamisessa ja käsittelyssä, DNA:n eristämismenetelmissä sekä lopullisen saannon määrittävissä mittaustekniikoissa. Muutkin kuin syöpäsairaudet voivat aiheuttaa muutoksia cf DNA-pitoisuuksiin ja vaikeuttaa diagnostiikkaa. Syövän genotyypitys. Veren cf DNA:n kokonaismäärää parempi vaihtoehto syövän merkkiaineeksi on kasvainlähtöinen ctdna. Veren nukleiinihapoista voidaan usein määrittää kunkin syövän somaattiset mutaatiot, mukaan lukien kromosomitason muutokset kuten geenien monistumat ja translokaatiot. Potilaiden verestä on määritetty monien merkittävien syöpägeenien mutaatioita. Tällaisia geenejä ovat esimerkiksi TP53, EGFR, KRAS, BRAF, APC ja PIK3CA (7, 15, 16, 17, 18). ERK-viestinvälitysreitin toimintaan TAULUKKO 2. Kudos- ja verinäytteiden (ns. nestebiopsia) käytettävyyteen liittyviä eroja. Kudosnäyte Nestebiopsia Saatavuus Vaihtelee Aina 1 Kajoavuus Kohtalainen tai suuri Vähäinen Toistuvan näytteenoton mahdollisuus Yleensä ei Kyllä DNA:n laatu (eheys) Tuorekudos: hyvä cfdna: kohtalainen Fiksoitu kudos: kohtalainen Histopatologisen tutkimuksen mahdollisuus Kyllä Ei Huomioi syövän klonaalisen heterogeenisuuden Yleensä ei Todennäköisesti 426 1 Onkogeenisiä mutaatioita tutkittaessa riippuu muun muassa syövän tyypistä, löytyykö verestä analysoitavissa oleva määrä ctdna:ta. A. Isomursu ym.

osallistuvien EGFR-, KRAS- ja BRAF-geenien aktivoivat mutaatiot vaikuttavat useissa tapauk sissa suoraan käytettävän lääkehoidon valintaan, ja esimerkiksi pienimolekyyliset tyrosiinikinaasin estäjät ovat vakiintuneet osaksi EGFR-mutaatiopositiivisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän hoitoa. Koska keuhkosyövästä ei usein saada kudosnäytettä kasvain-dna:n eristämiseksi, ctdna-pohjaiset mutaatiotutkimukset voivat tulevaisuudessa auttaa kohdentamaan parhaat olemassa olevat hoitomuodot niistä todennäköisimmin hyötyville potilaille (18). Esimerkiksi Keski-Suomen sairaanhoitopiirin patologian yksikössä plasmapohjaisia EGFR-mutaatiomäärityksiä on jo kokeiltu onnistuneesti. ctdna:ta voidaan hyödyntää myös syövän hoitoresistenttien muotojen havaitsemisessa. KRAS- ja NRAS-geenien aktivoivat mutaatiot tekevät kolorektaalisyövän solut vastustuskykyisiksi EGFR-vasta-aineille. Villin tyypin RAS-geenejä ilmentävät kasvaimet reagoivat hoitoihin usein suotuisasti, mutta näissäkin tapauksissa tauti kehittyy ennen pitkää lääkeresistentiksi. Verinäytteitä tutkimalla on havaittu, että myös hankinnainen resistenssi johtuu usein syöpäsolujen joukossa yleistyvistä ERK-reitin geenien, pääasiassa KRAS:n, patogeenisista mutaatioista (8). Ensimmäiset mutaatiot voidaan havaita usein jo kuukausia ennen taudin kliinistä etenemistä (19). Myös pienimolekyylisille EGFR:n estäjille resistenssin aiheuttavia EGFR-geenin p.t790m-mutaatioita on määritetty keuhkosyöpäpotilaiden ctdna:sta (17). Kun tietty resistenssimutaatio havaitaan, potilaan hoitoon voidaan tehdä hyvissä ajoin tarvittavia muutoksia. Yksittäisten syöpägeenien genotyypitystä kattavammat eksomi- ja genomisekvensointi ovat jo laajalti tutkimuskäytössä, ja lähitulevaisuudessa menetelmät saattavat muokata myös kliinisiä käytäntöjä. Uusilla sekvensointitekniikoilla on analysoitu syöpäpotilaiden ctdna:ta, ja tulosten on havaittu vastaavan pääasiassa hyvin sekä primaarikasvaimen että mahdollisten etäpesäkkeiden geneettisiä profiileja (8, 15, 20). Jatkossa verinäytteistä tehtävät analyysit voivat auttaa osoittamaan entistä kattavammin kunkin syövän eri solupopulaatioissa esiintyvät geneettiset muutokset. Käytännössä tämä parantaisi erilaisten kliinisten mutaatiomääritysten luotettavuutta. ctdna taudin havaitsemisessa ja seurannassa. Syövän somaattiset mutaatiot mahdollistavat ctdna:n havaitsemisen ja sen määrällisen tarkastelun: kun kasvaimelle ominainen mutaatio on määritetty kudosnäytteestä tai suoraan verta tutkimalla, kyseistä merkki- Useimpien syöpäpotilaiden veressä voidaan havaita kasvainlähtöistä ctdna:ta ainetta voidaan käyttää apuna erotettaessa syöpäsoluista ja terveestä kudoksesta lähtöisin oleva cf DNA toisistaan. Näin voidaan saada osoitus elimistössä mahdollisesti olevasta syöpäkudoksesta ja sen määrästä. Useimpien syöpäpotilaiden veressä voidaan havaita kasvainlähtöistä ctdna:ta. Neljä syöpätyyppiä (rinta-, haima- ja paksusuolisyövät sekä maha- ja ruokatorvisyöpä) käsittävässä aineistossa näiden potilaiden suhteellinen osuus vaihteli muun muassa sen mukaan, oliko kyseessä paikallinen kasvain (49 78 %) vai metastasoinut tauti (86 100 %) (8). Eri syöpätyyppien välillä on havaittavissa huomattavia eroja: esimerkiksi keskushermoston kasvaintaudeissa verestä löytyy ctdna:ta verrattain harvoin, mutta kolorektaalisyövässä ja metastaattisessa rintasyövässä verenkierron onkogeeniset mutaatiot ovat niin yleisiä, että niiden herkkyys taudin osoittamisessa on todettu paremmaksi kuin nykyään käytössä olevien merkkiaineiden CA 15-3:n (85 % vs 59 %) ja CEA:n (100 % vs 56 %) (7, 15). ctdna on teoriassa erittäin tarkka merkkiaine, sillä syöpägeenien aktivoivia mutaatioita ei pitäisi löytyä terveiden henkilöiden verestä. ctdna:n hyödyntämiseen esimerkiksi erilaisten riskiryhmien syöpäseulonnoissa liittyy valitettavasti myös ongelmia: eri syövissä esiintyy erilaisia mutaatioita, ja laajojen geenipaneelien tutkiminen rutiinimaisesti on nykyään sekä työlästä että kallista. Monissa tapauksissa syöpäkasvaimet voidaan havaita ctdna:n avulla kauan ennen kuin ne ovat radiologisesti kuvannettavissa. Lääkärin näkökulmasta tilanne on erityisen vaikea silloin, kun positii- 427 Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena

KATSAUS 428 YDINASIAT 88 Uusien biologisten syöpälääkkeiden tehokas hyödyntäminen edellyttää entistä tarkempien ja monipuolisempien prediktiivisten merkkiaineiden käyttöönottoa. 88 Solujen tuhoutuminen ja aktiiviset eritysmekanismit vapauttavat verenkiertoon DNA:ta, joka voidaan eristää ja analysoida molekyylipatologisin menetelmin. 88 Solunulkoista DNA:ta voidaan käyttää apuna esimerkiksi syövän varhaisvaiheen diagnostiikassa, genotyypityksessä, hoitovasteen seurannassa ja hankinnaisten resistenssimekanismien sekä mahdollisen jäännöstaudin havaitsemisessa. 88 Tutkimustiedon kliininen hyödyntäminen edellyttää menetelmien ja raportoinnin yhtenäistämistä sekä kattavia kliinisiä hoitokokeita. vista ctdna-testiä seuraavat jatkotutkimukset osoittautuvat negatiivisiksi; pelkästä syövän genomista ei voida edelleenkään päätellä luotettavasti kasvaimen tyyppiä tai sijaintia. Myös ctdna:n tarkkuuteen liittyy poikkeuksia: esimerkiksi melanoomaan yhdistettävä BRAFgeenin p.v600e-mutaatio on yleinen myös hyvänlaatuisissa pigmenttiluomissa, ja tätä mutanttialleelia voi esiintyä pieninä määrinä myös terveiden henkilöiden verenkierrossa (16, 21). Veren onkogeenisten mutaatioiden ja syövän välinen yhteys on kuitenkin kiistaton, ja taudin varhainen toteaminen parantaa usein potilaan ennustetta huomattavasti. Nestebiopsian käyttöä syöpätautien havaitsemisessa onkin syytä tutkia myös jatkossa. ctdna:n määrässä on suuria eroja jopa samaa syöpätyyppiä sairastavien potilaiden välillä (8). Osa vaihtelusta voidaan selittää merkkiaineina käytettyjen geenien kopiolukumuutoksilla (geenin monistuma lisää kyseisen geenin ja sen somaattisten mutaatioiden lukumäärää veressä), mutta myös taudin kliinis-patologisilla ominaisuuksilla on merkitystä: ctdna:n absoluuttinen määrä ja osuus cf DNA:n kokonaispitoisuudesta ovat molemmat yhteydessä esimerkiksi syövän levinneisyysasteeseen (6, 8). ctdna:n määrä seuraa useimmilla potilailla varsin hyvin radiologisesti mitattua kasvaintaakkaa, ja niinpä mittaustuloksia voidaan käyttää apuna hoitovasteen arvioinnissa. On myös tutkittu, kuinka suurella osalla metastaattista rintasyöpää sairastavista potilaista eri merkkiaineiden pitoisuudet lisääntyvät ennen taudin kliinistä etenemistä (15). ctdna osoittautui tässäkin suhteessa herkemmäksi merkkiaineeksi kuin CA 15-3 (89 % vs 50 %). Toisaalta ctdna on myös ennusteellinen merkkiaine, jonka suuri pitoisuus hoidon eri vaiheissa on usein yhteydessä ly hyeen elossaoloaikaan (8, 15). ctdna:sta voi olla apua myös jäännöstaudin paljastamisessa. On havaittu, että kolorektaalisyöpäpotilailta keskimäärin kuukausi leikkauksen jälkeen otetuista verinäytteistä todetut onkogeeniset mutaatiot ennustavat taudin uusiutumista (7). Mikäli taudille ominainen mutaatio havaittiin, uusiutumisen todennäköisyys oli 94 % (16 potilasta), muussa tapauksessa se oli 0 % (neljä potilasta). Ero on pienestä otoskoosta huolimatta tilastollisesti merkitsevä. Mikäli mahdollinen jäännöstauti kyetään löytämään luotettavasti jo ennen syövän kliinistä uusiutumista, potilaan seuranta ja jatkohoito voidaan räätälöidä paremmin tilanteeseen sopiviksi. Vaihtoehtoiset tutkimussuunnat. Nestebiopsiaa käsittelevät tutkimukset eivät keskity pelkästään veren cf DNA:n määrään ja onkogeenisiin mutaatioihin. Esimerkiksi cf DNA:n metylaatiotesteillä on havaittu kohdun, rinnan ja monia muitakin syöpäkasvaimia (22, 23). cf DNA:n eheyden on puolestaan todettu olevan yhteydessä muun muassa haima-, kolorektaali-, rinta- ja gynekologisiin syöpiin, vaikkakin useat näistä tutkimustuloksista ovat yhä ristiriitaisia ja vaikeasti yleistettävissä (6, 24, 25). Monet virukset voivat aiheuttaa syöpää, ja esimerkiksi plasmasta eristettävä Epstein Barrin viruksen (EBV) DNA saattaa olla käyttökelpoinen merkkiaine tiettyjen EBV-positiivisten syöpien diagnostiikassa (26). CTC:iden käyttöä syöpädiagnostiikassa on tutkittu vuosia. Solujen eristämiseen on A. Isomursu ym.

olemassa useita erilaisia menetelmiä, joista valtaosa perustuu epiteelisolujen kiinnittymisproteiini EpCAM:n (epithelial cell adhesion molecule) tunnistamiseen. CTC:t voivat olla merkittävä ennustemerkkiaine: niiden suuri määrä on yhdistetty heikkoon ennusteeseen esimerkiksi ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä, metastaattisessa silmämelanoomassa ja metastaattisessa rintasyövässä (15, 27, 28). Toisaalta ctdna on todettu CTC:itä herkemmäksi merkkiaineeksi niin taudin havaitsemisessa, kasvaintaakan seuraamisessa kuin kasvainten genotyypittämisessäkin (8, 15, 27, 28). Aihetta käsittelevää tutkimustietoa on kuitenkin yhä melko vähän, ja lisäksi elinkykyisinä eristettyjen syöpäsolujen voidaan ajatella tarjoavan pelkkää genotyyppiä kokonaisvaltaisemmin tietoa taudin biologiasta. Solujen käyttöä esimerkiksi kasvaimen lääkeaineherkkyyden arvioinnissa onkin alettu tutkia (29). CTC:iden merkitys merkkiaineena voi lisääntyä tulevaisuudessa, kun solujen eristämiseen ja analysointiin käytettävät menetelmät kehittyvät (29, 30). Erilaisilla solunulkoisilla vesikkeleillä on merkittävä rooli syövän patogeneesissa, esimerkiksi glioblastoomassa syöpäsolujen erit- TAULUKKO 3. ctdna:n analysointiin käytettyjä menetelmiä. Eri tekniikat soveltuvat toimintamekanisminsa puolesta erilaisiin tarkoituksiin, kuten ctdna:n genotyypitykseen ja kvantitointiin. Lista ei ole kattava, vaan muitakin menetelmiä on käytetty. Tutkimusmenetelmä(t) qpcr dpcr, BEAMing DCE HRM DK PARE ME-PCR, COLD-PCR, WTB-PCR NGS Toimintaperiaate Spesifiset koettimet ja fluoresoivat merkkiaineet osoittavat PCR-reaktiossa monistuvan mutanttialleelin reaaliajassa. Laimennetun näytteen DNA-juosteet monistetaan muista erillään ja genotyypitetään alleelispesifisten koettimien sekä fluoresoivien merkkiaineiden avulla. Kvantitatiiviset tulokset luetaan yleensä vasta PCR-reaktion jälkeen (vrt. qpcr). Kapillaarin olosuhteet denaturoivat osittain tietyt geelissä liikkuvat DNAkaksoisjuosteet. Tämä vaikuttaa juosteiden kulkeutumisnopeuteen ja mahdollistaa eri genotyyppien tehokkaan erottelun ajon jälkeen. Fluoresoivalla merkkiaineella leimattua kaksijuosteista DNA:ta lämmitetään hitaasti, ja muutokset fluoresenssissa mitataan reaaliajassa. Sulamisprofiilista voidaan osoittaa mahdolliset mutaatiot tai metylaatiomuutokset. Restriktioentsyymeillä pilkottua DNA:ta monistetaan ja sekvensoidaan koe tinkirjastoiksi. Koettimien lukumäärä ja sijainti suhteessa kromosomeihin kertoo syövän perimässä tapahtuneista kopiolukumuutoksista. Somaattisia translokaatioita käytetään yksilöllistettyinä merkkiaineina, ja ctdna:n määrä näytteessä mitataan muutosten suhteen spesifisiä alukepareja hyödyntävällä PCR:llä. Joukko PCR-menetelmiä, joissa pyritään estämään villin tyypin juosteiden monistuminen esim. sopivan restriktioentsyymin, tarkan lämpötilasäätelyn tai villin tyypin geeniin sitoutuvan DNA-koettimen avulla. Toisen sukupolven sekvensointimenetelmät soveltuvat erinomaisesti useiden geenien ja DNA-näytteiden emäsjärjestyksen yhtäaikaiseen selvittämiseen. Käyvät sellaisinaan myös verestä eristetyn ctdna:n määrän arvioimiseen. Arvioitu osoitustarkkuus 1 1 % 0,001 0,1 % 1 % 0,1 10 % 1 % 0,001 % 0,01 1 % 0,1 2 % 1 Mutantin osuus koko DNA:sta. qpcr = kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio, BEAMing = helmet, emulsio, monistus ja magnetismi (beads, emulsion, amplification and magnetics) (33), DCE = denaturoiva kapillaarielektroforeesi (34), HRM = hyväresoluutioinen sulatus (35), DK = digitaalinen karyotyypitys (36), PARE = uudelleenjärjestettyjen päiden yksilöllistetty analyysi (personalized analysis of rearranged ends) (37), ME-PCR = mutanttirikastettu PCR (38), COLD-PCR = yhteismonistus madalletussa denaturointilämpötilassa -PCR (co- amplification at lower denaturation temperature PCR) (39), WTB-PCR = villin tyypin poissulkeva PCR (40), NGS = uuden sukupolven sekvensointi 429 Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena

KATSAUS Resektio Biologinen lääkitys Kemoterapia Määrä 1 2 3 4 5 Kasvaintaakka Alkuvaiheen somaattinen mutaatio Resistenssimutaatio Aika KUVA 2. ctdna:n hyödyntäminen syöpähoitojen tukena. Mahdollisia käyttökohteita ovat esimerkiksi 1) taudin varhainen toteaminen, 2) jäännöstaudin havaitseminen, 3) hoitovastetta ennakoivat mutaatiomääritykset (esim. kliininen RAS- tai EGFR-testaus), 4) hoitovasteen ja kasvaintaakan seuranta sekä 5) hankinnaisen resistenssin havaitseminen. 430 tämät vesikkelit voivat edistää angiogeneesiä ja syöpäsolujen kasvua (31). Vesikkelien vaikutukset perustuvat niiden sisältämiin bioaktiivisiin molekyyleihin, joihin kuuluu vaihtelevassa suhteessa niin onkogeenisiä proteiineja, RNA:ta kuin DNA:takin. Nukleiinihappojen sekvenssit vastaavat kasvainsolujen genotyyppiä, ja syöpien mutaatiomäärityksiä onkin tehty myös esimerkiksi vesikkeleistä eristettyjen lähetti-rna-molekyylien käänteiskopioinnin avulla (10, 31). Teknologian merkitys cf DNA:ta on veressä melko vähän, ja tästäkin määrästä yleensä vain pieni osa on lähtöisin syöpäsoluista. Niinpä laitteistojen ja menetelmien herkkyydellä on varsinkin ctdnaanalytiikassa erittäin keskeinen merkitys (TAU- LUKKO 3). Yksi lupaavimmista molekyylipatologisista tutkimusmenetelmistä on digitaalinen polymeraasiketjureaktio (dpcr, digital polymerase chain reaction): tällä täysin kvantitatiivisella tekniikalla voidaan osoittaa erittäin pieniä ctdna-pitoisuuksia, usein varsin kohtuullisin yksikkökustannuksin (32). Monet ctdna-tutkimukseen käytetyistä menetelmistä edellyttävät tutkijalta tai lääkäriltä ennakkokäsitystä etsittävästä mutaatiosta. Perusteena voi olla esimerkiksi taudin tyyppi tai eri hoitovaihtoehtoihin liittyvä selvitystarve. Kohteena oleva mutaatio on myös voitu määrittää jo aiemmin kudosnäytteestä, jolloin uuden testin tehtäväksi jää potilaan ctdna:n havaitseminen tai sen määrän selvittäminen. Lopuksi Syöpätutkimus ja uusien hoitomuotojen kehittäminen perustuvat syövän aineenvaihdunnan ja viestinvälitysreittien ymmärtämiseen, ja usein tieto taudin perimästä ohjaa suoraan myös hoitopäätöksiä. Monien syöpätyyppien uusille merkkiaineille on olemassa selkeä tarve. Verestä eristettävä cf DNA voi tulevaisuudessa helpottaa syöpien geneettistä profilointia ja taudin kulun seurantaa tarjoamalla nopean ja turvallisen tavan arvioida potilaan hoitovastetta ja hankkia geneettistä materiaalia tutkimuksia varten (KUVA 2). Kasvainten histopatologinen tarkastelu on yhä tärkeä osa syöpädiagnostiikkaa. Erilaisten geneettisten hoitoindikaatioiden yleistyessä sairaalat joutuvat kuitenkin kehittämään myös molekyylipatologisia valmiuksiaan, ja samalla voidaan luontevasti ottaa käyttöön tekniikoita cf DNA:n eristämiseksi ja analysoimiseksi. Tutkimusmenetelmien ja tulosten raportoinnin tulee jatkossa yhtenäistyä siten, että eri cf DNA-tutkimusten vertaaminen keskenään on mielekästä. Uusien menetelmien siirtyminen tutkimuslaboratorioista syöpäklinikkaan edellyttää lisäksi eteneviä kliinisiä hoitokokeita. Parhaillaan on käynnissä esimerkiksi koeasetelma, jonka tarkoituksena on verrata ctdna:n ja tietokonetomografian käyttökelpoisuutta kolorektaalisyövän hoitovasteen arvioinnissa (NCT01983098). Suomessa syöpätutkijoiden kannattaa hyödyntää myös biopankkien tarjoamat mahdollisuudet. Tuorekudoksen rinnalla säilytettävät plasmanäytteet voivat sisältää paljon arvokasta tietoa. A. Isomursu ym.

KIRJALLISUUTTA 1. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, ym. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883 92. 2. Diaz LA Jr, Bardelli A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J Clin Oncol 2014;32:579 86. 3. Peters DL, Pretorius PJ. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA: a new paradigm in genetic behaviour. Clin Chim Acta 2011;412:806 11. 4. Jahr S, Hentze H, Englisch S, ym. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001;61:1659 65. 5. Sozzi G, Conte D, Mariani L, ym. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during followup of lung cancer patients. Cancer Res 2001;61:4675 8. 6. Diehl F, Li M, Dressman D, ym. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:16368 73. 7. Diehl F, Schmidt K, Choti MA, ym. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008;14:985 90. 8. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, ym. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014;6:224ra24. 9. Swystun LL, Mukherjee S, Liaw PC. Breast cancer chemotherapy induces the release of cell-free DNA, a novel procoagulant stimulus. J Thromb Haemost 2011;9:2313 21. 10. Rak J. Extracellular vesicles - biomarkers and effectors of the cellular interactome in cancer. Front Pharmacol 2013;4:21. 11. Wroclawski ML, Serpa-Neto A, Fonseca FL, ym. Cell-free plasma DNA as biochemical biomarker for the diagnosis and follow-up of prostate cancer patients. Tumour Biol 2013;34:2921 7. 12. Kamat AA, Baldwin M, Urbauer D, ym. Plasma cell-free DNA in ovarian cancer: an independent prognostic biomarker. Cancer 2010;116:1918 25. 13. Ren N, Ye QH, Qin LX, Zhang BH, Liu YK, Tang ZY. Circulating DNA level is negatively associated with the long-term survival of hepatocellular carcinoma patients. World J Gastroenterol 2006;12:3911 4. 14. Frattini M, Balestra D, Verderio P, ym. Reproducibility of a semiquantitative measurement of circulating DNA in plasma from neoplastic patients. J Clin Oncol 2005;23:3163 4. 15. Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, ym. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med 2013;368:1199 209. 16. Pupilli C, Pinzani P, Salvianti F, ym. Circulating BRAFV600E in the diagnosis and follow-up of differentiated papillary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 2013;98:3359 65. 17. Taniguchi K, Uchida J, Nishino K, ym. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2011;17:7808 15. 18. Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, ym. Gefitinib treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC: circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status. J Thorac Oncol 2014;9:1345 53. 19. Misale S, Yaeger R, Hobor S, ym. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-egfr therapy in colorectal cancer. Nature 2012;486:532 6. 20. Chan KC, Jiang P, Zheng YW, ym. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin Chem 2013;59:211 24. 21. Indsto JO, Kumar S, Wang L, Crotty KA, Arbuckle SM, Mann GJ. Low prevalence of RAS-RAF-activating mutations in Spitz melanocytic nevi compared with other melanocytic lesions. J Cutan Pathol 2007;34:448 55. 22. Liggett TE, Melnikov A, Yi Q, ym. Distinctive DNA methylation patterns of cell-free plasma DNA in women with malignant ovarian tumors. Gynecol Oncol 2011;120:113 20. 23. Hoque MO, Feng Q, Toure P, ym. Detection of aberrant methylation of four genes in plasma DNA for the detection of breast cancer. J Clin Oncol 2006;24:4262 9. 24. Umetani N, Kim J, Hiramatsu S, ym. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR for ALU repeats. Clin Chem 2006;52:1062 9. 25. Wang BG, Huang HY, Chen YC, ym. Increased plasma DNA integrity in cancer patients. Cancer Res 2003;63:3966 8. 26. Gandhi MK, Lambley E, Burrows J, ym. Plasma Epstein-Barr virus (EBV) DNA is a biomarker for EBV-positive Hodgkin s lymphoma. Clin Cancer Res 2006;12:460 4. 27. Punnoose EA, Atwal S, Liu W, ym. Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer: association with clinical endpoints in a phase II clinical trial of pertuzumab and erlotinib. Clin Cancer Res 2012;18:2391 401. 28. Bidard FC, Madic J, Mariani P, ym. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. Int J Cancer 2014;134:1207 13. 29. Gallant JN, Matthew EM, Cheng H, ym. Predicting therapy response in live tumor cells isolated with the flexible micro spring array device. Cell Cycle 2013;12:2132 43. 30. Flores LM, Kindelberger DW, Ligon AH, ym. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast cancer. Br J Cancer 2010;102:1495 502. 31. Skog J, Würdinger T, van Rijn S, ym. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol 2008;10:1470 6. 32. Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:9236 41. 33. Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:8817 22. 34. Khrapko K, Hanekamp JS, Thilly WG, Belenkii A, Foret F, Karger BL. Constant denaturant capillary electrophoresis (CDCE): a high resolution approach to mutational analysis. Nucleic Acids Res 1994;22:364 9. 35. Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem 2003;49:853 60. 36. Wang TL, Maierhofer C, Speicher MR, ym. Digital karyotyping. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:16156 61. 37. Leary RJ, Kinde I, Diehl F, ym. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci Transl Med 2010;2:20ra14. 38. Kahn SM, Jiang W, Culbertson TA, ym. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via enriched PCR amplification. Oncogene 1991;6:1079 83. 39. Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos GM. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 2008;14:579 84. 40. Dominguez PL, Kolodney MS. Wildtype blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene 2005;24:6830 4. 431 Verenkierron solunulkoinen DNA syövän merkkiaineena

KATSAUS Summary Circulating cell-free DNA as biomarker for cancer *header* The rapid accumulation of mutations in cancers and the resulting clonal heterogeneity frequently lead to generation of drug-resistant populations of cancer cells. Examinations requiring a tissue biopsy are invasive, making real-time monitoring of the disease difficult. One alternative to support tissue-based testing is fluid biopsy. Malignant cells release to the patient s circulation DNA, which contains somatic mutations and epigenetic changes characteristic of each cancer. Sufficiently sensitive methods of investigation enable the detection of tumor DNA in the blood sample, whereby it can be utilized e.g. in the monitoring of disease progression. ALEKSI ISOMURSU, solu- ja molekyylibiologian maisterivaiheen opiskelija Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Jyväskylän yliopisto TEIJO KUOPIO, dosentti, ma. professori Patologia, Keski-Suomen keskussairaala ja Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Jyväskylän yliopisto JUHA KONONEN, LT, onkologiaan erikoistuva lääkäri Syöpätaudit ja sädehoito, Keski-Suomen keskussairaala ja Syövänhoidon vastuualue, Tays SIDONNAISUUDET Aleksi Isomursu: Ei sidonnaisuuksia Juha Kononen: Apuraha (Roche, Amgen), asiantuntijapalkkio (GSK), luentopalkkio (GSK, Amgen, Celgene, Merck, Sanofi), patentti (NIH), lisenssitulo tai tekijänpalkkio (NIH), koulutus/kongressikuluja yrityksen tuella (Novartis, GSK, Roche, Amgen) Teijo Kuopio: Apuraha (Amgen), asiantuntijapalkkio (Amgen), luentopalkkio (Amgen), koulutus/kongressikuluja yrityksen tuella (Roche, Takeda-Leiras, AstraZeneca) Tämä on Mitä opin -artikkeli. Artikkeliin liittyvät interaktiiviset kysymykset löydät lehden verkkosivustolta www.duodecimlehti.fi