Marjatta Piipponen α-4 integriinin merkitys kantasolusiirteen tarttumisnopeuden ennustamisessa Metropolia Ammattikorkeakoulu Bioanalyytikko AMK Bioanalytiikan koulutusohjelma Opinnäytetyö Päivämäärä 2.5.2013
Tiivistelmä Tekijä Otsikko Sivumäärä Aika Marjatta Piipponen α-4 integriinin merkitys kantasolusiirteen tarttumisnopeuden ennustamisessa 26 sivua + 2 liitettä 2.5.2013 Tutkinto Sosiaali- ja terveysalan ammattikorkeakoulututkinto Koulutusohjelma Bioanalytiikan koulutusohjelma Suuntautumisvaihtoehto Ohjaajat Bioanalytiikka Erikoislääkäri Sanna Siitonen Osastonylilääkäri Riitta Alitalo Yliopettaja Riitta Lumme Alpha 4 integriinit ovat solun pinnan reseptoreita, joilla on osuus solujen liikkumisessa ja kiinnittymisessä kudoksissa. Kerättäessä kantasolusiirrettä verestä, joudutaan henkilöille antamaan kasvutekijä ja muuta hoitoa joka vaikuttaa hematopoieettisten kantasolujen alpha 4 integriineihin, ja saa kantasolut liikkeelle luuytimestä verenkiertoon. Tässä työssä on pyritty kehittämään CD49d vasta-aineella alpha 4 integriinin ilmentymisvoimakkuuden määritystä varten virtaussytometrinen menetelmä ja katsottu voidaanko em. menetelmää käyttää kantasolusiirteiden tarttumisnopeuden ennustamiseen. Työ on tehty Saksalaisen tutkimusryhmän Blood- lehdessä julkaiseman tutkimuksen innoittamana ja tarkoitus oli tutkia olisiko tutkimuksen tulos toistettavissa laboratoriossamme, myös muilla kantasolusiirteillä, kuin verensiirteillä, joita em. tutkimuksessa oli vertailtu. Työssä on tutkittu myös muiden mahdollisten siirteen tarttumiseen vaikuttavien seikkojen, kuten kantasoluviljelytuloksen ja siirteen CD34 positiivisten solujen pitoisuuden vaikutusta neutrofiilien nousun nopeuteen. Samalla on tutkittu normaalien hematopoieettisten kantasolujen CD34+CD38dim ilmentymää ja CD96+ ilmentymää ja niiden määrää ja sijaintia. Tutkimuksen kuluessa saatiin kerättyä 32 siirteen näytteet ja niistä saatujen tulosten perusteella ei korrelaatiota löytynyt hematopoieettisten kantasolujen alpha 4 integriinin ilmentymälle ja neutrofiilitason toipumiselle. Jotta määritys voitaisiin ottaa käyttöön, tarvitaan vielä lisätutkimuksia. Avainsanat kantasolusiirto, alpha 4-integriini, virtaussytometria, CD49d, kantasoluviljely
Abstract Author Title Number of Pages Date Degree Marjatta Piipponen The Meaning of the Expression Levels of α4 Integrin on Hematopoietic Stem Cells in The Predicting of the Time to Engraftment 26 pages + 2 appendices 2 of May 2013 Bachelor of Health Care Degree Programme Biomedical Laboratory Science Specialisation option Instructors Biomedical Laboratory Science Riitta Lumme, Principal Lecturer Sanna Siitonen, Docent Riitta Alitalo, Docent Alpha 4 integrins are trans membrane proteins that mediate the interaction between the adhesion molecules on the neighbouring cells and the extracellular matrix. To mobilize stem cells from bone marrow to peripheral blood, and to collect hematopoietic progenitor cell transplant (PBPC), one must administrate the donor with growth factors such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), which influences on cell surface integrins. In my project I developed a flowcytometric method to measure the intensity of alpha 4 integrin levels (CD49d) on the grafts hematopoietic stem cells. Secondly, I compaired the results with neutrophil regeneration time. My final project was inspired by a German study which was published by Hartz et al.in the journal Blood in October 2011. My purpose was to find out if it was possible to get the same kind of results with allogeneic HSC-grafts and bone marrow-grafts. In the German study, only autologous grafts and the recovery of the patient were examined. I also studied what the rates, distributions and antigen expressions of normal CD34+CD38dim cells were in multicolor flowcytometric analysis. Likewise, these things were examined on CD96+ cells, for the minimal residual disease analytics of different leukemia. Moreover, comparisons were made with other factors involving with HSC grafting, such as how the HSC: s in the graft grew in stem cell cultivations, and the influence of the amount of CD34+ cells in the graft. In my study, 32 samples were gathered and analyzed. No such correlation between CD49d antigen expression and grafting time was found as the Germans did in their study. Neither the correlation between other factors which were studied was found. The amount of the samples, 16 autologous and 16 allogeneic stem cell grafts, was too small to get reliable results and correlations. Further investigation is needed to show the advantages of this method. Keywords hematopoietic stemcell, CD49d, alpha 4-integrin, flowcytometry
1 Sisällys 1 Johdanto 2 2 Kantasolusiirtohoito 3 2.1 Kantasolusiirteet 3 2.2 Kantasoluviljely siirteen laadun arvioinnissa 7 3 α-4 integriini eli CD49d 9 4 Virtaussytometrinen menetelmä 12 5 Työn tarkoitus, tavoitteet ja tulokset 15 5.1 CD49d määrityksen pystyttäminen 15 5.2 Olisiko mahdollista saada samansuuntainen tulos, kuin alkuperäisessä tutkimuksessa. (Hartz 2011) 17 5.3 Saataisiinko vertailukelpoinen tulos CD49d PE vasta-aineella. 18 5.4 CD34+CD38dim- solujen ja niiden ilmentymien tutkiminen normaaliluovuttajien näytteistä 18 5.5 CD96PE vasta-aineen ilmentymien tutkiminen normaaliluovuttajien näytteissä 19 5.6 Onko kantasoluviljelytuloksella ja siirteen tarttumisen nopeudella yhteyttä? 20 5.7 CD34+ -solumäärien ja leukosyyttimäärien yhtäpitävyys vertailu 20 6 Tutkimusaineisto ja -tulokset 20 6.1 CD49d ilmentymän ja kantasolusiirteen tarttumisen nopeuden välinen yhteys 21 6.2 CD49d FITC ja CD49d PE ilmentymien vertailu 21 6.3 CD34+ CD38 dim -solujen ja CD34+CD96+ ilmentymät 22 6.4 CD34-positiivisten solujen prosenttimäärien vertailu siirteissä 24 7 Pohdinta 26 Lähteet 27 Liitteet Liite 1. Tutkittavat parametrit taulukoituna Liite 2. Analyysi pohja FaCSDiva ohjelmaan
2 1 Johdanto Hematopoieettiset kantasolusiirtohoidot ovat monen pahanlaatuisen veritaudin ainoa parantava hoitomuoto. Niihin liittyy kuitenkin paljon riskejä. Neutropenia ja immunosupressiivinen hoito altistavat potilaan erilaisille infektioille. Tavallisimmat kantasolusiirtopotilaan kuolemaan johtavat infektiot ovat neutropeeninen kuume, vaikea sepsis tai septinen shokki (Jantunen 2011). Kantasolusiirtopotilaiden kantasolusiirteen tarttumiseen kuluva aika siirron jälkeen on erittäin merkitsevä potilaan eloonjäännin kannalta. Potilaan neutrofiilitaso on matala jopa kolme viikkoa hoidon kuluessa. Kuolemaan johtavan opportunisti-infektion eli omien normaaliin bakteeriflooraan kuuluvien suun, suoliston ja ihon bakteerien aiheuttamien infektioiden riski kasvaa siirteen tarttumisen viipyessä. Myös verituotteiden siirtotarve lisääntyy, mikä lisää hoidon kustannuksia. Siirteen katsotaan tarttuneen, kun potilaan neutrofiilitaso nousee siirron jälkeen pysyvästi yli 0,5x10 9 /l, mikä kestää keskimäärin 8-19 vuorokautta (Harz 2011). Blood-lehdessä julkaistiin elokuussa 2011 tutkimus, jossa Saksalainen tutkimusryhmä (Hartz 2011) löysi mahdollisen menetelmän siirteen tarttumisnopeuden ennustamiseksi. Tutkimusryhmä löysi tutkimuksessaan korrelaation alfa 4 integriinin ilmentymisvoimakkuudelle CD34-positiivisissa kantasoluissa ja potilaan kantasolusiirteen tarttumisen nopeudelle. Tutkimuksessa verrattiin pakastettujen leukafereesinäytteiden kantasolujen alfa 4 integriinin ilmentymää CD49d vasta-aineella ja autologisen kantasolusiirron saaneiden potilaiden verisoluarvojen toipumista. Tästä heräsi kiinnostuksemme alfa 4 integriinin määritysmenetelmän kehittämiseen HUSLABin Meilahden sairaalan hematologian laboratoriossa. Halusimme selvittää olisiko tutkimustulos toistettavissa myös muilla kuin autologisilla verensiirteillä. Tässä työssä tutkin tuoreiden kantasolusiirteiden alpha 4 integriinin ilmentymää CD49d vasta-aineella, näytteistä, jotka tulevat laboratorioomme siirteen CD34-positiivisten kantasolujen pitoisuuden määritystä varten. Vertaan ilmentymän voimakkuutta siirteen tarttumisen nopeuteen. Samalla teen vertailuja myös muista siirteen tarttumiseen mahdollisesti vaikuttavista seikoista, kuten siirteen kantasoluviljelyn tuloksista ja CD34+ solujen määrästä.
3 2 Kantasolusiirtohoito Autologinen kantasolusiirto eli potilaalta itseltään kerättävien kantasolujen pakastus ja intensiivihoidon jälkeinen palautus, on vakiintunut tukihoito myelooman ja manttelisolulymfooman hoidossa. Lisäksi sitä käytetään lapsilla mm. neuroblastooman hoidossa (Leimi 2010). Autologisia kantasolusiirtoja tehdään suomessa kaikissa yliopistosairaaloissa yhteensä noin 200 vuodessa (Mahlamäki 2011.) Allogeeninen kantasolusiirto eli HLA- identtiseltä luovuttajalta saatava siirre, on puolestaan usein ensilinjan hoito keskisuuren ja suuren riskin akuuteissa myeloisissa leukemioissa ja yli 25vuotiaiden akuuteissa lymfaattisissa leukemioissa. Lisäksi hoitoa käytetään imatinibi- hoitoresistentissä kroonisessa myeloisessa leukemiassa, aggressiivisessa kroonisessa lymfaattisessa leukemiassa, aplastisessa anemiassa ja laajalle levinneissä lymfoblastisessa lymfoomassa ja Burkittin lymfoomassa (Volin 2007). Allogeenisia kantasolusiirtoja tehdään Helsingissä ja Turussa yhteensä yli 100 vuodessa (Juvonen ja Sumsa 2012). Noin kolmannekselle potilaista löytyy kudostyypiltään sopiva sisarusluovuttaja. Luuytimenluovuttajarekisteristä (LYR) saadaan seuraavaksi sopivin siirre lopuille kahdelle kolmasosalle tarvitsijoista (Juvonen ja Sumsa 2012). 2.1 Kantasolusiirteet Kantasolusiirtohoitojen alkaessa Suomessa 1981 luuydin oli ainoa hematopoieettisten kantasolujen lähde, josta siirre kerättiin. Kasvutekijähoitojen kehityttyä opittiin kasvutekijöillä mobilisoimaan kantasoluja vereen, siten että nykyään yli 90 % siirteistä kerätään leukafereesillä verestä (Korhonen 2012.) Luuytimestä kerättävää siirrettä varten luuytimen luovuttaja tulee edellisenä iltana sairaalaan. Keräyspäivänä häneltä kerätään yleisanestesiassa leikkaussalissa yhteensä noin 900 ml luuydintä, jaettuna kolmeen keräyspussiin, 300ml kuhunkin. Kaksi lääkäriä kerää luovuttajan takakristasta luuydintä, punktoimalla 1 3 millilitraa kerrallaan 20 millilitran ruiskuihin. Laboratoriohoitaja tyhjentää kerätyt erät keräysruiskuista keräyspussiin, jossa on soluille suotuisat olot antavaa elatusainetta ja hyytymisen estävää hepariinia. Keräyksen aikana avustava laboratoriohoitaja vie täyttyneestä pussista näytteen solulaskentaa varten laboratorioon verenkuva-analysaattorille. Näin tiedetään kahden pussin jälkeen koossa olevan kantasolusiirteen suuruus (tumallisten solujen määrä), ja voidaan päättää riittääkö 900ml keräys, vai joudutaanko keräämään lisää. (Torpo 2011 B) Luuytimestä kerätään yleensä 2-4x 10 8 tumallista solua / saajan painokilo. (Jantu-
4 nen 2008.) Kerätty luuydin siirretään aikuiselle saajalle suoraan keräyspusseista tai siitä poistetaan ensin punasolut ja plasmaa sentrifugoimalla siirre Cobe- solusentrifugilla. Allogeenisissä keräyksissä punasolujen ja plasman poisto suoritetaan potilaan ja luovuttajan veriryhmäerojen vuoksi tai lapsipotilailla siirteen volyymin pienentämiseksi. Autologisissa luuydinkeräyksissä siirteen Cobe käsittely suoritetaan siirteen pienentämiseksi pakastusta varten. Luovuttaja viettää vielä seuraavan yön sairaalassa ja kotiutuu aamupäivällä hemoglobiinikontrollin jälkeen. Leukafereesillä verestä kerättävä kantasolusiirre on nykyään yleisin siirretyyppi. Normaalisti hematopoieettisia kantasoluja on kiertävässä veressä hyvin vähän. Suurin osa niistä sijaitsee luuytimessä. Potilaalle tai kantasolujen luovuttajalle annetaan kasvutekijähoitoa (yleensä granulosyyttikasvutekijää) kantasolujen mobilisoimiseksi verenkiertoon. Kantasolukeräys aloitetaan, kun vereen on ilmaantunut riittäväksi katsottu määrä CD34-positiivisia kantasoluja. Monissa hoitoyksiköissä rajana pidetään vähintään 15 x 10 6 /l CD34-positiivista solua. Terveillä tämä tapahtuu 4-5 päivän kuluessa kasvutekijähoidon aloittamisesta. Luovuttaja saa kasvutekijähoidon pistoksina ihonalaiseen kudokseen kerran päivässä. Mikäli vereen ilmaantuu runsaasti CD34-positiivisia soluja, riittää keräys yhtenä päivänä. Keräystä varten asetetaan molempiin kyynärtaipeisiin kanyylit, joista toisen kautta veri menee fereesilaitteiston letkustoon, ja toisen kautta laitteisto palauttaa veren, josta on kerätty talteen mononukleaarisolufraktio, jossa kantasolut sijaitsevat. Silloin kun riittävän suuria laskimoita ei löydy kyynärtaipeista joudutaan asettamaan kaulalle keskuslaskimokatetri. Keräys kestää veren kantasolupitoisuudesta riippuen neljästä, kuuteen tuntia, jona aikana verta kiertää laitteiston läpi noin 160 litraa. (Korhonen 2012) Riittävänä pidetään veren siirrettä, jossa CD34-positiivisten solujen määrä on vähintään 2 x 10 6 /potilaan painokilo. Suuremman siirteen ilmeisin etu on verihiutaletuotannon nopeampi käynnistyminen. Tässä suhteessa optimaalisena pidetään siirrettä, jossa CD34-positiivisia soluja on vähintään 5 x 10 6 /kg. (Jantunen 2008.) Kantasolujen selekointi eli CD34-positiivisten solujen rikastaminen suoritetaan useimmiten autologisista siirteistä potilaan sairastaessa tautia, jossa maligneja soluja voi joutua kantasolusiirteeseen. Esimerkkejä tällaisista taudeista on manttelisolulymfooma aikuisilla tai neuroblastooma lapsilla. Selekointi voidaan suorittaa myös siirteen pienen-
5 tämiseksi. Selekoitu siirre on yleensä riittävä kun siinä on CD34+ -soluja vähintään 2x 10 6 /kg. Ennen kantasolukeräyksen aloittamista, tutkitaan kantasolupitoisuus verestä. Ennen autologisten siirteiden keruuta potilas saa solunsalpaaja lääkityksen (useimmiten syklofosfamidi) ennen kasvutekijähoitoa, jolloin hänen leukosyyttiarvonsa ovat hyvin matalat. CD34-positiivisten solujen määritystä varten veren leukosyyttiarvon tulee olla vähintään 1,0x10 9 /l. Luuydinsiirteistä kantasolupitoisuuden määritys suoritetaan ensimmäisestä keräyspussista, tai punasolujen ja plasman poiston jälkeen siirteestä otetusta näytteestä. Leukafereesillä kerätyistä siirteistä määritys tehdään jokaisesta kerätystä pussista (yksi pussi/päivä), sekä selekoidusta siirteestä ennen selekointia ja sen jälkeen. Kaikista siirteistä tehdään CD34-positiivisten solujen pitoisuusmääritys ennen kantasolusiirtoa. Näin tiedetään kuinka paljon CD34-positiivisia hematopoieettisia kantasoluja potilaalle annetaan. Tällä hetkellä HUSLABin Meilahden sairaalan erikoishematologian laboratorion virtaussytometriayksikössä CD34 -positiivisten solujen pitoisuusmääritys suoritetaan ns. ISHAGE-menetelmällä (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering järjestön antama ohjeistus), käyttäen Becton Dickinsonin Stem Cell enumeration reagenssipakkausta, joka sisältää kantasolureagenssin CD45FITC/CD34PE, ammoniumkloridi lysing- liuoksen ja 7-AAD reagenssin, sekä Trucount R putket, joiden avulla saadaan määritettyä absoluuttiset leukosyytti- ja kantasolupitoisuudet näytteistä. Trucount putkiin on lisätty jo tehtaalla tunnettu määrä helmiä, jotka ovat teräsverkon alla pienenä pallona putken pohjalla. 7-AAD reagenssin avulla analyysistä saadaan rajattua pois kuolleet solut. Määrityksessä käytetään niin sanottua single platform menetelmää (kaikki tulokset saadaan samoista putkista vs. dual platform menetelmä, jossa käytetään verenkuva-analysaattorin leukosyyttiarvoa absoluuttisten arvojen laskentaan) ja ISHAGE rajaus protokollaa. ISHAGE menetelmäsuositus antaa ohjeet, minkälaisia vasta-aineita tulisi käyttää, mitä liuosta käytetään punasolujen hajotukseen ja kuinka CD34-positiiviset solut tulee rajata, katso kuviot 1 ja 2. (Dauber 2011)
Kuvio 1. ISHAGE menetelmän mukaisesti tehtävät rajaukset CD34+ -solujen määrityksessä Cellquest Pro ohjelmalla FaCSCalibur virtaussytometrillä. Jokaisessa pistekuvaajassa (dotplot) on kerrottu minkä rajauksen solut siinä esiintyvät. Kuvaajan alla taas on kerrottu mitä kyseisessä pistekuvaajassa rajataan. Kuvio 1. jatkuu kuvioon 2. 6
7 Kuvio 2. Pistekuvaaja numero kahdeksassa näkyvät kaikki kerätyt tapahtumat ja siinä rajataan analyysiin mukaan elävät solut 7 AAD ilmentymän mukaan. 2.2 Kantasoluviljely siirteen laadun arvioinnissa Ennen virtaussytometrisen kantasolumääritysmenetelmän kehittymistä kantasoluviljely oli ensimmäinen keino arvioida siirteen kantasolumäärää ja kantasolujen kykyä ryhtyä tuottamaan verisoluja. Hematopoieettiset kantasolut muodostavat sopivissa kasvuolosuhteissa solupesäkkeitä puolikiinteässä kasvualustassa in vitro. Tällaisten viljelmien avulla voidaan tutkia kantasolujen määriä ja kasvuominaisuuksia (Partanen ja Ruutu 1985) Meilahden sairaalan kantasolulaboratorio suorittaa kaikista kantasolusiirteistä kantasoluviljelyn siirteen laadun varmistamiseksi. Viljelyä varten kootaan päivittäin työohjeen mukaan tuore puolikiinteä metyyliselluloosapohjainen viljelyalusta jääkaapissa ja pakastimessa säilytettävistä reagensseista. Viljelyalustaan on lisätty kasvutekijöitä.
8 Soluviljelyputkeen lisätään kantasolusiirteen laadun perusteella käytettävä näytemäärä soluviljelyä varten. Luuytimen siirteille 5x10 4, leukafereesi siirteille 0,5-1,0x10 4 ja selekoiduille siirteille 0,2x10 4 solua. Putki sekoitetaan huolellisesti ja viljeltävä seos siirretään neljälle pienelle petri-maljalle. Viljelymaljat siirretään isompaan petri-maljaan, johon mahtuu kuusi pienempää kahden vesimaljan kanssa, ja petri-malja asetetaan viljelykaappiin, jossa on optimaalinen +37C lämpötila, sekä sopiva kosteus ja 5,0 % hiilidioksidipitoisuus solujen kasvua varten. (Torpo 2011 b.) Kuvio 3 Kuvio 3. Soluviljelymaljat valmiina lämpökaapissa inkubointia varten 14 vuorokauden kuluttua lasketaan maljalle kasvaneet valkoiset ja punaiset solupesäkkeet. kuvio 4. Normaalin kasvun alarajana siirteiden viljelyissä pidetään noin 30 pesäkettä maljaa kohden, pesäkkeitä voi olla kuitenkin jopa yli 300 ennen kuin sitä pidetään epänormaalina. Vastaukseksi annetaan lausunto, jossa kommentoidaan onko kasvu normaali vai huono. (Torpo 2011 a.) Kuvio 4. Solupesäkkeiden laskentaa mikroskoopilla kahden viikon viljelyn jälkeen.
9 Kaikista allogeenisen siirteen luovuttajista tehdään luuydinnäytteen diagnostinen soluviljely. Sisarusluovuttajista se tehdään etukäteen, luovutuskelpoisuuden arvioinnin yhteydessä otettavista näytteistä ja rekisteriluovuttajista luuydinsiirteen keräyksen yhteydessä. Soluviljelyllä varmistetaan, ettei luovuttaja sairasta piilevää myeloproliferatiivista sairautta. 3 α-4 integriini eli CD49d Integriinit ovat solun pinnan reseptoreita, jotka kiinnittyvät erilaisiin soluväliaineen molekyyleihin sekä toisten solujen pinnan proteiineihin. Integriinit ankkuroivat soluja kiinni kudoksiin, ja niillä on myös tehtävä solujen liikkuessa kudoksissa. Ne ovat kahdesta glykoproteiinista koostuvia αβ-heterodimeerejä (Solunetti.fi). Vuonna 2005 oli löydetty 17 erilaista alpha osaa ja kahdeksan erilaista beeta osaa, ja 24 niistä muodostunutta erilaista yhdistelmää. Tutkittavana oleva dimeeri on α4β1. Kuvio 5. Integriinien rakenne solun pinta-antigeenina. Se ulottuu solun pinnalta solun sisälle jolloin se välittää signaaleja solun ulkopuolelta solun sisään ja päinvastoin. (Ameneh 2011)
Kuvio 6. Integriinien osuus solun kiinnittymisessä luuytimeen ja mobilisoinnissa verenkiertoon. Adheesio molekyylit mm. VCAM-1 ovat siinä tärkeässä roolissa. HSC on Hematopoieettinen kantasolu. (CD45 in the Stem Cell Niche) 10
11 Kuvio 7. Hematopoieettisten kantasolujen sijoittuminen kotipesiinsä (niche) (Shiozawa 2008.) Saksalainen tutkijaryhmä osoitti, että alfa 4 integriinin ilmentymällä on positiivinen korrelaatio siirteen tarttumiseen, riippumatta potilaan saaman siirteen CD34-positiivisten solujen määrästä (annoksesta) tai potilaan aikaisemmista hoidoista tai sairaudesta. Niiden potilaiden siirre tarttui hitaammin, joilla alfa 4 integriinin ilmentymä oli matala siirteen CD34-positiivisissa soluissa. Saksalainen tutkimus tehtiin autologisen kantasolusiirteen saaneiden henkilöiden pakastetuista siirrenäytteistä. Tutkimuksessa oli mukana 103 potilaan näytteet. Näyteampullit sulatettiin, ja niistä eroteltiin ficoll tiheysgradienttisentrifugaatio menetelmällä mononukleaariset solut. Leimausputkiin käytettiin solupitoisuutta 10 6 solua per litra. Tutkijat vertasivat kontrollia vastaan normalisoitua alpha 4 integriinin ilmentymää potilaan kantasolusiirteen tarttumisen nopeuteen. Viimeisin näyttö hiirellä tehdyillä siirtomalleilla esittää, että integriinien estäminen (downregulation) huonontaa siirteen tarttumista (Rettig 2012). Kaikki aikaisemmin aiheesta julkaistut tutkimukset on tehty siirtogeenisillä hiirillä, joten Saksassa tehty tutki-
12 mus, jonka pohjalta työni tehdään, on ensimmäinen julkaisu, joka perustuu ihmisten mobilisoitujen kantasolujen tutkimiseen. Jotta kantasolusiirre voitaisiin kerätä leukafereesillä verestä, on luovuttajalle annettava kasvutekijähoitoa, joka myös vaikuttaa alfa 4 integriineihin. Mobilisaatiohoitona käytetään normaaliluovuttajilla G-CSF-kasvutekijää (granulosyyttikasvutekijää). Autologisten siirteiden mobilisaatiossa syklofosfamidia (solunsalpaaja) ja G-CSF:ää käytetään yhdistelmähoitona. Uusinta ja kalleinta mobilisaatio lääkettä Plerixaforia käytetään silloin, jos pelkällä G-CSF-hoidolla ei saada mobilisoitua riittävästi kantasoluja vereen (Rettig 2012). 4 Virtaussytometrinen menetelmä Tämä työ tehdään virtaussytometrisella menetelmällä. Virtaussytometri on laite, joka rekisteröi lasersäteen läpi kulkevien yksittäisten solujen siroamaa ja lähettämää valoa. Valon sirontaa tutkitaan kahdesta eri suunnasta, kohtisuorasta suunnasta (FSC), joka on verrannollinen solun kokoon ja sivusuunnasta (SSC), joka on suhteessa solujen granulaarisuuteen ja tuman ja sytoplasman suhteeseen. (Siitonen 2005) Kuvio 8 Kuvio 8. Valon sironta lasersäteen kohtaamasta solusta, mitä suurempi ja granulaarisempi solu on, sitä enemmän se siroaa valoa sivusuuntaan. Copyright: BD Europe Valon sirontaominaisuuksien perusteella veren valkosolut voidaan erotella mm. lymfosyyteiksi, monosyyteiksi ja granulosyyteiksi. Kuvio 9.
13 Kuvio 9. Valkosolujen luokittelu solun valonsirontaominaisuuksien mukaan. europe Copyright: BD Valkosolujen immunofenotyypitys perustuu spesifisiin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka jaetaan tunnistamiensa antigeenien perusteella ns. CD-luokkiin (cluster of differentiation). CD-luokkia tunnetaan jo yli 200. CD-luokat voidaan jakaa ryhmiin sen perusteella tunnistavatko ne esim. myelooisia soluja, B-soluja, T-soluja, trombosyyttejä ja megakaryosyyttejä, NK-soluja jne. Solujen tunnistuksessa voidaan käyttää useampaa vasta-ainetta samanaikaisesti, jolloin voidaan tarkemmin määritellä solun erilaistumisaste. Esim. CD4-solut CD3 positiivisista soluista (T-auttajasolut), blastien kypsyysaste esim. CD38 negatiiviset solut CD34+ soluista (varhaisia hematopoieettisia kantasoluja). (Taulukko 1) Taulukko 1. CD-luokkia tavallisimmille veren soluille Solutyyppi Kantasolu Kaikki valkosoluluokat Granulosyytit Monosyytit CD luokka CD34+, CD117 CD45+ CD15+, CD13+ CD33+, CD14+, CD64+
14 T lymfosyytit CD3+, CD2, CD7 T -auttaja solut CD3+, CD4+ T -estäjä solut CD3+, CD8+ B- lymfosyytit CD19+, CD20+, CD22, CD79b Solujen lähettämää valoa päästään tutkimaan, kun solut leimataan fluoresoiviin merkkiaineisiin liitetyillä eli konjugoiduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla. Fluoresoivia merkkiaineita ovat mm. FITC eli fluorotioisosyanaatti, PE eli fykoerytriini, PerCP eli peridiniini-klorofylli-a-proteiini ja APC eli allofykosyaniini. Monivärianalyysejä varten on näistä kehitetty vielä tandemvasta-aineiksi nimitettyjä fluorokromeja mm. APC-Cy7- ja PE-Cy-7- merkkiaineet. Johtamalla laservalon virittämistä fluoresoivista merkkiaineista lähtevä valo sopivien linssien ja suodinten avulla valomonistinputkille voidaan yhdestä solusta lähtevät useat samanaikaiset signaalit rekisteröidä erikseen. Kuvio 10. Canto II optiikka: Kolme laseria, prismat ja linssit, joiden avulla valo kohdistetaan virtauskyvettiin, jonka läpi solut kulkevat yksitellen. Virtauskyvetistä valo johdetaan optisia kuitukaapeleita pitkin detektoreille, joissa valomonistinputket sijaitsevat. Puoliläpäisevien suodatinten avulla eri aallonpituuksinen valo pääsee omalle detektorilleen. Copyright: BD europe
15 Tietotekniikan kehitys on mahdollistanut myös virtaussytometrien nopean kehittymisen. Mitä enemmän ja nopeammin tietoja saadaan käsiteltyä, sitä monipuolisempia analyysejä virtaussytometreillä saadaan suoritettua. Vielä 1990-luvun alussa oli vain laitteita, joilla saatiin analysoitua kolme väriä kerrallaan ja analysoitavien solujen maksimimäärä oli 60 000. Tänään lasertekniikan, fluoresoivien merkkiaineiden ja sovellusohjelmien kehittymisen ansiosta laboratoriossamme on analysaattori, jossa on kolme laseria ja jolla voidaan analysoida jopa 10 väriä kerrallaan yhdestä putkesta ja kerätä jopa miljoonan solun tiedot. Omassa työssäni näytteiden analysointiin käytettiin FaCSCanto analysaattoreita, joissa on kaksi tai kolme laseria ja mahdollisuus 6-väri leimauksen ajoon ja analysointiin. Kuvio 10. 5 Työn tarkoitus, tavoitteet ja tulokset 5.1 CD49d määrityksen pystyttäminen Tähän työhön valittiin sama CD49d FITC vasta-aine, joka oli käytössä saksalaisessa tutkimuksessa (Harz 2011). Se oli klooniltaan 44H6 ja sen valmistaja on Serotec. Kun tämä vasta-aine oli saatu laboratorioon, suoritin testauksen normaalilla verellä oikean käytettävän vasta-ainepitoisuuden määrittämiseksi. Normaali veri soveltuu CD49d vasta-aineen testaukseen sillä normaalit T-solut ovat ko. antigeenin suhteen positiivisia. Testaukseen riitti yksi sarja, jossa käytettiin 1 ul, 5 ul ja 10 ul uutta vasta-ainetta, sillä sopiva pitoisuus löytyi tästä sarjasta ja oli 5 ul 50 mikrolitraa verta kohden. (Siitonen 2007.) CD49d määritykseen kantasoluista käytimme ensimmäisessä vaiheessa kahden putken sarjaa: CD49d/96/34/38/3/45 ja syto16/49d/34/38/3/45. (Taulukko 1) Tätä paneelia ehdin käyttää kahdeksan siirteen näytteisiin. Kun lähdin analysoimaan näitä sarjoja, huomasin, että tarvitsisin paneeliin lisäksi kontrolliputken. Lisäksi CD3 PE-Cy7 vasta-aine osoittautui ongelmalliseksi, aiheuttaen epäspesifistä sitoutumista, joten jouduin poistamaan sen tutkimuspaneelista. Jatkossa tutkimuspaneelissa olivat mukana taulukossa 2. esitetyt vasta-aineet. Työn kulkua havainnollistaa kuvio 11.
16 Taulukko 2. Ensin käytetty vasta-ainepaneeli PUTKI 1 VASTA- AINE MÄÄRÄ PUTKI 2 VASTA- AINE MÄÄRÄ Taulukko 3. Lopullinen vasta-aine paneeli PUTKI 1 CD49d FITC 5ul Syto16 FITC 2uL CD96 PE 1ul CD49 PE 5uL CD38PerCP- 5ul CD38PerCP- 5uL Cy5,5 Cy5,5 CD3PE-Cy7 1ul CD3PE-Cy7 1ul CD34APC 1ul CD34APC 1uL CD45APC-Cy7 5ul CD45APC-Cy7 5uL VASTA- AINE MÄÄRÄ PUTKI 2 VASTA- AINE MÄÄRÄ PUTKI 3 VASTA- AINE MÄÄRÄ SimIgG1 FITC/ 10ul CD49d FITC 5ul Syto16 FITC 2ul Sim IgG1 PE CD96 PE 1ul CD49 PE 5ul IgG1PerCP- 1ul CD38PerCP- 5ul CD38PerCP- 5ul Cy5,5 Cy5,5 Cy5,5 PE-Cy7 - PE-Cy7 - PE-Cy7 - CD34APC 1ul CD34APC 1ul CD34APC 1ul CD45APC-Cy7 5ul CD45APC-Cy7 5ul CD45APC-Cy7 5ul
17 1. Vasta-aineen tilaaminen ja titraus Vasta-aineen testaus sopivan käytettävän määrän löytämiseksi. 2. Ajo- ja analyysipohjien luominen FaCSDiva ohjelmaan Näytteiden ajoa varten luodaan ja talletetaan ajopohja, jossa määritellään talletettava solumäärä ja tehdään rajaukset haluttujen solupopulaatioiden löytämiseksi ja laskemiseksi. 3. Näytteiden leimaus ja ajo Numeroidaan putket, lisätään niihin solut ja vastaaineet. Lysoinnin ja pesujen jälkeen ajetaan virtaussytometriin valmiiseen ajopohjaan. 4. Näytteiden analysointi ja rajaus FaCSDiva ohjelmalla Tallennetut tiedostot analysoidaan tarkemmin haluttujen solupopulaatioiden rajaamiseksi ja tulosten saamiseksi. 5. Soluviljely ja tarttumistieto tulosten kirjaaminen Tutkimusnäytteiden kantasoluviljelyyulosten etsiminen ja kirjaaminen kantasolulaboratorion viljelykirjasta ja siirteiden tarttumistietojen etsiminen siirteiden käsittelykirjasta ja weblab potilastieto järjestelmästä. 6. Tulosten vienti Excel ja PasW ohjelmiin, korrelaatioiden ja muiden tulosten laskenta ja visualisointi Tulosten kirjaaminen potilas kerrallaan em. ohjelmiin. Tulosten analysointi ja tulkinta. Kuvio 11. Työn vaiheet 5.2 Olisiko mahdollista saada samansuuntainen tulos, kuin alkuperäisessä tutkimuksessa. (Hartz 2011)
18 Tutkimus, jonka tuloksia yritimme toistaa, ei kertonut solupopulaatioiden rajaus protokollaa kovin tarkasti. Siksi otimme käyttöön yleisesti käytössä olevan MFI vertailun, jossa antigeeni-ilmentymän normaali potilaskohtainen vaihtelu normalisoidaan vertaamalla antigeeni-ilmentymän mean arvoa sen kontrollin mean arvoon. (Mean arvo on virtaussytometrin laskentataulukosta saatava suure, joka kuvaa tutkittavan solukon keskimääräistä fluoresenssi-intensiteettiä.) 5.3 Saataisiinko vertailukelpoinen tulos CD49d PE vasta-aineella. Laboratoriossamme on jo käytössä CD49d vasta-aine PE-leimattuna, kroonisten lymfoproliferatiivisten sairauksien diagnostisessa paneelissa. CD49d on ennustemarkkeri kroonisissa lymfaattisissa leukemioissa (Shanafelt 2008.) Se on kuitenkin eri kloonia (9F10), kuin saksalaisessa tutkimuksessa käytetty vasta-aine. Jos CD49d ilmentymä olisi samanlainen PE kuin FITC leimatulla vasta-aineella tutkittuna, voisimme käyttää samaa vasta-ainetta kahdessa paneelissa. Mitä useampaan paneeliin samaa vastaainetta käytetään, sitä pienempi on riski, että kallis vasta-ainepullo ehtii vanhentua, ennen kuin se käytetään loppuun. 5.4 CD34+CD38dim- solujen ja niiden ilmentymien tutkiminen normaaliluovuttajien näytteistä CD49d-antigeenin lisäksi, samasta solusta tutkitaan CD34, CD38 ja CD45 -antigeeniilmentymät. CD34 -antigeeni ilmentyy vain kantasoluissa ja blastitasoisissa soluissa, ei kypsemmissä hematopoieettisissa soluissa. Sen ilmentymän perusteella rajataan työssä analysoitavat solut. CD45 antigeeni on ns. common leucocyte antigen. Se ilmentyy kaikissa muissa tumallisissa hematopoieettisissa soluissa paitsi erytroblasteissa. CD45-ilmentymän ja solun valonsirontaominaisuuksien avulla voidaan erottaa lymfosyytit, monosyytit, granulosyytit ja ns. blastialueen solut toisistaan. CD38 antigeenia käytetään kantasolujen kypsyysasteen arviointiin. Varhaisissa hematopoieettisissa kantasoluissa on hyvin matala CD38-ilmentymä.(van Rhenen 2007) CD34+CD38 dim solujen normaali ilmentymä täytyy tuntea hyvin, kun tutkitaan niiden ilmentymää leukemiapotilaiden jäännöstauti paneeleissa (dim tarkoittaa matalaa ilmentymää ja ilmaus on yleisesti käytössä solujen virtaussytometrisistä ominaisuuksista kirjoitettaessa).
19. Lisäksi putkeen lisätään ennen analysaattoriin ajoa DNA:han sitoutuvaa väriä, jonka avulla voidaan rajata analyysistä pois roskat ja tumattomat solut. 5.5 CD96PE vasta-aineen ilmentymien tutkiminen normaaliluovuttajien näytteissä Mukaan otettiin myös CD96PE vasta-aine siksi, että voitaisiin tutkia sen ilmentymää normaaleissa hematopoieettisissa kantasoluissa. On esitetty, että leukeemiset kantasolut voitaisiin erottaa normaaleista terveistä kantasoluista CD96+CD38dimilmentymän perusteella (Hosen 2009). Ennen kuin vasta-aine otetaan käyttöön myelooisten leukemioiden jäännöstautipaneelissa, selvitetään sen ilmentymää terveillä henkilöillä. Kuvio 12. CD38 dim ja CD96+ solujen rajaus FaCSDiva ohjelmalla. Rajaus on asetettu kontrolliputken avulla.
20 5.6 Onko kantasoluviljelytuloksella ja siirteen tarttumisen nopeudella yhteyttä? Kantasoluviljely on tehty siirteistä koko kantasolusiirtohoidon historian ajan siirteiden laadun tutkimiseksi. Olisiko kantasoluviljelyllä samanlaista ennustearvoa siirteen tarttumisen nopeutta ennustettaessa? 5.7 CD34+ -solumäärien ja leukosyyttimäärien yhtäpitävyys vertailu Kuinka hyvin tutkimusputkistani saatavat CD34-posiitiivisten solujen prosentit vastaavat BD:n Stemcell Kit pakkauksella saatuja arvoja. Työssäni pyrin keräämään mahdollisimman paljon tapahtumia, jolloin CD34-positiivisten solujen määrä nousee suuremmaksi kuin varsinaisessa kantasolumääritys menetelmässämme. Solujen laskennassa pätee sääntö: mitä suurempi solumäärä kerätään, sitä suurempi tarkkuus saavutetaan. Samalla voin myös vertailla helposti kantasolumäärityksemme single platform menetelmän antamia leukosyytti tuloksia Sysmex- verenkuva-analysaattorin antamiin leukosyytti tuloksiin. Etenkin luuydinnäytteiden leukosyyttimäärä on joskus haasteellista määrittää luotettavasti, näytteessä esiintyvien aggregaattien ja rasvan vuoksi. 6 Tutkimusaineisto ja -tulokset Työni aineistoon sain kerättyä kaikkiaan 32 näytettä. Niistä 23 oli verensiirteitä ja 9 luuydinsiirteitä. Autologisia siirteitä oli 16 ja allogeenisiä 16, joista sisarussiirteitä 10 ja rekisteriluovuttajalta saatuja siirteitä 6 näytettä. LYR on Luuytimen luovuttaja rekisteristä saatu siirre. Katso taulukko 3 näytteiden jakauma. Taulukko 4. Tutkimusnäytteiden laadullinen jakautuminen Siirteen tyyppi Lukumäärä Autologinen verensiirre 14 Autologinen luuydinsiirre 2 Allogeeninen sisarus verensiirre 7 Allogeeninen sisarus luuydinsiirre 3 Allogeeninen LYR verensiirre 2 Allogeeninen LYR luuydinsiirre 4
21 Siirteiden saajien ikä vaihtelee siten, että lapsia on viisi (iät 3-14v), aikuisia alle 60 vuotiaita on 18 ja yli 60 vuotiaita on 9 (vanhin 69 vuotias). 6.1 CD49d ilmentymän ja kantasolusiirteen tarttumisen nopeuden välinen yhteys Kantasolusiirteiden CD49d ilmentymälle ja siirteiden tarttumisen nopeudelle ei löytynyt työssäni minkäänlaista korrelaatiota. Vertasin erikseen verensiirteitä ja luuydinsiirteitä. Kummallakaan ei ollut havaittavissa korrelaatiota. Suurin yksittäinen siirrelaji on autologinen verensiirre, mutta niidenkin määrä 14 kappaletta on liian pieni luotettavien johtopäätösten tekemiseen. Aineistostani voidaan kuitenkin nähdä, että luuydin siirteissä on keskimäärin korkeampi CD49d ilmentymä, kuin verensiirteissä, vaikka tarttuminen tapahtui keskimäärin nopeammin verensiirteillä. Verensiirteen kantasoluissa adheesiomolekyylit ovat jo irrottaneet otteensa kotipesästään, joten niiden tarttumisaffineetti on pienempi, kuin luuydinsiirteen kantasoluilla. Luuytimestä kerätyt kantasolut ovat tavallaan natiivitilassa, jolloin adheesiomolekyylien affiniteetti on parempi. Aineiston tulisi olla suurempi ja yhtenäisempi, jotta voitaisiin tehdä varmoja johtopäätöksiä asiasta. Kuvio13 Kuvio 13. Siirteen laadun vaikutus CD49d ilmentymään. 6.2 CD49d FITC ja CD49d PE ilmentymien vertailu
22 Vasta-aineiden CD49d klooni 44H6 FITC konjugoituna ja CD49d klooni 9f10 PE konjugoituna ilmentymien välillä ei löytynyt korrelaatiota. Myöskään samanlaista eroa luuydinnäytteiden ja verensiirteiden välillä ei löydycd49d PE vasta-aineella, kuin näkyy CD49d FITC vasta-aineella. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että PE- fluorikromi on niin kirkas, että pienet erot vasta-aine ilmentymissä eivät tule esiin sitä käytettäessä. Kuvio 14. CD49 PE ja CD49 FITC MFI arvojen korrelaatio. Pearsonin korrelaatiokerroin 0,293 6.3 CD34+ CD38 dim -solujen ja CD34+CD96+ ilmentymät. CD34+ CD38 dim -solujen ilmentymää normaaleissa hematopoieettisissa kantasoluissa voitiin tutkia. Näiden solujen määrä on terveiden henkilöiden näytteissä pieni, mutta on tärkeää tietää niiden määrä ja normaali sijainti virtaussytometrisessä analyysissä, jotta voitaisiin leukemiapotilaiden jäännöstauti näytteissä luotettavasti selvittää, mitkä em. soluista ovat normaalia regeneraatiota hoidon jälkeen ja mitkä niistä ovat jäljellä olevia leukeemisia blasteja. Aineistossani CD34+CD38dim- solujen määrä vaihteli 0 % ja 0,0916% välillä keskiarvon ollessa 0,0127%. CD34+96+ -solujen ilmentymää saatoimme tutkia terveiden luovuttajien näytteistä. Solujen määrä oli keskimäärin 0,020% ja vaihteli välillä 0-0,092%
23 Kantasoluviljelytuloksen vertaaminen siirteen tarttumisen nopeuteen ja CD34+solujen määrään. Kantasolusiirteistä vain neljä kasvoi huonosti, lopuilla 28 näytteellä oli normaali tulos pesäkeviljelyssä. Pesäkkeiden määrä vaihteli 24 ja 219 välillä. Huonon viljelytuloksen saaneista siirteistä kaksi oli ulkomailta saatuja rekisterisiirteitä. Vaikka siirteiden kuljetus suoritetaan huolella, matka saattaa kestää jopa kymmenen tuntia, mikä ei voi olla vaikuttamatta siirteiden viabiliteettiin. N Minimum Maximum Mean Std. Deviation Kantasoluviljely tulos 32 24 219 86,44 43,777 Valid N (listwise) 32 Kuvio 15. Kantasoluviljelytulosten hajonta Kuvio 16. Siirteen kantasoluviljelytuloksen ja kantasolupitoisuuden korrelaatio. Pearsonin korrelaatiokerroin vain 0,227 mikä osoittaa hyvin vähäistä korrelaatiota.
24. Kuvio 17. Kantasoluviljelytulos siirretyypeittäin. Eri siirretyypeillä on keskimäärin hyvin samanlainen viljelytulos. Suurimmat pesäkemäärät löytyvät sisarusten luovuttamista verensiirteistä. 6.4 CD34-positiivisten solujen prosenttimäärien vertailu siirteissä CD34-positiivisten solujen prosenttimäärällä oli hyvä korrelaatio BD:n Stemcell enumeration määrityksellä saatujen prosenttien ja tutkimusputkista laskettujen prosenttien välillä. Tämä tulos lisää luottamusta sekä työni tuloksiin, että uskoa siihen että kantasolumäärityksessä kerättävä 100 000 tumallista solua on riittävä määrä luotettavan tuloksen saamiseksi. Tutkimusputkista sain kerättyä 1039 19655 CD34-positiivista solua kokonaissolumäärän ollessa 327280 1219874 solua. CD34-positiivisten solujen prosenttiosuus vaihteli siirteissä 0,44 prosentista 3,15 prosenttiin keskiarvon ollessa 1,44%. Kuvio 17.
25 Kuvio 18. Tutkimusputkien CD34+ solujen prosenttimäärän ja siirteen kantasolumäärityksestä saadun CD34+ prosenttimäärän välinen korrelaatio. Pearsonin korrelaatiokerroin on 0,884 Sysmex analysaattorin leukosyyttitulosten ja BD:n Stemcell enumeration määrityksellä saatujen tulosten korrelaatio oli erinomainen. Eroa oli ainoastaan korkeiden leukosyyttiarvojen kohdalla. Kantasolumääritystä varten näytteet laimennetaan siten, että tavoitteena on arvo 20x10 9 /litra. Sysmex verenkuva-analysaattorilla ajoa varten näytteitä ei laimenneta, vaikka niissä saattaa olla leukosyyttejä jopa 400x10 9 /litra, mikä lukema alkaa olla jo laitteiden lineaarisuusrajan yläpäässä. Kuvio 18
26 Kuvio 19. Leukosyyttimäärien vertailussa Pearsonin korrelaatiokerroin on 0,991 7 Pohdinta Työhöni valikoituivat näytteet, jotka saapuivat laboratorioon, joko niin ajoissa iltapäivällä, että ehdin tehdä ne samana päivänä tai viimeistään torstai-iltana saapuneet näytteet, jotka ehdin tehdä seuraavana aamuna. Tutkimusajanjaksolla näytteitä olisi ollut käytettävissä enemmänkin, mutta kiireen ja näyteruuhkan takia niitä ei ehditty leimata. Suurimman osan näytteistä leimasin ja ajoin itse. Alkuvaiheessa uuden menetelmän sisäänajovaiheessa sattui pieniä virheitä, joiden takia, kaikista näytteistä ei ole käytettävissä kaikkia parametrejä. Näytteiden leimaus ei vienyt paljoa aikaa, ja se sujui kitkattomasti muiden näytteiden lomassa. Niiden ajoon virtaussytometrille sen sijaan tarvittiin yli puoli tuntia aikaa, joka olisi tarkoittanut monesti ylitöitä, CD34-positiivisten solujen määritysnäytteet leukafereesinäytteistä saapuvat laboratorioomme yleensä myöhään iltapäivällä. Näytteiden analysointi oli aluksi työlästä, mutta alkuhankaluuksien jälkeen sekin alkoi sujua ja opin monta niksiä FaCSDiva ohjelman käytössä. Kantasolulaboratorion henkilökunta opasti minua ystävällisesti kantasoluviljelytulosten ja siirteen tarttumistietojen etsimisessä. Tulosten vienti Excel taulukkoon ja siitä PASW- ohjelmaan analysoitaviksi opettivat kärsivällisyyttä ja huolellisuutta. Kummassakin ohjelmassa on ominaisuuksia, joiden käyttämiseksi tarvitsin tietotekniikan opettajien ohjausta. Keräämäni näytemäärä jäi paljon pienemmäksi, kuin olin alun perin ajatellut ja arvioinut. Osasyynä olivat opintojani varten pitämäni opintovapaat, joiden aikana en voinut velvoittaa työtovereitani aineiston keruuseen muutenkin kuormittuneessa työssä. En myöskään voinut itse jäädä koulutyön ohella ylitöihin tekemään mahdollisia näytteitä. Näin ollen työni tulokset jäävät epävarmoiksi. Emme voi varmuudella sanoa löytyisikö korrelaatiota, jos näytemäärä olisi suurempi, jolloin pääsisimme vertaamaan eri siirrelajien korrelaatiota luotettavammin. CD34+CD38- ja CD34+CD96+ -solujen normaalin ilmentymän tutkimista näistä näytteistä jatkan vielä innovaatioprojektina Infinicyt- virtaussytometritulosten analysointiohjelmalla. Näiden solujen määrä on pieni ja niiden ilmentymän paikka normaaleilla hematopoieettisilla kantasoluilla on tärkeää tuntea, kun analysoidaan leukemiapotilaiden jäännöstautinäytteitä.
27 Lähteet Ameneh Eslami 2011. The role of integrins in wound healing. Science creative quarterly issue six, year 2011. CD45 in the Stem Cell Niche. R&D systems. Verkkodokumentti <http://www.rndsystems.com/cytokine_cb09i1_cd45_stem_cell_niche.aspx> luettu 28.2.2013 Greenbaum, A M Link, D C 2010. Mechanisms of G-CSF-mediated hematopoietic stem and progenitor mobilization. Leukemia advance online publication, November 16, 2010; doi:10.1038/leu.2010.248. Dauber, K Becker, D Odendahl, M Seifried, E Bonig, H Tonn, T 2011. Enumeration of viable CD34(+) cells by flowcytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD TM stem cell enumeration kit. Cytotherapy Apr 13 (4) 449-458. Hartz, Berndt Volkman, Thorsten Irle, Sebastian Loechelt, Cordula Neubauer, Andreas Brendel, Cornelia 2011. α4 integrin levels on mobilized peripheral blood stem cells predict rapidity of engraftment in patients receiving autologous stem cell transplantation. Blood 118 (8). 2362 2365. Hénon, PH Sovalat, H Bourderont, D 2001. Importance of CD34+ cell subsets in autologous PBSC transplantation: the Mulhouse experience using CD34+CD38- cells as predictive tool for hematopoietic engraftment. J Biol Regul Homeost Agents 15 (1). 62 70. Hernier, ME 1990. VLA proteins in the integrin family: structures functions, and their role on leukocytes. Annu Rev Immunol 8 365 400. Hong, Qian Karl, Tryggvason Sten Erik, Jacobsen Marja, Ekblom 2006. Contribution of a6 integrins to hematopoietic stem and progenitor cell homing to bone marrow and collaboratorion with a4 integrins. Blood 107 3503-3510. Hosen, Naoki Park, Christopher Tatsumi, Naoya Oji, Yusuke Sugiyama, Haruo Gramatzki, Martin Krensky, Alan Weissman, Irving 2007. CD96 is a leukemic stemcell-specific marker in human acute myeloid leukemia. PNAS 104 (26) 11008-11013. Integrins and associated molecules. R&D systems. Verkkodokumentti. <http://www.rndsystems.com/molecule_group.aspx?g=644&r=7&g2=3078>. Luettu 1.2.2013. Introduction to flowcytometry BD Biosciences E-learning material. Verkkodokumentti. <www.bdbiosciences.com/eu/support/training/self_paced.jsp>. Luettu 2.3.2012. Jantunen, Esa Jyrkkiö, Sirkku Kuittinen, Outi Lehtinen, Tuula Janes, Rita - Elonen, Erkki 2010. Lymfoomapotilaiden allogeeniset kantasolujensiirrot Duodecim 126 (2). 167 173. Jantunen, Esa 2008. Aikuispotilaiden autologiset kantasolusiirrot 2008 Suomen Lääkärilehti 63 (12 13). 1171 1177.
28 Jantunen, Esa 2011. Autologiset kantasolujensiirrot: indikaatiot ja näkökohtia aikuispotilailla. Luentotiivistelmä. Laboratoriolääketiedepäivät 2011. Juvonen, Eeva Sumsa, Päivi 2012. Aikuispotilaiden kantasolusiirrot. Ytimekäs 2012 Leimi, Lilli 2010. Lapsuusiän kantasolusiirrot HUS:ssa vuosina 1993-2006. Tutkielma. Helsingin yliopisto lääketieteellinen tiedekunta. Helsinki 25.3.2010. Jonathan M, Gerber Smith,Douglas Ngwang, Brownhilda Zhang, Hao Vala, Milada Morsberger, Laura Galkin, Steven Collector, Michael Perkins, Brandy - Levis, Mark J - Griffin, Constance Sharkis, Saul Borowitz, Michael Karp, Judith E Jones, Richard 2011. A clinically relevant population of leukemic CD34+CD38 cells in acute myeloid leukemia. Blood 119 (15). 3571-3577. Korhonen, Johanna 2012. Fereesihoitaja. Meilahden kolmiosairaala osasto 7b. Helsinki. Haastattelu 21.12. Mahlamäki, Eija 2011..Laboratorion osuus autologisissa kantasolujen siirroissa. Luentotiivistelmä. Laboratoriolääketiedepäivät. Partanen, Seija Ruutu, Tapani 1985. Hematopoieettisten kantasolujen viljely myeloproliferatiivisten sairauksien diagnostiikassa. Duodecim 101. 402-409. Priestley, GV Scott, LM Ulyanova, Tatiana Papayannopoulou, Thalia 2006. Lack of alpha4 integrin expression in stem cells restricts competitive function and selfrenewal activity. Blood 107 (7). 2959-2967. Prosper, Felipe Stroneck, David Mac Carthy, James Verfaillie, Catherine M 1998. Mobilization and homing of Periferal Blood progenitors is related to reversible downregulation of alpha4beta1 integrin expression and function. J. Clin.Invest. 101 (11). 2456-2467. Ratajczak, M Z 2010. Spotlight series on stem cell mobilization: many hands on the ball, but who is the quarterback? Leukemia 24. 1665 1666. Ratajczak, M Z Kim, C H Abdel, A Latif, A Schneider,G Kucia,M Morris, AJ Laughlin, MJ Ratajczak, J 2012. A novel perspective on stem cell homing and mobilization: review on bioactive lipids as potent chemoattractants and cationic peptides as underappreciated modulators of responsiveness to SDF-1 gradients. Leukemia 26. 63 72. Rettig, M P Ansstas, G DiPersio, J F 2012. Mobilization of hemtopoietic stem and progenitor cells using inhibitors of CXCR4 and VLA-4. Leukemia 26. 34 56. van Rhenen, A Moshaver, B Kelder, A Feller, N Nieuwint, AW Zweegman, S Ossenkoppele, GJ Schuurhuis, GJ 2007. Aberrant marker expression patterns on the CD34+CD38- stem cell compartment in acute myeloid leukemia allows to distinguish the malignant from the normal stem cell compartment both at diagnosis and in remission. Leukemia 21 (8). 1700-1707.. Shanafelt, TD Geyer,SM Bone, ND Tschumper, RC Witzig, TE Nowakowski, GS Zent, CS Call, TG Laplant, B Dewald, GW Jelinek, DF Kay, NE 2008. CD49d expression is an independent predictor of overall survival in patients with chron-
29 ic lymphocytic leukaemia: a prognostic parameter with therapeutic potential. Br J Haematol. 140 (5). 537-46. Shiozawa, Y Havens, A M Pienta, K J Taichman, R S 2008. The bone marrow niche: habitat to hematopoietic and mesenchymal stem cells, and unwitting host to molecular parasites. Leukemia 22. 941 950. Siitonen, Sanna Pelliniemi, Tarja-Terttu 2005. Virtaussytometria hematologian laboratoriossa: nelivärianalyysistä kuusivärianalyysiin Moodi 29 (6). 206 209. Siitonen,Sanna 2010. Kantasolut (CD34+) verestä, B-CD34-ks 4864 leukafereesinäytteestä, La-CD34-ks 8377 luuytimestä, Bm-CD34-ks 8475. Työohje HUSLAB Meilahden sairaalan laboratorio Virtaussytometria-työpiste 28.1.2010. Siitonen, Sanna 2007. Vasta-aineiden titraus. Työohje HUSLAB Meilahden sairaalan laboratorio Virtaussytometria-työpiste 5.10.2007. Solunetti.fi. Verkkodokumentti luettu 12.9.2012. Torpo, Hannele 2011 a. Erytroiset ja myeloiset pesäkeviljelyt (BFU-E, CFU-E ja CFU- GM viljelyt). Työohje HUSLAB Kantasolulaboratorio 21.3.2011. Torpo, Hannele 2011 b. Kantasolusiirteiden laadulliset vaatimukset. Työohje HUSLAB Kantasolulaboratorio. 17.10.2011. Volin, Liisa 2007. Hematologian klinikan toimintakäsikirja. HYKS Sisätaudit 9.10.2007 Watanabe, T Kawano, Y Watanabe, A Takaue, Y 1999. Autologous and allogeneic transplantation with peripheral blood CD34+ cells: a pediatric experience. Hematologica 84 (2). 167 76..
Liite 1 1 (6) Virtaussytometriltä ja kantasolulaboratoriosta kerätyt parametrit vietynä exceltaulukkoon analysointia varten. Allo sibling tarkoittaa allogeenista sisarussiirtoa. Allo- LYR allogeenista siirtoa rekisteriluovuttajalta. Näytteen numero Siirteen saajan ikä Siirteen tyyppi Näyte tyyppi Leuk Ishage E9/l Leuk Sysmex E9/l CD34% ISHAGE CD34 xe9/l 1 38 Autologinen La 66,2 65,1 0,77 0,507 2 46 Allo sibling Bm 30,5 26,5 2,77 0,843 3 64 Autologinen La 74,6 71,1 1,66 1,238 4 53 Allo sibling La 382,6 320 0,59 2,258 5 52 Allo sibling Bm 15,1 15,1 1,27 0,192 6 59 Autologinen La 70,1 66,7 1,23 0,862 7 68 Autologinen La 347,1 311,1 0,92 3,206 8 58 Allo sibling La 337 349,9 1,34 4,689 9 55 Autologinen La 109,1 100 1,00 1,091 10 34 Allo sibling Bm 29,3 33,1 1,28 0,375 11 8 Allo LYR Bm 17,7 17,1 0,96 0,169 12 69 Allo sibling La 326,1 365,5 0,77 2,506 13 65 Autologinen La 75,1 70,9 1,25 0,93 14 48 Allo sibling La 243,2 255,1 0,49 1,188 15 3 Autologinen La 171,6 146,1 0,63 1,077 16 62 Autologinen La 148,5 139,5 0,78 1,158 17 64 Autologinen La 65,3 64,6 2,06 1,342 18 42 Autologinen La 46,3 51 1,34 0,679 19 27 Autologinen La 82,1 81,2 0,62 0,508 20 34 Autologinen La 93,7 90,7 3,15 2,943 21 39 Allo LYR La 239,5 240 0,81 1,931 22 3 Allo LYR Bm 56,7 61,9 1,47 0,835 23 55 Allo sibling La 257,8 252,6 0,85 2,184 24 64 Allo LYR Bm 12,4 17,6 1,15 0,143 25 14 Allo LYR Bm 7,9 13 1,07 0,085 26 63 Autologinen La 46,4 51,6 0,94 0,434 27 67 Autologinen La 96,3 92,8 1,61 1,557 28 8 Allo sibling Bm 47 45,3 0,81 0,381 29 50 Allo sibling La 260,3 274,3 0,93 2,413 30 39 Allo LYR Bm 19,9 25,2 1,43 0,285 31 47 Allo sibling Bm 12,2 15,9 0,93 0,114 32 57 Allo sibling La 398 402 0,44 1,723
Liite 1 2 (6) Nro Kerätty solumäärä putki1 Kerätty solumäärä putki2 Kerätty solumäärä putki3 Putki 1 CD34+ kpl B- solujen kanssa Putki 1 CD34+ kpl Putki 1 CD34% B- solujen kanssa CD34% Putki 1 1 2 518726 567568 3 1057069 1018775 4 757740 475241 5 822563 822435 6 509643 540042 7 687421 754981 8 872079 765736 854363 6439 0,74 9 773054 587217 786177 5984 0,77 10 755385 740097 710928 8478 6674 1,12 0,88 11 531723 485986 452152 3239 2318 0,61 0,44 12 673232 867072 649785 4673 0,69 13 843743 810154 731324 9537 1,13 14 905768 985320 948022 4017 0,44 15 736865 827437 341112 4668 0,63 16 348364 364588 327280 2628 0,75 17 853535 865964 806691 16692 1,96 18 719783 677224 656930 11400 1,58 19 663849 716356 39443 4205 0,63 20 676803 251664 191622 19655 2,90 21 841249 752462 896125 6011 0,71 22 1241397 356506 473656 15068 12703 1,21 1,02 23 958980 992310 1020521 7364 7180 0,75 0,77 24 428857 185004 46984 3737 2655 0,87 0,62 25 762186 630345 537308 4561 3548 0,60 0,47 26 820277 753271 767071 7621 0,93 27 778152 805700 774031 9702 1,25 28 1132160 1219874 1071652 6137 0,54 29 991590 458118 363534 7974 0,80 30 549088 572051 504512 5723 4523 1,04 0,82 31 380374 374641 353128 2933 2109 0,77 0,55 32 835645 893209 860284 3478 0,42
Liite 1 3 (6) Nro P2 CD34+ kpl B- solujen kanssa Putki 2 CD34+ kpl CD34% Putki 2 CD34% Putki 2 P3 CD34+ kpl B- solujen kanssa Putki 3 CD34+ kpl Putki 3 CD34% B- solujen kanssa CD34% Putki 3 1 2 10536 9468 0,018252 1,825 9425 8649 1,817 0,015 3 13469 0,012742 1,274 13809 0,014 4 1816 0,002397 0,240 1024 0,002 5 6815 4506 0,005478 0,548 6571 4331 0,799 0,005 6 6790 0,013323 1,332 5994 0,011 7 5316 0,007733 0,773 4700 0,006 8 4570 0,005968 0,597 5120 0,006 9 3123 0,005318 0,532 4535 0,006 10 6902 5647 0,00763 0,763 7163 5624 1,008 0,008 11 2790 1955 0,004023 0,402 2395 1746 0,5297 0,004 12 6597 0,007608 0,761 5746 0,009 13 9058 0,011181 1,118 7976 0,011 14 4305 0,004369 0,437 3880 0,004 15 4356 0,005264 0,526 1987 0,006 16 2648 0,007263 0,726 2000 0,006 17 16113 0,018607 1,861 14838 0,018 18 9191 0,013572 1,357 9875 0,015 19 4286 0,005983 0,598 261 0,007 20 6984 0,027751 2,775 5121 0,027 21 5307 0,007053 0,705 6362 0,007 22 4238 3517 0,009865 0,987 5408 4569 1,142 0,010 23 7200 77015 0,007256 0,726 6918 6763 0,6778 0,007 24 1466 1039 0,005616 0,562 345 248 0,734 0,005 25 3482 2819 0,004472 0,447 2832 2156 0,527 0,004 26 7353 0,009761 0,976 6153 0,008 27 9123 0,011323 1,132 9920 0,013 28 7358 0,006032 0,603 5892 0,005 29 3351 0,007315 0,731 2934 0,008 30 6059 4431 0,007746 0,775 5105 4022 1,012 0,008 31 2774 1976 0,005274 0,527 2260 1563 0,75 0,004 32 3562 0,003988 0,399 3885 0,005
Liite 1 4 (6) Ka CD34 % CD34+CD3 8- Dim % CD34+ CD38di m CD34+C D38 dim B- solujen kanssa CD96+ kpl 96+ kpl B- solujen kanssa CD49 dfitc MFI Nro CD96% 1 2 0,017 0,0748 388 399 0,0441 229 256 3 0,013 0,0148 156 0,0015 16 4 0,002 0,0000 0,0005 4 5 0,005 0,0399 328 352 0,0305 251 389 6 0,012 0,0098 50 0,0043 22 7 0,007 0,0026 18 0,0023 16 8 0,006 0,0061 47 0,0033 25 11,36 9 0,006 0,0083 49 0,0131 77 12,79 10 0,008 0,0065 48 49 0,0159 118 118 13,05 11 0,004 0,0004 2 4 0,0451 219 140 17,68 12 0,008 0,0916 794 0,0142 123 8,31 13 0,011 0,0009 7 0,0042 34 10,06 14 0,004 0,0165 163 0,0012 12 7,54 15 0,006 0,0120 99 0,0062 51 14,03 16 0,007 0,0000 0 0,0085 31 7,79 17 0,019 0,0043 37 0,0139 120 7,00 18 0,015 0,0304 206 0,0213 144 10,07 19 0,006 0,0011 8 0,0289 207 12,83 20 0,028 0,0000 0 0,1367 344 10,85 21 0,007 0,0082 62 0,0027 20 7,76 22 0,010 0,0022 8 9 0,0449 160 182 12,18 23 0,007 0,0053 49 53 0,0028 26 28 11,17 24 0,006 0,0011 2 1 0,0346 64 85 17,25 25 0,004 0,0014 5 9 0,0397 209 250 18,06 26 0,009 0,0032 24 0,0178 134 14,27 27 0,012 0,0004 3 0,0082 66 10,01 28 0,006 0,0007 8 0,0166 203 13,48 29 0,008 0,0035 16 0,0046 21 8,80 30 0,008 0,0217 124 190 0,0217 124 142 15,86 31 0,005 0,0035 13 27 0,0222 83 116 13,07 32 0,004 0,0221 197 0,0113 101 7,06
Liite 1 5 (6) Näytteennumero CD49d PE MFI Kont FITC Mean CD34+CD4 9d FitC Mean B- solujen kanssa CD34+CD49d+FI TC Mean Kont PE Mean CD34+CD49d+ PE Mean 1 2 1310 1303 2322 3 893 1420 4 936 1428 5 1394 1406 2548 6 1342 2315 7 1041 1620 8 95,67 86 977 15 1435 9 102,47 85 1087 17 1742 10 97,08 107 1343 1396 25 2427 11 14,85 109 1819 1927 221 3281 12 73,24 103 856 17 1245 13 307,00 99 996 5 1535 14 43,21 98 739 24 1037 15 33,92 90 1263 65 2205 16 56,70 99 771 20 1134 17 40,94 130 910 33 1351 18 19,36 114 1148 95 1839 19 77,45 107 1373 31 2401 20 61,94 134 1454 36 2230 21 24,98 106 823 49 1224 22 45,29 159 1848 1937 66 3520 23 74,71 78 871 873 17 1267 24 88,24 114 1787 1966 41 3268 25 83,19 126 1914 2078 47 3869 26 97,74 103 1470 27 2639 27 84,32 106 1061 22 1855 28 37,49 101 1361 65 2437 29 52,65 97 854 23 1211 30 97,11 92 1394 1459 30 2669 31 31,78 123 1476 1607 105 3041 32 12,1 118 833 109 1319
Liite 1 6 (6) Osaa siirteistä ei koskaan siirretty, tai ne olivat rekisterisiirteitä, jotka lähtivät toiseen siirtokeskukseen. Näytteenumero CD49d PE MFI Kont FITC Mean CD34+CD4 9d FitC Mean B- solujen kanssa CD34+CD49d+FI TC Mean Kont PE Mean CD34+CD49d+ PE Mean 1 2 1310 1303 2322 3 893 1420 4 936 1428 5 1394 1406 2548 6 1342 2315 7 1041 1620 8 95,67 86 977 15 1435 9 102,47 85 1087 17 1742 10 97,08 107 1343 1396 25 2427 11 14,85 109 1819 1927 221 3281 12 73,24 103 856 17 1245 13 307,00 99 996 5 1535 14 43,21 98 739 24 1037 15 33,92 90 1263 65 2205 16 56,70 99 771 20 1134 17 40,94 130 910 33 1351 18 19,36 114 1148 95 1839 19 77,45 107 1373 31 2401 20 61,94 134 1454 36 2230 21 24,98 106 823 49 1224 22 45,29 159 1848 1937 66 3520 23 74,71 78 871 873 17 1267 24 88,24 114 1787 1966 41 3268 25 83,19 126 1914 2078 47 3869 26 97,74 103 1470 27 2639 27 84,32 106 1061 22 1855 28 37,49 101 1361 65 2437 29 52,65 97 854 23 1211 30 97,11 92 1394 1459 30 2669 31 31,78 123 1476 1607 105 3041 32 12,1 118 833 109 1319
Liite 2 1 (2) Näytteiden ajo ja analyysipohja
Liite 2 2 (2)