Desialotransferriinimääritys kapillaarielektroforeesilla Labqualityn Laaduntarkkailupäivät 12.2.2004 Annukka Mäki VITA Laboratorio
CDT = Carbohydrate Deficient Transferrin alkoholin suurkulutuksen merkkiaine pitoisuus nousee kun alkoholin käyttö on runsasta ja jatkuvaa pitoisuus alkaa laskea noin kahden viikon kuluttua alkoholin käytön lopettamisesta
NH 2 611 679 COOH Fe Fe 413 N acetyl glucosamine Mannose Galactose Sialic acid
CDT:n määritysmenetelmissä vähän siaalihappotähteitä sisältävät isoformit erotetaan kromatografisesti ioninvaihtokromatografia + RIA tai FIA tai TIA - HPLC elekroforeettisesti - isoelektrinen fokusointi - kapillaarielektroforeesi
Kapillaarielektroforeesi (CE) on tekniikka, jolla erotetaan liuosseoksessa olevat ioniset ja/tai neutraalit yhdisteet toisistaan.
Elektro-osmoottinen virtaus EOF - - - - -- ----- ++ ++ + + + ++ + + + - - - ++ - -- - - - - - + _ + + + + + + + + + + + + + + - - - - --- - - - - -- -- ------ - Silikakapillaari
Kapillaari Detektori + - Puskuriastiat - Näyteastia Jännitelähde Elektrodit
Menetelmä P/ACE TM MDQ electropherograph Beckman Coulter Silikakapillaari pituus 60 cm halkaisija 50 µm Ceofix CDT Capillary Electroforesis
Näytteen esikäsittely 60 µl seerumia 60 µl FeCl 2 liuos, 0.1 %
Menetelmä Huuhtelu initiaattoriliuoksella 1.5 min, paine 15 psi Huuhtelu puskuriliuoksella 2 min, paine 15 psi Näyteinjektio, vakuumi 10 s, 0.5 psi Erotus, jännite 28 kv, 7.4 min Kapillaarin huuhtelu, 0.2 mol/l NaOH, 1 min, paine 60 psi Kapillaarin puhdistus, 80 µa ja paine 20 psi, 1.5 min Analyysiaika yhtä näytettä kohden noin 15 min
0.12 0.10 UV - 200nm Migration Time Name Corrected Area Percent 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes 0.150 0.125 0.100 0.075 0.050 0.025 0.000-0.025-0.050-0.075 0.0 2.5 5.0 7.5 Minutes 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Au 6.23 0 sialo 1.20 6.33 0.25 6.71 4 sialo 63.35 6.49 2 sialo 8.19 6.57 3 sialo 9.63 6.93 6 sialo 3.67 6.82 5 sialo 13.70 AU µa
0.08 0.07 0.06 0.05 Au 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes
0.08 0.07 0.06 0.05 Au 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes
0.025 3 alkoholin suurkuluttajaa 3 alkoholin kohtuu käyttäjää 0.020 0.015 AU 0.010 0.005 0 2 3 4 5 6
Menetelmävalidointi korrelaatio alkoholin kulutukseen viitealue toistettavuus
Näytteet 1. WHO/ISBRA Study on State and Trait Markers of Alcohol and Alcoholism Päihdelääketieteen tutkimusyksikkö on Helsinki Clinical Center 2. Biological Markers of Alcohol Consumption and Effect of Calcitonin in Nonalcoholic Men: A Prospective, Double- Bilind Study Ville-Veikko Elomaa, Elisa Löyttyniemi, Päivi Kärkkäinen, Mikko Salaspuro and Kalevi Laitinen Alcohol Clin Exp Res, Vol 20, No 5, 1996: pp 830-835
Näytteet Tutkimusmateriaali - 58 raitista henkilöä - 117 kohtuukäyttäjää - 95 suurkuluttajaa Suurkulutuksen raja: alkoholin keskimääräinen kulutus päivässä yli 60 g, mikä vastaa noin neljää ravintola-annosta väkeviä juomia
Näytteet Viitearvojen tarkistaminen - 120 naista - 120 miestä
COMPARISON OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS (ANALIS CEOFIX CDT KIT) AND SMALL COLUMN (BIORAD %CDT-TIA AND CDTECT) METHODS FOR SERUM CARBOHYDRATE-DEFICIENT TRANSFERRIN IN DETECTION OF HEAVY DRINKING Taina Methuen, Annukka Mäki, Pertti Kaihovaara, Kalevi Laitinen, Jukka Hurme and Mikko Salaspuro 9TH CONGRESS OF THE EUROPEAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL RESEARCH ON ALCOHOLISM Alcohol and Alcoholism Vol 20, 2003: p 524
Korrelaatio alkoholikulutukseen %DST-CE: 0.74 %CDT-CE: 0.70 %CDT-TIA: 0.58 CDTect: 0.44
Viitearvot mediaani keskiarvo SD 95. persent. 97.5. persent. vaihteluväli naiset 0.68 0.21 0.67 1.12 1.24 0.27 1.27 n=113 miehet 0.76 0.30 0.67 1.44 1.77 0.35 1.83 n=107 kaikki 0.72 0.26 0.67 1.23 1.44 0.27 1.83 n=220 raittiit, 0.62 0.63 0.16 1.29 miehet n=58
1.00.75 Sensitivity.50.25 Ref erence Line %DST-CE %CDT-TIA 0.00 CDTect 0.00.25.50.75 1.00 1 - Specificity
%CDT-TIA cut off Sens CI Spec CI 2.9 a 44 33 to 54 96 92 to 98 2.6 b 48 37 to 59 93 88 to 96 2.5 c 52 42 to 63 90 85 to 94 2.5 d 52 42 to 63 90 85 to 94 %DST-CE cut off 1.8 a 43 33 to 54 96 92 to 98 1.4 b 53 43 to 64 94 89 to 97 1.0 c 80 71 to 88 81 74 to 86 1.2 d 65 55 to 75 90 85 to 94
Toistettavuus, sarjan sisäinen ka SD %CV n Matala 1.45 % 0.03 % 2.2 16 Korkea 11.37 % 0.14 1.2 16
Toistettavuus, päivittäinen ka SD %CV n Matala 1.51 % 0.09 % 5.8 10 Korkea 8.58 % 0.38 % 4.4 10
0.08 0.07 0.06 0.05 Au 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes
0.08 0.07 0.06 0.05 Au 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes
Comparison between «CC» homozygous (normal) and a «CB» variant of transferrin of two alcohol abusers. 4 Sialo C B 2 Sialo C B 0 Sialo C B 5 Sialo C B CB variant CC C 0 Sialo C 2 Sialo C 3 Sialo C 4 Sialo C 5 Sialo
Heterotsygoottiset transferriinivariantit Tutkimusnäytteet, 257 kpl - BC tyyppi: 5 kpl (1.9 %) - CD tyyppi: 2 kpl (0.8 %)
Heterotsygoottiset transferriinivariantit Viitemateriaali Naiset - BC tyyppi: 4 kpl (3.3 %) - CD tyyppi: 1 kpl (0.8 %) Miehet - BC tyyppi: 4 kpl (3.3 %) - CD tyyppi: 4 kpl (3.3 %)
Migration Time difference between the two tetrasialo Tf Variants 0.15 min D C 4D 5D 4C Asymmetric Valley One Shoulder 0.12 min Symmetric Valley C B2 4C 4B2 0.21 min C B1 4C 5C 4B1 Symmetric Valley One Peak D B1 4D 5D 0.37 min 4B1 Symmetric Valley Two Peaks
Dvariant Dvariant Alcohol Abuser 0 2 3 4 5 6 B2 variant B1 variant
0.06 0.06 0.05 0.05 0.04 0.04 0.03 0.03 Au 0.02 0.02 Au 0.01 0.01 0.00 0.00-0.01-0.01-0.02 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes -0.02
0.040 0.040 0.035 0.035 0.030 0.030 0.025 0.025 0.020 0.020 Au 0.015 0.015 Au 0.010 0.010 0.005 0.005 0.000 0.000-0.005-0.005-0.010 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 Minutes -0.010
0.08 0.08 0.07 0.06 0.07 0.06 monoklonaalinen α-raskasketju 0.05 0.05 Au 0.04 0.04 Au 0.03 0.03 0.02 0.02 0.01 0.01 0.00 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 Minutes 0.00 02790588
0.08 0.08 0.07 0.07 0.06 0.05 0.06 0.05 monoklon. IgA kappa Au 0.04 0.04 Au 0.03 0.03 0.02 0.02 0.01 0.01 0.00 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 Minutes 0.00
Yhteenveto hyvä toistettavuus helppo näytteiden esikäsittely geneettisten varianttien tunnistus hyvä korrelaatio alkoholin kulutukseen
CDT menetelmän uusi versio analyysiaika lyhenee tulostaso kohoaa noin 15 20 % CRP:n häiriövaikutus poistuu