Infektioepidemiologia Mikrobiologiset tutkimusmenetelmät infektioepidemiologian aseina Anja Siitonen, Jaana Vuopio-Varkila, Mika Salminen ja Carl-Henrik von Bonsdorff Mikrobiologiset laboratoriotutkimukset ja infektioiden laboratoriopohjainen seuranta ovat oleellisia tunnistettaessa infektio-ongelmia ja jäljitettäessä tartuntojen lähteitä. Mikrobien perimää analysoivat molekyylibiologiset menetelmät yhdistettyinä mikrobien ilmiasua tutkiviin fenotyypitysmenetelmiin ovat nykyaikaisen infektioepidemiologian tehoaseet, ja ne vahvistavat epidemiologisen selvityksen luotettavuutta. Potilaasta eristettyyn mikrobiin kohdistuvien menetelmien etuna on kokonaan anonyymisti toteutettavien tutkimusten mahdollisuus. Elintarvikkeiden ja juomaveden välityksellä levinneet bakteeri- ja virusepidemiat, sairaalainfektiot ja muut vakavat tartunnat ovat mikrobiologisten tyypitysmenetelmien yleisimpiä käyttökohteita. Bakteriologiassa tutkimuksen kohteena on yleensä eristetty bakteeri, ja sen puhdasviljelmä on edellytys fenotyyppitestien luotettavuudelle. Virusten tutkimukset sen sijaan tehdään usein suoraan potilasnäytteistä. Mikrobit ja epidemiat kulkeutuvat nykyään maiden rajojen yli aiempaa helpommin. Tarvittavien tyypitysmenetelmien harmonisointi onkin eri maiden kansallisten referenssilaboratorioiden yhteistyön keskeisiä päämääriä. Suomessa tehdään vuosittain infektiotautien toteamiseksi 4 5 miljoonaa Suomen Kuntaliiton nimikkeistössä mainittua laboratoriotutkimusta (Siitonen 1999). Suurin osa todetuista infektioista on yksittäisiä tapauksia, jotka eivät yleensä edellytä mikrobilöydöksen tarkkaa tyypitystä tai tartunnan lähteen yksityiskohtaista selvittämistä. Mikrobiologisia tyypitysmenetelmiä on käytetty totunnaisesti mm. sairaalainfektioepidemioiden ja salmonellatartuntojen alkulähteiden selvittämisessä. Viime vuosina yhdeksi laajimmista käyttöalueista on muodostunut elintarvikkeiden tai juomaveden välittämien epidemioiden eli»ruokamyrkytysten» toteaminen ja jäljitys. Myös sairaalainfektioiden ja eräiden muiden vakavien infektioiden tehostettu seuranta on lisännyt mikrobiologisten tyypitysmenetelmien käyttöä. Laboratoriossa tehtävät testit ja mikrobien laboratoriopohjainen seuranta ovatkin olleet suuri apu erilaisia infektioongelmia tunnistettaessa ja ratkottaessa. Mikrobiologisilla tuloksilla on ollut myös huomattava merkitys epidemiaselvitysten luotettavuuden vahvistajina. Ruokamyrkytysepidemioita on Suomessa seurattu jo yli 25 vuotta (Hatakka ym. 2001). 1990-luvun alkupuoliskolla vuosittain ilmoitettujen epidemioiden määräksi vakiintui noin 30. Vuonna 1997 aloitettu tehostettu epäilyilmoitus- ja selvitysjärjestelmä nosti vuosittaisen määrän lähes sataan. Ruokamyrkytyksiä aiheuttavien virusten kartoitustyö ja molekyylidiagnostiikan ja -epidemiologian kehittäminen ovat viime vuosina osoittaneet ihmisen suolistovirukset merkittäviksi epidemioiden aiheuttajiksi (v. Bonsdorff ja Maunula 2000, Hatakka ym. 2001, Lopman ym. 2002). Viruslöydösten lisääntymisestä huolimatta viranomaisten tietoon 2046 Duodecim 2002;118:2046 53 A. Siitonen ym.
arvioidaan vuosittain tulevan alle 3 % kaikista ruokaan tai juomaan liittyvistä tartunnoista (Siitonen ja Maijala 2001). Epidemioissa aiheuttaja sentään löytyy jo lähes 60-prosenttisesti (Hatakka ym. 2001). Vuonna 1998 Suomessa käynnistyi valtakunnallinen sairaalainfektio-ohjelma (SIRO). Se samoin kuin jo vuonna 1991 perustettu ihmisistä eristettyjen bakteerien resistenssiä tutkiva laboratorioverkosto (FiRe) pyrkivät kumpikin yhdenmukaistamaan mm. sairaalaperäisten infektioiden ja lääkeherkkyydeltään muuttuneiden bakteerien laboratoriodiagnostiikkaa. Tämä on osaltaan johtanut näiden infektioiden seurannan tehostumiseen ja antanut paremman pohjan mikrobiologiselle selvitystyölle. Ihmisten ja elintarvikkeiden vapaa liikkuminen ovat asettaneet uusia vaateita infektioista eristettyjen mikrobien seurannalle sekä epidemioiden jäljittämiselle ja torjunnalle. Esimerkiksi ruokamyrkytysepidemioiden maantieteellisesti laajentunutta merkitystä kuvaa se, että vuoden 2001 aikana Suomessa tehdyistä salmonellalöydöksistä välitettiin tyyppitietoa 15 kansainvälisen epidemian hallitsemiseksi. Taudinaiheuttajat eivät välttämättä enää pysähdykään maan rajojen sisäpuolelle, ja ne liikkuvat helposti myös potilaiden ja työvoiman mukana sairaalasta ja laitoksesta toiseen. Sairaalainfektioiden torjunnassa ulkomaisten taudinaiheuttajien invaasiota pyritäänkin nykyään ehkäisemään seulomalla Suomeen jatkohoitoon saapuvat potilaat lääkeherkkyydeltään muuntuneiden bakteerien suhteen. Taudinaiheuttajamikrobiin kohdistuvien tutkimusmenetelmien etu infektioseurannassa on kokonaan anonyymisti toteutettavien tutkimusten mahdollisuus; nykyisin tätä tarvitaan tietyissä tartuntataudeissa, esimerkiksi HIV-infektioiden seurannassa. Molekyyliepidemiologian menetelmät tarjoavat lisäksi erityisen apukeinon arvioida epidemioiden kestoa ja dynamiikkaa. Esimerkiksi klonaalisissa epidemioissa mikrobit muistuttavat läheisesti toisiaan, kun taas yksittäisissä tautitapauksissa erot mikrobikantojen välillä ovat tavallisesti huomattavia. Oikein sovellettuina mikrobien molekyylidiagnostiikka ja -epidemiologia ovatkin ne täsmäaseet, jotka sinetöivät tietyn taudinaiheuttajan tiettyyn epidemiaan, sen välittäjään ja tartunnan lähteeseen ja jotka hyödyttävät sekä viranomaisia että potilaita infektiotautien torjunnassa. Mikrobien osoitus ja tyypitys Rekombinaatio, mutaatio ja geneettisen materiaalin liikkuminen mikrobista toiseen ovat geneettisen vaihtelun lähteitä. Ne luovat perustan mikrobien sekä ilmiasuun (fenotyyppiin) että perimään (genotyyppiin) kohdistuvalle tarkalle tyypitykselle ja siten epidemioiden jäljitykselle. Bakteriologinen laboratoriodiagnostiikka nojaa edelleen näytteen viljelyyn ja bakteerilajin tunnistukseen totunnaisin fenotyypityksen menetelmin. Viime vuosikymmenenä läpimurron tehneet molekyylibiologian menetelmät ovat kuitenkin bakteriologiassakin vakiintuneet jatkuvaan käyttöön taudinaiheuttajan osoittamisessa ja tarkassa tyypityksessä (taulukko). Myös näiden menetelmien käyttö edellyttää bakteriologiassa useimmiten bakteerin puhdasviljelmää; virologiassa taas kaikki tutkimukset tehdään yhä enemmälti suoraan potilasnäytteistä. Molekyylibiologisista menetelmistä ovat Suomessa yleisessä käytössä polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvat ja mikrobien tiettyjä geenejä tunnistavat menetelmät. PCR:llä tunnistetaan mm. stafylokokkien metisilliiniresistenssiä määräävä meca-geeni, enterokokin vankomysiiniresistenssin van-geenit, enterohemorragisen Escherichia coli (EHEC) -bakteerin Shigatoksiinin stx-geenit ja Clostridium perfringensin enterotoksiinin cpe-geeni. Bakteerilajin tunnistavan PCR-testin ja eri mikrobilääkeresistenssigeenien monistaminen voidaan yhdistää samaan PCR-testiin. Näin tehdään esimerkiksi vankomysiinille resistenttien enterokokkien (VRE) osalta. Varsinaisista geneettisistä tyypitysmenetelmistä ovat erityisesti pulssikenttäelektroforeesi- (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) ja ribotyypitysmenetelmät laajassa käytössä bakteriologiassa. Niillä voidaan periaatteessa tutkia minkä tahansa mikrobin genomi. Käytännössä kukin mikrobi kuitenkin vaatii erilaiset koeolosuhteet, mikä asettaa vaateita testin koekäytölle ja ylläpidolle. PFGE-menetelmässä mikrobit va- Mikrobiologiset tutkimusmenetelmät infektioepidemiologian aseina 2047
Taulukko. Esimerkkejä Suomessa epidemioita aiheuttaneista mikrobeista, joiden feno- ja/tai genotyypitykseen tai molempiin on referenssilaboratorioissa jatkuva valmius. Mikrobi Fenotyypitys Genotyypitys Elintarvike- ja/tai vesivälitteisiä Salmonella enterica Enteritidis Paratyphi B Faagityypitys Typhimurium } muut serotyypit O:H-serotyypitys } DNA pilkotaan XbaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Escherichia coli EHEC-kannat Sorbitolin käyttötesti O:H-serotyypitys Shiga-toksiinin osoitus Enterohemolysiinin osoitus } Shiga-toksiinia ja intimiiniä määräävät geenit osoitetaan PCR:llä DNA pilkotaan XbaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä EHEC-O157 Faagityypitys Yersinia enterocolitica Biotyypitys O-serotyypitys DNA pilkotaan NciI-entsyymillä, hybridisoidaan koettimella DNA pilkotaan NotI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Yersinia pseudotuberculosis O-serotyypitys DNA pilkotaan NotI-(tai SpeI)-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Shigella-lajit O-serotyypitys Genotyypitys ei aktiivisessa käytössä Campylobacter jejuni Serotyypitys DNA pilkotaan SmaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Listeria monocytogenes O:H-serotyypitys DNA pilkotaan AscI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Clostridium perfringens Kalikivirus Hepatiitti A -virus Enterotoksiinin tuoton osoitus Serologia Enterotoksiinia määräävä geeni osoitetaan PCR:llä DNA pilkotaan SmaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä RNA käännetään DNA:ksi PCR-reaktiossa, tuote tunnistetaan koetinpaneelilla Sekvensointi, fylogenia Muita epidemioina leviäviä mikrobeja Staphylococcus aureus, MRSA-kannat Enterococcus-lajit, VRE-kannat Streptococcus pyogenes Corynebacterium diphtheriae Neisseria meningitidis Faagityypitys Lajintunnistus T-tyypitys, OF-testi Biotyypitys Difteriatoksiinin tuoton osoitus (Elek-testi) Seroryhmitys Ulkomembraanin proteiiniprofilointi DNA pilkotaan SmaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä Metisilliiniresistenssiä ja termonukleaasia määräävät geenit osoitetaan PCR:llä Vankomysiiniä määräävä geeni osoitetaan PCR:llä DNA pilkotaan SmaI-entsyymillä, palaset erotellaan PFGE:ssä M-proteiinin tyypitys (EIA-koettimella ja sekvensoinnilla) Toksiinia määräävän geenin osoitus PCR:llä Ribotyypitys Ei aktiivisessa käytössä HI-virus PFGE = pulssikenttäelektroforeesi Sekvensointi, fylogenia Mutaationtunnistus 2048 A. Siitonen ym.
letaan agaroosigeeliin (kuva 1), jossa niiden DNA pilkotaan ns. harvaan pilkkovalla restriktioentsyymillä (esim. XbaI, SmaI), ja palaset erotellaan sykäyksittäin suuntaansa vaihtavassa sähkövirrassa. Ribotyypityksessä DNA eristetään bakteerista, pilkotaan tiuhaan pilkkovalla entsyymillä (esim. EcoRI, HindI), minkä jälkeen DNA-palat hybridisoidaan ribosomaalista RNA:ta sisältävällä geenikoettimella (rrna) ja erotellaan tasaisessa sähkövirrassa. DNA-palat ajautuvat agaroosigeelin sähkökentässä tietyn ajan kuluessa kokonsa mukaisesti: pienet palaset nopeammin ja pitemmälle kuin isommat. Geelin värjäys tuo palat näkyviin juosteina,»viivakoodina» (kuva 1), ja keskenään identtisillä kannoilla ne ovat samassa kohdassa geeliä ja niitä on sama määrä. Tämä genotyyppiprofiili tai»sormenjälki» talletetaan nykyään sähköiseen kirjastoon myöhempiä vertailutarpeita varten. Useimpien bakteerien genotyypitysmenetelmät ovat kansainvälisesti standardoimattomia eivätkä siten ole referenssilaboratoriotoiminnassa syrjäyttäneet totunnaisia ja kansainvälisesti standardoituja fenotyypitysmenetelmiä (esim. bakteerien sero- ja faagityypitys tai lääkeresistenssin määritys). Eri menetelmillä on omat vahvuutensa ja heikkoutensa. Fenotyypitysmenetelmillä saadaan vastaus päivän, parin kuluessa, kun taas esimerkiksi PFGE-menetelmää käytettäessä tuloksen valmistuminen voi viedä parikin viikkoa. Fenotyypitysmenetelmät eivät ole yhtä erottelevia kuin genotyypityksessä käytettävät, mutta geneettisesti hyvin muuntelevia mikrobeja (esim. osa EHEC- ja Campylobacter-kannoista) tutkittaessa menetelmän suuri erottelukyky voi olla jopa haitta. Virusten ilmiasuun perustuvista diagnostisista menetelmistä elektronimikroskopiaa (EM) käytettiin vielä äskettäin yleisesti mm. kalikivirusten toteamisessa. Tämän nykyään yleisimmän ruokamyrkytysviruksen jäljille johtivat alun perin juuri elektronimikroskopistien kuvaamat»pienet pyöreät virukset», joita nähtiin ripulipotilaiden ulostenäytteissä. EM-diagnostiikka on kuitenkin epäherkkää ja epäspesifistä. Virusten diagnostiikassa ja epidemioloiden selvittämisessä on siirrytty yhä enemmän niiden Bakteerisolu Bakteeriviljelmän ja agaroosin seos Hajotetun solun osat agaroosin sisällä Bakteerin kromosomaalinen DNA Pilkkoutunut DNA Solun hajotus Pesu Agaroosi DNA:n pilkkominen restriktioentsyymillä DNA-palojen erottelu suuntaa muuttavassa sähkövirrassa St 1 2 3 4 5 6 St 7 8 9 10 11 12 St Kuva 1. Kaaviokuva bakteerin pulssikenttäelektroforeesityypityksestä (PFGE-tyypitys). Samassa agaroosigeelissä on tutkittu 12 salmonellakannan geneettistä identtisyyttä. Kaikki kannat poikkeavat toisistaan PFGE-profiililtaan eli genotyypiltään. St = molekyylipainostandardi. Mikrobiologiset tutkimusmenetelmät infektioepidemiologian aseina 2049
perimää tutkivien menetelmien käyttöön. Kalikivirusta tutkitaan RT-PCR-menetelmällä (reverse transcription-polymerase chain reaction). Siinä viruksen perimä käännetään ensi vaiheessa DNA:ksi ja sen jälkeen valitaan eri viruskantojen väliltä mahdollisimman konservoitunut alue, josta määritetään sopivat vastakkaista emäsjärjestystä edustavat noin 20 30 emäksen alukkeet. Nämä johtavat polymeraasientsyymin toimiessa noin 100 200 emästuotteen monistumiseen. Monistetun tuotteen varmistukseen käytetään koetinta; se on myös noin 20 emäksen nukleiinihappoketju, jonka komplementaarinen vastine löytyy monistetun tuotteen alueelta. Koettimeen on liitetty sopiva merkkiaine, joka voidaan tunnistaa. Kalikivirukset ovat varsin moninaisia toisin kuin esimerkiksi pikornaviruksiin kuuluvat enterovirukset, joista yksi alukepari ja sen tuotteen alueelle määritetty koetin tunnistavat kattavasti kaikki virusperheen jäsenet. Yhdellä alukeparilla voidaan menetelmän herkkyydestä tinkien monistaa auttavasti toistaiseksi tunnettujen virusten perimää. Varsinkin ympäristönäytteissä käytetään ainakin kahta alukeparia. Sen sijaan koettimia tarvitaan enemmän: lähes jokaiselle toistaiseksi tunnistetuille noin 15 NLV-kalikivirukselle (Norwalk-like virus) omansa. Tämä on ollut diagnostiikan kannalta varsin haastavaa mutta tarjonnut erinomaisen aseen epidemiaselvitysten tekijöille. Monistetun tuotteen alueella riittää yleensä noin 65 emäksen jakso erittäin luotettavaan kantatunnistukseen (v. Bonsdorff ja Maunula 2000). Virusten genomin pieni koko bakteereihin verrattuna sekä PCR- ja automaatti-sekvensaattoritekniikoiden kehittyminen ovat tehneet nukleiinihapon sekvensoinnista virusten nopean ja helpon tyypitysmenetelmän. Kun esimerkiksi kalikiviruksista tarvitaan edellä esitettyä tunnistusta tarkempaa tietoa, tukeudutaan tavallisimmin viruksen kuoriproteiinin geenin osittaiseen emäsjärjestyksen määrittämiseen. Äskettäin heränneet epäilyt kalikivirusten mahdollisesta rekombinaatiosta eli kahden eri viruskannan risteytymisestä saattavat kuitenkin merkitä sitä, että epidemian selvittelyn yhteydessä tarvitaan ainakin kahden eri alueen emäsjärjestyksen määrittämistä. Myös HI-virusten tutkimisessa käytetään lähes rutiinimaisesti viruksen perimän sekvensointia ja viruskantojen luokittelua mm. fylogeneettisin keinoin. Näillä menetelmillä seurataan erilaisten HIV-kantojen levinneisyyttä ja arvioidaan mm. kotoperäisten ja ulkomailta tuotujen infektioiden osuuksia. Menetelmiin voidaan myös laskea genotyyppiset lääkeresistenssimutaatiotestit, joita tehdään retroviraalilääkkeille. Mikrobiologinen tietopankki Mikrobiologisten osoitus- ja tyypitystulosten merkityksen arvioimiseksi on välttämätöntä tuntea epidemian aiheuttajaksi epäillyn tai osoitetun mikrobin eri tyyppien esiintymisen perustaso. Suomesta tietoa löytyy takautuvasti eniten epideemisistä bakteereista, mutta HI-viruksenkin genotyypeistä sitä on jo 1980-luvun lopulta. Kalikivirusten molekyyliepidemiologinen kirjo puolestaan on tiedossa vuodesta 1997 lähtien. Taustatiedoista on ollut hyötyä jäljitettäessä tartunnanlähdettä kansallisissa tai kansainvälisissä epidemioissa, esimerkiksi salmonellaepidemioissa. Salmonellojen kotoperäisten ja ulkomaisten sero- ja faagityyppien kirjo on tiedossa jo 1960-luvulta lähtien, ja se kattaa noin 150 000 salmonellatartuntaa. Mikrobilääkkeille moniresistenttien salmonellojen ilmaantumisen myötä on suolistoinfektioiden kansainvälisissä epidemiahälytyksissä nykyään vakiintunut käytännöksi ilmoittaa epidemiakannan resistenssiprofiili. Suomessa tätä tietoa on hankittu järjestelmällisesti vasta viime vuosina. Kahdeksan EU-maan Suomi mukaan luettuna yhteishankkeena on käynnistetty 25 000 sero- ja faagityypitetyn salmonellakannan EU-kokoelman keräys. Kokoelman avulla harmonisoidaan PFGE-menetelmä vastaamaan Yhdysvalloissa pitkään toiminnassa ollutta PulseNet-järjestelmää (Binder ja Levitt 1998). Hanke tuleekin sähköistämään salmonellojen molekyylibiologisten sormenjälkikuvioiden siirron ja vertailun ja tehostamaan kansainvälisten salmonellaepidemioiden selvittämistä. EHEC- ja Listeria monocytogenes -bakteerien aiheuttamista infektioista eristettyjen kantojen tyyppijakauma on Suomessa tiedossa yli kym- 2050 A. Siitonen ym.
meneltä vuodelta. Genotyyppiprofiilit on tallennettu sähköisiksi kirjastoiksi (Rantala ym. 2002), jotka mahdollistavat epidemiatilanteissa ihmisistä, elintarvikkeista, eläimistä ja ympäristöstä eristettyjen kantojen nopean vertailun. Toiveena on, että myös muista tärkeistä epidemioita aiheuttavista ruokamyrkytysmikrobeista, kuten Campylobacter jejunista ja Yersinia pseudotuberculosiksesta, saataisiin perustettua vastaavanlaiset kirjastot. Staphylococcus aureuksen faagityypityksiä on tehty Suomessa jo 1960-luvulta lähtien. MRSAkannoista (metisilliiniresistentti S. aureus) osa ei kuitenkaan tyypity faageilla, jolloin faagityypityksen erottelukyky ei aina riitä päätelmiin esimerkiksi tartuntaketjusta. PFGE-genotyypityksistä onkin tullut sekä MRSA- että VRE-kantojen tärkeä referenssimenetelmä. Näistä kannoista on saatavissa tarkkaa taustatietoa jo 1990- luvun alusta lähtien.»elävän elämän» esimerkkejä Ruoat ja juomat mikrobitartuntojen välittäjinä. Raakoina syötävät idut ovat aiemmin olleet useiden salmonellaepidemioiden lähteenä. Bakteeri piileskelee siemenen kuoren alla, jonne se on joutunut siemenen kehitysvaiheen aikana ja josta se lisääntyy suotuisissa idätysolosuhteissa. Epidemiaselvitys täydennettynä salmonellan serotyyppi-, XbaI-PFGE-genotyyppi- ja lääkeresistenssitiedoilla osoitti vuonna 1994 itujen levittäneen Suomessa ja Ruotsissa Salmonella Bovismorbificansia ja vuonna 1995 Suomessa ja Yhdysvalloissa Salmonella Stanleytä (Puohiniemi ym. 1997). Asian selvittämistä auttoi taustatieto, että todetut feno- ja genotyypit eivät kuuluneet kotoperäisiin salmonellatyyppeihimme. Salmonella Enteritidis, joka sekään ei kuulu kotoperäiseen»reserviimme», aiheutti Suomessa 1990-luvulla 15 laajaa epidemiaa. Useimmat niistä esiintyivät Varsinais-Suomessa ja olivat saman faagityypin aiheuttamia. Kyseisen faagityypin tiedettiin olevan yleinen Venäjällä ja Baltian maissa. Vuonna 1995 bakteeri jäljitettiin Turun seudulla toimivaan kanalaan. Sen tuottamien kananmunien sisältä ja munintakanojen munasarjoista löydettiin sero-, faagi- ja PFGEtyypiltään epidemiat aiheuttaneen salmonellan kanssa identtinen kanta (Johansson ym. 1996), joka erosi geneettisesti samaa faagityyppiä olevista Itä-Euroopan kannoista. Kanala lopetettiin, ja sen koommin kotimaiset kananmunat eivät ole olleet Suomessa salmonellaepidemioiden lähteenä. Vuonna 1999 sairastutti Suomen tärkein kotoperäinen salmonellatyyppi, S. Typhimuriumin faagityyppi 1, sukujuhlien osanottajia ja erään kerrostalon asukkaita hiirilavantautiin. Sukujuhlien pitokokki ja kyseisessä kerrostalossa asunut henkilö olivat käyttäneet saman maatilan tinkimaitoa kotijuuston raaka-aineena. Kyselytutkimus vahvisti pastöroimattomasta maidosta valmistetun juuston epidemian lähteeksi (Skogberg ym. 1999). Mikrobiologiset laboratoriotutkimukset puolestaan osoittivat, että potilaista, tilan lypsylehmistä, tilatankin maitonäytteestä ja rehusta löytyneet salmonellakannat olivat samaa sero- ja faagityyppiä, ja PFGEtyypitys vahvisti niiden geneettisen identtisyyden (Lindqvist ym. julkaisematon havainto). Vuonna 1999 löytyi useiden listerioosipotilaiden veri- tai likvoriviljelyistä harvinaista serotyyppiä 3a oleva Listeria monocytogenes (Lyytikäinen ym. 2000). Samanlainen kanta oli löytynyt jo aikaisemmin erään meijerin voista. Uusissa tutkimuksissa saman serotyypin kanta löytyi myös voinapeista sairaalassa, jossa suurin osa em. listerioosipotilaista oli hoidettavana muun syyn johdosta. Kaikki eristetyt kannat olivat samaa serotyyppiä ja geneettisesti keskenään identtisiä AscI- ja ApaI-PFGE-tyypityksissä. Tämän katsottiin olevan riittävä näyttö voin osuudesta epidemian puhkeamiseen. Tuotteen poisto markkinoilta lopetti epidemian. Juomavesivälitteisissä epidemioissa on Suomessa tavattu laaja kirjo eri NLV-kalikiviruksia. Löydökset viittaavat siihen, että saastuttajana on ollut jätevesi (Miettinen ym. 2001). Jätevedestä löytyykin yleensä samanaikaisesti eri genotyyppeihin kuuluvia Norwalk-like-viruksia. Heinäveden epidemia oli ensimmäinen, jonka yhteydessä pystyttiin osoittamaan sama kalikivirus potilasnäytteistä, raakavedestä (Kermajärven vesi) ja kuluttajien talousvesistä (Kukkula ym. 1999). Vaikka saastelähteestä ei saatu ehdoton- Mikrobiologiset tutkimusmenetelmät infektioepidemiologian aseina 2051
ta varmuutta, mahdollisena lähteenä olivat ne runsaat 500 kuopiolaista koululaista ja opettajaa, jotka runsaat kolme kuukautta aikaisemmin olivat syöneet serbialaisia pakastevadelmia ja sitten erittäneet Kallaveteen runsaasti RNAsekvenssiltään identtistä virusta (kuva 2). Lisäpiirteenä Heinäveden veden saastumisen seurauksista voitiin edelleen sekvenssivertailun perusteella todeta, että paikallisen catering-yrittäjän valmistama kotikalja aiheutti mieleenpainuvat 50-vuotispäivät Leppävirralla. Genomidiagnostiikka on keskeistä myös hepatiitti A -viruksen seurannassa. Tämä leviää samalla tavalla kuin kalikivirus, jonka aiheuttamista epidemioista eräät ovat osoittautuneet osaksi kansainvälistä epidemiaa (Pönkä ym. 1999, Hatakka ym. 2001). Suomessa on kuitenkin toistaiseksi vältytty laajemmilta hepatiitti A -epidemioilta (Lappalainen ym. 2001), mutta riski on olemassa, kun pakastemarjoja tuodaan maista, joissa kyseistä tautia esiintyy endeemisenä. Epidemioita enterokokeista HI-virukseen. Suomen ensimmäinen vankomysiinille resistentin enterokokin (VRE) aiheuttama epidemia todettiin vuonna 1996. SmaI-PFGE-genotyypityksen ja van-pcr-testin avulla tunnistettiin kaksi eri VRE-kantaa, jotka levisivät sairaalassa samanaikaisesti ja aiheuttivat epidemian. Tavanomaiset mikrobiologiset testit eivät olisi kyenneet todentamaan epidemian monimuotoisuutta (Suppola ym. 1999). A-ryhmän streptokokit aiheuttavat läntisellä pallonpuoliskolla 5 10 vuoden sykleissä esiintyviä vakavien infektioiden epidemia-aaltoja. Ilmiön syytä ei tunneta, mutta sen arvellaan liittyvän sekä bakteerin pintarakenteiden muunteluun että väestön immuniteetin vaihteluun. Koska osa A-streptokokkikannoista kykenee aiheuttamaan nopeasti etenevän tautimuodon, on tärkeää havaita, milloin kyseisten kantojen aiheuttamien tapausten määrä on lisääntymässä väestössä. A-streptokokit voivat aiheuttaa myös esimerkiksi tonsilliitti- ja tulirokkorypäitä varuskunnissa, kouluissa ja päiväkodeissa. Kaikkien em. tilanteiden tunnistamisessa ja selvittelyssä hyödynnetään jatkuvasti A-streptokokin fenotyypitystä (lääkeresistenssin määritys, T-serotyy- Kalikiviruksen tie Vadelmia kerätty ja pakastettu Serbiassa 2 500km 500 koululaista NLV:n uhriksi kouluaterian jälkeen Paljon NLV:tä jäteveteen 70 km 2 500 ihmistä sai NLV:n Heinävedellä juotuaan kunnan vettä Kermajärvestä 50 km 50 ihmistä sai NLV:n Leppävirralla juotuaan kotikaljaa, joka oli tehty Heinävedellä Kesä 1997 Lokakuun loppu 1997 Maaliskuu 1998 Huhtikuu 1998 Kuva 2. Hypoteesi kalikiviruksen kulkeutumisesta serbialaisten pakastevadelmien mukana Suomeen kolmen ripuliepidemian aiheuttajaksi. pitys) ja molekyylitekniikoita (M-tyypitys ja emm-tyypitys, jotka pohjaavat koetin-pcr-yhdistelmätestiin ja nukleiinihapposekvensointiin). Kun Suomessa todettiin ensimmäinen kurkkumätätapaus kolmenkymmenen vuoden tauon jälkeen vuonna 1993, tehostettiin difteriantunnistuksen valmiuksia. Fenotyyppisen difteriatoksiinituoton toteamistestin, ns. Elek-testin, rinnalle pystytettiin PCR-perustainen nopea difteriatoksiinigeenin toteamistesti ja bakteerin tyypitysmenetelmäksi ribotyypitys. Kansainvälisen yhteistyön avulla varmistui, että seuraavien neljän vuoden aikana Suomessa yhdeksästä muusta difteriapotilaasta eristetyt bakteerikannat olivat samanlaisia kuin samanaikaisesti Venäjällä laajan kurkkumätäepidemian aiheuttaneet difteriakannat. Vuodenvaihteessa 2002 todetut 2052 A. Siitonen ym.
kaksi uutta kurkkumätätapausta muistuttivat näiden menetelmien ylläpidon tarpeellisuudesta. Myös vakavat meningokokki-infektiot kuuluvat jatkuvan mikrobiologisen seurannan piiriin. Koska Suomessa käytössä olevat AC- ja ACWY-rokotteet eivät suojaa seroryhmän B meningokokkitaudilta, johon rokote on vasta kehitteillä, on tärkeää tietää, minkä seroryhmän kanta on aiheuttanut taudin. Toisaalta myös matkailijat voivat altistua tartunnalle alueilla, joilla meningokokki on endeeminen. Keväällä 2000 ja 2001 Mekassa käyneillä pyhiinvaeltajilla todettiin seroryhmän W135 aiheuttamia aivokalvontulehduksia useissa maissa. Seroryhmitys ja ulkomembraanin proteiinianalyysit vahvistivat, että tartunnan lähde oli sama. HIV-epidemiologiakin nojaa vahvasti molekyylibiologian menetelmiin. Niiden avulla HIVkannat on luokiteltu alatyyppeihin (A K), joiden levinneisyys vaihtelee merkittävästi. Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa yleisin on HIV-1:n alatyyppi B, kun taas Itä-Euroopassa esiintyy pääasiassa alatyyppiä A. Suomessa vuonna 1998 puhjenneen piikkihuumeiden käyttöön liittyvän HIV-epidemian voitiin yllättäen osoittaa kuuluvan Kaakkois-Aasiassa yleiseen AE-rekombinanttialatyyppiin. Molekyyliepidemiologinen selvitys vahvisti osaltaan myös päätelmää kyseisen epidemian tuoreudesta. Koska eri tapausten viruskannat eivät poikenneet toisistaan geneettisesti juuri ollenkaan, epidemian täytyi olla tuore. Tapausten lisääntyminen ei siten johtunut muutoksista seurantajärjestelmissä, joiden kautta aiemmin»piiloon» jääneitä tapauksia olisi yhtäkkiä paljastunut. Kirjallisuutta Binder S, Levitt AM. Preventing emerging infectious diseases: A strategy for the 21 st century. Morb Mort Wkly Rep 1998;47(RR-15):1 14. von Bonsdorff C-H, Maunula L. Ovatko ruokamyrkytykset virusten aiheuttamia? Duodecim 2000;116:70 76. Hatakka M, Loukaskorpi M, Pakkala P. Ruokamyrkytykset Suomessa vuonna 2000. Elintarvikeviraston julkaisuja 8/2001. Johansson TM-L, Schildt R, Ali-Yrkkö S, Siitonen A, Maijala RL. The first Salmonella Enteritidis phage type 1 infection of a commercial layer flock in Finland. Acta Vet Scand 1996;37:471 80. Kukkula M, Maunula L, Silvennoinen E, v. Bonsdorff C-H. Outbreak of viral gastroenteritis due to drinking water contaminated by Norwalk-like viruses. J Infect Dis 1999;180:1771 6. Lappalainen M, Chen RW, Maunula L, v. Bonsdorff C-H, Plyusnin A, Vaheri A. Molecular epidemiology of viral pathogens and tracing of transmission routes: hepatitis-, calici- and hantaviruses. J Clin Virol 2001;21:177 85. Lopman, BA, Brown, DW and Koopmans, M. Human caliciviruses in Europe. J Clin Virol 2002;24:137 60. Lukinmaa S, Schildt R, Rinttilä T, Siitonen A. Salmonella Enteritidis phage types 1 and 4: Pheno- and genotypic epidemiology of recent outbreaks in Finland. J Clin Microbiol 1999;37:2176 182. Lyytikäinen O, Autio T, Maijala R, ym. An outbreak of Listeria monocytogenes serotype 3a infections from butter in Finland. J Infect Dis 2000;181:1838 41. Miettinen IT, Zacheus O, v. Bonsdorff C-H, Vartiainen T. Waterborne epidemics in Finland in 1998 99. Water Sci Technol 2001;43:67 73. Puohiniemi R, Heiskanen T, Siitonen A. Molecular epidemiology of two international sprout-borne Salmonella outbreaks. J Clin Microbiol 1997;35:2487 91. Pönkä A, Maunula L, v. Bonsdorff C-H, Lyytikäinen O. An outbreak of calicivirus associated with consumption of frozen rapsberries. Epidemiol Infect 1999;123:469 74. Rantala L, Eklund M, Lukinmaa S, Myllys V, Siitonen A. Kansallinen laboratorioverkko vertailee ruokamyrkytysbakteereita. Kehittyvä elintarvike 2002;3:10. Salmenlinna S, Lyytikäinen O, Kotilainen P, Scotford R, Siren E, Vuopio- Varkila J. Molecular epidemiology of methicillin resistant Staphylococcus aureus in Finland. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000;19:101 7. Siitonen A. Tartuntatautitutkimukset: selvitys pikatestien ja ulkoisen laadunarvioinnin käytöstä. Kliin Lab 1999;16:89 91. Siitonen A, Maijala R. Ruoan mikrobiologiset vaarat. Duodecim 2001;117:84 90. Skogberg K, Hyvönen P, Siitonen A, Nuorti P. Salmonellaepidemia pastöroimattomasta maidosta. Kansanterveys, Kansanterveyslaitoksen tiedotuslehti 1999;(9):8. Suppola JP, Kolho E, Salmenlinna S, Tarkka E, Vuopio-Varkila J, Vaara M. vana and vanb incorporate into an epidemic ampicillinresistant vancomycin-sensitive Enterococcus faecium strain: effect on interpretation of clonality. J Clin Microbiol 1999;37:3934 9. ANJA SIITONEN, dosentti, sairaalamikrobiologi (rekist.), laboratorionjohtaja anja.siitonen@ktl.fi Kansanterveyslaitos, mikrobiologian osasto, suolistobakteriologian laboratorio Mannerheimintie 166, 00300 Helsinki JAANA VUOPIO-VARKILA, dosentti, ylilääkäri Kansanterveyslaitos, mikrobiologian osasto, sairaalabakteriologian laboratorio Mannerheimintie 166, 00300 Helsinki MIKA SALMINEN, dosentti, laboratorionjohtaja Kansanterveyslaitos, infektioepidemiologian osasto, HIV-laboratorio Mannerheimintie 166, 00300 Helsinki CARL-HENRIK VON BONSDORFF, professori, ylilääkäri HYKS-Laboratoriodiagnostiikka, virologian osasto 00029 HYKS Mikrobiologiset tutkimusmenetelmät infektioepidemiologian aseina 2053