II 1 1111111 II 111 11111 11 11111 111 11111 111 FI000104374B (12) (10) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT FI 104374B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 14.01.2000 SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk.7 - Int.k1.7 CO7K 14/195, 17/02 ; A61K 39/385, 39/02, 39/12 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 903292 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 29.06.1990 (24) Alkupäiva - Löpdag 31.01.1989 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 29.06.1990 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US89/00388 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 01.02.1988 US 150688 P (73) Haltija - Innehavare 1 -American Cyanamid Company, 1937 West Main Street Stamford, CT 06904-0060, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 -Bixler,Garvin, 92 Squirrel's Heath Road, Fairport, NY 11450, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Pillai,Subramonia, 286 Vollmer Parkway, Rochester, NY 14623, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 -Insel, Richard, 167 oakdale drive, Rochester, NY 14618, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning T-solu-epitooppl-oligopeptidejä ja niitä sisältävien konjugaattien valmistus T-cellepitop-oligopeptider och framställning av konjugat som innehäller dessa (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A 245045 (A 61K 39/385), EP A 186576 (C 07K 17/10), Nature vol. 300 1987 pp 168-170, Infection and lmmunity vol. 55 (1987) pp 1498-1502 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tämä keksintö koskee uusia bakteerituotteiden T-solun epitooppeja. Keksinnön mukaisia epitooppeja voidaan käyttää valmistettaessa epitooppien ja lääketieteellisesti käyttökelpoisten antigeenien, hapteenien tai antigeenisten determinanttien konjugaatteja. Nämä konjugaatit pystyvät nostattamaan samanlaisen vasta-ainevasteen kuin konjugaatit, jotka muodostuvat kantajaproteiineihin kovalenttisesti kytketyistä antigeeneistä, ja rokotekoostumuksessa muodostavat turvallisia ja taloudellisempia konjugaattirokotteita. Föreliggande uppfinning avser nya T-cellepitoper av bakteriella produkter. Epitoperna enligt uppfinningen kan användas för framställning av konjugat mellan epitoperna och medicinskt användbara antigener, haptener eller antigeniska determinanter. Dessa konjugat förmår uppväcka antikroppgensvar liknande dem som åstadkoms av antigenkonjugat, vilka kovalent kopplats till bärarproteiner, och i vaccinkompositioner bildar de säkrare och mera ekonomiska konjugatvaccin.
1 104374 T-solu-epitooppi-oligopeptidejä ja niitä sisältävien konjugaattien valmistus 1. Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee oligopeptidejä ja menetelmä niitä sisältävän konjugaatin valmistamiseksi. Tällaiset rokotekoostumukset sisältävät antigeenin, antigeenideterminantin tai -hapteenin konjugoituna kantajamolekyyliin. Tarkemmin sanottuna formulaatiot käsittävät antigeenin, 10 antigeenideterminantin tai hapteenin konjugoituna bakteeriperäisen tuotteen T-solun epitooppiin. Nämä koostumukset pystyvät tehokkaasti indusoimaan käytettyjä immunogeenejä vastaan suojaavien vasta-aineiden tuotannon, mutta samalla vältetään suurempien proteiinikantajamolekyylien käyttö. 15 2. Keksinnön tausta Suojaavan immuunivasteen tuottaminen mitä tahansa tiettyä infektoivaa ainetta vastaan selkärankaisissa riippuu alun perin sopivan ärsykkeen antamisesta isännän immuunisysteemille. Itse infektoiva organismi tuo tyypil- 20 lisesti monia immuunisysteemiä stimuloivia yhdisteitä eli antigeenejä sen solumembraanin koostumusten luonteesta johtuen tai isännän kehoon vapauttamiensa aineenvaihduntatuotteista johtuen. Immuunisysteemi tunnistaa nämä aineet,,', tavallisesti suurikokoisemmat molekyylit, kuten proteii- -. 25 nit, lipopolysakkaridit tai glykoproteiinit vieraiksi ja. saa aikaan yhden- tai useammantyyppisen isännän reaktion,. jonka tarkoituksena on'poistaa tunkeutuva organismi tai saattaa se toimintakyvyttömäksi. Antigeeni voi stimuloida herkistyneitä lymfosyyttejä (T-soluja), jotka saavat ai- 30 kaan soluvälitteisen immuniteetin. Vaihtoehtoisesti anti-.. geeni voi myös stimuloida B-lymfosyyttejä aloittamaan va- paiden vasta-aineiden tuotannon ja erittämisen vereen ja.. muihin kehon nesteisiin (humoraalinen immuniteetti) ja voi... 4.. 4 :
... : 2 104374 toimia B-lymfosyyttien kanssa. Kehon suojaavan immuunivasteen kehittyminen riippuu jommankumman tai toisen näistä systeemeistä stimuloitumisen kynnystason saavuttamisesta, toisin sanoen B-solujen aktivoitumisesta yhdessä aktivoi- 5 tujen T-solujen kanssa (katso edellä). Väliaikainen immuniteetti tulehdusta vastaan voidaan usein saada aikaan antamalla yksilölle ennalta muodostettuja vasta-aineita toiselta saman tai eri lajin yksilöitä; tämä tunnetaan passiivisen immuniteetin nimellä. Esimerkki tällaisesta 10 immuniteetista on äidin vasta-aineiden siirtymisen istukan kautta tai maidon välityksellä sikiöön tai vastasyntyneeseen antama suoja. Toinen esimerkki on poolattu aikuisten gammaglobuliini, jota voidaan käyttää tuhkarokon, vesirokon, maksatulehduksen, isorokon tai jäykkäkouristuksen 15 estämiseksi tai sairauden vaikutusten modifioimiseksi. Nämä saadut vasta-aineet kuluvat lopulta vuorovaikutuksessa antigeenien kanssa tai keho hajottaa ne ja siten suoja lopulta menetetään. Pysyvämpi suoja saadaan aktiivisilla immunisoinneilla rokottamalla, jolloin isännän oma immuu- 20 nivaste stimuloituu tuottamaan suojaavia vasta-aineita, aktivoimalla B - ja T-lymfosyyttejä. Lyhyesti kuvattuna rokotus antaa aktiivisen suojaavan immuniteetin käyttämällä hyväksi antigeenin vaaratonta tai ei-virulenttia muotoa, esim. tapettua tai geneettisesti muutettua bakteeria, tai 25 mikro-organismin soluseinästä tai kapselista eristettyä polysakkaridia tai glykoproteiinia, immuunisysteemin ensimmäisenä ärsykkeenä. Tämä saa aikaan melko hitaan vasteen vasta-aineiden tuottamisessa, jolloin syntyy vastaainepiikki, joka sitten laskee. Keho on kuitenkin hälyy- 30 tetty antigeenin olemassa olon suhteen ja seuraavalla kerralla, kun altistuminen tapahtuu oletettavasti elävälle, virulentille organismille, havaitaan toinen vaste, jolloin esiintyy paljon nopeampi ja runsaampi vasta-aineiden tuottaminen. Tämä toinen vaste on tavallisesti riittävä estä-
3 104374. mään mikro-organismin asettumisen kehoon riittävästi kyetäkseen aiheuttamaan täysin puhjennen infektion. 2.1.1. B - solun aktivaation mekanismi Kun antigeeni tulee kehon sisään, fagosytoivat 5 makrofagit saattavat niellä ja hajottaa ainakin osan siitä; toiset dendriittiset makrofagit (antigeenin esittelevät solut eli APCt) ottavat antigeenin pintamembraanilleen tarkoituksenaan esittää ne lymfosyyteille ja aktivoida nämä. Aikaisin B-solun kehityksessä kukin solu kehittää 10 sitoumuksen tietyn antigeenin sitomisspesifisyydeksi ja tuottaa vasta-ainetta, joka on spesifinen sen solupinnalla olevalle antigeenille. Antigeenin ensiesittely antigeeni-spesifiselle B-solulle johtaa hitaasti nousevaan vastaaineen synteesiin tavallisesti IgM:n dominoidessa. Tämä on 15 primaarinen vaste, joka on se vastetyyppi, joka tyypillisesti stimuloidaan rokottamalla; se saa aikaan B-lymfosyytin kypsymisen plasmasoluksi, joka on erittäin erikoistunut vasta-aineiden tuottamiseen. Kohdatessaan saman antigeenin toisen kerran yleensä antigeeniä kantavalle eläväl- 20 le mikro-organismille altistuttaessa systeemi on jo oppinut tunnistamaan antigeenin ja tapahtuu paljon nopeampi ja suurempi vaste (sekundaarinen vaste), jota dominoi IgG. Tämä "oppiminen" perustuu pitkäikäisiin muistisoluihin, jotka kiertävät jatkuvasti ensimmäisen antigeenille altis-.. 25 tumisen jälkeen; nämä muisti-b-solut kantavat pinnoillaan.. immunoglobuliineja, jotka sitoutuvat vahvasti uudelleen-.- tunkeutuvaan antigeeniin ja tuottavat nopeasti uuden vasta-aineen ja parhaimmissa olosuhteissa estävät infektoivan organismin aiheuttamasta sairautta.. 30 2.1.2 B- ja T-solujen yhteistyö Edellä esitetään erittäin yleisellä tavalla B-so- lun stimuloitumisen ja vasta-aineiden tuotannon mekanismi. Todellisuudessa kuitenkin B-solut eivät toimi täysin itsenäisesti suojaavaa vastetta muodostettaessa. Vaikka T-so- 35 lut eivät itse eritä vasta-aineita, tarvitaan usein yhtä
4 104374 T-solutyyppiä, auttaja-t-soluja, auttamaan B-solujen stimuloitumista, koska joidenkin antigeenien vuorovaikutus pintaan sitoutuneiden vasta-aineiden kanssa ei useinkaan yksinään riitä stimuloimaan B-solujen kasvua ja liukoisten 5 vasta-aineiden erittämistä. Auttaja-T-solut ovat myös vuorovaikutuksessa ja tunnistavat antigeenejä antigeenin esittelevien makrofagien pinnalla ja kehittävät antigeenin tunnistamisen. Sitten T-solut tunnistavat antigeenin makrofagien pinnalla ja välittävät lepäävien B-solujen 10 aktivointia ja erilaistumista. Liukoisia tekijöitä erittämällä B-solun kasvutekijät lisäävät aktivoituneiden B-solujen lukumäärää vuorovaikutuksellaan niiden pintareseptorien kanssa ja kypsymistekijä pysäyttää proliferaation ja stimuloi erilaistumisen vasta-ainetta erittäviksi plasma- 15 soluiksi. Tiettyjen antigeenien spesifisten tyyppien täytyy saada apua T-soluilta synnyttämään sopiva vaste T-soluista. Yleisesti sanottuna nämä antigeenit, joissa determinantti esiintyy vain kerran molekyyliä kohti, kuten asym- 20 metrinen proteiini, ovat erittäin riippuvaisia T-solun vuorovaikutuksesta ja niiden täytyy tukeutua sen muihin determinantteihin tai T-solun epitooppihin molekyylin pinnalla, jotta T-solut tunnistaisivat ne. Siten T-solu oletettavasti lähettää auttavan signaalin B-solulle, mikä 25 auttaa B-solujen antigeenistimulaatiota olemaan tehokkaam-.. pi. 2.2 Kantajavaikutus Tietyt molekyylityypit, kuten pienet peptidit tai 30 ' hapteenit, ovat itsessään tuskin lainkaan immunogeenisiä tai ovat heikosti immunogeenisiä, eivätkä ne pysty tuot- taamaan vasta-ainevastetta missään olosuhteissa. Toiset molekyylit, kuten tietyt bakteeriperäiset kapselipolysak- karidit (CPt) voivat olla erittäin immunogeenisiä aikui- sissa, mutta heikosti kehittyneessä lapsessa immuunisys-...... 35 teemi ei pysty tuottamaan riittävää suojaavaa vastetta.
5 104374 e 11.... Immuunivasteen indusoimisessa heikosti immunogeenisillä molekyyleillä, kuten pienillä peptideillä, hapteeneilla, CP:illä ja vastaavilla molekyyleillä, kohdattujen ongelmien kiertämiseksi näiden immunogeenisyyttä on 5 yritetty parantaa sitomalla ne "kantajamolekyyleihin". Nämä kantajat ovat tavallisimmin suuria immunogeenisiä proteiineja; näiden konjugaattien tarkoituksena on jäljitellä T-solun yhteistyövaikutusta, jota esiintyy luonnostaan immunogeenisillä molekyyleillä. Toisin sanoen kanta- 10 jaan kovalenttisesti sitoutunut polysakkaridi saa aikaan T-solujen osallistumisen vasta-aineiden tuotantoon siten, että T-solu reagoi kantajassa olevien determinanttien läsnäoloon. Sitten T- ja B-solujen vuorovaikutus etenee tavalliseen tapaan, kuten edellä kuvattiin suurille, immu- 15 nogeenisille proteiineille. Kiinnittämällä T-solut kantajadeterminantteihin B-solut aloittavat vasta-aineen tuotannon eivät pelkästään itse kantajaa vastaan vaan myös sitoutunutta polysakkaridimolekyyliä vastaan. Tätä lähestymistapaa pienten tai heikosti immunogeenisten molekyy- 20 lien immunogeenisyyden lisäämiseksi on käytetty menestyksellisesti vuosikymmenten ajan [katso esimerkiksi Goebel et al., J. Exp. Med. 69 (1939) 53] ja on kuvattu monia rokotekoostumuksia, joissa puhdistettuja kapselipolymeerejä on konjugoitu kantajaproteiineihin tehokkaampien roko- 25 tekoostumusten muodostamiseksi käyttäen hyväksi tätä "kan- tajavaikutusta". Esimerkiksi Schneerson et al. [J. Exp. Med. 152 (1980) 361-376] kuvaavat Haemophilus influenzae b -polymeerin proteiinikonjugaatteja, jotka antavat immuni- 30 teetin tuon mikro-organismin aiheuttamia tunkeutuvia tauteja vastaan. Konjugoinnin tarkoituksena oli ohittaa ikään liittyvä kapselipolymeerien immunologinen käyttäytyminen lapsissa. Polymeerit konjugoitiin lukuisiin eri proteiineihin, kuten seerumin albumiiniin, Limulus polyphemus
6 104374 -hemosyaniiniin ja difteriatoksiiniin käyttäen kytkentäainetta, kuten adipiinidihydratsiinia. PRP:n (polyribosyyliribitolifosfaatti, H. influenzae b:n kapselipolymeeri) konjugaattien on osoitettu ole- 5 van tehokkaampia kuin pelkkään polysakkadidiin perustuvat rokotteet [Chu et al., Infect. Immun. 40 (1983) 245; Schneerson et al., Infect. Immun. 45 (1984) 582-591]. Konjugoinnin on myös osoitettu sivuuttavan heikon vastaainevasteen, joka havaitaan yleisesti lapsilla immunisoi- 10 taessa vapaalla polysakkaridilla [Anderson et al., J. Pediatr. 107 (1985) 346; Insel et al., J. Exp. Med. 158 (1986) 294]. Geyer et al. (Med. Microbiol. Immunol. 165 (1979) 171-288] valmistivat konjugaatteja, jotka muodostuivat 15 tietyistä Klebsiella pneumoniae -bakteerin kapselipolysakkaridifragmenteistakytkettyinänitrofenyylietyyliamiiniliittäjään pelkistävän aminaation kautta ja sitten derivatisoitu sokeri kiinnitettiin proteiiniin atso-kytkennän avulla. 20 2.2.1 Kantajaproteiinit Se, että kantaja-aineperiaatteen käyttö muodostaa.. tehokkaan menetelmän kapselipolymeerejä sisältävien ro-., kotteiden parantamiseksi, on laajalti hyväksytty ajatus. Näillä polymeeri-proteiinikonjugaateilla on kuitenkin 4 e 1 25 haittansa erityisesti ihmiskäytössä. Esimerkiksi eetti- sesti ihmisille antoon mandollisina kantajaproteiineina. käytettäviksi hyväksyttyjen proteiinien lukumäärä on suh- --.. teellisen rajoitettu. Tällä hetkellä käytettävissä olevat kaksi ensisijaista proteiinia ihmiskäyttöön ovat tetanus- 30 toksoidi ja difteriatoksoidi. Vielä yksi arvokas kantajaproteiini on CRM197, proteiini, joka sisältää yhden aminoha-, pon muutoksen natiiviin difteriatoksiiniin verrattuna, mutta joka itsessään ei ole myrkyllinen ja sillä on säilynyt oleellisesti identtinen natiivin proteiinin immunogee- 35 nisyys. Näiden tunnettujen kantajaproteiinien rutiinikäyt-
7 104374. io IGOII töön vaikuttavat myös monet näkökohdat. Esimerkiksi käytettävissä olevien proteiinien rajoitettu määrä tarkoittaa sitä, että suuri joukko rokotetuotteita perustuu yhdelle näistä proteiineista; monet rokotukset aineilla, jotka on 5 konjugoitu näihin lukumäärältään rajoitetuihin kantajiin, lisää sitä mandollisuutta, että ei-toivottuja reaktioita näille proteiineille voi esiintyä toistuvien immunisointien seurauksena. Etukäteen olevien vasta-aineiden läsnäolo saattaa myös indusoida haitallisia paikallisia tai 10 systeemisiä immunologisia herkistymisreaktioita. Lisäksi on olemassa myös se mandollisuus, että konjugaatin sisältämä proteiini saattaa reagoida ristiin isännän normaalin kudoksen kanssa ja siten nostattaa autoimmuunityyppisen ilmiön mandollisuuden. On myös mandollista, että epitoopin 15 suppressioilmiö saattaa tapahtua käytettäessä konjugaattirokotteita. Lyhyesti kuvattuna tämä ilmiö, jonka kuvasivat ensimmäisinä tulivuorikotilon hemosyaniinikonjugaateille Herzenberg et al. [J. Exp. Med. 155 (1982) 1741] ja tetanustokdoidikonjugaateille Joliet et al. [Biochem. Bio- 20 phys. Res. Comm. 117 (1983) 359] ja Schulte et al. [J. Immunol. 135 (1985) 2319] havaitaan, kun immuniteetti konjugaatin sisältämälle proteiinille esiintyy jo rokotettavassa yksilössä ja häiritsee vasteen muodostumista kovalenttisesti kytketylle polysakkaridille. Vaikkakaan tätä 25 ei ole vielä kuvattu ihmisillä, tällä suppressiolla (jos sitä esiintyy) voi mandollisesti olla vakavia vaikutuksia konjugaattirokotteiden kehittämiseen. Lopuksi koska proteiinit ovat biologisen prosessin tuotteita, niillä esiintyy useita sisäsyntyisiä vaikeuk- 30 sia. Ensiksikin biologisen systeemin tuotteena proteiinissa esiintyy väistämättä vaihtelua erästä toiseen; tämä vaihtelu saattaa mandollisesti muuttaa proteiinin T-solusta riippuvaisia ominaisuuksia tai sen kokonaisantigeenisyyttä. Siten tarvitaan tiukempaa tuotannon monitorointia, 35 mihin liittyy kustannusten nousua. Toiseksi biologisen
8 104374 tuotteen valmistukseen ja puhdistukseen liittyy selviä kohonneita kustannuksia. Selvästi siis tarvitaan vaihtoehtoa tällä hetkellä saatavissa oleville konjugaattirokotteille, joilla väite- 5 tään immunologiset vaikeudet, jotka liittyvät näiden rokotteiden käyttöön ja jotka kuitenkin säilyttävät oleellisesti saman immunogeenisyyden kuin tunnetut tehokkaat rokotteet. Nyt on osoitettu, että on mandollista saada sellainen rokote konjugoimalla antigeeni, antigeenide- 10 terminantti tai hapteeni bakteerituotteen T-solun epitooppiin. 2.3 T-solun determinantit Tällä hetkellä ei ole vielä selvää, kuinka T-solut tunnistavat proteiineja tai minkä T-solu tunnistaa immuno- 15 geeniseksi determinantiksi. Useiden vuosien ajan on oltu yleisesti yhtä mieltä siitä, että proteiinien antigeenisillä vasta-aineeseen sitoutumisdeterminanteilla on kaksi erilaista rakennetta. Proteiinien determinantit voivat esiintyä primaarisen sek- 20 venssin lyhyinä segmentteinä, jotka sisältävät aminohapot suoraan kytkettyinä peptidisidoksin. Tällaiset determinantit on nimetty "sekventiaalisiksi" tai "jatkuviksi" determinanteiksi. Vaihtoehtoisesti determinantti voi muodostua aminohapoista, jotka ovat kaukana toisistaan 25 primaarisekvenssissä, mutta jotka ovat avaruudellisesti lähekkäin sekundaarisen yhteenkiertymisen vuoksi. Determinantit, joilla on tämä rakenne, on nimetty "topografisiksi" tai harvemmin "epäjatkuviksi" determinanteiksi. Lisäksi ollaan yleisesti yhtä mieltä siitä, että vasta- 30 aineet tunnistavat proteiinin saavutettavissa olevia pinta-alueita, jotka ovat konformaatiosta riippuvaisia ja joiden pituus on vähintään 5-7 aminohappotähdettä. T-solun proteiinien tunnistaminen on monimutkaisempi tapahtuma kuin vasta-aineen sitoutuminen ja sen 35 vuoksi se tunnetaan huonommin. T-solujen on yleisesti
9 104374 ajateltu tunnistavan jatkuvia determinantteja. Monta vuotta sitten osoitettiin, että T-solut pystyivät tunnistamaan sekä proteiinin natiivin että denaturoidun muodon toisin kuin vasta-aine [Maizels et al., Eur. J. Immunol. 5 10 (1980) 509]. Tämän havainnon tulkittiin osoittavan T- solujen tunnistavan pelkästään sekventiaalisia determinantteja ja osoittavan kahtiajakoisuutta T- ja B-solujen proteiinin tunnistamisessa (Maizels et al., yllä). Vaikka ei vakiintuneena, käsitys, että T- ja B-solut tunnistavat 10 periaatteellisesti eri rakenteita, kuitenkin säilyy [Ben- jamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2 (1984) 67]. Ristiriitaisuus siitä, mitä T-solu tunnistaa determinantiksi, ulottuu myös siihen, kuinka T-solu havaitsee proteiinin. On hyvin osoitettu, että immuunisysteemi 15 tunnistaa proteiinin geneettisesti säädellyllä tavalla ja että T-solu havaitsee proteiinit yhdessä Ia-molekyylin kanssa antigeenin esittelevän solun pinnalla. On ehdotettu, että APC kohtaa ensin proteiinin, nielaiseen sen ja hajottaa proteiinin pienemmiksi fragmenteiksi. Alkuperäi- 20 sen proteiinin pienet fragmentit ekspressoidaan sitten Ia:n kanssa APC:n pinnalle, jossa T-solut voivat sen tunnistaa. Niinpä T-solu voisi nähdä vain "prosessoidun" peptidifragmentin. Vaikka vieläkään ei ole selvää, mitä T-solu ha-. 25 vaitsee, monet, erilaiseja malleja käyttävät ryhmät ovat. yhtä mieltä siitä, että 7-17 aminohappotähdettä sisäl-. tävä alue tarvitaan tunnistukseen. Jo vuonna 1972 osoi- tettiin, että 7 tähdettä sisältävä poly-l-lysiinipolymee-.. ri indusoi viivästyneen tyyppisen yliherkkyyden marsuilla 30 [Schlossman, Transplant Rev. 10 (1972) 97]. Myöhemmät tutkimukset monilla erilaisilla luonnontuotteilla, kuten fibrinopeptidillä, influenza-hemagglutiniinilla, syto-... : kromilla, lysotsyymillä, ovalbumiinilla ja myoglobiinilla, ovat osoittaneet minimipeptidikoon T-solujen stimu-.... 35 lointiin olevan 7-17 aminohappotähdettä. Tietyn spesifi-
10 104374 syyden omaavia T-soluklooneja käyttäen havaittiin, että tarvitaan koko 10-14 tähdettä T-soluvasteen saamiseksi [Atassi et al., Biochem. J. 246 (1987) 3037-312]. T-solun tunnistamiseen tarvittava suurempi peptidikoko ver- 5 rattuna vasta-aineen sitomiseen tarvittavaan 5-7 tähteeseen voi viitata ylimääräisiin tähteisiin, jotka tarvitaan determinantin ekspressioon Ia-molekyylin yhteydessä. Ia:n ja synteettisten peptidien vuorovaikutus on todellakin osoitettu monilla malleilla. Ia-sitoutumisessa 10 mukana oleva alue, agretooppi, pidettiin selviönä [Katz et al., J. Mol. Cell Immunol. 1 (1983) 3]. Tämän jälkeen Ia:ta sisältäviä tasomaisia membraaneja on käytetty synteettisten peptidien esittelemiseksi T-soluille [Watts et al., PNAS 81 (1984) 7564]. Viimeaikaisemmat tutkimukset 15 ovat osoittaneet synteettisten peptidien sitoutuvan suoraan Ia-molekyyleihin [Babbett et al., Nature 317 (1985) 359; Buss, PNAS 83 (1986) 3968], jotka esiteltiin geneettisesti rajoitetulla tavalla Ia-molekyylin alkuperästä riippuen [Groillet et al., Science 235 (1987) 865]. Suu- 20 relta osin näiden tutkimusten vuoksi on väitetty, että T- soluepitooppi muodostuisi hydrofiilisestä alueesta, joka voi olla vuorovaikutuksessa T-solun reseptorien kanssa ja hydrofobisesta agretoopista, joka sitoutuu Ia-molekyyleihin. Lisäksi oletetaan, että nämä fragmentit, jotka edus- 25 tavat jatkuvia determinantteja, muodostuisivat alkuperäi-.. sen proteiinin proteolyyttisissä prosessoinnissa.. Yritettäessä ennustaa vasta-aineen sitomispaikkoja tai T-solun determinantteja on käytetty useita erilaisia. lähestymistapoja. Useita vuosia sitten Hopp ja Woods [PNAS. 30 78 (1981) 3824; EP-hakemusjulkaisu 0 056 249; ZA-patentti 823 952] määrittelivät numeerisen hydrofobisuus/hydrofii-... lisyys-indeksin jokaiselle aminohapolle ja tutkivat usei- den proteiinin primaarisekvenssin tällä indeksillä. Heidän,.,. " analyysiensä perusteella tunnetut proteiinien vasta-aineen.... 35 sitomispaikat korreloivat hydrofiilisiin alueisiin. Kyte
11 104374 ja Doolittle [J. Mol. Biol. 157 (1982) 105-132] käyttivät samanlaista lähestymistapaa käyttäen hieman erilaista derivoinnin numeerista indeksiä. Myöhemmin on yritetty korreloida proteiinialueet, 5 joilla esiintyy suurempaa taipuisuutta tai segmentaalista liikkuvuutta, vasta-aineen sitomisalueisiin [Tainer et al., Nature 315 (1985) 327; Ann. Rev. Immunol. 3 (1985) 501; Westhoff et al., Nature 311 (1984) 123]. Tässä lähestymistavassa röntgensäde- tai neutronidiffraktiomal- 10 leista saadut tulokset antavat arvion tähteen suhteellisesta konformationaalisesta vaihtelevuudesta, joka ilmaistaan atomisena lämpötilatekijänä. Graafinen esitys atomisisesta lämpötilatekijästä tähteen numeron funktiona osoittaa suhteellista liikkuvuusastetta tietyn proteiinin 15 polypeptidiketjussa. Korkean liikkuvuuden alueiden ajateltiin korreloivan tunnettuihin vasta-aineen sitomispaikkoihin (Tainer et al., yllä). Jotkut tutkimusryhmät ovat pitäneet T-solujen determinantteja amfipaattisen rakenteen omaavina, toisin 20 sanoen determinantin on ajateltu muodostuvan hydrofiilisestä alueesta, joka sitoutuu T-solun reseptoriin ja myös hydrofobisesta alueesta, joka sitoutuu Ia-molekyyleihin. Lysotsyymin 16 tähteen pituisen T-solun determinantin havaittiin muodostuvan lyhyestä, jatkuvasta hydrofiilisten 25 tähteiden sarjasta [Allen et al., PNAS 81 (1984) 2489]... -. Muut ovat kuitenkin ehdottaneet, että T-solujen determi- ". nanteilla on taipumus muodostaa pysyviä, helikaalisia ra- kenteita, joissa hydrofiiliset tähteet asettuvat suoraan riviin heliksin toisella pinnalla, kun taas hydrofobiset 30 tähteet asettuvat suoraan riviin vastakkaisella pinnalla [DeLisi ja Berzofsky, PNAS 82 (1985) 2489; Watts et al., PNAS 82 (1985) 7048]. Algoritmi tietyn proteiinisekvens- 411,, sin etsimiseksi alueille, joilla on taipumus muodostaa helikaalisia, amfipaattisia rakenteita, on kehitetty 35 (DeLisi ja Berzofsky, yllä) ja sitä on sovellettu usei-
12 104374... siin proteiinimalleihin. Sitä vastoin monet tutkijat ovat edelleen sitä mieltä, että T-solun determinantit liittyvät proteiininsisäisiin beeta-käännöksiin [Katz et al., J. Immunol. 135 (1985) 1386]. Selkeä kuva siitä, mitkä teki- 5 jät ovat tärkeitä T-solujen determinanttien ennustamisessa on vielä saamatta. Useat tutkimusryhmät ovat havainneet, kuinka tärkeää on sisällyttää T-solujen determinantti osaksi synteettistä rokotetta. Milch et al. (US-patenttijulkaisut 10 4 599 230 ja 4 599 231) ovat syntetisoineet peptidirokotteen, joka muodostuu hepatiitti B -viruksen pinta-antigeenin T- ja B-soludeterminanteista. Samoin malariarokote muodostettiin circumsporozoiittiproteiinin auttaja-t-solun epitoopista kovalenttisesti kytkettynä tämän proteiinin 15 tärkeimpään B-solun determinanttiin [Good et al., Science 235 (1987) 1059]. Mielenkiintoista on, että auttaja-t-solujen determinantti ennustettiin DeLisin ja Berzofskyn, yllä, algoritmien avulla. Näissä molemmissa tutkimuksissa käytettiin T- ja B-solun determinantteja samasta pro- 20 teiinista rokotteen muodostamiseksi. Toisin kuin edellä Leclerc et al. [Eur. J. Immunol, 17 (1987) 269] muodostivat rokotteen kopolymeroimalla streptokokkiperäinen peptidi, S-34, joka sisältää sekvenssissään sekä T- että B- solujen determinantit, viruspeptidiin, joka edustaa hepa- 25 tiitti B -viruksen B-solun determinanttia. T-solun determinantti, joka tässä tapauksessa vastasi oleellisesti natiivia peptidiä, teki viruspeptidin immunogeeniseksi toimien siten kantajamolekyylinä. 3. Keksinnön yhteenveto 30 Keksinnön kohteena on oligopeptidi, jolle on tunnusomaista, että se koostuu oleellisesti bakteeriperäisen toksiinin, CRM:n tai toksoidin vähintään yhdestä T-solun epitoopista. Toisin sanoen keksintö antaa käyttöön uusia eristettyjä tai synteettisiä bakteerituotteiden T-solun 35 epitooppeja ja tällaiset epitoopit ovat käyttökelpoisia
13 104374 OOOOO O OO valmistettaessa rokotekoostumuksia, joiden käyttökelpoisuus on analoginen aikaisemmin tunnettujen rokotteiden kanssa, joissa käytetään kantajaproteiineja vasta-ainetuotannon lisäämiseksi. Tällaisia epitooppeja ovat baktee- 5 ritoksiineista, erityisesti difteriatoksiinista tai sen kanssa ristiin reagoivasta materiaalista (CRM) ja tetanustoksiinista, eristetyt epitoopit. Tässä selitysosassa ja vaatimuksissa käytettyinä keksinnön mukaiset T-solun epitoopit viittaavat itse T-solun epitooppeihin. 10 T-solun epitooppeja voidaan käyttää yhdessä ulkopuolisen B-solun determinantin kanssa, jotta saataisiin tuotetuksi huomattavia määria vasta-ainetta B-solun determinanttia vastaan tuottamatta vasta-aineita T-solun epitoopeille. Nyt on yllättäen keksitty, että tällainen yh- 15 distelmä voi tuottaa oleellisesti yhtä tehokkaan vastaaineen tuotannon tason kuin tällä hetkellä yleisesti käytetyt B-solun determinantti-kantajaproteiini-yhdistelmät. Tällaisen yhdistelmän saatavuus ja osoitettu käyttökelpoisuus tekevät nyt mandolliseksi välttää potentiaalisesti 20 ei-toivottuja immunologisia seurauksia, joita voi liittyä kantajaproteiinipohjaisten rokotteiden käyttöön. Lisäksi itse T-solun epitoopin käyttö vastakohtana suuremman, epitoopin sisältävän peptidin käytölle tuottaa taloudellista hyötyä, sillä epitooppi voidaan helposti synteti- 25 soida, samoin kuin turvallisuushyödyn väittämällä kokonaisen proteiinin käytön. Keksintö antaa käyttöön myös menetelmän immunogeenisen konjugaatin valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että kytketään 30 polysakkaridiantigeeni oligopeptidiin, joka koostuu oleellisesti bakteeriperäisen toksiinin, CRM:n tai toksoidin vähintään yhdestä T-solun epitoopista. Nämä konjugaatit sisältävät eristetyn tai synteettisen T-solun epitoopin konjugoituna antigeeniin, antigeenideterminanttiin tai 35 hapteeniin. Näiden kanden elementin konjugointi rokote-
14 104374 8 koostumuksessa mandollistaa tehokkaamman vasta-ainevastetason antigeenille. Nämä rokotteet ovat käyttökelpoisia tuotettaessa vasta-aineita minkätyyppiselle antigeenille tahansa, mukaan lukien ei vain patogeenisiin organismeihin 5 (bakteereihin, viruksiin tai parasiitteihin) liittyvät antigeenit vaan myös allergeenit ja syöpään liittyvät antigeenit ja vastaavat. Konjugaatit ovat kuitenkin erityisen käyttökelpoisia formuloitaessa rokotekoostumuksia käyttäen antigeenejä, jotka ovat vain heikosti immunogee- 10 nisia, toisin sanoen antigeenejä, jotka perinteisesti on ollut pakko konjugoida kantajaproteiineihin tyydyttävän vasta-aineiden tuotantotason saavuttamiseksi. Näiden konjugaattien saatavuus mandollistaa menetelmän immuunivasteen stimuloimiseksi lämminverisillä 15 eläimillä, jossa menetelmässä eläimelle annetaan immunogeeninä tehokas määrä mielenkiinnon kohteena olevaa antigeenia konjugoituna bakteerituotteen T-solun epitooppiin. Menetelmä sisältää suojaavan immunisoinnin perinteisessä mielessä, toisin sanoen injektion tiettyä mikrobipatogee- 20 niä vastaan, mutta sen on tarkoitettu sisältävän myös minkä muun tyyppinen käsittely tahansa, jossa lisääntynyt vasta-aineen tuotanto olisi toivottavaa, esimerkiksi tätä menetelmää voidaan käyttää kasvainspesifisten tai kasvaimiin liittyvien antigeenin vastaisten vasta-aineiden sti- 25 mulointiin, tai tuotettaessa vasta-aineita yleisille allergeeneille. Menetelmä on myös erityisen käyttökelpoinen immunisoitaessa ihmislapsia, joiden immuunisysteemi ei vielä ole täysin kehittynyt. Tätä menetelmää voidaan käyttää sekä terapeuttisessa että ennaltaehkäisevässä mieles- 30 sä. 4. Kuvioiden kuvaus Kuvio 1 esittää CRM:n primaarisekvenssin normaalina yksikirjaimisena koodina. Ne alueet, joilla on taipumus muodostaa amfipaattisia helikaalisia rakenteita, on mer- 35 kitty numerolla 1 ja ne sekvenssit, joilla on mandollista T-solun epitooppiaktiivisuutta on alleviivattu.
15 104374 Kuvio 2 esittää peptidin 6 HPLC-analyysin. A. Raakapeptidin 6 kromatogrammi; pylväs osoittaa yhdistetyt alueet. B. Peptidin 6 (edellä saatujen yhdistettyjen fragmenttien) uudelleenkromatografointi; synteettinen 5 peptidi eluoitiin tekstissä kuvatulla tavalla. Kuvio 3 esittää synteettisen peptidin 6 PTH-johdannaisten valittuja kromatogrammeja; peptidi sekvenoitiin tekstissä kuvatulla tavalla; luvut osoittavat Edman-syklit; piikit a ja b, jotka toimivat sisäisinä merkkiainei- 10 na, edustavat N',N-dimetyyli-N'-fenyylitioureaa ja vastaavasti N',N-difenyylitioureaa. Sykli 2 osoittaa tyrosiinin, sykli 5 valiinin, sykli 9 isoleusiinin, sykli 17 asparagiinin, sykli 22 proliinin ja sykli 28 glysiinin läsnäoloa. 15 Kuvio 4 esittää valittujen, PRP:tä vastaan muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla todettujen peptidikonjugaattien Western blot -analyysia; vasemmalta oikealle rivit sisältävät molekyylipainovakion (LMW) ja konjugaatit PRP-(peptidi 357-380), PRP-(peptidi 306-20 334) ja PRP-CRM, PRP:n ja lyhyt PRP-(peptidi 366-383) -konjugaatin. Kuvio 5 esittää diagrammin muodossa kantajalle, DT:11e, esialtistuksen vaikutuksen immuunivasteeseen PRP- (306-334) -konjugaatilla. 25 Kuvio 6 esittää diagrammin muodossa vasta-ainevasteen RS-viruksen (Respiratory Syncytial Virus) (RSV) F -proteiinikonjugaateille. 5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5.1. Bakteeriperäiset T-solun epitoopit 30 Tämän keksinnön monet sovellutusmuodot perustuvat siihen havaintoon, että eristetyt tai synteettiset bakteerituotteiden T-solun epitoopit voivat toimia yhtä tehokkaasti kuin antigeenien kantajaproteiinit immunisointitarkoituksissa. Aikaisemmin ei ole osoitettu, että baktee- 35 rituotteen T-solun determinantti voi antigeeniin sidottuna toimia samalla tavalla kuin samaan antigeeniin konjugoitu
16 104374. ***** *** ge 1... kokonainen natiivi proteiini. Tieto siitä, että bakteerituotteen T-solun epitooppi voi toimia yhtä tehokkaasti kuin kantajaproteiini vasta-ainevasteen aikaansaamiseksi, on avannut oven kokonaan uudentyyppisille rokotteille, 5 jotka perustuvat eristettyjen T-solun epitooppien käyttöön yhdessä B-solun determinantin tai koko antigeenin kanssa. Seuraavassa tarkastelussa kuvataan yksityiskohtaisesti keinot sopivien T-solun epitooppien identifioimiseksi ja eristämiseksi tässä keksinnössä käytettäväksi. Sen lisäk- 10 si, että saadaan samanlaiset immunologiset ominaisuudet, epitooppien käytöllä (vastakohtana kokonaisen natiivin proteiinin käytölle) saatetaan välttää mandolliset yliherkkyyteen, autoimmuunisuuteen ja perusteelliseen puhdistamiseen liittyvät ongelmat tehokkutta uhraamatta. 15 5.1.1. T-solun epitooppien identifiointimenetelmät Vaikka bakteerituotteiden T-solun epitooppeja ei olekaan aikaisemmin identifioitu, kirjallisuudessa on kuvattu monia menetelmiä, joita voidaan käyttää mielenkiinnon kohteena olevan bakteerituotteen sisältämän T-solun 20 epitoopin tai sisältämien T-solun epitooppien identifiointiin. Esimerkiksi DeLisi et al. [PNAS 82 (1985) 7048; katso myös Margalite et al., J. Immunol. 138 (1987) 2213] ovat ehdoittaneet, että mandolliset epitooppialueet voidaan paikallistaa identifioimalla molekyylin potentiaali- 25 set amfipaattiset alfahelikaaliset alueet. Rothbard et al. (Modern Trends in Human Leukemia VII, 1986) kuvaavat myös kokeellisen lähestymistavan T-solun epitooppien identifioimiseksi tutkimalla proteiinin primaarisekvenssiä hydrofobisuuden, varauksen, poolisuuden ja glysiini- tai pro- 30 liinitähteiden esiintymisen suhteen. Sekvenssi, jossa varattua tähdettä tai glysiinitähdettä seurasi kaksi hydrofobista tähdettä, viittasi mandolliseen T-solun epitooppiin. Bixler et al. [Immunol. Comm. 12 (1983) 593; J. Immunogenet. 11 (1984) 245; J. Immunogenet. 11 (1984) 339] 35 kuvaavat strategian, jossa syntetisoidaan päällekkäisiä synteettisiä peptidejä, jotka käsittävät koko proteiinimo-
17 104374 oa r.ra lekyylin, T-solun epitooppien rajaamiseksi. Gysen'n kuvaama uusi synteesimenetelmä [Giba Foundation Symposium 119 (1986) 130] antaa mandollisuuden syntetisoida monia eri peptidejä pieninä määrinä, jolloin on mandollista jälji- 5 tellä erilaisia mandollisia sitoutumispaikkoja, mikä puolestaan sallii molekyylin nopean seulonnan. Perinteisemmät menetelmät, kuten proteiinien entsymaattinen tai kemiallinen hajotus, tuottavat peptidifragmentteja, jotka voidaan helposti testata T-soluaktiivisuuden suhteen. Esimerkiksi 10 entsyymeillä, kuten kymotrypsiini, elastaasi, fisiini, papaiini, pepsiini tai trypsiini, saadaan aikaan rajoitettuja ja ennustettavia fragmentteja pilkkomalla tietyt aminohappoliitokset. Samoin kemialliset yhdisteet, kuten N- kloorisukkinimidi-bpns-skatoli, syanogeenibromidi, muura- 15 haishappo tai hydroksyyliamiini, tuottavat myös fragmentteja vaikuttaessaan proteiineihin. Halutun T-soluja stimuloivan aktiivisuuden läsnäolo missä tahansa tietyssä fragmentissa voidaan helposti määrittää saattamalla puhdistetut fragmentit normaaliin T-solun proliferaatiomäärityk- 20 seen tai analysoimalla puhdistamattomat fragmentit T-solun Western-määritysmenetelmällä [Young et al., Immunol. 59 (1986) 167]. 5.1.2. T - solun epitooppien lähteet On lukuisia bakteerituotteita, jotka muodostavat 25 käteviä mandollisesti käyttökelpoisten T-solun epitooppien lähteitä sen ansiosta, että natiivia kantamolekyyliä voidaan käyttää kantajaproteiinina. Esimerkiksi voidaan käyttää erilaisten gram-negatiivisten bakteerien ulkomembraaniproteiineja, kuten Haemophilus influenzae'n OMP:tä. 30 Monien gram-negatiivisten bakteerien pinnalla esiintyvät karvat (fimbrit), kuitumaiset, ei-flagellaariset lisäkkeet, samoin kuin flagelliini, bakteerien flagellojen proteiinikomponentti, edustavat mandollista T-solun determinanttilähdettä. Tiettyjen bakteerien, esim. pertussisbak- 35 teerin, kuitumaiset hemagglutiniinit (FHA) sopivat myös T- solun determinattilähteeksi.
18 104374 Arvokkaimpia bakteerien proteiineja tässä keksinnössä käytettäviksi ovat tunnetut bakteeritoksiinit, joita on käytetty menestyksellisesti kantajaproteiineina perinteisissä rokotekoostumuksissa. Vaikka edellä mainittuja 5 bakteeritoksiineja ja toksoideja on käytetty vuosia ihmisten immunisointiin, tiedetään hyvin vähän siitä, kuinka immuunisysteeni tunnistaa ne. Se vähän, mitä kirjallisuudessa on kuvattu, on ollut keskeneräistä. Triebel et al. [Eur. J. Immunol. 16 (1986) 47] tutkivat ihmisen perifee- 10 risiä valkosoluja T-solureaktiivisuuden suhteen syanogeenibromidilla pilkkomalla saatuihin difteriatoksiinin fragmentteihin. Kuitenkin vain rajoitettu suurten fragmenttien joukko otettiin huomioon, eikä T-solun determinanttien tarkka rajaaminen ollut mandollista. Niinpä bakteeritok- 15 siinin tarkkaa T-solun determinanttia ei ole vielä identifioitu. Tässä kuvattu bakteeritoksiinin T-solun determinanttivalmiste voi perustua mihin tahansa tunnettuun toksiiniin, joita yleisesti käytetään natiivissa muodos- 20 saan vain heikosti immunogeenisten antigeenisten yhdisteiden kantajana. Tunnettuja bakteeritoksiineja, - CRM:iä tai -toksoideja ovat Pseudomonas-, Staphylococcus-, Streptococcus- ja Pertussis-bakteerien sekä enterotoksisten bakteerien, esim. E. colin, toksiinit, CRM:t ja toksoidit. 25 Yleisimmin hyväksyttyjä kantajaproteiineja ovat kuitenkin tetanus- ja difteriatoksoidit, jotka käytössä ovat osoittautuneet turvallisiksi. Erityisen edullinen T-solun epitooppi eristetään CRM 197 :stä, difteriatoksiinin myrkyttömästä mutantista, 30 5.1.3 CFt14197-epitoopit "Ristiinreagoivat aineet" eli CRM:t ovat geneettisesti muunnettuja proteiineja, jotka antigeenisilta ominaisuuksiltaan ovat samanlaisia kuin natiivi proteiinitoksiini ja ovat kuitenkin myrkyttömiä. Difteriatoksiinin 35 CRM on jo osoittautunut tehokkaaksi nostattamaan vastaainevasteen bakteerien kapselipolymeereille [Anderson et
19 104374 al., J. Pediatr. 107 (1985) 346]. CMR",:nä tunnettu ristiinreagoiva aine on huomionarvoinen, sillä siinä esiintyy yksi ainoa aminohapon muutos ja se on immunologisesti erottamaton natiivista difteriatoksiinista. CRM 197 -pro- 5 teiinia tuottavan Corynebacterium diphtheriae -kannan C7 (g 197) viljelmä on talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, Rockville, Maryland, ja sille on annettu talletusnumero ATCC 53281. Mandollisten T-solun determinanttien paikallista- 10 miseksi CRM:ssä huomio kohdistettiin proteiinin helikaalisiin, amfipaattisiin alueisiin DeLisin ja Berzofskyn teorian mukaan [PNAS 82 (1985) 2489]. Paikka määritettiin algoritmin avulla tietokoneella ja validoitiin vertaamalla saatuja tuloksia valaan sperman myoglobiinin analyysiin 15 DeLisin ja Berzofskyn, yllä, kuvaamalla tavalla. Sitten ohjelmaa sovellettiin tunnettuun CRM 197 :n sekvenssiin [Collier, Bacteriol. Rev. 39 (1975) 54; Drazin et al., J. Biol. Chem. 254 (1979) 5832]. Kuusi CRM-aluetta valittiin yksityiskohtaisen tutkimuksen kohteeksi. Nämä alueet syn- 20 tetisoitiin normaalilla vaiheittaisella Merrifieldin kiinteä faasi -synteesillä. Kun tietyn CRM-alueen oli kokeellisesti varmistettu sisältävän T-solun determinantin tai sen osan, determinantin tarkat rajat voitiin kartoittaa. Tämä toteutettiin 25 käyttäen useita erilaisia synteettisten peptidien joukkoja, jotka systemaattisesti analysoivat mielenkiinnon kohteena olevan alueen. Ensimmäisessä peptidijoukossa peptidin N-päätä muuteltiin lisäämällä peräkkäin 3-5 luonnollista sekvenssitähdettä kerrallaan pitäen C-pää 30 muuttumattomana. Tämä mandollistaa N-pään rajan karkean arvioinnin. Rajan sijainnin määrittämiseksi tarkemmin syntetisoitiin toinen peptidisarja, joka analysoi tämän alueen, lisäämällä yksi luonnollinen sekvenssitähde kerrallaan N-päähän. Kolmannessa peptidijoukossa C-pään täh- 35 teet poistettiin peräkkäin 1-3 tähteen vaiheissa pitäen N-pää muuttumattomana. Koska tämä johtaa asteittaisesti
20 104374 lyhyempiin peptideihin, mikä voisi vaikuttaa haitallisesti niiden tunnistukseen, oli välttämätöntä korvata koon pieneneminen lisäämällä N-päähän ylimääräisiä tähteitä, jotka eivät kuuluneet proteiinin luonnolliseen sekvenssiin. Kun 5 determinantin sekä N- että C-päät oli kartoitettu, rajattua aluetta vastaava peptidi syntetisoitiin ja varmistettiin T-solun determinantiksi. Kuviossa 1 mandollisiksi T-solun epitoopeiksi rajatuista alueista alueella 357-383 oleva peptidi aiheutti 10 huomattavan vasteen stimuloitaessa difterialla (DT) herkistettyjä imusolmukesoluja. Lisätutkimukset paikallistivat epitoopin CRM 197 :n 369-383 -alueeksi. Sekvenssi edustaa CRM 197 :n ja difteriatoksiinin T-solun epitooppia. Peptidi on kovalenttisesti sidottuna kapselipolymeeriin 15 PRP osoitettu tehokkaaksi nostamaan haluttu vasta-ainevaste PRP:lle in vivo, eikä se myöskään indusoi vasta-aineita, jotka reagoisivat ristiin koko CRM:n tai DT-toksiinin kanssa. Siten tällä peptidillä on bakteeritoksiinikonjugaatille toivotut ominaisuudet. Toinen T-solun epitooppi 20 on paikallistettu CRM:n 306-334 -alueelle. 5.1.4. CMR:n T-solun epitoopin valmistus Kuten edellä viitattaessa esimerkkeihin mainittiin, peptidin pituutta voidaan muuttaa monella tavalla vaikuttamatta T-soluvasteaktiivisuuteen ja katsotaankin, että 25 tämä keksintö kattaa mitkä tahansa peptidifragmentit, jotka säilyttävät stimuloivan aktiivisuuden, mutta jotka eivät aiheuta haitallisia immunologisia reaktioita, joita natiivit proteiinit voivat aiheuttaa. Katsotaan myös, että tämä keksintö kattaa variaatiot aktiivisessa peptidissä, 30 jonka primaarisekvenssiin tehdään aminohapposubstituutioita vaikuttamatta peptidin aktiivisuuteen. Alan ammattimies tuntee hyvin tällaiset substituutiot. Substituutioita voidaan tehdä esimerkiksi kyseisten tähteiden poolisuuden, varauksen, liukoisuuden, hydrofobisuuden, hydrofiilisyyden 35 ja/tai amfipaattisen luonteen samanlaisuuden perusteella. Negatiivisesti varattuja aminohappoja ovat asparagiinihap-
21 104374 po ja glutamiinihappo; positiivisesti varattuja aminohappoja ovat lysiini ja arginiini; aminohappoja, joissa on varauksettomia poolisia pääryhmiä tai poolittomia pääryhmiä, joilla on samanlaiset hydrofiilisyysarvot, ovat leu- 5 siini, isoleusiini, glutamiini, seriini, treoniini, fenyylialaniini ja tyrosiini. Valmistusmenetelmäksi voidaan valita mikä tahansa peptidisynteesialalla tunnetuista menetelmistä. Yleisemmin käytettyihin menetelmiin kuuluu kytkentä Merrifieldin 10 kiinteä faasi -synteesillä ([J. Am. Chem. Soc. 96 (1964) 2986-2983], jossa suojattu aminohappo sidotaan hartsipartikkeliin. Aminohapot, joissa on funktionaalisia ryhmiä, esim. tyrosiini, suojataan yleensä helposti poistettavalla suojaryhmällä. Jokainen näistä menetelmistä sopii 15 yhtä hyvin tämän keksinnön tarkoituksiin. 5.1.5. Tetanustoksiiniepitoopit CRM 197 :n T-solun epitooppien identifioinnin lisksi tutkittiin myös tetanustoksiinimolekyyli T-solun epitoopin läsnäolon suhteen. Näiden epitooppien paikallistamiseksi 20 tetanustoksiinimolekyyli pilkottiin kooltaan tunnettuihin fragmentteihin erilaisia proteaaseja käyttäen. Näin muodostetut fragmentit tutkittiin aluksi niiden kyvyn suhteen stimuloida hiiren T-solujen proliferaatiota. Joukko päällekkäisiä peptidejä, jotka sisälsivät aktiiviset fragmen- 25 tit, syntetisoitiin ja testattiin T-soluaktiivisuuden suhteen. Edulliset epitoopit ovat tetanustoksiinin peptidit 961-980 ja 1021-1040. 5.2. Antigeeni -T - solun epitooppi -konjugaatit Tämän keksinnön mukaiset T-solun epitoopit voidaan 30 arvokkaasti yhdistää käytännössä mihin tahansa antigeeniin, antigeeniseen determinanttiin tai hapteeniin, jolla on lääketieteellistä tai eläinlääketieteellistä mielenkiintoa ja jonka immunogeenisyyden lisäys olisi toivottavaa. Nämä antigeenit voivat esimerkiksi olla bakteeri-, 35 virus-, parasiitti- tai sieniperäisiin infektoiviin aineisiin liittyviä ja esimerkkejä näistä ovat pneumokokki-
22 104374. peräiset polysakkaridit, gonokokkiperäiset ulkomembraaniproteiinit, Mycoplasma pneumoniae'n adheesioproteiinit tai gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkarideihin liittyvät pintasakkaridit. Alan ammattimies tunnistaa helposti 5 lisää tämäntyyppisiä antigeeneja. Toinen antigeenisten materiaalien tyyppi, jota voidaan käyttää immunogeenisten konjugaattien B-soluosana, ovat mitkä tahansa tunnetuista allergeeneista. Esimerkkejä allergeenityypeistä, jotka saattaisivat olla käyttökel- 10 poisia ovat B-soludeterminantit tuoksukista [Atassi et al., FEBS Letters 188 (1985) 96], raiheinästä [Standring et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 83 (1987) 96], pölypunkkiproteiinit Der pi ja Der f [Chapman et al., J. Immunol. 139 (1987) 1479]; mehiläisen myrkyn fosfolysaatti 15 A,:n hiilihydraattiepitooppi [Weber et al., Allergy 42 (1987) 464]; penisilloyylideterminantit [Ahlstedt et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 61 (1980) 91], merituppien hiilihydraattideterminantit [Oka et al., J. Allergy Clin. Immunol. 80 (1987) 57]; ja Ascaris-antigeenit [Dar- 20 den et al., Immunol. Comm. 7 (1978) 393]. Sopiviin antigeeneihin kuuluvat myös kasvaimeen liittyvät antigeenit. Paremmin karakterisoituja antigeeneja ovat karsinoembryonaalinen antigeeni [Kuroki et al., Cancer Res. 46 (1983) 300; Laferti ja Krantz, Mol. 25 Immunol. 20 (1983) 421], adenokarsinoomaan liittyvä antigeeni DU-DAN-2 [Lan et al., Cancer Res. 45 (1985) 305] ja gastrointestinaalispankreatiittinen antigeeni [Magnani et al., Cancer Res. 43 (1983) 5489]. Mandollisesti mielenkiintoisia ovat myös autoim- 30 muunisairauksiin, kuten nivelreumaan ja lupus erythematoses -tautiin, liittyvät erilaiset antigeenit. Edellä esitetystä tulee ymmärtää, että käytettäessä termiä antigeeni tarkoitetaan joko koko antigeenia tai yhtä sen determinanteista ja sen on tarkoitettu sisältävän 35 myös hapteenimolekyylit, jotka saattaisivat hyötyä immuu-
23 104374 nivasteen lisäämisestä, mikä tapahtuu konjugaatiossa bakteeriperäiseen T-solun epitooppiin. Edellä oleva antigeeniluettelo on vain esimerkinluonteinen ja alan ammattimiehet tunnistavat helposti muita käyttökelpoisia antigeene- 5 ja. 5.2.1. Kapselipolymeerit Kuten aikaisemmin on mainittu, bakteerien kapselipolymeerit ovat antigeeniryhmä, joita olisi mandollista käyttää tehokkaasti rokotteessa, mutta jotka ovat vain 10 heikosti immunogeenisiä nuorissa ihmisissä. Tässä hakemuksessa käytettynä termi "kapselipolymeerit" viittaa sokeria sisältäviin polymeereihin, kuten sokerien, sokerihappojen, aminosokereiden, polyhydristen alkoholien ja sokerifosfaattien polymeereihin, eikä viittaa aminohappoja sisältä- 15 viin polymeereihin. Näihin "kapselipolymeereihin" viitataan lääketieteellisessä kirjallisuudessa usein "kapselipolysakkarideina", vaikka ne saattavat sisältää muitakin sidoksia kuin glykosidisidoksia ja muita aineosia kuin sokereita, kuten edellä lueteltuja aineita. 20 Kapselipolymeerit (CP) voivat olla peräisin monista erityyppisistä bakteereista. Näitä ovat Haemophilus influenzae, Streptococcus-lajit, kuten pneumoniae (erityisesti serotyypit 1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F), pyogenes ja aglactiae, Neisseria meningitidis, 25 Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ja Staphylococcus aureus. Eri bakteerien CP:iden immunogeenisyys vaihtelee huomattavasti ihmiselämän ensimmäisen vuoden aikana. Jotkut ovat kohtalaisen aktiivisia, kuten Streptococcus 30 pneumoniae serotyyppi 3 ja Neisseria meningitidis serotyyppi A. Herkkyys koteloituvien bakteerin aiheuttamaan systeemiseen infektioon on suurempi elämän ensimmäisenä vuotena. Immunogeeninen vaste monille bakteeriperäisille kapselipolymeereille lapsilla on iästä riippuvainen, tämä
24 104374 *... tarkoittaa, että immunokompetenssi CP:ille kasvaa aikuisen tasoille noin kuuden vuoden iässä. Inaktiivisia CP:itä ovat Haemophilus influenzae tyypin b, Streptococcus pneumoniae serotyyppien 6 ja 12 ja 5 Neisseria meningitidis seroryhmän C CP:t. Esimerkkejä CP:istä, jotka stimuloivat keskiasteisen vasteen lapsilla, ovat Streptococcus pneumoniae serotyypit 19 ja 51. Organismeista, kuten Neisseria meningitidis seroryhmästä B, on löydetty myös polysakkarideja, jotka eivät ole immunogee- 10 nisiä missään ikäryhmässä. Ei-bakteeriperäiset polymeerit voivat olla peräisin hiivasta ja sienistä, esimerkiksi Crytococcus neoformans'- ista, tai sakkaridiyksiköitä, joita löytyy yksinomaan syöpäsoluista, tai allergeeneihin liittyvistä sakkaridi- 15 yksiköistä. 5.2.2. Muut antigeenit Muita antigeeneja, jotka ovat käyttökelpoisia immunogeenisen koostumuksen valmistamisessa, ovat mikrobiperäiset antigeenit, virusantigeenit, kasvainantigeenit, 20 allergeenit ja autoimmuunisuuteen liittyvät antigeenit. Esimerkkejä mikrobiperäisistä antigeeneistä ovat ulkomembraaniproteiinit (esim. Haemophilus influenzae'sta tai Branhamella catarrhalis'sta) ja pintaproteiinit (esim. Streptococcus pyogenes'in M-proteiini). Esimerkkejä vi- 25 rusproteiineista ovat RS-viruksen (RSV) F- ja G-proteiinit. 5.2.3. Antigeeni-epitooppi-konjugaattien valmistus Kuvatut antigeeni-epitooppikonjugaatit voidaan valmistaa millä tahansa alalla tunnetulla biologisesti hyväk- 30 syttävällä menetelmällä antigeenien kytkemiseksi kantajiin. Konjugaattien tehokkaimman hyväksikäytön varmistamiseksi kytkentämenetelmä on edullisimmin kovalenttinen kytkentä. Tällä hetkellä on käytettävissä monia tällaisia menetelmiä poly- ja oligosakkaridien, proteiinien ja pep- 35 tidien kytkemiseksi peptidikantajiin. Useimmissa menetel-
25 104374 II II II V. missä muodostetaan joko amiini- tai amidisidoksia tai joissakin tapauksissa tioestereitä. Kytkentäkemiaa voidaan muuttaa tietyssä määrin T- solun epitoopin modifioitujen analogien synteesin kautta. 5 Tällaisia modifikaatioita voivat esimerkiksi olla lysiinin tai kysteiinin lisääminen peptidin N-päähän välittäjämolekyylin kanssa tai ilman sitä. Tällaisten analogien kykyä stimuloida T-soluja on verrattu modifioimattoman peptidin vastaavaan kykyyn. 10 (a) Polysakkkaridit tai oligosakkaridit peptideihin Eräs käyttökelpoinen menetelmä sakkaridin kytkemiseksi on pelkistävä aminointi. Poly- ja oligosakkarideilla on vapaita pelkistäviä pääteryhmiä, jotka voidaan aminoida pelkistävästi peptidin N-terminaalisen aminohapon tai ly- 15 siinin E-aminoryhmien typpeen. Muodostunut sidos on sekundaarinen amiini. Vaihtoehtoisesti poly- tai oligosakkaridi voidaan hapettaa esimerkiksi perjodaatti-ionilla, jolloin saadaan sisäisiä ja/tai terminaalisia aldehydiryhmiä. Aldehydiryhmät voidaan myös pelkistävästi aminoida peptidien 20 N-terminaaliseen aminohappoon tai lysiinin E-aminoryhmiin. Lyhyitä bifunktionaalisia välittäjämolekyyliryhmiä, joissa on aminoryhmä toisessa päässä ja aktiivinen ryhmä, kuten amino-, peitetty aldehydi-, karboksyylihappoesteri-, aktiivinen esteri- tai tioryhmä, toisessa päässä, voidaan 25 aminoida pelkistävästi sakkaridiin ja sitten kytkeä se peptidiin välittäjämolekyylin toisen pään kautta. a-aminokapronihappo ja 4-aminobutyylidimetyyliasetaali ovat esimerkkejä tällaisista välittäjämolekyyliryhmistä. Terminaalisten pelkistävien sokereiden reaktio 0-30 fenyleenidiamiinin ja nitrofenyylihydratsiinien kanssa tuottaa substituoituja 1-fenyyliflavatsoleja. Funktionalisoitujen sakkaridien kytkentä peptideihin tapahtuu muuttamalla nitroryhmä diatsoryhmäksi.